用硫氰酸胍脱氰酸胍萃取后剩余样品磷蛋白酶的可行性

  • 弗兰克罗尔夫斯
    隶属关系
    Amsterdam UMC,癌蛋白实验室,部门医疗肿瘤,地点VUMC,阿姆斯特丹,荷兰

    分子病理学,荷兰癌症研究所,阿姆斯特丹,荷兰

    Oncode Institute,阿姆斯特丹,荷兰
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  • 桑德拉·普尔玛
    隶属关系
    Amsterdam UMC,癌蛋白实验室,部门医疗肿瘤,地点VUMC,阿姆斯特丹,荷兰
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  • Mariana Paes Dias.
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    分子病理学,荷兰癌症研究所,阿姆斯特丹,荷兰

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  • 作者脚注
    †联合通讯作者
    Jos Jonkers.
    一致
    应解决对应的通信:JOS Jonkers。 。电话:+31 20 512 2000,Connie R. Jimenez。 。电话:+31 20 444 2340
    脚注
    †联合通讯作者
    隶属关系
    分子病理学,荷兰癌症研究所,阿姆斯特丹,荷兰

    Oncode Institute,阿姆斯特丹,荷兰
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  • 作者脚注
    †联合通讯作者
    康妮R. Jimenez.
    一致
    应解决对应的通信:JOS Jonkers。 。电话:+31 20 512 2000,Connie R. Jimenez。 。电话:+31 20 444 2340
    脚注
    †联合通讯作者
    隶属关系
    Amsterdam UMC,癌蛋白实验室,部门医疗肿瘤,地点VUMC,阿姆斯特丹,荷兰
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  • 作者脚注
    †联合通讯作者
开放访问发布:4月02,2021 DOI: //doi.org/10.1016/j.mcpro.2021.100078

      强调

      • 硫氰酸亚氰酸酯 - 苯酚 - 氯仿(AGPC)萃取蛋白质组学
      • AGPC. 与常用尿素裂解方案的磷脂数据的比较
      • AGPC. 产生来自细胞和(肿瘤)组织样品的高质量磷酸性数据
      • AGPC. 允许组合基因组,转录组合&相同样本的蛋白质组学分析
      • AGPC. 允许对临床肿瘤标本等小样品进行多OMICS分析

      抽象的

      在日常练习中,通常提取不同类型的生物分子以用于大规模’omics’分析定制协议。然而,当样品材料有限时,优选一体化策略。虽然具有尿素的细胞和组织的裂解广泛用于磷蛋白蛋白酶应用,可以使用酸性硫氰酸苯酯 - 苯酚 - 氯仿(AGPC)从小样品中同时提取DNA,RNA和蛋白质。已经报道了使用AGPC进行质谱(MS)基磷蛋白酶,但尚未彻底评估典型的磷蛋白酶方案。在这里,我们将尿素与基于AGPC的蛋白质提取进行比较,在电离U2OS细胞的辐照后DNA损伤响应途径中的分析磷酸化作为原则的证据。平均而言,我们用两种萃取方法识别每种样品的9000个磷酸水。此外,我们观察到磷的高相似性(例如94%共有1类鉴定)和推导的激酶活动(例如ATM,ATR,Chek1 / 2,Prkdc)。我们进一步扩展了我们与鼠和人体组织样品的比较,从而产生类似的提取方案的相似且高度相关的结果。因此,基于AGPC的样品萃取可以替代磷蛋白蛋白酶工作流的常见细胞裂解物,因此可以是获得多个OMIC工作流的输入材料的有吸引力的方法,从单个样本产生几种数据类型。

      图形概要

      缩写:

      AGPC. (硫氰酸亚氰酸酯 - 苯酚 - 氯仿 ), HCC. (肝细胞癌 ), 墨水 (综合推断激酶活性 ), IR. (照射 ), MBR. (竞争之间的匹配 ), 多发性硬化症 (质谱 ), NT. (未经处理 ), PS. ( ), PTM海 (翻译后修改(PTM) - 签名浓缩分析 ), Ptyr. (phosphotyrosine. ), rnab. ( RNA-BEE. ), U2OS (U2骨肉瘤)

