TMEM67,TMEM237和乳酸乳酸MCT1中的复合物中的注册素是光感受器外部段膜的独特组分

开放访问发布:2021年4月29日DOI://doi.org/10.1016/j.mcpro.2021.100088

      强调

      • 鉴定了光感受器外部分段膜的独特蛋白质组
      • TMEM67,TMEM237和注册素是该膜的新颖独特组件
      • 该膜中的注册蛋白与单羧酸盐转运蛋白MCT1有关
      • 感光体外部部分可能促进乳酸输送

      抽象的

      脊椎动物光感受器的外部段(OS)细胞器是一种高度专业化的纤毛
      进化以捕获光并启动光线响应。包围外部段的血浆膜在支持光感受器函数和健康方面起着重要和多样化的作用。然而,关于其蛋白质成分的身份知之甚少,因为这种膜不能纯化为均匀性。在这项研究中,我们使用蛋白质相关性分析技术来鉴定独特的OS血浆膜蛋白。为了实现这一点,我们使用无标记的定量质谱法将富集的OS质膜的富集制剂中的相对蛋白质丰度与总外分段膜的制备进行比较。我们发现只有五种蛋白质在与以前验证的OS血浆膜标记中相同的水平。这些蛋白质中的两个尚未分配给该膜,并且尚未在感光体中识别出该膜和一个副蛋白的蛋白质,TMEM67和TMEM237。我们进一步表明,在OS质膜中与单羧酸转运蛋白MCT1的注册蛋白缔合物,促进通过该细胞室的乳酸转运。

      图形概要

      缩写:

      OS. (外部), 罗斯 (棒外部), rpe. (视网膜颜料上皮细胞), MCT. (单羧酸盐运输车)

      介绍

      脊椎动物光感受器池的外部段(OS)是负责捕获光并启动最终传输到大脑的电光信号的蠕动细胞器。 OS由一堆盘形膜或“盘”组成,该膜或“盘”,其封装在质膜内。虽然负责视觉信号的光捕获和传播的蛋白质主要位于圆盘中,因此血浆膜母膜蛋白质负责产生电响应的光(Rev。(
      • arshavsky v.y.
      • 烧伤M.E.
      光感受器信号传导:支持各种光强度的视觉。
      )))。尽管与围绕感光电池的其余部分的血浆膜呈现,但OS质膜的蛋白质组成由于靶向蛋白质递送和蛋白质保留在OS基础上的扩散屏障施加的组合(Rev。 (
      • 珍珠J.N.
      • Salinas R.Y.
      • 贝克S.A.
      • arshavsky v.y.
      蛋白质分类,靶向和贩运光感受器细胞。
      ,
      • Goldberg A.F.
      • 莫里茨o.l.
      • 威廉姆斯D.S.
      感光体外部段架构的分子基础。
      ,
      • Baehr W.
      • Hanke-Gogokhia C.
      • 谢里夫A.
      • 芦苇m.
      • Dahl T.
      • 弗雷德里克·赫姆。
      • 等等。
      动物模型揭示的感光体纤氯素洞察。
      ,
      • WENSELT.G.
      • 张Z.
      • Anastassov I.A.
      • Gilliam J.C.
      • Schmid M.F.
      • 等等。
      杆光感受器形态发生和疾病的结构和分子碱基。
      )))。
      超出其在调节离子电流方面的作用,OS等离子体膜有几种额外的功能。支持连续操作系统更新至关重要,这将OS基础的恒定产生的新感光盘与OS尖端在OS尖端的吞噬症(RPE)相结合,并通过OS尖端(RPE)(
      • 年轻的R.W.
      感应电池外部段的更新。
      ,
      • Lakkaraju A.
      • Umapathy A.
      • Tan L.X.
      • Daniele L.
      • philp n.j.
      • Boesze-Battaglia K.
      • 等等。
      视网膜色素上皮的细胞生物学。
      )。 OS等离子体膜也可能通过与盘,细胞外基质和相邻细胞的复杂相互作用来稳定OS架构(
      • Goldberg A.F.
      • 莫里茨o.l.
      • 威廉姆斯D.S.
      感光体外部段架构的分子基础。
      ,
      • 诗人A.
      • MORTAY L.L.
      • Meteray R.S.
      CGMP门控通道和相关的谷氨酸富苯蛋白在杆光感受器椎间盘膜的边缘区域的外周-2相互作用。
      )。认为这些重要的方法是由对OS质膜特异的蛋白质介导的蛋白质,然而,我们对其身份的了解仍然不完整。因此,阐明该膜的蛋白质组成将使我们更好地了解其各种功能。
      本研究的目标是表征OS质膜的独特蛋白质组分。实现这一目标的主要挑战是,使用标准化生化技术,几乎不可能获得纯度纯度的纯度高度高的纯度高。这是因为该膜包括总OS膜材料的一小部分,并且不能完全与其他膜分离。因此,我们使用称为“蛋白质相关性分析”的策略,这是一种强大的质谱方法,用于分析可以分级但不能纯化为均匀性的多蛋白质复合物或细胞器(
      • 安德森J.S.
      • Wilkinson C.J.
      • 市长T.
      • Mortensen P.
      • nigg e.a.
      蛋白质相关性分析蛋白质组学表征人中子组。
      ,
      • 福斯特L.J.
      • de hoog c.l.
      • 张Y.
      • 谢X.
      • Mootha V.K.
      通过蛋白质相关性分析的哺乳动物细胞器地图。
      ,
      • 威斯特S.
      • Gronemeyer T.
      • Ofman R.
      • Kunze M.
      • grou c.p.
      • Almeida J.A.
      • 等等。
      串联质谱与蛋白质相关性分析蛋白质组学表征小鼠肾过氧血清。
      ,
      • Reidel B.
      • 汤普森J.W.
      • 佛罗里达州
      • Moseley M.A.
      • skiba n.p.
      • arshavsky v.y.
      层状组织的蛋白质组学分析显示出光感受器细胞的独特糖酵解专用。
      )。在这种方法中,从粗制剂中富集膜制剂,并使用无标记的定量蛋白质组学来定量粗料和富集膜中存在的蛋白质的相对丰度。将得到的值与已知在感兴趣的膜中唯一地存在于唯一的蛋白质标志物的相对丰度。虽然预期膜的所有独特成分的丰度预期与标记物保持恒定的摩尔比,但由于膜纯度增加,预期污染和/或非独特蛋白的相对丰度将降低。
      为了进行OS血浆膜的蛋白质相关性,我们从总杆OS膜的制备和这些制剂的蛋白质组合物进行免疫富集该膜。我们发现,在两种膜制剂中自信地鉴定的〜800蛋白中,只有五个富含五个程度,如三种良好的OS质膜标记 - NA +/ ca.2+/ K. + Exchanger NCKX1和CGMP门控通道的两个亚基,CNGα1和CNGβ1(
      • 煮n.j.
      • MORTAY L.L.
      • 里德D.
      • Kaupp U.B.
      • Meteray R.S.
      牛杆光感受器的CGMP门控通道仅在质膜中局部地定位。
      ,
      • 里德下午
      • Friedel U.
      • Meteray R.S.
      • 煮n.j.
      钠钙交换剂作为牛棒外段的主要蓖麻素结合糖蛋白及其对质膜的定位。
      ,
      • Korschen H.G.
      • illing m.
      • Seifert R.
      • Sesti F.
      • 威廉姆斯A.
      • gotzes s.
      • 等等。
      240kDa蛋白代表来自杆光感受器的环状核苷酸门控通道的完整β亚基。
      )。这五种蛋白质中的两种 - 促进蛋白-1和Protocadherin-21 - 已先前表征为OS质膜组分(
      • 杨Z.
      • 陈Y.
      • LILLO C.
      • Chien J.
      • yu z.
      • Michaelides M.
      • 等等。
      在黄斑变性患者中发现的突变促蛋白酶1破坏了小鼠中的感光盘形态发生。
      ,
      • 汉诗。
      • 安德森D.W.
      • 造纸欲D.S.
      PROMININ-1定位于外部段LAVIS棒和锥形光感受器的外部分段薄片的开放边缘。
      ,
      • Zacchigna S.
      • 哦,
      • Wilsch-Brauninger M.
      • Missol-Kolka E.
      • Jaszai J.
      • 詹森斯。
      • 等等。
      胆固醇结合蛋白质促进蛋白-1 / CD133的丧失导致盘瘤病发生和光感受器变性。
      ,
      • rattner a。
      • 小木下午
      • 威廉姆斯J.
      • Cooke C.
      • Savchenko A.
      • Lyubarsky A.
      • 等等。
      感光体特异性的钙粘蛋白对于外部段的结构完整性和感光体存活至关重要。
      ),而另外三个TMEM67,TMEM237和宫内蛋白 - 之前尚未分配给该膜。我们通过免疫荧光验证了每种蛋白质的OS血浆膜定位。最后,我们展示了宫内蛋白,一种尚未在光感受器细胞中鉴定的蛋白质,与乳酸转运蛋白MCT1相关联,可能是用于控制OS质膜的MCT1含量,因此,通过外部段的乳糖的通量。

