HLA类II呈现在B淋巴细胞系列JY的升高温度下明确改变

  • Laura C. Demmers.
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学,博物馆生物分子研究和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰
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  • 魏武
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学,博物馆生物分子研究和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰
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  • Albert J.r. Heck.
    一致
    通讯作者:Albert J. R. Heck,
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学,博物馆生物分子研究和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰
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开放访问发布:2021年4月29日DOI://doi.org/10.1016/j.mcpro.2021.100089

      强调

      • 在40℃下生长的JY细胞可能会诱导细胞适应性,相似受感染诱导的适应。
      • HLA II类蛋白质在40℃下在JY细胞中上调。
      • 热处理严重影响HLA级别II,但不是JY细胞中的I类系统。
      • 所呈现的夹肽嵌套曲目在很大程度上是N末端,在37ºC下延伸,但C末端延伸到40℃。

      抽象的

      HLA I类和HLA II类分子通过信号传递细胞,在我们的自适应免疫系统中起重要作用’通过呈现小肽的免疫系统对免疫系统的健康状况。理解HLA生物学由于其在癌症免疫治疗中的自身免疫疾病和作用而突出的突出意义。尽管已经广泛研究了HLA类和II级抗原处理和呈现途径,但HLA II类抗原呈现的基本规则仍然不太了解。为了澄清HLA类和II类系统之间的机械和适应性差异,我们挑战了一种B淋巴细胞线(JY),广泛用作研究抗原呈现的模型系统,具有高温处理,以模仿“发烧 - 像国家一样’,代表感染最常见的生理反应之一。在没有真正的入侵致病肽的情况下,我们可以专注于划清本征的HLA途径适应,以应对该特定细胞系中的高温。在三管齐下的方法之后,我们进行了蛋白质组的定量分析,HLA级联植入植入族,以及HLA II类韧性化体。数据显示,通过从不变链源自夹肽的HLA II类呈递能力和特定释放增加,升高的温度可能已经为免疫样响应制备了这些细胞。有趣的是,在高温下,观察到夹子曲目组成的突出变化,富集含有超出夹芯区域的C末端延伸的肽。总的来说,这些在该B细胞系中说明了有趣的温度敏感调整。

      图形概要

      关键词

      介绍

      人的白细胞抗原(HLA)I类和II类分子是将小肽配体(8-至12-聚体和13-至18-×18-13-18mer)从内源或外源蛋白质呈现给免疫系统的跨膜蛋白。因此,他们在自适应免疫防御中发挥着至关重要的作用
      • Chaplin D.D.
      免疫应答概述。
      。这些肽还反映了呈递细胞的健康状况。通常,当触发免疫系统时,可以通过免疫系统容忍“自我”肽的呈现,而呈现“非自我”肽的细胞,例如病毒,细菌或突变的肽,则会破坏。这可以防止病毒和/或细菌感染的进一步繁殖,并停止癌症开始。由于未能消除这种患病细胞可能导致严重后果,因此完全了解HLA I类和HLA II类肽配体加工和呈现至关重要。
      鉴于其在个性化抗癌治疗中的潜在治疗作用,越来越多地研究HLA肽加工和呈现
      • Rammensee H.G.
      • Singh-Jasuja H.
      HLA Cigandome肿瘤抗原发现,用于个性化疫苗方法。
      • 纽约A.
      • 等等。
      结肠直肠癌有机体的免疫肽术揭示了稀疏的HLA级别新尼太植物景观,没有干扰素或MEK抑制剂治疗没有增加新抗原。
      • Bassani-Sternberg M.
      • 等等。
      通过质谱法直接鉴定在天然人黑色素瘤组织上呈现的临床相关的新脑膜。
      • Demmers L.C.
      • 等等。
      单细胞衍生的肿瘤有机体在HLA类肽呈现中显示多样性。
      。虽然HLA类I和HLA二级演示途径之间存在相似之处,但也存在区分这些途径的关键差异。 HLA A类肽配体呈现给CD8 + T细胞,主要来自内源性的,从细胞内蛋白质降解或缺陷的核糖体产物产生的肽
      • Michalek M.T.
      • 授予E.P.
      • 克拉姆
      • Goldberg A.L.
      • 岩石K.L.
      在MHC级I限制抗原呈现中泛素依赖性蛋白水解途径的作用。
      ,
      • Bourdetsky D.
      • Schmelzer C.E.
      • Admon A.
      核糖体产品缺陷对HLA肽的贡献性质和程度。
      。然后可以通过ER膜中的抗原肽转运蛋白1和/或2在内质网(ER)中旋转到内质网(ER)中的一些
      • Michalek M.T.
      • 授予E.P.
      • 克拉姆
      • Goldberg A.L.
      • 岩石K.L.
      在MHC级I限制抗原呈现中泛素依赖性蛋白水解途径的作用。
      ,
      • 重新获得E.
      • 等等。
      通过MHC A类I.抗原呈递前核和细胞质隔室中的肽扩散,保护和降解。
      。在ER中,空HLA I类分子上的肽负载通过含有木薯,Calreticulin和ERP57的复合物进行
      • Cresswell P.
      • 伯娅
      • 迪克T.
      • Diedrich G.
      MHC类I肽加载复合物的性质。
      ,还有更高的亲和肽不断竞争下亲和力。在加载高亲和力肽时,HLA类I分子上的聚糖触发从ER朝向GOLGI装置释放,然后在血浆膜随后呈现其肽
      • Moremen K.W.
      • Tiemeyer M.
      • Nairn A.v.
      脊椎动物糖基化:多样性,合成和功能。
      。最近,据报道了Tapbpr的Tapasin模拟。虽然这些蛋白质是类似物的,但TapBPR不与肽负载复合物相关,不必在ER中存在并且与Tapasin相互排斥,因此在肽负载中起替代作用。
      • 赫尔曼C.
      • Trowsdale J.
      • 博伊尔L.H.
      TapBPR:MHC I类的新播放器I呈现途径。
      。这种途径最近发现突出显示的事实,尽管过去的调查有激烈的调查,但仍然有更多的是发现HLA肽加工和呈现。
      HLA类II呈现途径本质上不同。 HLA II类肽配体呈现给CD4 + T细胞,主要从外源蛋白质和内源蛋白质中取样通过内体途径的自噬产生
      • 苏里阿。
      • Lovitch S.B.
      • unanue e.r.
      与II类MHC分子结合的肽的宽多样性和复杂性。
      。 HLA II类复合物在ER中组装,其中,代替高亲和力抗原肽的结合,该一部分CD74(不变链)结合到肽结合槽中并将分子靶向内体途径
      • neefjes J.
      • Jongsma M.L.
      • 保罗
      • Bakke O.
      迈向MHC I类和MHC II级抗原呈现的系统理解。
      ,
      • Cresswell P.
      不变链结构和MHC II类功能。
      。 HLA II类分子与MIIC隔室中的抗原肽接触
      • neefjes j.c.i.i.v.
      MHC II类装载的MIIC和其他隔室。
      ,不变链通过肉豆蔻(LGMN),组织蛋白酶S,组织蛋白酶L和组织蛋白酶F顺序地切割,留下称为夹子的较小肽片段。该HLA II类结合的夹肽可以在伴侣HLA-DM和HLA DO的帮助下进行更高亲和抗原肽。
      • unanue e.r.
      • 土耳其人V.
      • neefjes J.
      MHC II类抗原加工和健康与疾病呈现的变异。
      ,
      • Ghosh P.
      • Amaya M.
      • Mellins E.
      • Wiley D.C.
      II类MHC成熟中中间体的结构:与HLA-DR3结合的夹子。
      。加载后,HLA II级配合物通过稳定插入的凹形转运将与肽配体的HLA二级配合物通过凹形转运输送到质膜
      • Wubbolts R.
      • 等等。
      将MHC类II分子的直接晶体传输从溶酶体结构到细胞表面。
      • 博伊斯米
      • 等等。
      树突状细胞的T细胞接合迅速重新排列MHC II类运输。
      • Kleijmeer M.
      • 等等。
      重组多产体调节树突细胞的MHC类II抗原呈递。
      .
      虽然这些HLA类和II类机制已经在正常的稳态条件下进行了很长时间,但仍然很少讨论特定的细胞应激条件如何改变这些途径,同样或独特。因此,我们通过三天暴露于高温对JY B细胞的热应激,监测HLA处理和呈现如何受到影响。生理学上,这将是一种发烧状态
      • Pritchard M.T.
      • 等等。
      模拟发烧热成分的协议:临床前和临床经验。
      ,没有实际的入侵病原体。由此,我们发现,单独的热诱导的细胞应激似乎重新塑造B细胞蛋白质组并使B细胞用于免疫应答,从而特别调节HLA II类呈递中的最终步骤,以及刺激特异性CD74的释放夹肽。

