染色质蛋白质组学研究表观遗传学 - 挑战和机遇

  • Guido Van Mierlo
    一致
    对于通信:Guido Van Mierlo; Michiel vermeulen.
    隶属关系
    Radboud Solidular Life Sciences,Onodode Institute,Radboud University,Nijmegen,Nijmegen,Nijmegen,Nijmegen,Nijmegen,荷兰的分子生物学系
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  • Michiel vermeulen.
    一致
    对于通信:Guido Van Mierlo; Michiel vermeulen.
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    Radboud Solidular Life Sciences,Onodode Institute,Radboud University,Nijmegen,Nijmegen,Nijmegen,Nijmegen,Nijmegen,荷兰的分子生物学系
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开放访问发布:2月5日,2021年DOI://doi.org/10.1074/mcp.R120.002208

      强调

      • 蛋白质组学方法研究染色质和基因调控的概述。
      • 突出了不同方法的力量和局限性。
      • 染色体蛋白质组学突出挑战的观点。
      • 讨论了染色质蛋白质组学的未来方向。
      基因表达的调节对于所有真核生物的运作至关重要。了解基因表达调节需要确定哪种蛋白质与染色质中的调节元素相互作用。染色质的基于MS的分析是鉴定与基因调节相关的蛋白质的强大工具,因为它允许在其上学习蛋白质功能和蛋白质复杂形成在体内染色质上下文。在基于MS的分析之前,可以在基于MS的分析之前直接分析从细胞中分离的染色质分离的总染色质。在DNA复制期间组装的新形成的染色质也可以特别分离和分析。此外,捕获特异性染色质域有利于鉴定与这些结构域相互作用的先前未知的转录因子。最后,近年来,已经对鉴定与单一基因组的兴趣区相互作用的蛋白质进行了进展。在本综述中,我们突出了染色质蛋白质组学方法的力量以及这些方法以及与常规亲和纯化方法相比的互补替代品。此外,我们讨论了应解决的生化挑战,以巩固和扩展染色质蛋白质组学的作用作为基因表达调控和健康疾病的表观生物学研究中的关键技术。

      图形概要

      关键词

      缩写:

      AP (亲和力净化), CHEP. (染色体富集蛋白质组学), 芯片Sicap. (染色质相关蛋白的芯片和选择性分离), Chrop. (染色质蛋白质组), 德拉克 (染色质MS分析的密度基富集), DIA (独立数据的收购), HRP. (辣根过氧化物酶), mnase. (微核核酸核酸酶), nur (核微血体重塑和脱乙酰酶), PPI. (蛋白质 - 蛋白质相互作用), (内源蛋白的快速免疫沉淀MS), TFS. (转录因素), XL-MS. (交联 - 女士)
      存在于每个真核细胞中的染色质,是DNA和蛋白质的复杂组装,其在基因表达的调节中起着核心作用。基因表达调节涉及募集蛋白质(所谓的转录因子[TFS])对基因组中的调节区域,例如启动子和增强剂。因此,这些TFS募集了多种因素,包括染色质修饰和染色质重塑复合物,这取决于它们的功能,介导基因的转录活化或沉默。为了理解基因表达的调节方式,染色质研究旨在鉴定所有TF结合位点,如何募集TFS和调节蛋白质复合物如何募集到这些位点,以及这将如何影响局部染色质环境。为了确定感兴趣的相关蛋白的基因组 - 染色蛋白相关的蛋白质,染色质免疫沉淀,然后在靶向下测序和切割,使用核酸酶释放是最广泛使用的方法(
      • 约翰逊D.S.
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      基因组范围内的映射 在体内 蛋白质-DNA相互作用。
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      一种有效的DNA结合位点高分辨率映射的有效核酸酶策略。
      )。这些技术使用针对感兴趣的蛋白质的抗体,然后用免疫沉淀(IP)和共用DNA片段的测序,允许针对这些蛋白质的位置对基因组的尺度进行精确定位。这种测定经常用诸如使用测序鉴定可接近的染色质区域的转座酶可接近染色质的测定的技术(
      • Buenrostro J.D.
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      • 常熟。
      • greenleaf w.j.
      天然染色质的转子用于开放染色质,DNA结合蛋白和核小体位置的快速敏感表观型分析。
      )和RNA-SEQ确定这些基因的表达状态。这些测定在一起允许确定蛋白质的基因组结合,以及这些结合位点是否与活性或无活性染色质有关。此外,可以基于基础的DNA序列(以下)可以计算结合那些区域的新型调节蛋白。
      • 李Z.
      • Schulz M.H.
      • 看起来t.
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      使用ATAC-SEQ鉴定转录因子结合位点。
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      GimMemotifs:转录因子基序分析的分析框架。
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      • 刘B.
      • 马Q.
      利用深层学习框架预测人芯片测序数据的调控基序。
      )。
      基因组的分析技术对于我们对基因调控的理解至关重要。然而,这些技术不能提供染色质的无偏见和综合视图,因为它们仅限于一次研究一种或几种蛋白质,因此有限地是它们鉴定新型染色质调节蛋白的能力。此外,基因组学技术(1)略微偏向于活性染色质地(
      • Teytelman L.
      • Thurtle D.M.
      • rine J.
      • 范欧雅纳州A.
      高表达的基因座容易受到多个无关蛋白质的误导性芯片定位。
      ); (2)TF结合的计算预测取决于关于基于DNA-MOTIF的预测的预先存在的知识; (3)提供有关与直接与DNA与DNA相互作用的蛋白质相互作用基序的有限知识,例如核体和组蛋白修饰的粘合剂; (4)偏向于具有预期染色质函数的蛋白质,因此忽略了潜在的“展示蛋白质”。为了克服这些限制,已经开发出高分辨率的MS方法以以更全面和无偏见的方式研究蛋白质功能和蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)(
      • smits a.h.
      • vermeulen M.
      使用质谱分析蛋白质 - 蛋白质相互作用:挑战和机遇。
      )。为研究表观遗传过程和创新方案的开发,改编这种工作流程的适应性显着增强了可用于研究染色质的健康和疾病的过程的工具箱。这些最近的进步将是本综述的重点,我们突出了这些工作流程的优势和局限性。我们进一步讨论了突出的挑战和机遇以及如何解决这些问题。虽然本综述主要侧重于TFS,但是许多讨论的技术也可以适用于研究其他染色质特征,例如组蛋白修饰。