      实验步骤

       抗体

      预先描述并用于获得牛NCKX1上的细胞外结构域内的表位的PME 2D9单克隆抗体,并用于获得富集的OS血浆膜(
      • 金T.S.
      • 里德下午
      • Meteray R.S.
      杆光感受器中NA / CA-K交换器的结构功能关系与定位。
      ,
      • 郭米克。
      • Holopainen J.M.
      • MORTAY L.L.
      • 福斯特L.J.
      • Meteray R.S.
      光感受器外部段的蛋白质组学识别蛇形和RAB蛋白的子集,涉及膜囊泡运输和融合。
      )。使用来自Thermo Sciencific蛋白质生物学的定制抗体生产服务产生针对C末端TMEM67肽GQKNLATKTLVDERFLI的兔多克隆抗体。使用已建立的单克隆抗体技术制备小鼠单克隆抗体3C4对腔内的。通过蛋白质印迹验证每个新产生的抗体的特异性,如图所示 图S1。兔Clabbin237的兔多克隆抗体被C.下午博士提供。工艺并在(
      • Zuniga F.I.
      • 施工C.M.
      解入鼠标视网膜中Als2Cr4的结构和功能。
      )。对MCT1的兔多克隆抗体描述于(
      • philp n.j.
      • 王D.
      • yoon h.
      • Hjelmeland L.M.
      单羧酸转运蛋白在人视网膜色素上皮和ARPE-19细胞中的偏振表达。
      )。对R9AP的兔多克隆抗体描述于(
      • Keresztes G.
      • mutai h.
      • Hibino H.
      • Hudspeth A.J.
      • 地狱家。
      鸡和小鼠中RGS9-1锚定蛋白R9AP的表达模式表明神经系统中的多种作用。
      )。抗CMYC单克隆抗体9E10来自Thermof Shorcific。小鼠单克隆抗体PMC1D1AGAINSTCNGα1描述于(
      • 煮n.j.
      • MORTAY L.L.
      • 里德D.
      • Kaupp U.B.
      • Meteray R.S.
      牛杆光感受器的CGMP门控通道仅在质膜中局部地定位。
      )。

       抗体交联与蛋白A / g磁珠

      300-400μL刺穿蛋白A / g磁珠(Thermo Sciencific,#88802)与PBS平衡,并与750μl5mm双(磺基琥珀酰亚胺)的Suberate(BS3,Thermo Scientific,#21580)温育20分钟温度。将BS3除去,将珠子在22℃下孵育40分钟,用200μg的PME 2D9抗体(或用作对照的抗myc单克隆抗体)溶解在750μlPBS中。用100mM Tris-HCl pH8.0淬灭交联反应,然后用PBS平衡珠子。为了表征交联PME 2D9抗体的能力,将5μg的PME 2D9-珠(或对照Myc-Beads)与100μg的ROS膜中溶解在含有0.5%十二烷基胺的PBS中的100μg的ROS膜温育。用相同的缓冲液洗涤珠子两次,用含有2%SDS和10%甘油的100mM Tris-HCl(pH6.8)洗脱结合的材料。通过使用PME 2D9抗体通过Western印迹分析洗脱的蛋白质。

       从牛视网膜中孤立ROS

      所有程序在4°C下在昏暗的红光下进行。首先,在修改的程序后纯化ROS(
      • McDowell J.H.
      制备杆外部分段膜,再生逆止蛋白酶,并确定罗多蛋白浓度。
      ),如(
      • skiba n.p.
      • 斯宾塞W.J.
      • Salinas R.Y.
      • 骗取e.c.
      • 汤普森J.W.
      • arshavsky v.y.
      独特感光盘组分的蛋白质组学鉴定揭示了PRCD的存在,蛋白质与视网膜变性有关。
      )。简而言之,100个冷冻牛视网膜(T.A.&W.L. Lawson Co.,Lincoln,Ne)被解冻,重新悬浮在200毫升缓冲液A(20 mm Hepes,100 mm Kcl,2 mm Mgcl2 和0.1毫米EDTA; pH 7.4)含有25%蔗糖。通过在1LERLENMEYER烧瓶中旋转并通过以3,700×g离心6分钟将外段与视网膜碎片分离出来的外部区段。用相等体积的缓冲液A稀释上清液,通过以6,300×g离心8分钟来沉淀ROS。将沉淀重新悬浮在含有20%蔗糖的缓冲液A中,施用在蔗糖的27/32%步长梯度上,并以83,000×g以83,000×g在SW-28转子中离心1小时。从27/32%的蔗糖相互作用收集ROS,并立即用于净化血浆膜。为了获得耗尽大多数可溶性蛋白质的ROS膜的制备,将RO在冰上的低渗缓冲液(10mM HEPES; pH 7.4)中孵育1小时并通过以100,000×g离心沉淀30分钟,收集膜并用低渗缓冲液再次。将所得制剂重新悬浮在缓冲液A中并储存在-20℃。

       OS.血浆膜富集

      如上所述进行光感受器血浆膜富集(
      • Meteray R.S.
      • MORTAY L.L.
      牛视网膜杆外部段盘蛋白质组成的差异和蓖麻葡聚糖密度扰动法分离的血浆膜。
      )随着以下修改。将10mg新鲜制备的结构完整的ROS与200μg的PME 2D9抗体与蛋白A / G磁性珠粒(Thermofer Serian)一起温育,在4mL 20mM Hepes(pH7.4)中,100mM KCl,2mM MgCl 2,在4°C下为0.1mm EDTA,温和摇摆。接下来,将珠子转移到含有10mM Tris-HCl(pH7.5)和2mM DTT的低渗缓冲液中,并孵育16-20小时以允许OS血浆从盘和其他膜中离解。用低渗缓冲液洗涤珠子三次,用200μl100mMTris-HCl(pH6.8),2%SDS和10%甘油洗脱结合的材料,并在-20℃下储存直至用于质谱分析。为了考虑与磁珠的非特异性蛋白质结合,我们用与单克隆抗Myc抗体9e10相关的A / G珠重复这些实验。

       样品制备和LC-MS / MS分析

      三种类型的蛋白质样品(低吞清洗的OS膜,通过PME 2D9抗体和蛋白质沉淀的蛋白质,在三种生物重复中并行加工。对于每个样品,5-20μg总蛋白质用于制备蛋白质组学分析的肽混合物。使用顺磁珠基方法用胰蛋白酶/内蛋白酶LysC混合物(Promega,V5072)裂解蛋白质(
      • 休斯C.S.
      • Foehr s.
      • 加菲尔德D.A.
      • Furlong E.E.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      采用顺磁珠技术的超敏感蛋白质组分析。
      )。将每种消化物溶于12μl1/ 2/97%(体积)的三氟乙酸/乙腈/水溶液中,将3μl注入5μm,180μm×20mm对称C18捕集柱(水)在水中在1%乙腈中在5μl/ min的水中3分钟。对于连续视网膜部分中的蛋白质分析,将每个截面溶于100μl2%SDS中,0.1M Tris-HCl pH 8.0,如上裂解蛋白质。接下来在55℃下以0.4μl/ min的流速超过90分钟的HSS T31.8μm,75μm×250mm柱(水)在0.4μl/ min的流速下进行分析分离。使用5-30%的流动相B梯度,其中A相是水中的0.1%甲酸和在乙腈中的相B 0.1%甲酸中。用LC分离的肽在1900V和275℃的毛细管温度下使用阳性电喷雾电离引入Q.辐射HF轨道标质谱仪(Thermo Fisher Scientific)。数据收集在数据相关的采集(DDA)模式下,具有120,000个分辨率(在M / Z 200)的MS1前体测量中。 MS1分析利用扫描从375-1600 m / z的扫描,目标AGC值为2.0e5离子,RF透镜设置为30%,最大喷射时间为50 ms。在数据采集期间启用了高级峰值检测和内部校准(EIC)。使用电荷状态滤波选择用于MS / MS的肽(
      • 珍珠J.N.
      • Salinas R.Y.
      • 贝克S.A.
      • arshavsky v.y.
      蛋白质分类,靶向和贩运光感受器细胞。
      ,
      • Goldberg A.F.
      • 莫里茨o.l.
      • 威廉姆斯D.S.
      感光体外部段架构的分子基础。
      ,
      • Baehr W.
      • Hanke-Gogokhia C.
      • 谢里夫A.
      • 芦苇m.
      • Dahl T.
      • 弗雷德里克·赫姆。
      • 等等。
      动物模型揭示的感光体纤氯素洞察。
      ,
      • WENSELT.G.
      • 张Z.
      • Anastassov I.A.
      • Gilliam J.C.
      • Schmid M.F.
      • 等等。
      杆光感受器形态发生和疾病的结构和分子碱基。
      ),单同质峰值检测和20秒的动态排阻时间,具有10ppm的质量耐受性。使用HCD进行MS / MS的碰撞能量为30±5%,使用快速扫描速率检测,AGC目标值为3.0e3离子,最大喷射时间为300 ms,以及用于所有可用的离子注射启用时间。