      材料和方法

       细胞培养

      B淋巴细胞型细胞系JY(HLA-A * 02:01,HLA-B * 07:02,HLA-C * 07:02,HLA-DPA1 * 01:03,HLA-DPB1 * 02:01/04: 02,HLA-DQA1 * 01:03/03:01,HLA-DQB1 * 03:02/06:03,HLA-DRA * 01,HLA-DRB1 * 04:04/13:01,HLA-DRB4 * 04, HLA-DRB5 * 02)在RPMI 1640培养基(+谷氨酰胺,Gibco,美国)中培养,其补充有10%胎牛血清,50 u / ml青霉素和50μg/ ml链霉素,在37℃下,5%CO2。收获前三天,细胞在37℃或40℃下分裂并在潮湿的培养箱中生长,5%CO2.

       蛋白质组学

      JY细胞在补充有1倍完全EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche诊断,瑞士),50μg/ ml dNase i(Sigma-Aldrich,美国)和50μg/ ml rnase a(Sigma- aldrich)。通过以18000离心清除裂解物1小时g 在15ºC。用Bradford测定(Bio-rad,美国)测定蛋白质浓度。对于每个样品,用Lys-C(1:100)和胰蛋白酶(1:75)依次减少50μg全细胞裂解物,烷基化和消化。将消化的肽酸化至0.1%甲酸,并通过Seppak C18柱(Supelco,United)纯化。用80%甲腈在0.1%甲酸中进行肽洗脱。将样品通过真空离心干燥并在LC-MS / MS分析之前在2%甲酸中重构。每个样品,通过LC-MS / MS测量三种技术复制。