      介绍

      基于质谱(MS)的磷蛋白酶是一种强大的工具,可以在全球时尚和高分辨率下学习细胞信号传导,无论是稳定状态还是在扰动或发育疾病
      • Centerham E.J.
      • Parker B.L.
      • Burykin T.
      • 詹姆斯D.E.
      • Humphrey S.J.
      照亮深色磷脂蛋白酶。
      )。此外,磷酸化位点的研究允许鉴定上游效应器,即激酶,从而预测其活动(
      • Wirbel J.
      • Cutillas P.
      • SAEZ-RODRIGUEZ J.
      基于磷蛋白酶的激酶活性探讨癌细胞。
      ,
      • Beekhof R.
      • van Alphen C.
      • Henneman A.A.
      • knol J.C.
      • PHAM T.V.
      • rolfs f.
      • 刹车M.
      • Henneberry E.
      • Le大T.Y.
      • de haas r.r.
      • 派尔斯队S.R.
      • Vurchio V.
      • Bertotti A.
      • Trusolino L.
      • verheul h.m.
      • JIMENEZ C.R.
      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      )。
      常用和接受的方法,用于将磷蛋白质分析中的生物显微化分离蛋白质是磷蛋白蛋白谱的应用是螯合物剂如尿素(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
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      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
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      • Beltran L.
      • Cutillas P.R.
      磷蛋白酶磷肽富集技术的研究进展。
      ,
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
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      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
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      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
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      • Satpathy S.
      • jaehnig e.j.
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      • Kim B.-J.
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      • Anurag M.
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      • 辛格P.
      • 高A.
      • 纳奈伊。
      • 窦啊。
      • 温B.
      • Vasaikar S.v.
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      • Watson M.A.
      • 苹果。
      • Ademuyiwa F.O.
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      • Schiff R.
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      • 雅各布斯。
      • Malovannaya A.
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      • perou c.m.
      • 里程G.
      • 张B.
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      • ellis m.j.
      精密肿瘤学的微观蛋白叶蛋白酶学方法。
      )。在日常实践中,通常使用不同的方案提取诸如核酸的其他生物分子。然而,在可用样品材料受到限制的情况下,希望使用一种方案尽可能多地提取各种类型的生物分子。这可以通过酸胍硫氰酸酯 - 苯酚 - 苯酚 - 氯仿(AGPC)萃取来实现,所述商业上可获得的试剂如TRIZOL,TRIFAST,TRI试剂或RNA-BEE(
      • chomczynski p.
      用于从细胞和组织样品中单步同时分离RNA,DNA和蛋白的试剂。
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      • chomczynski p.
      • Sacchi N.
      硫氰酸亚氰酸盐 - 苯酚 - 氯仿萃取酸胍酸脱苯胺 - 苯酚 - 氯仿的单步方法:二十多年。
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      • Tan S.C.
      • yiap b.c.
      DNA,RNA和蛋白质提取:过去和现在。
      )。已经表明,以这种方式分离的蛋白质与蛋白质表达分析的定量质谱相容(
      • Braakman R.B.H.
      • Bezstarosti K.
      • Sieuwerts上午
      • de Weerd V.
      • van galen上午
      • Stingl C.
      • Luider T.M.
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      • Smid M.
      • Martens J.W.M.
      • Foekens J.A.
      • demmers j.a.a.
      • umar A.
      基因组学和蛋白质组学数据的综合分析临床乳腺癌组织标本用酸性硫氰酸盐 - 苯酚 - 氯仿提取。
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      • Braakman R.B.H.
      • Sieuwerts上午
      • umar A.
      用酸性硫氰酸盐 - 苯酚 - 氯仿提取组织标本的霰弹枪蛋白质组学。
      ,
      • 流行c.
      • Ameling S.
      • empen K.
      • RüdebuschJ.
      • 达洛斯五。
      • Felix S.B.
      • loghin f.
      • VölkerU.
      • 锤e.
      使用丁醇基蛋白质提取的心脏活组织检查蛋白质组分析。
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      • 米尔斯J.
      • McConnell E.
      • LeitãoJ.A.
      • Lapierre L.R.
      联合核苷酸和蛋白质萃取胶囊杆菌。
      )。虽然基于AGPC的蛋白质萃取已被用于分析磷蛋白酶(
      • 杨F.
      • Stenoien D.L.
      • strittmatter e.f.
      • 王J.
      • 丁L.
      • Lipton M.S.
      • Monroe M.E.
      • Nicora C.D.
      • 格里斯滕科M.A.
      • 唐克。
      • 方罗。
      • Adkins J.N.
      • 营地D.G.
      • 陈D.J.
      • 史密斯r.d.
      人体皮肤成纤维细胞的磷脂蛋白酶谱响应于低剂量辐照。
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      • 火腿下午
      • 杨F.
      • Jayachandran H.
      • jaitly n ..
      • Monroe M.E.
      • 格里尼科米。
      • liveay e.a.
      • 赵立
      • Purvine S.O.
      • 奥顿D.
      • Adkins J.N.
      • 营地D.G.
      • 罗西S.
      • 史密斯r.d.
      样品制备及复制分析对HeLa细胞磷蛋白酶覆盖的影响。
      ,
      • luís。
      • 亚历山大光明
      • oliveira m.m.
      • abreu i.a.
      选择合适的蛋白质提取方法,以研究玉米光合组织的磷脂体。
      ),目前缺乏对使用磷蛋白酶的广泛使用的尿素方法进行广泛使用的尿素传导方法的该分离方法的直接比较。
      在这项工作中,我们将用尿素方案或AGPC试剂(RNA-BEE)的蛋白质提取物的磷脂蛋白酶进行比较。在功能性上下文中,我们还比较了DNA损伤后良好研究的磷酸化反应的覆盖率(
      • 斯蒂夫洛
      • von l.
      • 奥尔森J.V.
      蛋白质组学洞察DNA损伤反应并将这些知识转化为临床策略。
      ),对来自未处理的U2OS细胞的磷酸化位点数据进行差异分析。我们还将我们与鼠和人类组织样品的比较扩展。使用高分辨率串联质谱和最近的生物信息工具,如推断激酶活性(INKA)分析和磷签名富集分析(PTM-SEA)(
      • Beekhof R.
      • van Alphen C.
      • Henneman A.A.
      • knol J.C.
      • PHAM T.V.
      • rolfs f.
      • 刹车M.
      • Henneberry E.
      • Le大T.Y.
      • de haas r.r.
      • 派尔斯队S.R.
      • Vurchio V.
      • Bertotti A.
      • Trusolino L.
      • verheul h.m.
      • JIMENEZ C.R.
      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      ,
      • 克鲁格克。
      • Mertins P.
      • 张B.
      • 犀鸟P.
      • Raju R.
      • Ahmad R.
      • Szucs M.
      • Mundt F.
      • 林业D.
      • Jane-valbuena J.
      • Keshishian H.
      • Gillette M.A.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      • MANI D.R.
      磷酸化特异性签名分析的策划资源。
      ),我们表明,两种提取方法的磷酸化数据非常相似。

      实验步骤

       U2OS细胞培养,鼠和人体组织样品,辐照和蛋白质分离

      U2OS细胞(KCLB猫#30096,RRID:CVCL_0042)在补充有谷氨酸(Gibco)的DMEM中的15厘米菜肴中培养。培养基补充有10%FBS(Serana)和50个单位/ mL青霉素 - 链霉素(Gibco),并且在共同的实验室氧气条件下在37℃下生长细胞(具有CO的湿润的大气空气2 在治疗前加入5%)至80-90%的汇合。
      从健康的17周龄FVB / N小鼠收集鼠肝脏。荷兰癌症研究所的动物伦理委员会批准了组织收集,并按照机构,国家和欧洲的动物护理指南进行了批准。
      根据赫尔辛基,人类残留肿瘤和正常组织切除试样(肝脏;肝细胞癌(HCC);黑素瘤)从阿姆斯特丹UMC的病理部获得。由于残留组织用于科学研究的目的,并且在常规临床实践程序的范围内收集,因此涉及人类受试者法案的荷兰医学研究不适用。 Amsterdam UMC治疗的患者有可能选择用于使用其数据和组织进行研究目的。
      使用伽马河40提取器进行U2OS细胞的电离照射低剂量速率研究辐照器(最佳Theratronics Ltd.),该辐射器设定为10Gy的剂量,并在收获前允许细胞恢复一小时。
      对于用RNA-BEE提取的磷蛋白萃取,用PBS洗涤六种细胞培养皿(3个未处理,3个辐照),用2ml RNA-BEE(TEL-TEST)裂解,在干冰上冷冻并在-80℃下储存直至进一步采用。随后,在室温下解冻1ml等分试样,加入150μl氯仿,用手摇动管,并在室温下孵育5分钟。然后,将样品离心(12000×g,15分钟,4℃)。除去含有RNA的一相并加入300μl100%乙醇后,将样品在室温下温育3分钟,并离心(2000×G,5分钟,4℃)以沉淀DNA。将所得上清液用3mL冰冷丙酮沉淀,在室温下温育5分钟,并离心(2800×g,5min 4℃)以收集沉淀的蛋白质。用500μl95%乙醇洗涤蛋白质颗粒两次,随后通过移液溶解在800μL尿素裂解缓冲液(9M尿素,20mM,1mM酸钠钠,2.5mM型焦磷酸盐,1mMβ-甘油磷酸盐)中溶解。然后,使用Eppendorf Thermixer在室温下在室温下强烈涡旋样品约1-2小时。最后,使用Branson高强度Cuphon Songator并通过离心(16000×g,10分钟,室温)清零,样本被超声处理三个循环(最大幅度为20秒,20秒,20秒)。
      对于磷蛋白萃取用尿素方案提取,用PBS洗涤另外的6个细胞培养皿(3个未处理的3个照射)并使用2mL尿素裂解缓冲液裂解,然后三个超声处理(20秒,最大振幅为20秒) 。然后通过离心(16000×g,10min,室温)来清除样品。用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度,并将所有样品储存在-80℃直至进一步使用。
      如对U2OS细胞所述提取来自组织物质的磷蛋白。用上述尿素和RNA-BEE方案的交替20-50μm切片连续切断冷冻组织和>20个部分在3-4种不同的2ml管中收集。对于萃取,加入1mL RNA-BEE和2mL脲裂解缓冲液。