       蛋白质识别和量化

      对于无标记的相对蛋白质定量,原始质谱数据文件(.RAW)导入了蛋白质组学4.2软件(非线性动力学)的后代QI,用于副本运行每个准备和峰值区域计算的对齐。肽峰列表使用后部产生4.2产生。使用吉祥物3.5.1(矩阵科学)鉴定肽,用于搜索自定义IPI牛数据库(源自IPI牛数据库V3.73; 2011年9月),其中包含在多个ROS准备中自信地识别的1598个蛋白质。对于鼠标样本,我们使用了Uniprot 2019的审核鼠标数据库,其中包含17,008个主体。吉祥物搜索参数为:前体离子的10 ppm质量耐受性; 0.025DA用于片段离子容差;一个错过了胰蛋白酶的切割;固定改性是半胱氨酸的氨基甲酰化;可变改性是氧化甲硫氨酸。只有2种或更多种肽鉴定的蛋白质(吉祥物评分>15肽和肽>50对于对应于蛋白质FDR - 1.3%的蛋白质和使用反转诱饵数据库计算的肽FDR - 0.4%的蛋白质),包括在蛋白质相关性分析分析中。为了考虑用于单独的LC-MS / MS中的蛋白质材料的实验条件和蛋白质材料的变化,使用通过通过每次运行中所有峰的全部强度计算的自动后代算法计算的因子来校正每个鉴定的肽的集成峰面积。表示蛋白质量的值是基于所有鉴定的组分非矛盾肽的离子强度和(
      • Reidel B.
      • 汤普森J.W.
      • 佛罗里达州
      • Moseley M.A.
      • skiba n.p.
      • arshavsky v.y.
      层状组织的蛋白质组学分析显示出光感受器细胞的独特糖酵解专用。
      )。
      对于小鼠ROS中的绝对蛋白质定量,在胰蛋白酶消化之前用冷同位素标记的合成肽掺入样品。使用DDA工作流程通过LC-MS / MS分析肽混合物,如上述用于无标记的蛋白质定量。如上所述,使用吉祥物版本2.5.1鉴定肽2.5.1。包含标签: 13C(6)15N(2)对于赖氨酸和 13C(6)15N(4)精氨酸。使用对蛋白质组学的后IQ测量光和重肽的强度4.2。基于相应光和重肽的强度和已知的重肽量来计算蛋白质量。使用以下肽(来自JPT肽Technologies,GmbH):NPLGDDASatask,EAAAQQQESATTQK,用于罗地甙,VYGSSSPAVDR,IAIISQGR,ABCA4的ALSLLEENR; LLSSGSTFEQSIK,SATVPVSIWR,LFVNQDSSSK和TMEM67的FVAASYDIR; ftaptgvsqpvg,aegseppaaelk和dvalsvhr for tmem237;和sddsniennvpr,sliayvgdstvlk和gtfnihvpk用于纪念蛋白。

       实验设计与统计理由

      对于蛋白质相关性分析,我们将相对于在富含PME 2D9抗体的OS血浆膜的三种独立制剂中被自信地鉴定的相对量的蛋白质通过在表明膜制剂中的量之间的量计算比率,通过计算比较。通过三种膜标记 - NCKX1,CNGα1和CNGβ1的平均值归一化,所述比例载入相应的膜制剂中。在该分析中,预期标记物和所有其他独特的OS膜膜蛋白接受接近的比例。为了考虑与磁珠的非特异性蛋白质结合,我们对通过抗控制珠沉淀出沉淀的蛋白质的分析相同的分析-MYC 9E10抗体。从用实验样品与具有PME 2D9珠子的实验样品一起获得的所得值。只有在至少两个实验中鉴定和定量鉴定和定量的蛋白被用于进一步的蛋白质相关性分析。

       免疫沉淀和Western Blotting

      对于注册素免疫沉淀,将2.1mg牛ROS在400μl50mMHEPES(pH7.4)中,150mM NaCl,20mM的30分钟,在4℃下溶解150mM NaCl,20mM液。在贝克曼Optima TLA 110转子中以40,000rpm离心除去不溶物10分钟,将上清液加入100μl3c4缀合的琼脂糖珠中,在Millipore超薄MC HVPDVDF0.45μm墨盒中。将珠子在4℃下浇水,旋转1.5小时,用500μL相同的缓冲液洗涤十次。在20℃下在相同的缓冲液中用两个100μl的2%SDS的2%SDS洗脱结合的材料30分钟。对于质谱法,如上所述制备样品。对于蛋白质印迹,对蛋白质进行SDS-PAGE,用指示的抗体和相应的二抗探测,并在700nm或800nm通道中成像在奥德赛红外扫描仪(赋予赋予生物学)。

       免疫荧光显微镜

      所有小鼠实验都是根据Duke University Iacuc批准的动物使用和护理方案进行的。如上所述,在厚的琼脂糖嵌入部分中进行免疫荧光蛋白质检测
      • Lobanova E.S.
      • Herrmann R.
      • Finkelstein S.
      • Reidel B.
      • skiba n.p.
      • 邓维。
      • 等等。
      机械基础对锥体转霉素失败转换:为什么锥体永远不会被光蒙蔽。
      )。将麻醉的小鼠与15mL含有4%多聚甲醛的定位溶液在80mM管(pH6.8),5mM EGTA和2mM MgCl中,用15ml含有4%多聚甲醛的固定溶液灌注。2 (
      • Leyton-Puig D.
      • Kedziora 3.
      • Isogai T.
      • van den Broek B.
      • Jalink K.
      • Innocenti M.
      PFA固定使肌动蛋白细胞骨架和相关蛋白质的无伪影超分辨率成像。
      )。在固定后,在林格溶液中解剖眼睛上的眼睛。眼睛嵌入7%低熔融琼脂糖(A3038; Sigma-Aldrich)中,并由vibriaTome(vt1200s; leica)切成200μm厚的切片。将该部分在22℃下含有5%甜菜血清和0.5%Triton X-100的PBS中封闭40分钟。接下来,在4℃下用同一封闭缓冲液中的一抗孵育切片6小时。在封闭缓冲液中洗涤部分3次,然后加入与Alexa Fluor 488缀合的二次抗体以及与Alexa Fluor 647(W32466; Thermo Fisher Scientific)缀合的1μg/ ml WGA(H3569; Thermo Fisher Scientific )在同一个缓冲区中。将切片在22℃温育2小时,在PBS中洗涤3次,并安装在甘油中的载玻片上。对于MCT1染色,在视网膜分析之前未灌注或固定小鼠,将新鲜的振动部分封闭25分钟,在4℃下与初抗体孵育1小时,并在与上述相同的固定剂固定1小时。固定后,加入初级抗体另外6小时,并如上所述进行其余的方法。使用尼康NIS-Elements软件,用共聚焦显微镜(Eclipse 90i和A1 Concocal扫描仪;尼康)采用共聚焦显微镜(Eclipse 90i和A1 Concocal扫描仪;尼康)。使用ImageJ进行图像分析和处理。

       鼠标罗斯的孤立

      从含有130mM NaCl,3.6mM KCl,2.4mM MgCl的小鼠林林溶液中的红外照射下的眼罩中,从眼杯中解剖到八个深色调整P30 WT C57BL / 6J小鼠的视网膜。2,1.2 mm cacl2和10 mm Hepes(pH 7.4),调整为314 mOSM。将视黄菌溶液聚集成400μL冰冷的16%蔗糖在林纳溶液中,并以最大速度涡旋60s,以1.5ml Eppendorf管。然后将管以200×g离心30秒以沉积大视网膜碎片。将总共​​350μl上清液装载在1.8ml步长的梯度的顶部,在林纳溶液中的27%和32%蔗糖组成,并在摆动铲斗SW-55转子中以30,000rpm以30,000rpm离心30分钟(Beckman Coulter )在4°C时。从27/32%的蔗糖界面小心地收集罗斯,在林纳溶液中稀释至少四倍,并在TLA 100.3转子(Beckman Coulter)中以50,000rpm以50,000rpm离心30分钟。在低渗冲击前用林格氏溶液洗涤黑暗的调整小鼠ros颗粒一次用林格氏溶液洗涤,以去除如上所述的可溶性蛋白质。

       冷冻鼠标视网膜的串行切片切片

      如前所述基本上进行样品制剂(
      • Sokolov M.
      • Lyubarsky A.L.
      • strissel k.j.
      • savchenko a.b.
      • govardovskii v.i.
      • Pugh Jr.,E.N.
      • 等等。
      杆状细胞两个主要隔室之间的跨越式旋转旋转易转换:一种轻型的新机制。
      ,
      • Lobanova E.S.
      • Finkelstein S.
      • 宋H.
      • 曾思。
      • 陈C.K.
      • Sokolov M.
      • 等等。
      杆中的转琥酸易位是通过GTP酶活化复合物的饱和来触发的。
      )。使用邻近光盘定位的手术意图从新鲜获得的鼠标上过度切割视网膜冲头(2mm直径),通过朝上的光感受器层转移到PVDF膜上,平面安装在由塑料垫片(CA)分开的两个玻璃载玻片之间。 。240μm)和在液氮中冷冻液体,然后储存在-80℃。随后,视网膜表面与低温刀刀的切割平面对齐,并修剪视网膜的边缘。将渐进式10-μm切段收集到干冰上的单个管中,以100μl2%SDS,0.1M Tris-HCl(pH8.0)溶解并制备用于质谱分析。