       HLA I类和HLA Class II Ligandomics

      每个条件,5x10
      • 重新获得E.
      • 等等。
      通过MHC A类I.抗原呈递前核和细胞质隔室中的肽扩散,保护和降解。
      通过离心收获细胞,并用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤三次,该盐水(PBS)在各自的生长温度下温育。在4℃下,在4℃下,在4℃下,在10ml裂解缓冲液中造成沉淀的细胞在温和的端到端旋转。裂解缓冲液由Pierce IP裂解缓冲液(Thermo Fischer Scientific,美国)组成,补充有1x完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche诊断),50μg/ ml dNase i(Sigma-Aldrich)和50μg/ ml RNasea(Sigma-Aldrich) 。然后通过以18000离心清除裂解物1小时g 在4ºC。用BCA测定法(Pierce,美国)测定上清液的蛋白质浓度。
      如前所述进行HLA I类免疫亲和力纯化
      • Demmers L.C.
      • heck a.j.r.
      • 吴W.
      预分馏延伸,但也在可检测的HLA类IOTA Ligandome中产生偏差。
      。简而言之,使用0.5mg W6 / 32抗体纯化HLA A类复合物。
      • Barnstable C.J.
      • 等等。
      生产单克隆抗体,对红细胞,HLA和其他人细胞表面抗原 - 新工具进行遗传分析。
      加上125μl蛋白A / G珠(美国圣克鲁斯)。为了防止共洗,抗体与蛋白A / g珠子交联。对于HLA II类复合物的检索,我们使用了HLA-DR特异性抗体(B8-11-2,Bioceros / Polpharma生物学,荷兰),并使用HLA类进行下拉,我耗尽裂解物作为输入。对于免疫亲和力纯化,孵育在4℃下进行约16小时。在免疫亲和力纯化后,用40ml冷PBS洗涤珠子。 HLA类I和HLA II类复合物和肽配体用10%乙酸洗脱。使用10KDA分子量截止过滤器(Millipore,United States)用于HLA A类和30KDA分子量截止过滤器(Millipore)的HLA分子分子分离肽配体。将含有HLA I类或HLA II类肽配体的流动冷冻干燥,以0.1%的甲酸重构,通过C18阶段提示(Thermo Fischer Scientific)进一步清除,并从C18阶段尖端洗脱80%乙腈,0.1%甲酸。将样品通过真空离心并在LC / MS-MS分析之前在2%甲酸中进行干燥。每个样品,通过LC-MS / MS测量三种技术复制。将10KDA和30KDA含有HLA I类和HLA II类蛋白质的滞留物在8M尿素中重新悬浮,保留凝胶分析。

       蛋白质组LC-MS / MS分析

      使用耦合到Q-辐射HFX质谱仪(Thermo Fischer Scientific)的UHPLC 1290系统(Agilent)获取数据。在分析柱(Agilent Poroshell,EC-C18,2.7μm,50cm x75μm上分离之前,将肽(Maisch Reprosil C18,2cm,2cm,2cm×100μm)在溶剂A(0.1%甲酸中)中捕获(0.1%甲酸)中的5分钟(0.1%甲酸)(0.1%甲酸) )。溶剂B由0.1%甲酸中的80%乙腈组成。梯度如下:5min捕获,然后从10%至36%溶剂B捕获,随后,随后,用100%溶剂B和10min与100%溶剂A进行洗涤的10min。在数据中操作的质谱仪依赖模式。来自M / Z 375-1600的全扫描MS光谱以60,000的分辨率获得3×10的目标值
      • Michalek M.T.
      • 授予E.P.
      • 克拉姆
      • Goldberg A.L.
      • 岩石K.L.
      在MHC级I限制抗原呈现中泛素依赖性蛋白水解途径的作用。
      或者最大喷射时间为20ms。 MS / MS光谱以15,000的分辨率获得。选择具有2至5的充电状态的前15个最强烈的前体用于碎片化。 HCD碎片在27%的正常化碰撞能量上在选定的前体上进行,在累积到1x10后,在1.4m / z隔离窗口下有16s动态排除。
      • Michalek M.T.
      • 授予E.P.
      • 克拉姆
      • Goldberg A.L.
      • 岩石K.L.
      在MHC级I限制抗原呈现中泛素依赖性蛋白水解途径的作用。
      离子或最大喷射时间为50ms。

       Ligandome LC-MS / MS分析

      使用耦合到侧桥融合Lumos Tribriat质谱仪(Thermo Fischer Scientific)的UHPLC 1290系统(Agilent)获取数据。在分析柱上分离之前在溶剂A(0.1%甲酸中,Maisch ReprosilC18,3μm,2cm×100μm)捕获(Maisch Reprosil C18,3μm,2cm×100μm)5分钟(Agilent Poroshell,EC-C18,2.7μm, 50厘米×75μm)。溶剂B由0.1%甲酸中的80%乙腈组成。梯度如下:首先捕获5分钟,然后从7%〜35%溶剂B的梯度B.随后用100%溶剂B和10min再平衡用100%溶剂A洗涤的10min。在数据中操作的质谱仪 - 依存模式。从M / Z 400-650(HLA等级I)或M / Z 300-1500(HLA Class II)的全扫描MS光谱以60,000的分量在累积为4x10后获得60,000
      • Demmers L.C.
      • 等等。
      单细胞衍生的肿瘤有机体在HLA类肽呈现中显示多样性。
      或者最大喷射时间为50ms(HLA I类)或250ms(HLA Class II)。以15,000的分辨率获得串联质谱(MS / MS)光谱。选择在M / Z 100(HLA IS类I)或充电状态2至5(HLA II类)开始为2或3的充电状态的三种最强烈的前体进行碎片化。用于肽鉴定ethcd碎片
      • 蒙茂G.P.
      • 等等。
      使用电子转移/更高能量碰撞解离(ethCD)膨胀可检测的HLA肽曲目。
      在累积5×10的累积后,在选定的前体上以35%的正常排列(HLA等级I)或60s动态排除(HLA Class II)进行了35%的正常碰撞能量。
      • Bassani-Sternberg M.
      • 等等。
      通过质谱法直接鉴定在天然人黑色素瘤组织上呈现的临床相关的新脑膜。
      离子或250ms(HLA I类)或1500ms(HLA II类)的最大喷射时间。

       蛋白质组数据分析

      使用MaxQuant版本1.6.10.0以及针对人类UNIPROT数据库(2019年12月下载的20431条目,2019年12月下载的20431条目)搜索原始文件。将酶特异性设定为胰蛋白酶,允许最多2个错过的切割。半胱氨酸氨基甲酰化被设定为固定改性。将甲硫氨酸氧化和N-末端乙酰化被设定为可变改性。前体质量耐受设定为20ppm。片段离子耐受设定为4.5ppm。蛋白质和肽量化的假发现率(FDR)限制为1%。为了定量比较,无标签量化(基于唯一+剃须刀肽),以“运行之间的匹配相匹配”。对于HLA蛋白质定量,无标记量化仅基于独特的肽。使用Perseus 1.6.7.0执行数据归一化和统计信息。基因本体学(GO)分析是用数据库进行注释,可视化和集成发现版6.8(David
      • 黄达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。数据以GraphPad Prism 8.0可视化。