      小姐 的染色质富集策略

      整体方法在研究中提供了一个强大的起点,旨在将两个或多个条件相互比较,例如健康 相对 患病细胞。纯化染色质,然后基于MS的分析允许以细胞型或疾病特异性方式鉴定染色质蛋白质组。与全细胞蛋白质或甚至核蛋白质群体的基于MS的基于MS的分析相比这种方法的优点是它允许测量通常在LC-MS之前没有广泛的样品分级而没有大量样品分级的染色质相关因子(
      • Kustatscher G.
      • 赫格拉特N.
      • 遗嘱k.l.h.
      • 毛皮C.
      • Bukowski-Wills J.-C。
      • Hochegger H.
      • Rappsilber J.
      模糊器材的蛋白质组学:间染色体。
      )。鉴定染色质相关蛋白质组的初步努力使用粗细胞分级以获得天然染色质馏分(Fig. 1A),其在定义与癌基因过度表达相关的新型TFS时高度信息 c-myc. (
      • Shiio Y.
      • 艾森曼r.n.
      • yi e.c.
      • Donohoe S.
      • Goodlett D.R.
      • Aeberberold R.
      染色质相关因素的定量蛋白质组学分析。
      )。用于染色质分离的亚细胞分级具有额外的益处,即细胞质和核部分可以使用蛋白质组学分别分别分析,允许对细胞质和染色质之间的蛋白质易位进行调查(
      • van mierlo g.
      • Wester R.A.
      • 标记H.
      使用硅胶的定量亚细胞蛋白质组学揭示了多能地面状态的增强的代谢缓冲。
      )。这是发现可能在细胞质中的蛋白质中的蛋白质的重要​​工具,但在细胞或环境变化时易于诱导基因表达的核心。值得注意的实例包括具有PDZ结合基序蛋白的Yes相关的蛋白质和转录共粘膜,其是河马信号传导途径的效应模块。它们的核细胞质分布是它们活性的关键决定因素,并且在许多癌症中观察到具有PDZ结合基质的Yes相关蛋白/转录同学的异常核定位(
      • Shreberk-Shaked M.
      • oren m.
      新洞察yap / taz核细胞质穿梭:新癌症治疗机会?
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1将染色质分离染色质的方法. A,细胞质中的天然细胞的原油分馏(在低盐孵育后获得),细胞核和染色质。 B,交联,然后是SDS-尿素介导的染色质分离。 C,使用CSCL超速离心从交联核提取物中分离染色质。在CSCL梯度中,自由DNA最终在梯度顶部的颗粒,游离蛋白质,中间的蛋白质-DNA复合物。通过将针插入管的侧面,可以隔离这种中间部分。 D,使用MNA酶分离(主要)欧洲蛋白。 E,使用简短的MNA酶消化和洗涤分离欧氏蛋白和异铬胺。注意,D-帽首先用盐进行核,以除去Nontightly结合的蛋白质,并且在MNA酶消化后,只需释放蛋白质“紧密”结合染色质。相反,在差分中的MNA酶消化中,简要消化导致单核糖体片段(欧核区)的释放,并且第二洗涤而是更加异种色素蛋白。 F,使用不同的NaCl浓度分离硝基,欧芳族和异色蛋白。 G,染色质分离使用蔗糖密度超速离心。在该梯度中,渐变或较重的蛋白质和复合物在梯度中最终降低。使用针在几个位置使用针头的馏分分离不同尺寸的染色质部分。注意,该方法仅用于在异铬胺馏分上进行蛋白质组学。 HI,掺入胸苷类似物以纯化新生(IPOND和NCC)或全(DM-CHP)染色质。 CSCL,氯化铯; D-帽,差分染色质相关蛋白; DM-CHP,DNA介导的染色质下拉; Ipond,蛋白质的分离在新生DNA上; mnase,微核核酸核酸酶; NCC,新生的染色质捕获。
      虽然已经采用了天然的染色质纯化以获得新的洞察各种生物过程(
      • Shiio Y.
      • 艾森曼r.n.
      • yi e.c.
      • Donohoe S.