      结果

       OS.等离子体膜的蛋白质相关性分析表明八种独特的组件

      为了鉴定OS血浆膜的独特蛋白质组,我们进行了两个膜制剂的蛋白质相关性分析:总OS膜和富集的OS质膜膜。如图所示获得每种准备 Fig. 1A.通过大量的牛棒外部段(ROS)制备总OS膜,其有效地除去可溶性和外周膜蛋白(
      • 史密斯Jr.,H.G.
      • 螺杆G.W.
      • Litman B.J.
      从视网膜杆外部段中隔离和纯化渗透压圆盘。
      )。使用方法从该制剂中富集,通过用与单克隆抗体PME 2D9与NCKX1缀合的磁珠孵育新鲜获得的牛RO来富含感光盘的方法来富含该制剂。
      • Meteray R.S.
      • MORTAY L.L.
      牛视网膜杆外部段盘蛋白质组成的差异和蓖麻葡聚糖密度扰动法分离的血浆膜。
      ),一种特异性地居住在该膜中的蛋白质(
      • 金T.S.
      • 里德下午
      • Meteray R.S.
      杆光感受器中NA / CA-K交换器的结构功能关系与定位。
      )。该方法导致从盘中的血浆膜的显着分离,如富集的NCKX1和另一个OS质膜标记,CNGα1的富集所证明的Fig. 1B;也可以看看 (
      • Meteray R.S.
      • MORTAY L.L.
      牛视网膜杆外部段盘蛋白质组成的差异和蓖麻葡聚糖密度扰动法分离的血浆膜。
      ))和滤光片特异性蛋白质R9ap的耗尽(Fig. 1b)。
      图缩略图GR1.
      图1蛋白质膜膜富集蛋白质相关性分析。 (一种) 获得膜制剂的工作流程蛋白质相关性分析。通过对完整的牛ROS的低渗洗涤,通过用PME 2D9抗体孵育牛RO,然后对蛋白A / G磁珠进行膜来制备OS质膜来获得总OS膜。 (b) 用抗NCKX1,抗CNGα1和抗R9AP抗体探测总OS膜的蛋白质膜和OS膜膜制剂(20μg)槲皮素。数据取自3个类似实验中的一个。
      为了进行蛋白质相关性分析,溶解总OS膜和富集OS质膜的制剂,用胰蛋白酶消化并进行无标记的定量LC-MS / MS分析。为了考虑与用于OS血浆膜富集的抗体缀合珠的非特异性蛋白质结合,我们使用与抗myc单克隆抗体缀合的对照珠粒,并排除了从分析中与对照珠子结合的蛋白质(参见材料和方法)。分析了三组独立获得的膜制剂,每种屈服于700-900蛋白,可以在粗制剂和富集的制剂中自信地鉴定和定量。
      为了比较两个膜制剂之间各鉴定的蛋白质的相对丰度,首先计算其成分肽的离子强度之和。对于每种制剂,我们计算OS质膜样品中蛋白质丰度与总OS膜样品之间的比率,作为蛋白质富集的量度。接下来,我们将每种蛋白质的富集的程度与三种良好的杆状睾丸质膜标记,Nckx1,CNGα1和CNGβ1进行了比较了每种蛋白质的富集。这是通过对NCKX1,CNGα1和CNGβ1的产生值进行平均来实现的,并将所有其他蛋白质的比率值标准化为此平均标记值。所得到的比率在排名中绘制 Fig. 2A(另见 补充表1)。在该计算中,标记物的平均比率等于1,因此屈服于1的比率的其他蛋白质可能是独特的OS质膜组分。具有较低比率的蛋白质代表该膜的非独特成分,或者更常见的是污染物。
      图缩略图GR2.
      图2OS.质膜的蛋白质相关性分析。 (一种) 代表性蛋白质相关性分析实验。标准化的富集比(OS血浆膜/总OS膜制剂)在膜制剂中鉴定的所有蛋白质的等级顺序中绘制。 (b) 65个顶部蛋白质的正常化富集比在等级序列中绘制的三个独立分析实验中平均。误差条表示标准差。八个蛋白质在ILLET中列出的等级顺序,以占所有实验的比率接近1。看 for mass spec data.
      表现出蛋白质相关性分析实验 Fig. 2在三个独立进行的实验中平均的65个蛋白质的A和数据显示在 Fig. 2B.显着性地,仅将五种蛋白质与OS血浆膜标记聚集。对于它们中的每一个,归一化比率从Unity的偏差不超过整个数据集计算的变化系数(21.2%)。这些蛋白质是促进蛋白-1,Protocadherin-21,TMEM67,TMEM237和副蛋白。其中,促促蛋白酶-1和Protocadherin-21具有相对良好的特征。它们彼此相互作用,并被认为参与新形成光感受器圆盘的形态发生(
      • Goldberg A.F.
      • 莫里茨o.l.
      • 威廉姆斯D.S.
      感光体外部段架构的分子基础。
      )。它们的分析与OS血浆膜标记表明,它们在圆盘成熟和/或新形成盘(其膜仍然与OS质膜依然邻接)的膜中螯合到该膜中的剖面,并且在我们的分级期间将用OS质膜共分离程序。另外两种蛋白质,TMEM67和TMEM237先前被描述为外部分段蛋白(
      • Zuniga F.I.
      • 施工C.M.
      解入鼠标视网膜中Als2Cr4的结构和功能。
      ,
      • Tiwari S.
      • 哈德森斯。
      • Gigtone 2nd,V.H.
      • 米勒C.
      • Chernoff E.A.
      • belecky-adams t.l.
      Meckelin 3对于大鼠麦克风综合征的感光体外部段开发是必要的。
      ),尽管它们的功能仍然未知,而先前未申报常规尚未在光感受器中表达。

       评估OS血浆膜富集

      蛋白质相关性分析的另一种效用是,它使我们可以定量评估从各种类型的污染膜分离的OS质膜分离的程度。例如,我们评估了OS膜与盘分离的程度。两种椎间盘特异性蛋白ABCA4和ROM1的归一化分析比为0.19和0.23,表明盘上的OS血浆膜的富集程度为4-5倍。另一方面,罗地脂,已知存在于OS等离子体膜和盘中(
      • Goldberg A.F.
      • 莫里茨o.l.
      • 威廉姆斯D.S.
      感光体外部段架构的分子基础。
      ),较高的谱比为0.48,与其到两种膜类型的定位一致。
      唯一意想不到的观察是盘特异性蛋白外周-2产生的分析比为0.53,类似于罗多蛋白酶的渐变,而不是在其他盘蛋白标记的范围内。对这种异常的最可能解释的是,外周-2与OS细胞质的CNGβ1相互作用(
      • 诗人A.
      • MORTAY L.L.
      • Meteray R.S.
      CGMP门控通道和相关的谷氨酸富苯蛋白在杆光感受器椎间盘膜的边缘区域的外周-2相互作用。
      ),这可能导致在其富集期间将含有外周-2的椎间盘碎片的共偏析。
      类似地,我们能够在代表内部区段和/或RPE微毛虫的污染上评估OS血浆膜富集程度。乳蛋白和Glut1的分析比,两种蛋白质在这些膜中每一个但不在OS中大量表达,分别为0.14和0.11。这表明来自OS血浆膜制剂的这些膜的〜8倍耗尽。