       Cigandome数据分析

      使用蛋蛋白质组发现者的续集HT来搜索原始文件,与瑞士人人类数据库(2018年2月下载的20258条参赛作品)编辑了JY特异性HLA蛋白和20个最丰富的FBS污染物
      • 郑X.
      • 等等。
      胎儿牛血清不同大量批量生料的蛋白质组学分析作为细胞培养物的原料。第四部分。蛋白质组学在生物药物制造中的应用。
      。将搜索设定为未特异性的797DA的最小前体质量,以最大前体质量为1950DA(HLA类I)或350DA的最小前体质量为5000DA(HLA II类)的最大前体质量,具有10ppm的质量耐受性。片段离子耐受设定为0.02DA。使用渗滤器算法,5%肽FDR和XCorr将所鉴定的肽过滤。用1%FDR过滤。 >1.将半胱氨酸半胱氨酸纤维质化和甲硫氨酸氧化设定为可变改性。从所鉴定的肽,除去FBS污染物。使用NetMHCPAN-4.0预测HLA类I肽配体的结合亲和力
      • Jurtz V.
      • 等等。
      NetMHCPAN-4.0:改进的肽-MHC Is相互作用预测整合洗脱的配体和肽结合亲和力数据。
      在等级的粘合剂截止值2.用Netmhciipan-4.0预测HLA II类配体的结合亲和力
      • Reynisson B.
      • 等等。
      通过质谱和基序的分折叠的MHC II抗原呈现改进了MHC II抗原呈现的预测。
      带有粘合剂的截止<1000nm。使用MSA R包进行对齐。数据以GraphPad Prism 8.0可视化。

       实验设计与统计理由

      对于每个蛋白质组和HLA肽生物样品,测量了三种技术复制。将这些样品从单独的注射孔中注射以防止蒸发并从而浓缩样品。蛋白质组LFQ强度由MaxQuant提取,并在Perseus中进行标志2。在至少一个条件下过滤蛋蛋白质组鉴定至少2个有效值。基于正常分布抵消了缺失的值。使用学生的T检验进行成对比较(双面调整的P值<0.05).

      结果

       JY HLA级别和II类Ligandomes的组成

      为了研究如何在细胞应激对细胞应激的变化时如何变化,JY细胞在37℃下生长,随后在37℃或40℃下分成两个并进一步生长在37℃或40℃下进行分析。从这些配对的材料中,我们依次从JY细胞系中依次纯化HLA类I和HLA II类复合物和肽配体,在37℃下生长。 JY细胞系是HLA-A * 02:01,HLA-B * 07:02,HLA-C * 07:02的纯合,这简化了HLA类I肽呈现的解释,并使其成为广泛使用的基准测试单元免疫肽素系中的线条
      • Demmers L.C.
      • heck a.j.r.
      • 吴W.
      预分馏延伸,但也在可检测的HLA类IOTA Ligandome中产生偏差。
      ,
      • zarling a.l.
      • 等等。
      通过体内主要的组织相容性综合I类分子天然加工并呈递磷酸化肽。
      • COBBOLD M.
      • 等等。
      MHC类I相关的磷酸肽是白血病中的记忆样免疫靶标。
      • 哈桑C.
      • 等等。
      人白细胞抗原呈现的B淋巴细胞的韧性化合物。
      • Tafuro S.
      • 等等。
      肽 - β2M融合分子HLA类I阴性癌细胞中抗原介绍的重构。
      • Bassani-Sternberg M.
      • Pletscher-Frankild S.
      • Jensen L.J.
      人白细胞抗原类I肽蛋白的质谱揭示了蛋白质丰度和抗原呈现的强烈影响。
      • 冲C.
      • 等等。
      高通量和敏感的免疫肽素平台揭示了人白细胞抗原(HLA)Ligandome的深刻干扰型介导的重塑。
      • 彼得森J.
      • 等等。
      磷酸化的自肽改变人白细胞抗原等级I限制抗原呈递并产生肿瘤特异性表位。
      。在HLA II类方面,JY细胞具有等位基因HLA-DPA1 * 01:03,HLA-DPB1 * 02:01/04:02,HLA-DQA1 * 01:03/03:01,HLA-DQB1 * 03: 02/06:03,HLA-DRA * 01,HLA-DRB1 * 04:04/13:01,HLA-DRB4 * 04和HLA-DRB5 * 02,通过通过下一代测序通过HLA键入验证。通过Coomassie染色,我们在各分子量的SDS-PAGE上验证了HLA类I和HLA II类蛋白的特定免疫亲和蛋白(图1一种)。这给了我们信心,即来自相同裂解物的HLA类I和II类复合物的顺序纯化是可行的,可检测产率。
      图缩略图GR1.
      图1HLA I类和II类肽配体特征。一种) Coomassie染色的免疫沉淀HLA I类和HLA II类蛋白质。 HLA I类和HLA II类带分别在41kda和30kda下可见。 b) 鉴定的HLA类I肽配体总数。第一个条形图显示总数,另一个条形为每个HLA类型的分布。 C) 鉴定的HLA类II肽配体的总数及其在不同HLA类型上分布。 d) HLA I类(灰色)和HLA类II(黑色)肽配体长度分布。 e) 基于丰富的前10个源蛋白,有助于HLA类I和HLA II类肽韧带。
      从HLA Class I净化,我们确定了>10,000个独特的肽配体(10380±24, 图1b),超过三种技术复制。在此,预测93%的肽与HLA-A * 02:01,HLA-B * 07:02或HLA-C * 07:02结合。较少数量的HLA-C粘合剂可能导致HLA-C的较低蛋白质拷贝数相对于另一类I HLAS
      • Apps R.
      • 等等。
      HLA类I蛋白在正常和艾滋病毒感染细胞中的相对表达水平。
      ,
      • kaur g。
      • 等等。
      结构和调节多样性形状HLA-C蛋白表达水平。
      。与HLA类肽配体的大鉴定相比,仅约2100 HLA II类肽(2173±10, 图1c)被确定。预计该识别号较低的鉴定次数,仍然具有81%的高特异性,并且与JY细胞上的HLA II类的较低表达水平一致。在这里,我们仅预测了对HLA-DR等位基因的结合亲和力,因为我们用DR特异性抗体进行了HLA II类免疫亲和纯化,与HLA类I纯化不同,其中PAN-HLA I类抗体(W6 / 32)是用过的。 HLA-A / B / C和HLA-DRB1的组合肽数超过100%,因为等位基因的结合基序可以是相似的。以这种方式,可以将肽分配给多个等位基因。正如预期的那样,HLA II类肽配体的含量在15个残基的模式中也基本上较长,而HLA级别I的9个残基相比(图1d)。
      有趣的是,从前十个源蛋白中取样的HLA类II肽在每种测量中产生的近70%近70%,这表明这十个源蛋白的片段在没有致病性肽的情况下大致支配HLA II类肽Ligandome。在这些是CD74中,夹子肽的不变链前体蛋白,已知是结合和辅助HLA II类分子的折叠的夹肽。源自I类HLA蛋白的肽也是HLA II类Cigandome介绍的最佳贡献者。这可能是由于HLA II类呈现期间血浆膜HLA I类分子的强制性逆行再循环
      • 格罗姆米
      • 等等。
      再循环MHC I类分子和内体肽载荷。
      ,
      • Montealegre S.
      • van endert下午
      非职业抗原呈递和树突细胞中MHC I类分子的内吞再循环。
      。在引人注目的交叉比较中,前十个源蛋白仅促使约10%的HLA类肽配体(图1e)反映了HLA类I和II类肽介绍的采样空间的基本差异。