       蛋白质消化和磷肽富集

      如前所述进行实验步骤(
      • Beekhof R.
      • van Alphen C.
      • Henneman A.A.
      • knol J.C.
      • PHAM T.V.
      • rolfs f.
      • 刹车M.
      • Henneberry E.
      • Le大T.Y.
      • de haas r.r.
      • 派尔斯队S.R.
      • Vurchio V.
      • Bertotti A.
      • Trusolino L.
      • verheul h.m.
      • JIMENEZ C.R.
      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      ,
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
      • PHAM T.V.
      • Ishihama Y.
      • verheul h.m.w。
      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )。简而言之,使用等效的500μg总蛋白质,并用尿素裂解缓冲液稀释至500μl总体积的终浓度为1μg/μl。将二硫醇(DTT)加入到终浓度为4mm,并在水浴中在55℃下将样品孵育30分钟。冷却至室温后,将碘乙酰胺加入到10mm的最终浓度,并在黑暗中孵育样品15分钟。然后通过在室温下加入20mM HEPES pH 8.0并在室温下用5μg/ ml序列改性的胰蛋白酶(PRomega)消化过夜,将样品稀释至2μm尿素终浓度。
      然后将摘要用三氟乙酸(TFA)酸化至最终浓度为0.1%,使用Oasis HLB柱(10mg容量,水)脱盐。用乙腈(ACN)活化柱,并在0.1%TFA中平衡。将结合的肽用0.1%TFA洗涤两次,并在0.1%TFA,80%ACN溶液中洗脱。
      如前所述,如前所述进行脱盐肽的磷酸富集(
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
      • PHAM T.V.
      • Ishihama Y.
      • verheul h.m.w。
      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )使用TiO.2 珠子:为此,用乳酸溶液(0.3g / ml乳酸,0.07%TFA,53%ACN)稀释脱盐肽1:1。用于磷酸肽捕获,2.5毫克TiO2 珠子(GL科学,10μm)填充舞台尖端,窄端配有16G针质量(3M empore)的16G-针刺。包含TiO的提示2 首先用200μL0.1%TFA / 80%ACN洗涤床,并与200μL300mM乳酸溶液平衡。在每个循环中使用200μL肽混合物在5个循环中在5个循环中进行脱盐肽负载。 tio.2 首先用200μL乳酸溶液洗涤带有结合磷酸肽的床,其次用200μL0.1%TFA / 80%ACN洗涤。通过以1500×g离心4分钟来进行所有步骤。然后,用50μl0.5%哌啶(Thermo Fisher Scienctific)和50μl5%哌啶洗脱的磷肽用两步洗脱,随后在100μl20%H中淬灭34。随后使用在窄端的200-μl阶段尖端脱磷酸肽,其在窄端,用20μl0.1%TFA / 80%ACN洗涤并与其平衡洗涤20μl0.1%TFA。将磷酸肽加载并以1000×g离心3分钟。然后用20μl0.1%TFA洗涤SDB-XC床,用20μL0.1%TFA / 80%ACN洗脱脱盐磷肽。在LC-MS / MS之前,最终在真空离心机中干燥并溶解在20μl0.5%TFA / 4%ACN中。

        LC-MS / MS

      使用具有50cm×75μmID的终极3000纳米-SMS / MS系统(Thermo Fisher Scientific),配备了50cm×75μm的ID适应肽(C18,1.9μm)柱分离肽。注射后,在10mM×75μmID上以3μl/ min捕获肽以11mm×75μm,在2%缓冲液B(缓冲液A:0.1%甲酸(Fisher Scientific),Buffer B:80%AcN,0.1%Formic之后酸)在35℃下在10-40%缓冲液B梯度中以300nl / min分离在300℃(125分钟注射到注射)中。将肽在+2kVA的电位中被电离成Q辐射HF质谱仪(Thermo Fisher Scientific)。使用3E6电荷的AGC靶值和100ms的MAXIT,在横侧的分辨率120.000(在M / Z 200)中以M / Z 350-1400(在M / Z 200)中的距离的肿块和100ms的最大值来测量完整的质量。在HCD(更高能量碰撞)单元(1.4 AMU隔离宽度,26%归一化碰撞能量)中,将前15个用于肽信号(充电状态2+和更高)的MS / MS。使用1E6电荷的AGC目标值,64 ms的MAXIT和底部填充比为0.1%,在Orbitrap的分辨率15000(在M / Z 200)中获取MS / MS光谱。MS /的强度阈值MS为1.3E5。使用重复计数为1的动态排除和30秒的排除时间。

       肽鉴定

      搜查了MS / MS Spectra以瑞士普 HOMO SAPIENS. 参考蛋白质组(U2OS细胞:2019年2月下载,规范和同种型,42,417个条目;人类组织:4月2020年4月,规范和同种型,42,347个条目)或 亩肌肉 参考蛋白质组(2018年2月,规范和同种型,25,131条目)使用MaxQuant软件(U2OS细胞:1.6.4.0版;小鼠和人类组织:1.6.10.43版)(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )。将酶特异性设定为胰蛋白酶,允许两种错过的裂解。半胱氨酸羧酰胺甲基化(Cys,+ 57.021464Da)被视为固定改性和丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸磷酸化(+79.96330Da),甲硫氨酸氧化(Met,+ 15.994915Da)和N-末端乙酰化(N-末端,+ 42.010565Da)作为可变修改。搜索肽前体和片段离子,分别以4.5ppm和20ppm的最大质量偏差进行搜索。使用诱饵数据库策略在1%的FDR中过滤肽,蛋白质和现场鉴定。最小的肽长度为7个氨基酸,改性肽的最小和romeda评分为40,相应的最小Δ评分为6(默认最大设置)。肽鉴定在样品中繁殖,在尿素和RNA-BEE之间的所有样品(MBR-ON)或尿布之间的禁用之间的匹配与尿素和RNA-BEE之间的样品(MBR-OFF)之间的匹配。为此,在最大值和数据在下游分析期间,每次提取组检测尿素和RNA-BEE提取的样品。请注意,对于同一提取组的示例,将启用MBR选项。每个数字图例中指示MBR选项的设置。