       TMEM67和TMEM237是独特的OS血浆膜蛋白

      在下一组实验中,我们验证了蛋白质相关性分析提出的TMEM67(也称为Meckelin)和TMEM237的OS血浆膜定位。他们认为这两个都显示为外部段(
      • Zuniga F.I.
      • 施工C.M.
      解入鼠标视网膜中Als2Cr4的结构和功能。
      ,
      • Tiwari S.
      • 哈德森斯。
      • Gigtone 2nd,V.H.
      • 米勒C.
      • Chernoff E.A.
      • belecky-adams t.l.
      Meckelin 3对于大鼠麦克风综合征的感光体外部段开发是必要的。
      )和与各种综合征患者有关。 TMEM67中的突变与两个教练相关联(
      • Doherty D.
      • 巴黎M.A.
      • 芬兰L.S.
      • Gunay-Aygun M.
      • Al-Mateen M.
      • 贝茨D.
      • 等等。
      3基因(MKS3,CC2D2A和RPGRIP1L)中的突变导致教练综合征(Joubert综合征,先天性肝纤维化)。
      )和Meckel Gruber(
      • 史密斯U.M.
      • 联席领域
      • TEE L.J.
      • 麦基下午
      • maina e.n.
      • Whelan S.
      • 等等。
      跨膜蛋白麦克白(MKS3)在Meckel-Gruber综合征和WPK大鼠中突变。
      )综合征,而TMEM237中的突变与Joubert综合征有关(
      • 黄兰
      • Szymanska K.
      • Jensen V.L.
      • Janecke A.R.
      • Innes上午
      • 戴维斯。
      • 等等。
      TMEM237.在具有Joubert综合征相关疾病的个体中突变,扩大了TMEM系列在睫毛过渡带的作用。
      )。 TMEM67在啮齿动物中的敲除或突变导致OS形态和严重视网膜变性的缺陷(
      • Tiwari S.
      • 哈德森斯。
      • Gigtone 2nd,V.H.
      • 米勒C.
      • Chernoff E.A.
      • belecky-adams t.l.
      Meckelin 3对于大鼠麦克风综合征的感光体外部段开发是必要的。
      ,
      • COLLIN G.B.
      • 赢了J.
      • 希克斯W.L.
      • 厨师s.a.
      • Nishina下午
      • Naggert J.K.
      Meckelin是光感受器肾移交和外部细分形态发生的必要条件。
      )。
      TMEM67的免疫荧光染色在小鼠视网膜纵向横截面中的TMEM237证实每种蛋白质专门为光感受器OS(Fig. 3a,b),与之前的报告一致。为了确认这些蛋白质被限制在OS血浆膜上,我们通过OS层切割的免疫切向视网膜部分(Fig. 3光盘)。每种蛋白质的染色模式出现为与OS质膜标记,小麦胚芽凝集素(WGA)共定的环。我们还注意到存在点状染色,大致遵循这些环的轮廓;我们怀疑该旁路是源自切向截面中组织保存的某些缺陷的文物。这些结果证实了我们从蛋白质相关性分析中的发现,并确定TMEM67和TMEM237的实际上是OS质膜的独特组分。
      图缩略图GR3.
      图3.TMEM67和TMEM237的免疫染色在WT小鼠视网膜横截面(A,B)和外部区段层(C,D)上的切向区段。 如图所示,TMEM67和TMEM237染色以绿色显示。 OS血浆膜标记WGA的染色在洋红色中示出。对于面板A和B的秤条为10μm,对于每个面板,为每个面板C和D为5μm,从至少3个实验中取出数据。
      虽然以前的研究表明,TMEM67和TMEM237的定位偏置到OS基础(
      • Zuniga F.I.
      • 施工C.M.
      解入鼠标视网膜中Als2Cr4的结构和功能。
      ,
      • Tiwari S.
      • 哈德森斯。
      • Gigtone 2nd,V.H.
      • 米勒C.
      • Chernoff E.A.
      • belecky-adams t.l.
      Meckelin 3对于大鼠麦克风综合征的感光体外部段开发是必要的。
      ),他们的免疫染色 Fig. 3A,B似乎甚至在整个操作系统中都相对较此。为了解决这种差异,我们使用定量质谱法分析了沿OS长度的每种蛋白质的分布。通过无冻结的平面的小鼠视网膜的光感受器层切割连续10μm厚切线部分,并使用无标记的定量蛋白质组学(Fig. 4; 补充表2.)。将各个蛋白质的分布与ABCA4的分布相比,已知在整个OS长度(
      • 太阳H.
      • Nathans J.
      STARGARDT的ABCR是视网膜杆外部段的盘膜。
      ,
      • MORTAY L.L.
      • Wahl D.
      • Sarunic M.v.
      • Meteray R.S.
      小鼠中P.ASN965SER(N965S)ABCA4变体的定位和功能表征显示出疾病性黄斑变性的致病机制。
      )。虽然TMEM237的分布非常类似于ABCA4的两个蛋白质在第一部分中最丰富的蛋白质,TMEM67在第3节中最丰富,表明朝向OS基础的转变可能被免于免疫染色。尽管如此,在源自外部区段层的每个截面中存在两种蛋白质。
      图缩略图GR4.
      图4.TMEM67,TMEM237和序列切线素的分布表示小鼠视网膜外部/内部区段层的串行切线部分。 通过无WT小鼠的冷冻平面视网膜的感光层和TMEM67,TMEM237,注册素和ABCA4的相对含量切割连续10μm厚切片,使用无标记的定量蛋白质组学来确定每个部分中的TMEM67,Nemigin和ABCA4。底部的动画片说明了光感受器细胞的部分和亚细胞间之间的近似对应。缩写:OS - 外部段; CC - 连接纤毛;是 - 内部段。看 for mass spec data.
      然后,使用具有寒冷同位素标记的肽标准的质谱法确定纯化的小鼠ROS中TMEM67和TMEM237的绝对量。因为习惯性以表达OS蛋白质为罗经蛋白酶的摩尔比,所以我们还量化了在相同制剂中的紫红素的含量。总而言之 表格1 (也可以看看 补充表3.),发现两种蛋白质分别在与〜1:3,900和1:3,100摩尔比的相对水平上表达,分别对TMEM67和TMEM237的rhodopsin表示。鉴于鼠标杆含有5°10之间7 and 7∙107 杂皮物分子(
      • Lyubarsky A.L.
      • daniele l.l.
      • Pugh Jr.,E.N.
      通过洛越蛋白漂白在鼠标眼中的坎德拉斯在鼠标眼中的光学筛选,以及小鼠ERG主要成分的浅追索依赖性。
      ,
      • 尼克尔S.
      • Park P.S.
      • Baumeister W.
      • Palczewski K.
      由冷冻电解层析成像确定的鼠杆外部段的三维架构。
      ),每根杆中的TMEM67分子的数量为~15,000,TMEM237分子的量为19,000。为了参考,我们类似地量化了ABCA4的杆含量,用作光盘标记 Fig. 4并且发现它以每根杆200,000分子的量表示,略低于半定量Western印迹的先前估计值(
      • 太阳H.
      • Nathans J.
      STARGARDT的ABCR是视网膜杆外部段的盘膜。
      )。
      表格1小鼠杆外部段中TMEM67,TMEM237和宫内蛋白的绝对定量。
      蛋白质罗地糖素的摩尔比每根杆的分子
      TMEM237.1:3,118±412~19,000
      TMEM671:3,922±109~15,000
      内部素蛋白1:6,238±1,168~10,000
      ABCA41:302±20~200,000
      数据是从三个独立实验的平均值,并呈现为平均值±SD。提供质量规格数据 补充表3..

      注册素是与单羧酸盐转运蛋白MCT1相关的独特的OS血浆膜蛋白

      纪念蛋白属于一个整体膜蛋白质,伴随的碱和神经糖苷,其主要功能是将单羧酸盐转运蛋白(MCT)引导到许多细胞类型的质膜和调节MCT函数一旦递送(
      • IACONO K.T.
      • 棕色A.L.
      • 格林米。
      • Saouraf S.J.
      CD147免疫球蛋白超家族受体功能和病理学作用。
      ,
      • Perez-Escuredo J.
      • van hee v.f.
      • Sboarina M.
      • 哎呀
      • 达金伏特。
      • Pellerin L.
      • 等等。
      单羧酸转运蛋白在脑和癌症中。
      )。然而,它以前尚未发现在光感受器中。视网膜横截面的免疫染色表明,宫内蛋白专门为光感受器外部段定位(Fig. 5a)通过在外部区段层上切割的切向部分的免疫染色来确认其对OS质膜的特定定位(Fig. 5b)。纪念蛋白似乎沿OS长度均匀免疫染色,其通过串行切线部分的定量质谱(Fig. 4; 补充表2.)。小鼠杆中的绝对数量的小鼠杆,估计如上所述,是每根杆10,000分子(表格1; 补充表3.)。
      图缩略图GR5.
      图5.WT小鼠视网膜中腔内腔内的免疫蛋白(A)和外部段层(B)的切向区段。 注册素染色以绿色和WGA染色显示在洋红色。对于面板a,尺度条是10μm,对于面板B,5μm。对于每个面板,数据从至少3个实验中取出。
      Emmigin是OS等离子体膜的独特组分的发现是我们分析分析的最原始结果。这激起我们进一步了解其在光感受器中的潜在作用。我们通过用抗副蛋白单克隆抗体3C4从溶解的ROS中免疫沉淀蛋白质来搜索了jemigin的互动伴侣。为了控制相互作用特异性,我们对免疫预抗体进行了平行的沉淀。我们发现只有五种蛋白质 - 宫内蛋白,单羧酸盐转运蛋白MCT1,视网膜瓜曲苷酸环化酶1,Nckx1和Prohibitin - 富集>3C4中的2折叠在对照沉淀物上沉淀(Fig. 6一种)。 jemigin后的第二种富含蛋白质是MCT1,其通过蛋白质印迹还记录了与jemigin的共沉淀(Fig. 6b)。使用多克隆抗MCT1抗体的相互共沉淀证实了其与腔内的相互作用,以及已知的菠菜蛋白在感光体内部区段中与MCT1相互作用(Fig. 7一种)。通过蛋白质印迹进一步证实抗MCT1抗体的副蛋白的沉淀(Fig. 7b)。
      图缩略图GR6.
      图6.单羧酸盐转运蛋白MCT1的共沉淀。 (一种) 富含蛋白质的蛋白质 >用预防抗体对照沉淀物在对照沉淀物上通过抗腔内抗体3C4免疫沉淀的溶解牛ROS蛋白的免疫沉淀物中的2倍。使用标记的质谱法测定沉淀物中蛋白质的相对量。数据显示为平均值±SD(n = 2)。 (b) MCT1使用抗注册素抗体3C4的副蛋白共析出,通过蛋白质印迹用3C4和抗MCT1抗体探测。用于对照沉淀实验的免疫预抗体。每条泳道加载20μg总蛋白质。数据取自两个类似的实验之一。
      图缩略图GR7.
      图7.Co-mct1副蛋白的沉淀。 (一种) 富含蛋白质的蛋白质 >用兔IgG通过对照沉淀物通过抗MCT1抗体免疫沉淀的溶解牛ROS蛋白的免疫沉淀物2倍。使用标记的质谱法测定沉淀物中蛋白质的相对量。数据显示为平均值±SD(n = 2)。 (b) 使用抗MCT1抗体与MCT1的注册蛋白共沉淀,通过蛋白质印迹与抗腔室抗体3C4探测。兔IgG用于对照降水实验。负载到每条泳道的蛋白质的量被标准化为输入材料的20%。数据从三个类似的实验中取出。
      与MCT1的注册蛋白相互作用与其他组织中的观察结果一致,其副蛋白总是与单羧酸盐转运蛋白(
      • halestap a.p.
      单羧酸转运蛋白系列 - 结构和功能性。
      ,
      • halestap a.p.
      • 威尔逊M.C.
      单羧酸盐转运蛋白家族 - 作用和调节。
      )。令人惊讶的是,MCT1先前已经显示为搭扣和光感受器内部的顶部膜,在两种情况下,在与碱(
      • peachey n.s.
      • 余米
      • 汉杰伊。
      • Lengacher S.
      • magistretti p.j.
      • Pellerin L.
      • 等等。
      MCT.1单速度在小鼠视网膜上的影响。
      ,
      • philp n.j.
      • Ochraietor J.D.
      • Rudoy C.
      • Muramatsu T.
      • linser p.j.
      在视网膜颜料上皮和5A11 / Basigin-Null鼠中的神经视网膜上的MCT1,MCT3和MCT4表达的丧失。
      ,
      • 汉杰伊。
      • Kinoshita J.
      • Bisetto S.
      • 贝尔B.A.
      • Nowak R.A.
      • peachey n.s.
      • 等等。
      单羧酸转运液在外视网膜中代谢稳态中的作用:从细胞特异性BSG缺失中获得的洞察力。
      ),但不是操作系统。因此,我们研究了一部分光感受器MCT1是否局限于OS。这在技术上是具有挑战性的,因为相邻的内部段和RPE都具有很高的MCT1表达。为了提高MCT1检测的敏感性,我们采用免疫染色程序,由此在组织固定之前与视网膜一起温育初生抗体。这种方法通常促进抗体染色,这可能是由于固定剂的化学改性的表位(
      • Stradleigh T.W.
      • Ishida A.T.
      视网膜免疫组织化学的固定策略。
      )。如图所示 Fig. 8A,该过程在WT小鼠视网膜的内部和外部段中产生强烈的MCT1免疫染色,彻底地从RPE脱离。
      图缩略图GR8.
      图8.MCT.1在WT小鼠视网膜横截面(A)和外部区段层(B)上的切向区的免疫染色。 MCT1染色以绿色和WGA染色显示在洋红色。对于面板a,尺度条是10μm,对于面板B,5μm。对于每个面板,数据从至少3个实验中取出。
      在蛋白质相关性分析中,证据了证据了蛋白质膜中MCT1的存在的独立证据。 MCT1的分析比为0.48,即通过从原料〜2倍耗尽。如果该MCT1仅来自内部区段和/或RPE的污染膜,那么OS质膜富集对MCT1耗竭的程度应与代表这些污染膜的蛋白质标记的蛋白质标志物相当。然而,如上所述,这些膜的实际耗竭组合为〜8倍。这种差异表明OS质膜制剂中存在的大多数MCT1不能源于污染物。这些数据表明,副蛋白和MCT1都是OS质膜的组分,其中它们彼此叠在复合物中。