       CD74肽聚类是HLA II级曲目中最具取样的自我蛋白质

      鉴于HLA II类分子上CD74肽的高占用(〜20%, 图1e),我们检查所有这些CD74肽的序列特征和强度更紧密。 CD74是296个氨基酸蛋白,其在HLA II类肽负载中起关键作用。在HLA II类肽负载的早期步骤期间,CD74的剪辑区域( 图2A)被插入HLA II类结合槽中以稳定复合物并防止其他肽的非特异性结合,直到分子达到了预期肽货物的内体隔室,其中拾取了预期的肽货物
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      不变链结构和MHC II类功能。
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      展示自己!通过MHC I类和MHC II类分子。
      。具有可容纳N-末端和C末端肽突起的开放HLA类II肽槽
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      • 等等。
      人类II类MHC蛋白HLA-DR1的晶体结构与流感病毒肽复合。
      ,据报道,HLA类II绑定槽含有四个锚定位置(P1,P4,P6和P9),其中M107,A110,P112和来自夹芯区域的M115应该被绑定
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      主要组织相容性复合物II的结合到不变链衍生的肽,夹子,由II类的等位基因多态性调节。
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      图缩略图GR2.
      图2夹子是肽的曲目。一种) CD74蛋白的域示意图,注释内化,跨膜和夹子区域。 b)将鉴定的夹肽簇与它们对相应的结合亲和力(nm)对准HLA-DRB1 * 04:04和HLA-DRB1 * 13:01。C) 所有鉴定的夹肽的饼图,其中含有强度的强度作为源自37℃的CD74夹区域的CD74夹区域的总强度的一部分。
      在我们的JY HLA II类肽Ligandome中,检测来自CD74夹区的32种不同的肽(图2b)。通过将这些肽对准CD74夹序列,我们注意到在检测到的所有夹肽中,只有M115(四个记录的锚定位)在所有夹肽中都是完全保守的,而几乎几乎一半的肽(32个)不包括M107 。这确实肯定了什么是经典描述的 '夹肽'不是单一序列,而是一组不同的序列。此外,几乎所有来自核心区域的CD74精选延伸的肽;用N-末端延伸检测17个肽,而15是C末端延伸的。通过Netmhciipan预测,我们进一步验证了检测到的所有这些32个肽可以与DRB1 * 04:04/13:01结合,并且这些肽中的每一个可以结合JY细胞系的两个DRB1等位基因中的至少一种, 和<1000nm亲和力。尽管阶梯序列阶梯,但这32个夹肽的强度分布远非均匀。例如,LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM肽在强度下贡献约50%,8个其他肽共同构成强度的38%(图2C, 补充表I.),建议除了序列变化之外,可以用作HLA II类沟槽占用的代理的强度也可能不同。总的来说,该数据在37℃下在正常生长条件下整合夹子肽曲目和比例。