       无标记的磷酸肽量化& data analysis

      通过其提取的离子强度定量磷酸肽(“最大值”中的'强度')量化。对于磷酸水,最大输出数据(磷光(Sty)站点.txt)加载到r(3.6.3版)中(

      R核心团队(2018)R:统计计算的语言和环境。 R基金会统计计算,维也纳,奥地利。 URL. httpswww.r-project.org.,

      )使用自定义脚本进一步处理。简而言之,排除了诱饵数据库命中,污染物和全零强度行。通过在所得表中的每个磷酸盐条目中的强度塔中数据的样品向量子求和来确定磷酸盐数量和缺失值。对于每个网站,这涉及三个单独的强度柱,__1 / __ 2 / __ 3,分别与1,2或≥3个磷酸化位点分别源自磷酸化肽的数据,其区分为产生不同的信号量大。然后将数据矩阵从宽格式转换为单独的__1,__2和__3柱,长格式,具有从具有1(__1),2(__2)或≥3(__3)磷酸化位点的磷酸肽的单独行。数据在所有识别的磷酸水上的中值强度上标准化并标准化。只有具有本地化概率的磷化水 0.75(类别1)用于进一步分析。
      相关性分析基于1类磷酸酯的Pearson相关性,并使用ComplexHeatMap R包绘制(
      • 顾Z.
      • EILS R.
      • Schlesner M.
      复杂的热手套揭示了多维基因组数据中的模式和相关性。
      )。对于尺寸减小分析,均匀歧管近似和投影(UMAP)算法(
      • 麦克尼恩斯L.
      • 堆积j.
      • 梅尔维尔J.
      UMAP:尺寸透明近似和投影尺寸减小。
      ,
      • Becht E.
      • 麦克尼恩斯L.
      • 堆积j.
      • dutertre c.-a.
      • kwok i.w.h.
      • ng l.g.
      • Ginhoux F.
      • 纽厄尔e.w.
      使用UMAP可视化单细胞数据的维度减少。
      )用在UMAP R包装中实施。计算基于第1类磷强度,缺失值用零替换。
      基因本体分析使用Cluego插件3.5.4(
      • BINDEA G.
      • Mlecnik B.
      • 黑客H.
      • CharoEntong P.
      • Tosolini M.
      • Kirilovsky A.
      • Fridman W.-h.
      • Pagèsf.
      • Trajanoski Z.
      • 加仑J.
      Cluego:Cytoscape插件解码功能分组的基因本体和途径注释网络。
      )对于cytoscape软件(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      )默认设置。使用Bonferroni下降,仅允许进行Go-Pange校正后的重大术语(<考虑了0.05)。
      如前所述进行墨水分析(
      • Beekhof R.
      • van Alphen C.
      • Henneman A.A.
      • knol J.C.
      • PHAM T.V.
      • rolfs f.
      • 刹车M.
      • Henneberry E.
      • Le大T.Y.
      • de haas r.r.
      • 派尔斯队S.R.
      • Vurchio V.
      • Bertotti A.
      • Trusolino L.
      • verheul h.m.
      • JIMENEZ C.R.
      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      ),使用在线版本可访问 //inkascore.org。对于U2OS细胞数据,过滤已下载的喷墨得分以进行全数据存在,以便在其中一种治疗组中(未经处理或辐照)复制。雷玛(
      • 里奇M.E.
      • Phipson B.
      • 吴D.
      • 胡Y.
      • 法律C.W.
      • 施W.
      • Smyth G.K.
      LiMMA为RNA测序和微阵列研究进行差异表达分析。
      )R包装用于对Inka评分和磷的强度数据进行差异表达分析。
      此外,将磷光强度数据过滤,在至少一种治疗组中的样品中存在至少2个中的至少2个。在一个组中存在数据存在的情况下,另一个(磷酸盐ON / OFF行为),允许在没有缺失的“磷酸盐上”组中的观察结果。仅在这些情况下,缺失值在“磷胶异关”组中归零,以零来导出p值。使用每个治疗组的平均值测定折叠变化,并计算出防眩光值(2(log2值组2 - log2值组1的平均值组1) )。
      为了对PTM-SEA进行磷酸磷酸盐,乘以折叠变化的符号乘以氨基玛的负值LOG10 p值。在复杂的磷酸性氨基酸窗口的情况下,使用最显着的(最低p值)进入。使用GenePattern平台进行PTM-Sea(
      • 雷神米
      • Liefeld T.
      • 古怪J.
      • Lerner J.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      Genepattern 2.0。
      )输出在R.进一步加工。
      从尿素的每个治疗组计算从每种提取方法估计磷酸水磷酸盐的相似性的标准偏差,并且RNAB衍生的磷粘物强度在一起,缺失值归零。

       实验设计与统计理由

      对12个U2OS细胞样品(15cm细胞培养皿)进行单次磷蛋白蛋白质分析,来自单个正常鼠肝脏的8个复制样品,9人组织样品(3个重复为单一正常肝脏,HCC和黑色素瘤样品)。对于每个变异('尿素',用尿素裂解缓冲液提取;'Rnab',用RNA-BEE提取;'IR',照射;'NT',不治疗)3-4重复样品。选择单个细胞系和单个组织标本作为原理的证据最小化细胞间线和间间变化,因此允许在每个条件下更加无偏见的聚焦在磷酸化位点上。以前评估磷蛋白酶工作流程再现性(
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
      • PHAM T.V.
      • Ishihama Y.
      • verheul h.m.w。
      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )因此,我们可以选择每个条件的至少三个重复作为样品号,这可以在给定时间容易地处理,而不会影响处理质量。为了避免批量效应,替代样品和条件的测量(例如,3个循环,其中尿素-NT,尿素IR,RNAb-NT和RNAB-IR组或交替尿素和RNAB分离的样品)。为了分析差异磷酸水,选择利马,因为它被设计用于处理差异表达研究和更小的样品尺寸(
      • 里奇M.E.
      • Phipson B.
      • 吴D.
      • 胡Y.
      • 法律C.W.
      • 施W.
      • Smyth G.K.
      LiMMA为RNA测序和微阵列研究进行差异表达分析。
      )。在原始出版物中描述了Inka评分和PTM-Sea的统计方面(
      • Beekhof R.
      • van Alphen C.
      • Henneman A.A.
      • knol J.C.
      • PHAM T.V.
      • rolfs f.
      • 刹车M.
      • Henneberry E.
      • Le大T.Y.
      • de haas r.r.
      • 派尔斯队S.R.
      • Vurchio V.
      • Bertotti A.
      • Trusolino L.
      • verheul h.m.
      • JIMENEZ C.R.
      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      ,
      • 克鲁格克。
      • Mertins P.
      • 张B.
      • 犀鸟P.
      • Raju R.
      • Ahmad R.
      • Szucs M.
      • Mundt F.
      • 林业D.
      • Jane-valbuena J.
      • Keshishian H.
      • Gillette M.A.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      • MANI D.R.
      磷酸化特异性签名分析的策划资源。
      )。