      讨论

      在这项研究中,我们采用了蛋白质相关性分析的强大质谱技术,以鉴定光感受器OS质膜的独特组分。值得注意的是,该分析表明,只有八种蛋白质仅针对这种膜,考虑到这种膜在光感受器中扮演的不同功能,这是一个令人惊讶的低数量。这些蛋白质中的三种(NCKX1,CNGα1和CNGβ1)先前是在我们研究中用作标记蛋白的该膜的组分。已知另外两种(Prominin-1和Protocadherin-21)位于新形成盘的膨胀边缘内,其与OS质膜邻接。 TMEM67和TMEM237以前未被鉴定为该膜的组分,但被证明是将外部段定位的。最后,以前已知纪念蛋白根本没有在感光体中表达。
      除了这些独特的蛋白质之外,许多其他成型作为OS质膜可能的非独特组分。特别是,一组〜60蛋白显示在〜0.6至〜0.25之间的分析比率,表示椎间盘特异性标记的折叠率高的值。虽然其中一些可能是来自其他膜类型的污染物,但是其他可能代表蛋白质是非独特,但存在于OS质膜中的蛋白质,例如逆止蛋白蛋白。该候选蛋白质清单是未来研究的有价值的资源,尽管在任何结论中都可以在其在OS血浆膜中的存在之前需要独立验证。

       评估蛋白质检测极限

      一种自然的问题是OS血浆膜是否确实只有八种独特的组分或一些更少的蛋白质低于我们分析的敏感性限制。鉴于我们无法直接回答这个问题,我们可以评估我们的仪器的蛋白质检测的下限。 TMEM67,TMEM237和腔室的绝对定量表明它们的表达量为每根杆的约15,000,200,000和10,000分子。这些蛋白质的成分肽的总离子强度至少为1,000,000,远高于检测阈值。仍然自信地识别的50个最少丰富蛋白质的相应值从12,000到227,000左右,平均值为123,000。这表明我们的分析足够敏感,以检测每根杆至少1,000分子水平表达的蛋白质,并且可能较少的数量级。
      我们还考虑了先前报道的任何蛋白质是否未被鉴定为在我们的分析中鉴定出独特的OS膜组分。虽然描述这种蛋白质的文献非常有限,但我们确实预期发现一种蛋白质胰岛素生长因子1受体(IGF-1R),其已经提出主要是局部定位于OS质膜(
      • Dilly A.K.
      • Rajala R.v.
      胰岛素生长因子1受体/ pi3k / akt杆光感受器外部段膜中的存活途径。
      )。然而,尽管在所有三个实验中被自信地识别出这种蛋白质,但它是OS质膜制剂中最耗尽的(分析比<0.01)。该结果强烈表明IGF-1R不是OS血浆膜蛋白。

       光转凝蛋白的分析

      本研究的另一个发现是OS血浆膜的三种跨膜蛋白在光电扫描中的三种跨膜蛋白质中强烈耗尽:视网膜胍基环酶1 &2和R9AP。这些蛋白质的分析比在0.17和0.25之间变化,这与盘标记,ABCA4和ROM1的比例一致,但不是用于罗多蛋白酶,在盘和质膜之间共用的蛋白质。这表明至少涉及这些蛋白质(级联去激活和CGMP恢复)的光电传递事件主要在椎间盘膜上发生。这种结果很有趣,因为有关光电套路级联主要在盘或圆盘和等离子体膜上操作的有限信息。甚至建议将胍酸盐环化酶限制在质膜中或富含血浆膜(
      • 刘X.
      • 塞诺克
      • Nishizawa Y.
      • Hayashi F.
      • Yamazaki A.
      • Matsumoto H.
      • 等等。
      黄芪胍基环化酶的超微结构定位在人与猴子视网膜中。
      ),我们目前的数据与我们之前的蛋白质组学研究一起反驳,证明了光感受器特异性的胍基环酶同种型在盘中存在(
      • 郭米克。
      • Holopainen J.M.
      • MORTAY L.L.
      • 福斯特L.J.
      • Meteray R.S.
      光感受器外部段的蛋白质组学识别蛇形和RAB蛋白的子集,涉及膜囊泡运输和融合。
      ,
      • skiba n.p.
      • 斯宾塞W.J.
      • Salinas R.Y.
      • 骗取e.c.
      • 汤普森J.W.
      • arshavsky v.y.
      独特感光盘组分的蛋白质组学鉴定揭示了PRCD的存在,蛋白质与视网膜变性有关。
      )免疫透视研究,观察主要位于盘边的这些同种型(
      • Nemet I.
      • 田G.
      • imanishi Y.
      组织杆光感受器外部段膜上的CGMP传感结构。
      )。