       高温为HLA II类免疫应答的B细胞制备B细胞

      凭借广泛的HLA I类和II级肽肽肽鉴定JY细胞系,夹肽曲目的休息特性完全记录,我们接下来挑战模型系统,在40℃下进行三天的热处理,模拟延长的发热反应虽然在没有真正的入侵病原体的情况下。然后,我们与HLA I类和II类肽一起分析了总蛋白质组,用于沿抗原呈递途径的温度诱导的变化和对韧带族的后果。如果没有抗抗原的装载和干扰竞争,我们旨在更好地关注抗原呈现的内在反应和适应。
      如火山图(图3.一种, 补充表二)总结3478蛋白的变化,该蛋白质中的3478蛋白在3个技术重复中至少2中量化,相对较少的蛋白质受到剧烈折叠变化的调节,表明蛋白质组变化并不普遍,但可能在对高温进行的JY细胞中非常具体。实际上,在涉及调节T细胞增殖和激活的功能过程中,确实富集了超过2倍的蛋白质(177上调; 103调节的),以及干扰素-γ介导的信号传导与感染期间B细胞的生物学功能一致
      • 莱昂B.
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      • 米拉拉斯。
      • Wojciechowski W.
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      感染期间B细胞的解开效应功能:除抗体产生之外的隐藏世界。
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      调节B细胞的案例。
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      B细胞的免疫调节功能。
      (图3.公元前)。在上调的蛋白质中,还检测了许多细胞表面局部分化(CD)蛋白,指示B细胞功能活化的蛋白质(图4.A-B)。 CD20和CD22的存在已与B细胞活化和分化有关
      • TedderT.f.
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      B细胞表面分子B1与B细胞活化和分化在一起。
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      由CD20在膜筏中介导的存储操作阳离子进入。
      ,
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      CD22:先天和自适应B细胞应答和自身免疫调节器。
      虽然CD86,CD48,CD70,CD47和CD166是功能B细胞的标志物,其可以从事T细胞共模
      • Lanier L.L.
      • 等等。
      CD80(B7)和CD86(B70)为T细胞增殖,细胞因子生产和CTL的产生提供了类似的共刺激信号。
      ,
      • Elishmereni M.
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      CD48:免疫的共刺激受体。
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      • 等等。
      通过CD70调节B细胞激活和IgG生产的信号传导。
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      CD47:一种细胞表面糖蛋白,其调节健康和疾病中造血细胞的多种功能。
      ,
      • Hassan N.J.
      • 巴克莱A.N.
      • 棕色m.h.
      前线:最佳T细胞激活需要CD6和CD166的接合。
      。 CD59是针对膜攻击复合物(补体系统)的主要保护蛋白,确保只有侵入病原体裂解
      • Farkas I.
      • 等等。
      CD59不仅将C9的插入到MAC中,而是通过同源C5B-8以及C5B-9抑制离子通道形成。
      免疫球蛋白生产需要CD40
      • Elgueta R.
      • 等等。
      免疫系统CD40 / CD40L接合的分子机制及功能。
      。在对上调蛋白质进行的基因本体学富集(图3.b),HLA II类抗原介绍的生物过程中发现了最显着的富集(图3.公元前)。这确实肯定了热处理和模型系统研究温度诱导的抗原呈现变化的相关性。
      图缩略图GR3.
      图3.蛋白质组改变在40℃下。一种) 在40ºC下的所有改变蛋白质(n = 3478)的火山曲线 相对 37ºC。所有蛋白质>10倍的增加以红色和a表示>蓝色10倍下降。 b) 用全蛋白质作为背景,40℃下所有上调蛋白的基因本体研究生物过程分析。 C) 使用全蛋白质作为背景,40℃下所有下调蛋白的基因本体研究生物过程分析。
      图缩略图GR4.
      图4.B细胞制备在40℃。一种) 蛋白质折叠变化(折叠变化2),40ºC 相对 37ºC细胞表面分化(CD)蛋白质。 b) 功能类别的上调CD蛋白。
      详细检查HLA II类抗原加工和呈现途径的具体变化显示,只有HLA II类分子的丰度似乎显着变化(>2倍)在热处理中,沿HLA II类抗原呈途途径在其他地方观察到没有显着变化( 图5.一种)。在CD74蛋白水平(1.6倍)中的温和升高也可能另外具有相关性,需要粘合到途中的HLA II类蛋白质的更多副本。总的来说,这证明了通过高温诱导的JY细胞的适应,可能发生在HLA II类呈现的最终步骤中,但不恰到较早的侵袭和破坏外源病原体(例如LGMN,IFI30,CTS,CTS, 图5.一种)。
      图缩略图GR5.
      图5.HLA Class II和HLA类I抗原处理和介绍在40ºC。一种) HLA类II加工和呈现途径的示意图。注释是在该过程中涉及的重要蛋白质,它们在升高的温度下进行它们经历的相应,大量,折叠变化(40ºC 相对 37ºC). b) HLA I类处理和呈现途径的示意图。注释是在该过程中涉及的重要蛋白质,其相应,可忽略的折叠变化,它们在升高的温度下进行(40ºC 相对 37ºC).
      相反,HLA类途径似乎在升高的温度下最小化(图5.b),在处理和演示水平。虽然检测到ER转运蛋白BCAP31的边缘增加,但BCAP31的ER转运蛋白功能不具体仅针对载荷的HLA I类复合物的出口,而且涉及许多其他膜蛋白的一般出口。因此,该蛋白质组的蛋白质组比较提供了清楚的证据表明HLA类I和II类路径的调节明显独立地控制,使得可以单独触发任何系统。此外,HLA II类蛋白质和CD74的特异性上调似乎是在高温后的初步步骤,这可能会导致促进HLA II类呈现,当病原体确实存在于系统中时。
      为了进一步评估高温的这种调整,在所呈现的HLA肽的水平下,我们重叠在37℃和40℃下鉴定的I类或II类肽配体物种(图6.A-B)。由于温度适应性不涉及HLA类I蛋白的表达增加,因此逻辑呈现出呈现的HLA类肽配体的总数没有显着变化(9589±71肽配体),并且大的肽物种重叠为91%被观测到。另一方面,HLA II类肽配体种类总共增加了17%(2547±12肽配体)。考虑到每种HLA类II蛋白的丰度增加超过100%(图5.a),HLA肽种类的增加似乎很低。这意味着在40℃下,更多HLA II类蛋白质被似乎相同的肽配体加载。这也很明显 图6.C,其中含有肽的前10个源蛋白与HLA I类和II类呈现的蛋白质仍然与37ºC的正常增长的情况相同(图1F)。具体而言,EIF4G和TME9(适用于I类)和FCER2(II类) 图6.c不是37ºC的前10个源蛋白之一(图1e),但仍然仍然在前40个主要来源蛋白质中为HLA I类和II类装载提供肽。总的来说,这些数据引导我们得出结论,在40℃下,进行更多HLA II类蛋白质,但HLA II类肽Ligandome曲目与更多蛋白质的膨胀抽样不会急剧变化。
      图缩略图GR6.
      图6.HLA I类和II类肽配体特性为40ºC,相比37℃。一种) 鉴定的HLA类I肽配体重叠在37℃和40ºC之间。 b) 鉴定的HLA II类肽配体的重叠在37℃和40℃之间。 C) HLA I类和HLA II类肽肽的前10个源蛋白,40℃。