      结果

       用尿素或RNA-BEE提取的U2OS细胞的磷蛋白酶数据非常相似

      为了比较两种提取方案,U2OS细胞未治疗或用10GY处理或照射,然后用RNA-BEE(RNAB)或尿素的蛋白质分离前一小时恢复(每次治疗隔离组合三重复, Fig. 1 A和实验程序)。对于两种隔离方法,我们的标准TIO2 磷蛋白酶工作流程(
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
      • PHAM T.V.
      • Ishihama Y.
      • verheul h.m.w。
      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )被应用(实验程序)。总共鉴定了13,519族磷酸盐(PS),平均每样品为9034 ps。在用尿素与RNAB提取的样本之间没有发现缺失值数的明显差异(补充图1 a-b补充表1 B-C)。鉴定的PS高度重叠,供萃取方法,高信N级别1 PS的94.2%共享识别(Fig. 1 乐队 补充图2b)。发现1级PS比例等于两种不同的提取方法(Fig. 1 b)。非共享类1 PS显示比共享1 PS的定位概率较低(补充图2 A-B)。此外,当非共用类1 PS的基因名称用于基因本体分析时,没有发现与RNAB提取的重大术语,并且仅观察到具有低基因覆盖的术语尿素提取(补充图2 c)。标准化数据的相关分析(Fig. 1 c)能够区分提取技术,但总体显示出非常高的相似性,最小相关系数为0.91(Fig. 1 C)。当UMAP尺寸减少算法(
      • 麦克尼恩斯L.
      • 堆积j.
      • 梅尔维尔J.
      UMAP:尺寸透明近似和投影尺寸减小。
      ,
      • Becht E.
      • 麦克尼恩斯L.
      • 堆积j.
      • dutertre c.-a.
      • kwok i.w.h.
      • ng l.g.
      • Ginhoux F.
      • 纽厄尔e.w.
      使用UMAP可视化单细胞数据的维度减少。
      )用于这些磷化物数据,在未处理的与辐照样品之间发生主要分离,而不是在分离方法之间(补充图2 d)。总之,基于AGPC提取的蛋白质样品的磷蛋白酶分析完全重新承载与通过经典尿素缓冲溶解制备的蛋白质提取物获得的结果。
      图缩略图GR1.
      图1用尿素裂解缓冲液或RNA-BEE提取的未处理和辐射的U2OS细胞的磷蛋白酶数据比较或RNA-BEE表示非常高的相似性。 一个) 实验设置的示意图概述。用10Gy照射三个用U2OS细胞的复制15厘米,然后孵育1小时(IR)或留下未处理(NT)并随后用尿素裂解缓冲液(尿素)或RNA-BEE(RNAB)收获。将RNA和DNA除去用于RNAB裂解的细胞,用丙酮沉淀蛋白质并溶解在尿素裂解缓冲液中。裂解物是超声处理的,并且使用TiO富集的磷酸肽2 在测量QE HF质谱仪之前。使用MaxQuant和R软件进行数据分析。 b) 上条图显示了尿素和RNAB分离的样品的自信定位(类1)磷酸酯(PS)的比例。显示尿素和RNAB之间检测到的1 ps的大重叠的低venn图。识别PS的序列窗口用于重叠。 C) Heatmap显示尿素和RNAB之间的相关性和强烈相似性。注意最低的相关性为0.91。 Pearson相关系数(Corr.Coeff。)基于归一化强度数据和1类磷酸水。 d) 尿素或RNAB裂解后辐照激酶活性的相关性。进行单个样品推断激酶活性(Inka)分析以检测活性激酶。散点图显示未处理(NT)与乳脲或RNAB孤立的标本的未处理(NT)与辐照(IR)细胞的变化(Fc)。仅描绘了显着差分激酶。雷玛导出的p值是颜色编码的。 Inka评分幅度通过圆形尺寸表示,并显示每个激酶的尿素或RNAB隔离案例的复制平均喷墨分数的中值。相关的单个图表显示在 . e) 使用尿素或RNAb裂解细胞的磷蛋白蛋白酶数据的磷缺乏特异性签名分析(PTM-SEA)产生高度相关的结果。作为排名度量,使用 - 使用 - 使用倍数变化的符号的-log10(p值)。散点图显示尿素或RNAB分离后衍生自未处理(NT)与辐照(IR)细胞衍生的磷鉴定的标准化富集分数(NES)。签名意义是颜色编码。 P值的幅度通过圆形尺寸表示。对于具有两种提取方法的显着或无显着的签名仅平均p值。相关图案分别显示所有重要签名 . F) 显示为尿素和RNAB溶解细胞中显示的PTM-Sea标志性激酶-PSP_ATM的PS重叠的VENN图。重叠基于序列窗口。请注意,由于数据存在在统计评估之前过滤并非所有PS重叠在此处。这些非共用PS中的一些在样品的一小部分中检测到,比较H,I.几个PS仅在照射后仅存在(OFF / ON行为);鉴于样品号,仅考虑具有辐照或控制的完整数据存在的案例;与H,I。数字标签X_1和X_2表示PS X分别来自单独或双磷酸化肽。 G) 使用PS重叠与e中的PTM-SEA签名集合Kinase-PSP_ATM,在照射(IR)或未治疗(NT)的签名后的每个PS成员的所有样品(无关的隔离方法)上计算强度的标准偏差。绘制了所得到的频率分布。 H) 克利夫兰点绘图显示针对PTM-SEA的Kinase-PSP_ATM签名的PS重叠的折叠变化(FC)与E.ILIMMA-SEA中所示的PTM-SEA衍生的NT Vs. IR比较显着。在指示照射后PS的OFF / ON(黑/白色调节)行为。分离方法用不同的形状描绘。仅在照射后仅存在几种PS,大部分可能是由于样品号,并且只考虑了辐照或控制的完全数据存在的情况;与I.数字标签X_1,X_2和X_3指示PS X是否来自单独或常见的磷酸化肽;衍生自这些肽的当量ps标记为*。 一世) EmplMap可视化富含PTM-Sea Kinase-PSP_ATM签名的PS。所示的PTM-Sea Kinase-PSP_ATM签名。测量的log2强度为每个PS编码。黑色表示无检测。为了 为所有样本启用A-I MaxQuant MBR。
      U2OS细胞在照射诱导的DNA损伤后显示已知的磷酸化响应,并且通过磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶引发DNA损伤信号传导,例如ATM,ATR和DNAPK / PRKDC(
      • Beli P.
      • Lukashchuk N.
      • 瓦格纳S.A.
      • Weinert B.T.
      • 奥尔森J.V.
      • Baskcomb L.
      • 杰克逊S.P.
      • C.
      蛋白质组学研究揭示了RNA处理因子Thrap3在DNA损伤反应中的作用。
      )。为了研究在用尿素的磷蛋白质分析捕获该反应的程度的可能差异,使用我们推断的激酶活性(INKA)分析管道(
      • Beekhof R.
      • van Alphen C.
      • Henneman A.A.
      • knol J.C.
      • PHAM T.V.
      • rolfs f.
      • 刹车M.
      • Henneberry E.
      • Le大T.Y.
      • de haas r.r.
      • 派尔斯队S.R.
      • Vurchio V.
      • Bertotti A.
      • Trusolino L.