       emmigin,MCT1和乳酸乳酸转运

      我们最初的观察结果是OS血浆膜含有与单羧酸盐转运蛋白MCT1相关的副蛋白。注册素属于一类细胞表面糖基化蛋白,其通过单个跨膜结构域锚定血浆膜,并具有两个或三个免疫球蛋白样域(在腔内蛋白)的大糖基化细胞外部分(
      • IACONO K.T.
      • 棕色A.L.
      • 格林米。
      • Saouraf S.J.
      CD147免疫球蛋白超家族受体功能和病理学作用。
      )。虽然注册蛋白通常与MCT2相关,但已经显示出与大鼠红细胞中的MCT1相互作用,其中将MCT1引导至血浆膜并调节其活性(
      • Poole r.c..
      • halestap a.p.
      红细胞乳酸转运蛋白(单羧酸盐转运蛋白1)与免疫球蛋白超家族的整体70-KDA膜糖蛋白相互作用。
      )。我们现在展示了在感光体OS质膜中与MCT1的jugigin与MCT1类似的关联。该结果是出乎意料的,因为之前的文献仅记录了与碱的复合物中的感光体内部段中的MCT1的存在,其中它将乳酸输送到感光体细胞中(
      • peachey n.s.
      • 余米
      • 汉杰伊。
      • Lengacher S.
      • magistretti p.j.
      • Pellerin L.
      • 等等。
      MCT.1单速度在小鼠视网膜上的影响。
      ,
      • philp n.j.
      • Ochraietor J.D.
      • Rudoy C.
      • Muramatsu T.
      • linser p.j.
      在视网膜颜料上皮和5A11 / Basigin-Null鼠中的神经视网膜上的MCT1,MCT3和MCT4表达的丧失。
      ,
      • 汉杰伊。
      • Kinoshita J.
      • Bisetto S.
      • 贝尔B.A.
      • Nowak R.A.
      • peachey n.s.
      • 等等。
      单羧酸转运液在外视网膜中代谢稳态中的作用:从细胞特异性BSG缺失中获得的洞察力。
      )。
      来自光感受器的乳酸乳酸乳酸乳酸乳酸盐对于视网膜代谢来说至关重要。光感受器主要依赖于有氧糖酵解用于产生ATP,这导致乳酸的产生,必须将光感受器出口到RPE和Müller细胞中进行进一步的能量处理(
      • Kanow M.A.
      • 吉亚加吉玛。
      • 詹坎德斯基C.S.
      • Tsantilas K.
      • Engel A.L.
      • 杜杰克
      • 等等。
      视网膜和视网膜色素上皮的生化适应支持脊椎动物的代谢生态系统。
      )。虽然先前建议,这种运输仅通过MCT1在与Basigin的复合物中通过内部段发生(
      • philp n.j.
      • Ochraietor J.D.
      • Rudoy C.
      • Muramatsu T.
      • linser p.j.
      在视网膜颜料上皮和5A11 / Basigin-Null鼠中的神经视网膜上的MCT1,MCT3和MCT4表达的丧失。
      ,
      • 汉杰伊。
      • Kinoshita J.
      • Bisetto S.
      • 贝尔B.A.
      • Nowak R.A.
      • peachey n.s.
      • 等等。
      单羧酸转运液在外视网膜中代谢稳态中的作用:从细胞特异性BSG缺失中获得的洞察力。
      ),我们的数据表明,MCT1也在OS血浆中在与腔内的复合物中表达。尽管该专业化的精确功能意义仍有待确定,但是一个有吸引力的假设是,使用两个特定的特定副衬盒用于MCT1输送到内部和外部段允许感光体在整个细胞中获得乳酸乳酸乳酸乳酸的最佳分布。
      总之,我们的研究突出了蛋白质相关性分析的力量,用于鉴定不能以足够纯度获得的细胞膜或细胞器的独特组分。我们展示了包围的质膜,该膜膜包围光感受器细胞的外部段细胞器仅含有八种独特的蛋白质,以超过每种细胞数百分子的水平表达。这些发现无疑将促进了解这些蛋白质在支持光感受器健康和/或视网膜的能量代谢方面发挥的功能作用的进展。

      数据可用性

      通过PRIDE [1]伙伴存储库与DataSet标识符PXD022864和10.6019 / PXD022864

      兴趣宣言

      提交人声明他们没有知道可能似乎影响本文报告的工作的竞争性的经济利益或个人关系。
      ☐作者宣布以下经济利益/个人关系,可能被视为潜在的竞争利益:

      信用作者贡献声明

      Nikolai P. Skiba.: 概念化,方法,正式分析,调查,数据策策,写作 - 原稿草案,写作 - 审查&编辑,监督,资助收购。 玛莎A. Cady.: 验证,正式分析,调查,写作 - 原始草案,写作 - 审查& editing. Laurie Mettay: 正式分析,调查,资源。 约翰y.s.汉: 调查。 Tylor R. Lewis.: 调查,写作 - 审查& editing. 威廉J. Spencer.: 调查,写作 - 审查& editing. J. Thompson会: 调查。 莎拉·哈尔斯: 调查。 南希J. Philp.: 概念化,写作 - 评论&编辑,资助收购。 罗伯特S. Mettay: 概念化,写作 - 评论&编辑,资助收购。 Vadim Y. Arshavsky.: 概念化,写作 - 评论&编辑,项目管理,资助收购。

      利益冲突

      作者宣称没有利益冲突。

      致谢

      NIH GRANTS EY027484(NPS),EY030451(VYA),EY002422(RSM),EY029929(TRL),EY029929(NJP),EY012042(NJP),EY012042(NJP),EY012042(NJP),EY029922(CIHR)Grant PJT 148649( RSM)通过研究来防止失明,对杜克大学不受限制的授予。