       C末端延长夹芯肽在40℃下持久化

      如前所述,在37℃培养的细胞的HLA II类肽中可以检测34种不同的梯形夹肽(图2b),使CD74成为JY细胞中最重叠的自我蛋白质之一。有趣的,高温诱导在CD74中取样的偏移,两者都在单独的夹子肽强度,以及夹子曲目的组成。如图所示 图7.A,HLA II类分子上的夹子的总占率从暴露于高温时从20%降至10%。在37ºC的剪辑曲目中,LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM(51%)中最丰富的物种仍然是40ºC最丰富的,但其对剪辑曲目的总贡献减少到28%(图7.b)。此外,接下来的六个最丰富的剪辑变体贡献了剪辑群集​​的60%的强度。因此,40ºC的剪辑曲目更加平衡,并且由多个同样丰富的变种组成(图7.b)而不是AT 37℃优势LPKPKPKPVSKMRMATPLLMQALPM肽(图2C)。定量地,当细胞暴露于高温时,HLA II类蛋白也差异地呈现N-末端和C末端延伸夹肽(图7.C-E)。总的来说,这些数据概述了HLA类II相关夹肽曲目的定性和定量变化,当JY细胞暴露于高温时。
      图缩略图GR7.
      图7.HLA结合夹肽曲目中的温度诱导变化。一种) CD74夹肽在37℃和40℃下将CD74夹肽与HLA II类Ligandome的贡献。 b) 所有鉴定的夹肽在40℃下的饼图,其中贡献强度为所有CD74肽的总强度的级分。 C) 40ºC的夹子强度变化为37ºC。 d)37ºC的N末端和C末端夹强度的百分比。 e) 在37ºC下N末端和C末端夹强度的百分比。
      一起服用HLA II类蛋白质的上调(图5.a)随着总夹占占用率的减少似乎表明了额外的引发机制,以制备来自外源病原体的肽。只有升高的温度就足以引发这些变化是有趣的。另一方面,朝向C末端延伸的特殊倾斜似乎暗示夹子肽修剪可能受到温度的影响。