      • verheul h.m.
      • JIMENEZ C.R.
      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      )。在比较未经处理的(NT)与辐照(IR)样品比较时,测试所得的喷墨得分以进行显着差异。此分析返回ATM,CheK1 / 2和DNAPK / PRKDC作为每种情况的顶部命中(补充图2 E-F 补充表1 e),在照射后一小时内预期细胞(
      • Beli P.
      • Lukashchuk N.
      • 瓦格纳S.A.
      • Weinert B.T.
      • 奥尔森J.V.
      • Baskcomb L.
      • 杰克逊S.P.
      • C.
      蛋白质组学研究揭示了RNA处理因子Thrap3在DNA损伤反应中的作用。
      ,
      • 松山S.
      • Ballif B.A.
      • Smogorzewska A.
      • 麦当劳e.r.
      • Hurov K.E.
      • 罗杰。
      • bakalarski c.e.
      • 赵Z.
      • 萨米尼尼尼。
      • Lerenthal Y.
      • Shiloh Y.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      ATM和ATR底物分析显示响应DNA损伤的广泛蛋白质网络。
      ,
      • Bensimon A.
      • Aeberberold R.
      • Shiloh Y.
      超越ATM:DNA损伤反应的蛋白质激酶景观。
      )。此外,这些激酶的折叠变化显示出两种提取方法之间的强相关性,与类似的墨水分数相关(Fig. 1 D).
      我们接下来使用PTM-SEA(
      • 克鲁格克。
      • Mertins P.
      • 张B.
      • 犀鸟P.
      • Raju R.
      • Ahmad R.
      • Szucs M.
      • Mundt F.
      • 林业D.
      • Jane-valbuena J.
      • Keshishian H.
      • Gillette M.A.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      • MANI D.R.
      磷酸化特异性签名分析的策划资源。
      )磷酸化特异性签名分析工具,以鉴定尿素或RNAB提取后未处理的与辐照细胞中的信号传导途径和激酶活性的辐照诱导的变化。类似于Inka分析,发现在照射后富集ATM和Chek1 / 2激酶的签名,而不管使用的萃取方法(补充图2 G-H补充表1 F-G)。此外,在照射后富集电离辐射,UV和ATR特异性签名,而细胞周期相关的CDK1 / 2和Nocodazole签名是负富集的。两种提取方法的归一化富集分数的显着签名显示出高相关(Fig. 1 E).
      由于这些签名是分组术语,并且单个PS可能根据所应用的提取方法而不同,因此我们进一步检查了与PTMSIGDB储存库所定义的DNA损伤响应的候选签名重叠的磷酸水,更多地(图1 f-i补充图3)。对于Kinase-PSP_ATM签名的PS,我们发现在匹配Eliched PS序列窗口时,我们发现了强烈的窗口进行提取方法(Fig. 1 F)。对于每种条件(NT或IR),为尿素和RNAB提取的样品的PS强度共同计算的标准偏差显示峰接近零(Fig. 1 G)。此外,对IR与NT样品中这些PS的折叠变化对于拔出方法(Fig. 1 h),也发现了PS强度(图1是我)。为ATR,AurkB和CDK1签名(激酶-PSP_ATR,激酶-PSP_Aurb / Aurkb和激酶-PSP_CDK1为类似的观察结果。 补充图3 a-l )。
      虽然对DNA损伤的磷酸化反应主要通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶介导(
      • Bensimon A.
      • Aeberberold R.
      • Shiloh Y.
      超越ATM:DNA损伤反应的蛋白质激酶景观。
      )与丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点相比的磷酸酪氨酸(PTYR)位点的总比分别为低(1:1800和1:200(
      • ong s.e.
      • Grønborgm.
      • 斯丁H.
      • Jensen O.N.
      • Pandey A.
      用质谱分析蛋白质磷酸化:解密磷蛋白酶。
      )),我们还通过尿素或rnab提取后PTYR位点的可能差异(补充图4)。我们观察到少数PTYR位点,并在每种样品平均鉴定76个PTYR位点(占总磷酸水的0.84%)(补充表1 B-C)。当第1类PTYR站点强度时,没有观察到明确差异(补充图4 a-b[每种治疗,比较尿素对尿素对rnab ps的标准偏差(补充图4c )。
      对于上述分析,我们在MaxQuant软件中启用了运行(MBR)选项之间的匹配,基于精确的质量和保留时间值在样本之间传输MS1识别功能(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      ,
      • prianichnikov n。
      • koch h.
      • 科赫斯。
      • Lubeck M.
      • Heilig R.
      • Brehmer S.
      • 菲舍尔r.
      • Cox J.
      离子移动性增强霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant软件。
      )。由于这可能导致尿素和RNAB提取的样品之间的重叠较高,因此我们对U2OS细胞重复了所有分析,而不允许在MaxQuant中的两个提取组之间的识别转移,因此在允许时分别处理两个组(MBR-OFF)由相同协议隔离的样本中的特征传输(补充图5 - 9)。正如预期的那样,这导致重叠级别1 PS的百分比下降(补充图5 b,f),减少样品相关性(补充图5c)当我们应用UMAP算法时,通过提取组分离样品(补充图7 d)。但是,基于Inka分析的细胞的生物响应为照射(补充图7 E-F,5 d)和PTM-SEA(补充图7 G-H,5 e)不受萃取组的单独加工的影响。我们还重复了对PTM-Sea签名的更详细分析,并发现它们大多与MBR-OFF设置保持不变(补充图5 g-i,8 b-l)。用MBR-OFF鉴定的1类PTYR位点与用MBR-ON鉴定的群体相当。虽然仅在一个分离基团中鉴定了几种PTYR位点,但没有发现对提取方法的清晰偏好(补充图9)。同样对于尿素提取的样品,MBR截止设定导致相关系数的滴度,其数量级类似于MBR-OFF尿素和RNAB样品的比较(补充图5c和10 a)。对于RNAB提取的样品,观察到与MBR-ON相比,与MBR-OFF相关的相似下降(补充图5c和10 b)。这表明MBR选项对样本相似性和相关性具有更强的影响,而不是尿素和RNAB隔离之间的差异。