      附录A. 补充数据

      参考

        • arshavsky v.y.
        • 烧伤M.E.
        光感受器信号传导:支持各种光强度的视觉。
        J Biol Chem。 2012; 287: 1620-1626
        • 珍珠J.N.
        • Salinas R.Y.
        • 贝克S.A.
        • arshavsky v.y.
        蛋白质分类,靶向和贩运光感受器细胞。
        PROG RETIN EYE RES。 2013; 36: 24-51
        • Goldberg A.F.
        • 莫里茨o.l.
        • 威廉姆斯D.S.
        感光体外部段架构的分子基础。
        PROG RETIN EYE RES。 2016; 55: 52-81
        • Baehr W.
        • Hanke-Gogokhia C.
        • 谢里夫A.
        • 芦苇m.
        • Dahl T.
        • 弗雷德里克·赫姆。
        • 等等。
        动物模型揭示的感光体纤氯素洞察。
        PROG RETIN EYE RES。 2019; 71: 26-56
        • WENSELT.G.
        • 张Z.
        • Anastassov I.A.
        • Gilliam J.C.
        • Schmid M.F.
        • 等等。
        杆光感受器形态发生和疾病的结构和分子碱基。
        PROG RETIN EYE RES。 2016; 55: 32-51
        • 年轻的R.W.
        感应电池外部段的更新。
        J细胞BIOL。 1967; 33: 61-72
        • Lakkaraju A.
        • Umapathy A.
        • Tan L.X.
        • Daniele L.
        • philp n.j.
        • Boesze-Battaglia K.
        • 等等。
        视网膜色素上皮的细胞生物学。
        PROG RETIN EYE RES。 2020; : 100846
        • 诗人A.
        • MORTAY L.L.
        • Meteray R.S.
        CGMP门控通道和相关的谷氨酸富苯蛋白在杆光感受器椎间盘膜的边缘区域的外周-2相互作用。
        J Biol Chem。 2001; 276: 48009-48016
        • 安德森J.S.
        • Wilkinson C.J.
        • 市长T.
        • Mortensen P.
        • nigg e.a.
        蛋白质相关性分析蛋白质组学表征人中子组。
        自然。 2003; 426: 570-574
        • 福斯特L.J.
        • de hoog c.l.
        • 张Y.
        • 谢X.
        • Mootha V.K.
        通过蛋白质相关性分析的哺乳动物细胞器地图。
        细胞。 2006; 125: 187-199
        • 威斯特S.
        • Gronemeyer T.
        • Ofman R.
        • Kunze M.
        • grou c.p.
        • Almeida J.A.
        • 等等。
        串联质谱与蛋白质相关性分析蛋白质组学表征小鼠肾过氧血清。
        Mol细胞蛋白质组学。 2007; 6: 2045-2057
        • Reidel B.
        • 汤普森J.W.
        • 佛罗里达州
        • Moseley M.A.
        • skiba n.p.
        • arshavsky v.y.
        层状组织的蛋白质组学分析显示出光感受器细胞的独特糖酵解专用。
        Mol细胞蛋白质组学。 2011; 10//doi.org/10.1074/mcp.M110.002469
        • 煮n.j.
        • MORTAY L.L.
        • 里德D.
        • Kaupp U.B.
        • Meteray R.S.
        牛杆光感受器的CGMP门控通道仅在质膜中局部地定位。
        J Biol Chem。 1989; 264: 6996-6999
        • 里德下午
        • Friedel U.
        • Meteray R.S.
        • 煮n.j.
        钠钙交换剂作为牛棒外段的主要蓖麻素结合糖蛋白及其对质膜的定位。
        生物化学。 1990; 29: 1601-1607
        • Korschen H.G.
        • illing m.
        • Seifert R.
        • Sesti F.
        • 威廉姆斯A.
        • gotzes s.
        • 等等。
        240kDa蛋白代表来自杆光感受器的环状核苷酸门控通道的完整β亚基。
        神经元。 1995; 15: 627-636
        • 杨Z.
        • 陈Y.
        • LILLO C.
        • Chien J.
        • yu z.
        • Michaelides M.
        • 等等。
        在黄斑变性患者中发现的突变促蛋白酶1破坏了小鼠中的感光盘形态发生。
        J Clin Invest。 2008; 118: 2908-2916
        • 汉诗。
        • 安德森D.W.
        • 造纸欲D.S.
        PROMININ-1定位于外部段LAVIS棒和锥形光感受器的外部分段薄片的开放边缘。
        投资眼科毒素VIS。 2012; 53: 361-373
        • Zacchigna S.
        • 哦,
        • Wilsch-Brauninger M.
        • Missol-Kolka E.
        • Jaszai J.
        • 詹森斯。
        • 等等。
        胆固醇结合蛋白质促进蛋白-1 / CD133的丧失导致盘瘤病发生和光感受器变性。
        J Neurosci。 2009; 29: 2297-2308
        • rattner a。
        • 小木下午
        • 威廉姆斯J.
        • Cooke C.
        • Savchenko A.
        • Lyubarsky A.
        • 等等。
        感光体特异性的钙粘蛋白对于外部段的结构完整性和感光体存活至关重要。
        神经元。 2001; 32: 775-786
        • 金T.S.
        • 里德下午
        • Meteray R.S.
        杆光感受器中NA / CA-K交换器的结构功能关系与定位。
        J Biol Chem。 1998; 273: 16561-16567
        • 郭米克。
        • Holopainen J.M.
        • MORTAY L.L.
        • 福斯特L.J.
        • Meteray R.S.
        光感受器外部段的蛋白质组学识别蛇形和RAB蛋白的子集,涉及膜囊泡运输和融合。
        Mol细胞蛋白质组学。 2008; 7: 1053-1066
        • Zuniga F.I.
        • 施工C.M.
        解入鼠标视网膜中Als2Cr4的结构和功能。
        投资眼科毒素VIS。 2010; 51: 4407-4415
        • philp n.j.
        • 王D.
        • yoon h.
        • Hjelmeland L.M.
        单羧酸转运蛋白在人视网膜色素上皮和ARPE-19细胞中的偏振表达。
        投资眼科毒素VIS。 2003; 44: 1716-1721
        • Keresztes G.
        • mutai h.
        • Hibino H.
        • Hudspeth A.J.
        • 地狱家。
        鸡和小鼠中RGS9-1锚定蛋白R9AP的表达模式表明神经系统中的多种作用。
        Mol Cell Neurosci。 2003; 24: 687-695
        • McDowell J.H.
        制备杆外部分段膜,再生逆止蛋白酶,并确定罗多蛋白浓度。
        方法Neurosci。 1993; 15: 123-130
        • skiba n.p.
        • 斯宾塞W.J.
        • Salinas R.Y.
        • 骗取e.c.
        • 汤普森J.W.
        • arshavsky v.y.
        独特感光盘组分的蛋白质组学鉴定揭示了PRCD的存在,蛋白质与视网膜变性有关。
        J蛋白质组。 2013; 12: 3010-3018
        • Meteray R.S.
        • MORTAY L.L.
        牛视网膜杆外部段盘蛋白质组成的差异和蓖麻葡聚糖密度扰动法分离的血浆膜。
        J细胞BIOL。 1987; 105: 2589-2601
        • 休斯C.S.
        • Foehr s.
        • 加菲尔德D.A.
        • Furlong E.E.
        • Steinmetz L.M.
        • Krijgsveld J.
        采用顺磁珠技术的超敏感蛋白质组分析。
        MOL SYST BIOL。 2014; 10: 757
        • Lobanova E.S.
        • Herrmann R.
        • Finkelstein S.
        • Reidel B.
        • skiba n.p.
        • 邓维。
        • 等等。
        机械基础对锥体转霉素失败转换:为什么锥体永远不会被光蒙蔽。
        J Neurosci。 2010; 30: 6815-6824
        • Leyton-Puig D.
        • Kedziora 3.
        • Isogai T.
        • van den Broek B.
        • Jalink K.
        • Innocenti M.
        PFA固定使肌动蛋白细胞骨架和相关蛋白质的无伪影超分辨率成像。
        BIOL开放。 2016; 5: 1001-1009
        • Sokolov M.
        • Lyubarsky A.L.
        • strissel k.j.
        • savchenko a.b.
        • govardovskii v.i.
        • Pugh Jr.,E.N.
        • 等等。
        杆状细胞两个主要隔室之间的跨越式旋转旋转易转换:一种轻型的新机制。
        神经元。 2002; 34: 95-106
        • Lobanova E.S.
        • Finkelstein S.
        • 宋H.
        • 曾思。
        • 陈C.K.
        • Sokolov M.
        • 等等。
        杆中的转琥酸易位是通过GTP酶活化复合物的饱和来触发的。
        J Neurosci。 2007; 27: 1151-1160
        • 史密斯Jr.,H.G.
        • 螺杆G.W.
        • Litman B.J.
        从视网膜杆外部段中隔离和纯化渗透压圆盘。
        Exp眼睛res。 1975; 20: 211-217
        • Tiwari S.
        • 哈德森斯。
        • Gigtone 2nd,V.H.
        • 米勒C.
        • Chernoff E.A.
        • belecky-adams t.l.
        Meckelin 3对于大鼠麦克风综合征的感光体外部段开发是必要的。
        Plos一个。 2013; 8e59306
        • Doherty D.
        • 巴黎M.A.
        • 芬兰L.S.
        • Gunay-Aygun M.
        • Al-Mateen M.
        • 贝茨D.
        • 等等。
        3基因(MKS3,CC2D2A和RPGRIP1L)中的突变导致教练综合征(Joubert综合征,先天性肝纤维化)。
        J Med Genet。 2010; 47: 8-21
        • 史密斯U.M.
        • 联席领域
        • TEE L.J.
        • 麦基下午
        • maina e.n.
        • Whelan S.
        • 等等。
        跨膜蛋白麦克白(MKS3)在Meckel-Gruber综合征和WPK大鼠中突变。
        NAT Genet。 2006; 38: 191-196
        • 黄兰
        • Szymanska K.
        • Jensen V.L.
        • Janecke A.R.
        • Innes上午
        • 戴维斯。
        • 等等。
        TMEM237.在具有Joubert综合征相关疾病的个体中突变,扩大了TMEM系列在睫毛过渡带的作用。
        我是j嗡嗡声的遗传。 2011; 89: 713-730
        • COLLIN G.B.
        • 赢了J.
        • 希克斯W.L.
        • 厨师s.a.
        • Nishina下午
        • Naggert J.K.
        Meckelin是光感受器肾移交和外部细分形态发生的必要条件。
        投资眼科毒素VIS。 2012; 53: 967-974
        • 太阳H.
        • Nathans J.
        STARGARDT的ABCR是视网膜杆外部段的盘膜。
        NAT Genet。 1997; 17: 15-16
        • MORTAY L.L.
        • Wahl D.
        • Sarunic M.v.
        • Meteray R.S.
        小鼠中P.ASN965SER(N965S)ABCA4变体的定位和功能表征显示出疾病性黄斑变性的致病机制。
        哼唱mol tenet。 2018; 27: 295-306
        • Lyubarsky A.L.
        • daniele l.l.
        • Pugh Jr.,E.N.
        通过洛越蛋白漂白在鼠标眼中的坎德拉斯在鼠标眼中的光学筛选,以及小鼠ERG主要成分的浅追索依赖性。
        视觉res。 2004; 44: 3235-3251
        • 尼克尔S.
        • Park P.S.
        • Baumeister W.
        • Palczewski K.
        由冷冻电解层析成像确定的鼠杆外部段的三维架构。
        J细胞BIOL。 2007; 177: 917-925
        • IACONO K.T.
        • 棕色A.L.
        • 格林米。
        • Saouraf S.J.
        CD147免疫球蛋白超家族受体功能和病理学作用。
        Exp Mol Pathol。 2007; 83: 283-295
        • Perez-Escuredo J.
        • van hee v.f.
        • Sboarina M.
        • 哎呀
        • 达金伏特。
        • Pellerin L.
        • 等等。
        单羧酸转运蛋白在脑和癌症中。
        Biochim Biophys Acta。 2016; 1863: 2481-2497
        • halestap a.p.
        单羧酸转运蛋白系列 - 结构和功能性。
        IUBMB生活。 2012; 64: 1-9
        • halestap a.p.
        • 威尔逊M.C.
        单羧酸盐转运蛋白家族 - 作用和调节。
        IUBMB生活。 2012; 64: 109-119
        • peachey n.s.
        • 余米
        • 汉杰伊。
        • Lengacher S.
        • magistretti p.j.
        • Pellerin L.
        • 等等。
        MCT.1单速度在小鼠视网膜上的影响。
        Adv Exp Med Biol。 2018; 1074: 375-380
        • philp n.j.
        • Ochraietor J.D.
        • Rudoy C.
        • Muramatsu T.
        • linser p.j.
        在视网膜颜料上皮和5A11 / Basigin-Null鼠中的神经视网膜上的MCT1,MCT3和MCT4表达的丧失。
        投资眼科毒素VIS。 2003; 44: 1305-1311
        • 汉杰伊。
        • Kinoshita J.
        • Bisetto S.
        • 贝尔B.A.
        • Nowak R.A.
        • peachey n.s.
        • 等等。
        单羧酸转运液在外视网膜中代谢稳态中的作用:从细胞特异性BSG缺失中获得的洞察力。
        Faseb J. 2020; 34: 5401-5419
        • Stradleigh T.W.
        • Ishida A.T.
        视网膜免疫组织化学的固定策略。
        PROG RETIN EYE RES。 2015; 48: 181-202
        • Dilly A.K.
        • Rajala R.v.
        胰岛素生长因子1受体/ pi3k / akt杆光感受器外部段膜中的存活途径。
        投资眼科毒素VIS。 2008; 49: 4765-4773
        • 刘X.
        • 塞诺克
        • Nishizawa Y.
        • Hayashi F.
        • Yamazaki A.
        • Matsumoto H.
        • 等等。
        黄芪胍基环化酶的超微结构定位在人与猴子视网膜中。
        Exp眼睛res。 1994; 59: 761-768
        • Nemet I.
        • 田G.
        • imanishi Y.
        组织杆光感受器外部段膜上的CGMP传感结构。
        频道(奥斯汀)。 2014; 8: 528-535
        • Poole r.c..
        • halestap a.p.
        红细胞乳酸转运蛋白(单羧酸盐转运蛋白1)与免疫球蛋白超家族的整体70-KDA膜糖蛋白相互作用。
        J Biol Chem。 1997; 272: 14624-14628
        • Kanow M.A.
        • 吉亚加吉玛。
        • 詹坎德斯基C.S.
        • Tsantilas K.
        • Engel A.L.
        • 杜杰克
        • 等等。
        视网膜和视网膜色素上皮的生化适应支持脊椎动物的代谢生态系统。
        Elife。 2017; 6