      讨论

      在这项研究中,我们返回了HLA肽介绍的一些基础知识,以扩大我们对此进程基本规则的理解。通过从相同的JY细胞中分析蛋白质组和HLA类I和II类肽韧带,我们可以通过同一生物系统中的I类和II类机制直接比较和对比抗原呈现。这使得超过10,000级级和2100多级肽配体纯化并从同一批次材料中纯化并鉴定出来(图1)。虽然静止的HLA级等IA1Andome由来自许多更多细胞内蛋白质的多种肽片段组成,但HLA II类Ligandome由源自十几种不同源蛋白的肽配体支配,有助于〜70%至全MS强度。同时与上一份报告
      • Chicz r.m.
      • 等等。
      与HLA-DR等位基因结合的天然加工肽之间的特异性和滥交。
      ,我们还观察到,在HLA II类分子上源自膜蛋白和HLA I类蛋白以及CD74的主要肽,从而反映了HLA II类呈现特异性的独特生化加工和负载路径。
      在没有入侵病原体的情况下,CD74的肽片段占据休息JY细胞的HLA II类韧带。虽然夹子肽的贡献估计是之前的报告中的〜60%
      • Sette A.
      • 斯多林S.
      • 米勒J.
      • Appella E.
      主要组织相容性复合物II的结合到不变链衍生的肽,夹子,由II类的等位基因多态性调节。
      ,
      • Riberde J.M.
      • Newcomb J.R.
      • surman m.j.
      • Barbosa J.A.
      • Cresswell P.
      来自抗原加工突变体细胞系的HLA-D分子与不变的链肽有关。
      ,我们发现这一比例更为温和,我们的实验率约为20%。我们认为这种差异主要是由于缺乏仪器敏感性,因此其他低强度II类配体无法检测到,导致夹肽贡献的偏斜定量估计。实际上,随着MS检测灵敏度显着增加,我们现在还发现了一种较大的夹肽,其特征在于梯形阶梯,特别是除夹核序列之外还与N末端和C末端延伸件相同(图2)。这是支持剪辑是一组以二亮氨酸图案为中心的不同序列的概念
      • neefjes J.
      • Jongsma M.L.
      • 保罗
      • Bakke O.
      迈向MHC I类和MHC II级抗原呈现的系统理解。
      ,
      • Cresswell P.
      • 罗氏P.A.
      不变链-MHC II类复合体:总是奇数,永不不变。
      。尽管夹子经典被认为是通过四个残基的HLA II类的开放肽槽锚定,但我们发现这四个中的M107在从我们的模型系统中检测到的夹子肽的一半中可以分配。相反,二亮氨酸序列在32个夹肽中的31个中保守,表明该区域对于结合HLA II类分子可能是更关键的,并且这四个额外的锚定位可以仅发挥子公司作用协助加载夹肽曲目。然后,这些额外的锚位点的重要性也可以根据HLA II类等位基因和特定肽负载槽而变化。实际上,为了支持我们的模型,偶尔报道了夹子肽滑动和翻转对接
      • Gunther S.
      • 等等。
      不变链肽对MHC II类分子的双向结合。
      .
      通过在培养物中使用无病原体和人工诱导的高温处理,我们模仿了三天的发热状态
      • Pritchard M.T.
      • 等等。
      模拟发烧热成分的协议:临床前和临床经验。
      探测B细胞中HLA类I和II类抗原呈现系统的变化。这种实验设置可能看起来很简单,但是很多据思考,专注于鉴定蛋白质组和抗原水平的宿主适应。即使在没有真正入侵的外源病原体的情况下,我们也观察到我们的模型系统在三天内适用于B细胞激活,以及各种B细胞特定功能( 图3., 图4.),暗示单独的温度可以触发细胞并将它们部分准备通过HLA II类蛋白的上调来解决感染。此外,没有真正的侵犯外源性病原体使我们观察到夹子肽与HLA II类蛋白结合的自发性丧失,而不是通过源自致病蛋白的肽竞争HLA II类分子的肽。在病原体攻击系统中,不可辨别这种夹子肽结合的这种自发性丧失。因此,我们认为,概念上,这是我们在这里显示的免疫系统中的一个非常有趣的观察和生理上有趣的适应,以至于我们在这里表现出高度特异性的HLA II级呈现。
      更具兴趣,我们还观察到,夹子肽曲目在HLA II类蛋白上含有升高温度的组合物(图7.b)。在我们看来,由于II类肽加工途径的全局变化,这不太可能,因为其他HLA II类肽配体的大量比例保持不变(图6.b),HLA类II肽加工蛋白在很大程度上仍未调节(图5.a)和前10个源蛋白也没有大幅改变(图6.C)。事实上,在这些前10个蛋白质中,CD74中,夹子肽曲目的前体是在较高温度下唯一可显着减少的蛋白质(图7.一种)。通过对齐这些证据,似乎高温显然增加了HLA II类蛋白的表达(图5.a),并改变HLA II类分子上特定夹肽的占用。这也是一致的,夹子在保护肽负载槽免受成熟抗原载荷之前的关键作用是一致的,然后在HLA II类蛋白到达内剂体之前
      • neefjes J.
      • Jongsma M.L.
      • 保罗
      • Bakke O.
      迈向MHC I类和MHC II级抗原呈现的系统理解。
      ,
      • Cresswell P.
      • 罗氏P.A.
      不变链-MHC II类复合体:总是奇数,永不不变。
      。因此,在高温下释放夹肽可以确实是向呈递外源病原体的肽的准备步骤。此外,不仅是HLA II类蛋白质上的夹肽的集体占用率在40℃下减半(从〜20%至〜10%),夹子曲目内的夹子变体的分布也被改变,有利于肽与C. - 超出夹核的延伸延伸(图7.d)。具体地,在高温处理期间,C末端延伸夹肽的比例从39%增加到61%。这可能进一步提示HLA II类肽修剪的温度诱导的变化,这可能是在未来探索的有趣。
      为了进一步检查剪辑曲目对其他HLA II类性韧带的连贯性,我们还分析了来自三级HLA II类数据集的三种配体(PXD004894
      • Bassani-Sternberg M.
      • 等等。
      通过质谱法直接鉴定在天然人黑色素瘤组织上呈现的临床相关的新脑膜。
      ; PXD020011
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      活化后免疫细胞中HLA配体呈递的生物发生揭示了肽长度偏好的变化。
      ; PXD012308
      • 纱楼J.
      • 等等。
      免疫酸体深图案解卷积的HLA类II表位的鲁棒预测。
      )。 PXD004894含有21种不同黑素瘤细胞系的HLA II类韧带。 PXD020011含有来自三种不同供体的未成熟和成熟的树突细胞韧带,以及配对的CD19 + B细胞和CD4 +和CD8 + T细胞。 PXD012308含有来自7种不同B细胞(也是JY),一种T细胞系和15种不同脑膜瘤细胞系的HLA类联接数据。在记录夹子肽的所有情况下,它们始于N-末端延伸的CD74肽,同时我们观察到这些夹子物种在正常温度条件下占据主导地位。
      虽然仍然略有效果与HLA级别的Ligandomes工作相比,但近年来也相当于少数大量质谱的HLA II类肽谱分析研究
      • Wendorff M.
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      从蛋白质组中取样到人白细胞抗原-DR(HLA-DR)Ligandome通过高特异性进行。
      。鉴于强烈的疾病相关性,这种日益增长的兴趣可能会联系起来。尽管如此,HLA II类抗原介绍的基本规则仍然不如HLA A类的仍然不那么清晰。发烧状态是伴随感染的最常见的生理反应之一,这可能伴随着剪辑曲目的偏好变化,我们在这里展示。然而,目前的研究仅限于种植的单一常用的B细胞系 体外。此外,HLA-DO和HLA-DM蛋白也低于JY细胞系检测,这排除了进一步研究该细胞系系统中夹肽交换的机制和效率。如果这些温度适应在更多细胞系中,将建立未来的工作,并研究加载有C末端夹的HLA-II蛋白仍然插入细胞表面,但我们在此处的方法需要大量的细胞输入材料可能与组织级分析不兼容。更基本上,识别剪辑呈现的转变机制是有趣的,因为这些信息可以使特定提升到外来抗原的呈递,以加强宿主免疫系统的触发。这可能导致这种疾病导致病原体的自然清除更快,而不会对正常HLA I类和II类肽Ligandome的干扰过多。

      数据可用性

      通过骄傲沉积了质谱蛋白质组学和肽素数据。通过骄傲沉积在蛋白质十六种联盟中
      • VizCaino J.A.
      • 等等。
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      与数据集标识符PXD022930或DOI的合作伙伴存储库:10.6019 / PXD022930。将描述用于样本映射的原始文件 补充表III.

      利益冲突

      所有作者宣布没有利益冲突

      致谢

      我们希望通过地平线2020计划获取对本研究的支持,通过地平线2020项目ePIC-XS(项目823839)和NWO通过国家路线图进行了大型基础设施计划X-OMICS的国家路线图(项目184.034.019)嵌入在荷兰蛋白质组学中心。 L.C.D.和a.j.r.h. NWO引力计划化学免疫学研究所进一步支持(ICI00003)。我们承认Stefan Stevanovi博士(德国德国劳工大学),用于提供Pan-HLA抗体W6 / 32。

      Sappendix A. 补充数据

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