       用尿素或RNAB提取的鼠和人体组织材料的磷蛋白蛋白质数据具有高度相关性

      作为原理的进一步证明,我们将两种提取方案的比较扩展到鼠和人体组织材料(Fig. 2)。我们首先用RNAB或尿素从正常小鼠肝组织(四次重复)中的蛋白质分离出来,类似于上述U2OS细胞并应用于上述TIO2 磷蛋白酶工作流程。总共鉴定了9040个磷酸水,平均每种样品为6556 ps(补充图11补充表1 i)。所有鼠肝脏样品都显示出相当的缺失值数,尤其是一种尿素提取的样品,其比所有其他样品显着较少的PS识别(补充图11A)。对于这种肝脏复制,由于脱盐柱损害胰蛋白酶消化后,样品清洁。如图所示,对于U2OS细胞,鉴定的PS对于两种提取方法高度重叠,具有94.3%的高型级别1 PS的共享识别(Fig. 2 A和 补充图12)。还发现了1级PS比例等于两种不同的提取方法(Fig. 2 一个)。非共享类1 PS显示比共享1 PS的定位概率较低(补充图12 A-B)。此外,当非共用类1 PS的基因名称用于基因本体学分析时,没有发现与RNAB或尿素提取的重大术语(补充图12 c)。标准化数据的相关分析(Fig. 2 b)不完全能够区分提取技术和整体展示非常高的相似性,与〜0.93的最小相关系数(Fig. 2 b)。计算所有鼠肝脏类别1的标准偏差,无论隔离方法如何均显示零点左右(Fig. 2 c),表明这些磷酸圈的非常高的相似性。当研究第1类鼠肝PTYR位点(检查每个样品的平均51)时,没有观察到明显差异(补充图13, 补充表1 J )。
      图缩略图GR2.
      图2. 用尿素裂解缓冲液或RNA-BEE提取的小鼠和人组织材料的磷蛋白酶数据比较显示出高的相关性。 一个) 鼠肝组织:上杆图显示了尿素和RNAB的自信定位(1)磷酸酯(PS)的比例。显示尿素和RNAB之间检测到的1 ps的大重叠的低venn图。识别PS的序列窗口用于重叠。 b) 鼠肝组织:热图显示尿素和RNAB之间的相关性和强烈相似性。 Pearson相关系数(Corr.Coeff)基于归一化强度数据和1类磷酸水。 C) 鼠肝组织:无论隔离方法如何,所有样品都计算了1类磷酸酯的标准偏差。绘制了所得到的频率分布。 d) 人体组织:与 A对于正常肝脏(左),HCC(中)和黑色素瘤(右)。 e) 人体组织:与 B对于正常肝脏(左),HCC(中)和黑色素瘤(右)。 F) 人体组织:进行单一样本推断激酶活性(INKA)分析以检测活性激酶。散点图显示尿素和rnab孤立标本的墨水分数的相似性。墨水分数从三个重复和基于尿素提取的基团的排名激酶活动的平均值进行了平均。在所有样品中计算出墨水分数的标准偏差(SD),而无论隔离方法如何,都是彩色编码。相关因子在每个面板的右下角表示。正常肝脏(左),HCC(中)和黑色素瘤(右)。 G) 人体组织:相同 C对于正常肝脏(左),HCC(中)和黑色素瘤(右)。为了 对于所有样本都启用了g maxquant mbr。
      我们接下来使用正常的人体组织材料来比较尿素和RNAB隔离方法用于磷蛋白酶。我们使用尿素或RNAB从人正常肝脏,肝细胞癌(HCC)和黑色素瘤中分离蛋白质(每组组织和分离方法3重复),并再次富含磷酸肽与我们的TIO2 程序。由于这些样品在组织源和收集程序中不同,因此我们分别分析它们的尿素和RNAB衍生数据/ rnab衍生数据(图2 D- G, 补充图14-18)。根据组织来源,我们鉴定了不同数量的PS,从8764 ps的正常肝脏(平均6320 ps /样品)为8571 ps,对于HCC(平均6154 ps /样品)和4530 ps的黑素瘤(平均为3075 ps样本)。用尿素提取的样品与RNAB提取的样品之间没有明显差异(补充图14补充表1 m,r,w)。如上所述,鉴定的PS对于两种提取方法强烈重叠,具有大约90%的高型级别1 PS的共享识别。对于U2OS细胞或鼠肝样品(鼠肝样品)观察到,我们注意到了约5%的重叠(Fig. 2 D和 补充图15)。至于U2OS细胞和鼠肝,1级PS比例被发现等于两种不同的提取方法(Fig. 2 d)和非共享类1 PS显示出比共享1 PS的定位概率较低(补充图15)。当在基因本体分析中比较非共用类1 pS的基因名称时,发现少数重大术语,具体取决于组织来源(补充图15c,f,i)。这些术语彼此无关。归一化数据的相关性分析每个组织原点的提取技术都具有萃取技术,但总体上显示出非常高的相似性,呈现出非常高的相关系数为0.87-0.91(Fig. 2 e)。我们接下来通过Inka分析推导出用于人体组织样品的激酶活性。当尿素或rnab提取的样品的墨水疮彼此绘制时,我们观察到HCC样品的整体最低关联系数为0.95的每个组织类型非常高的相关系数(Fig. 2 F)。我们还检查了每人组织所有1磅PS的标准差(无论隔离方法)。如观察到鼠肝脏样品,我们的计算导致每种组织再次零峰(Fig. 2 G)。对肝脏,HCC和黑色素瘤样品的1类PTYR位点的分析显示出与U2OS细胞和鼠肝脏样品非常相似的结果,尿素或RNAB提取没有明显差异(补充图16-18)。 PTYR位点的样本平均级别为人类肝脏的96类,HCC为51个,13例为黑素瘤样品(补充表1 n,s,x )。
      最后,我们重复了鼠和人体组织的分析,而不会在尿素和Rnab中提取的样品之间转移鉴定特征(MBR-OFF, 补充图19-28)。如图所示,对于U2OS细胞,为鼠标滴(补充图19A达到78.5%)和人类(补充图19 D.,〜70%)组织样品。样本相关性(补充图19 b& E)再次降低到与U2OS细胞观察的相似程度(补充图5c)。相比之下,推导出激酶活动(补充图19 f)1 PS的标准偏差(补充图19 c& G)当MBR在尿素和RNAB分离的样品之间关闭时,大大不受影响。虽然仅在一个分离基团中鉴定了几种PTYR位点,但载入的1个MBR-off PTYR位点与MBR-on Surte相当。在这方面,发现了对提取方法的明确偏好(补充图22,
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      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      )。当我们比较尿素MBR-ON和MBR-OFF以及RNAB的MBR-ON和MBR-OFF样品彼此组织(补充图23和29 相比 补充图19 b和e),我们再次观察到MBR选项对磷的相似性更强,而不是提取方案。
      一起带着, 基于来自细胞系,鼠组织和人(肿瘤)组织的AGPC提取的蛋白质样品的磷蛋白酶分析完全重新承载通过尿素缓冲溶解制备的蛋白质提取物获得的结果。

      讨论

      使用“OMICS”技术,现在可以全面地量化和表征样品中存在的几乎所有生物分子。但是,这需要不同类型的生物分子的专用工作流程。用小样品,将它们分成等分试样的问题成为不同的工作流程的等分试样,例如,为不同的工作流量覆盖足够的输入材料。转录组织和蛋白质组学。在这些情况下,从相同的样品中提取不同类型的生物分子变得不可避免。一种这样的策略是使用硫氰酸胍 - 苯酚 - 苯酚 - 氯仿(AGPC)提取物的有机相,通常在检测含RNA的水相后通常丢弃,以检索样品的蛋白质补充剂。虽然已经表明这种方法对于两个蛋白质组学都是可行的(
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      选择合适的蛋白质提取方法,以研究玉米光合组织的磷脂体。
      ),对其相对于专用(“常见”)提取程序的直接和彻底的比较尚未针对磷蛋白组来报告。在这里,我们表明,来自有机AGPC(RNAB)级分的蛋白质提取可以用磷蛋白蛋白酶工作流程中的尿素缓冲液,同等捕获中央磷蛋白玩家以及细胞系中的功能生物学以及小鼠和人组织中的蛋白质裂解。
      为了我们的第一次比较,我们使用细胞的良好研究响应DNA损伤(
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      蛋白质组学研究揭示了RNA处理因子Thrap3在DNA损伤反应中的作用。
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      DNA损伤后核磷脂组体的ATM依赖性和依赖性动态。
      )作为磷酸化变化的触发。用两种不同的提取程序获得的结果非常相似,具有超过94%的所有类-1磷酸酯的共用。
      在DNA损坏刺激后推断激酶活性,我们应用我们最近开发的单一样本喷墨算法(
      • Beekhof R.
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      Inka,一种用于活性激酶的磷蛋白蛋白质推理的一体化数据分析管线。
      )。我们在照射后识别的推导的激酶,例如ATM,ATR,CheK1 / 2和DNAPK / PRKDC,均详细描述了DNA损伤信号的关键激酶,并参与额外下游DNA修复因子(
      • Blackford A.n.
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      ATM,ATR和DNA-PK:DNA损伤反应的核心的三位一体。
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      DNA损伤激酶信号:30年来检查点和维修。
      )。我们通过翻译后修饰签名浓缩分析(PTM-SEA)确认了我们的调查结果用墨水算法(
      • 克鲁格克。
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      磷酸化特异性签名分析的策划资源。
      )使用从数据库组装的签名术语(
      • 克鲁格克。
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      磷酸化特异性签名分析的策划资源。
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      • Latham V.
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      磷酸化多样,2014年:突变,PTM和重新校准。
      )。尿素和RNAB衍生数据来自先前研究U2OS细胞的系统响应对磷蛋白蛋白酶水平的DNA损伤的研究,显示出归因于ATM,ATR,DNAPK / PRKDC和CHEK1 / 2在照射时增加的磷酸化(
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      蛋白质组学研究揭示了RNA处理因子Thrap3在DNA损伤反应中的作用。
      )。
      ATM,ATR和CHEK1 / 2激酶活性的一种效果是抑制CDK,以防止DNA损伤后通过细胞周期进一步进展(
      • Reinhardt H.C.
      • Yaffe M.B.
      控制细胞周期的激酶响应DNA损伤:CHK1,CHK2和MK2。
      )。对于尿素和RNAB衍生的磷化物数据PTM-SEA确定了照射后负富集的CDK1 / 2签名。这与两种先前的磷蛋白酶研究相同,其中CDK2的靶标在用辐射瘤新arzinostatin治疗后在G361人黑素瘤细胞中显示出降低的磷酸化(
      • Bensimon A.
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      DNA损伤后核磷脂组体的ATM依赖性和依赖性动态。
      ),或者发现CDK2序列基质在B淋巴细胞细胞照射后在磷酸化(
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      DNA损伤反应期间核蛋白质组特异性磷酸化动力学。
      )。
      PTM海 提供了强大的浓缩分析方法,主要取决于当前的磷酸化签名注释,从未完成的数据库可获得的激酶,ertubations和途径。超过95%的全部报告的人磷酸水激酶或生物学功能是未知的(
      • Centerham E.J.
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      • Burykin T.
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      照亮深色磷脂蛋白酶。
      )。
      与PTM-SEA一样,INKA分析也捕获了尿素和RNAB衍生数据类似的CDK1 / 2分数减少(补充表1 e),但Inka评分没有显着差异。另一方面,Inka分析表明尿素和RNAB数据辐射后的PBK活性降低,所述尿素和RNAB数据未与PTM-SEA检测到。 PBK / TOPK(PDZ结合激酶/ T-L-L-LAK细胞源自蛋白激酶)参与细胞周期和有丝分裂进展(
      • 赫伯特K.J.
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      T-Lak细胞源自蛋白激酶(TOPK):癌症特异性治疗的新出现靶标。
      )。在纤维糖瘤细胞中,显示在多柔比蛋白诱导的DNA损伤和PBK过表达,细胞绕过G2 / M DNA损伤检查点并进入下一个有丝分裂(
      • Nandi A.K.
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      通过PBK衰减DNA损伤检查点,一种新型丝分裂激酶,涉及与肿瘤抑制器P53的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      ),这可能解释细胞的需要在DNA损伤的情况下调节PBK活性。
      在一起,我们对未处理和辐照的U2OS细胞的比较在诱导DNA损伤时再现先前发现的激酶活性,并且鉴定的激酶活性变化在很大程度上对两种提取方法重叠。
      为了我们对PhopSheCroticomics使用的有机AGPC(RNAB)和尿素缓冲溶解的比较,我们还使用了更复杂的鼠和人体组织材料。我们的结果清楚地清楚地概括了用U2OS细胞观察到的发现,并支持来自两个提取方案的数据的非常高的相似性。
      运行(MBR)算法之间的MaxQuant匹配旨在肽的再现性较高,因此蛋白质量化。它通过允许基于精确的质量和保留时间值允许样品之间的MS1识别特征转移MS1识别特征(
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      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
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      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )。因此,启用MBR算法可能导致UREA和RNAB提取导出数据的更高相似性。实际上,没有MBR,我们观察到在两种不同隔离方案的样品对细胞和组织的可比程度上的1ps级别的重叠和相关性,但是数量仍然足够高。此外,细胞对从组织数据中推导的照射和激酶活动的生物响应不受MBR选项的调节的影响,这涉及MBR诱导的任何潜在偏差。此外,当我们使用相同方案处理的样品比较MBR-ON比较时,我们观察到相关程度的相关程度。最近表明,通过MBR的错误转移数量高,但通过用下游MaxQuant LFQ算法处理蛋白质水平量化(
      • Lim M.Y.
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      • Gygi S.P.
      使用双蛋白质组模型评估匹配与运行算法的误传递速率。
      )。然而,MBR算法对磷酸肽或磷酸盐水平的错误转移的贡献较小,并且我们正计划额外的实验以进一步检查这一点。
      总之,我们显示尿素或AGPC萃取后鉴定的磷酸水的高相似性,并使用抗体延伸先前的发现(
      • 谦卑A.B.
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      • difilippantonio m.j.
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      延长贮藏后患者材料尿液萃取RNA和DNA后的蛋白质分离和溶解。
      )。因此,基于AGPC的蛋白质提取与随后的磷酸磷蛋白质分析研究非常相容,并且当样品材料有限时,可能是用于同时分离多种生物分子的优选方法,例如DNA,RNA和蛋白质/磷蛋白。基于AGPC的提取可能适用于微观的临床活组织检查工作流程,并努力在癌症等疾病中进行个性化多环境数据分析。在这方面,最近的工作证明了微观的蛋白质工作流程的效用,从人乳腺癌核心针活检中分离蛋白质,磷蛋白,DNA和RNA(
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      精密肿瘤学的微观蛋白叶蛋白酶学方法。
      )。这里,样品被连续切断和收集的交替切片分开分离蛋白质和核酸。我们的研究结果表明,AGPC可能会使来自芯针活检的蛋白质和核酸同时提取蛋白质和核酸。在未来的研究中需要解决AGPC的蛋白质提取物用于分析其他翻译后修改的效用。

      竞争利益宣言

      作者宣称没有利益冲突。

      致谢

      我们感谢Richard R. de Goeij-de Haas博士为TiO2舞台提示,Jaco C. Knol博士为批判性阅读和关于文本的建议。我们要感谢Amsterdam UMC,Henk Dekker和Mariette Labots的病理部,以帮助人类组织样本。我们进一步感谢癌症组织和Jonkers实验室的所有成员,以便在该项目期间进行讨论和支持。这项工作得到了来自德国研究基金会(DFG)的奖学金,并由荷兰科学研究组织(NWO-MiddelGroot项目91116017至CRJ),荷兰癌症协会(KWF项目VU2013-6423)提供支持。欧洲联盟Horizo​​ n 2020 MarieSkłodowska-Curie Grant(协议722729)和持仓研究所的研究和创新计划,部分由KWF融资。

      补充数据

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据和MaxQuant软件生成的文本文件已通过骄傲沉积在Proteomexchange联盟上(
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