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      染色质相关因素的定量蛋白质组学分析。
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      • van mierlo g.
      • Wester R.A.
      • 标记H.
      使用硅胶的定量亚细胞蛋白质组学揭示了多能地面状态的增强的代谢缓冲。
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      • elldege s.j.
      染色质定位筛选筛选聚(ADP核糖) - 调节抑制作用的抑制作用和NURD复合物对DNA损伤的部位。
      ),这些粗ue提取方法易于通过细胞质蛋白污染(
      • Kustatscher G.
      • 赫格拉特N.
      • 遗嘱k.l.h.
      • 毛皮C.
      • Bukowski-Wills J.-C。
      • Hochegger H.
      • Rappsilber J.
      模糊器材的蛋白质组学:间染色体。
      )。蛋白质组学(CHEP)方法的染色质富集,其依赖于染色质提取之前依赖于甲醛交联,是减少细胞质蛋白污染的相对简单的方法(
      • Kustatscher G.
      • 遗嘱k.l.h.
      • 毛皮C.
      • Rappsilber J.
      染色体富集蛋白质组学。
      )(Fig. 1B)。因此,CHEP已成功地研究不同生物的多种细胞类型的染色质(例如,(
      • Batugedara G.
      • 鲁X.M.
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      多能性和早期血统承诺中染色质相关蛋白质的质谱调查。
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      细胞周期依赖性蛋白酶体对染色质的定位。
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      • Fukagawa T.
      • expershaw w.c.
      • Rappsilber J.
      使用络合物组合蛋白质组学确定有丝分裂染色体的蛋白质组成。
      )))。然而,染色质仍然是生物化学上挑战的细胞器,可能是由于其带来的高度充电性(
      • OHTA S.
      • Bukowski-Wills J.-C。
      • Sanchez-Purido L.
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      • Rappsilber J.
      使用络合物组合蛋白质组学确定有丝分裂染色体的蛋白质组成。
      ),CHEP程序仍然导致细胞溶质污染,例如线粒体蛋白质(
      • Kustatscher G.
      • Grabowski P.
      • Rappsilber J.
      染色质数据线粒体综合体组织细胞器阴影组合蛋白质组学。
      )。更新的交联染色质富集的适应包括染色质(DEMAC)的MS分析的密度基富集,其依赖于交联核,裂解和随后在由氯化铯制成的浮力密度梯度中的交联裂解物的超速离心(
      • ginno p.a.
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      细胞周期分辨的染色质蛋白质组学揭示了基因组调控景观的有丝分裂保存的程度。
      )(Fig. 1C)。在交联之前使用核隔离和以可溶性形成染色质的染色质液可能导致来自与染色质交联的细胞质蛋白的污染较低。因此,虽然由于需要超速离心的要求,在技术上比CEP更具有挑战性,但DEMAC具有能够使染色质相关蛋白质组的表征具有低水平的污染物。因此,DEMAC是一种有价值的工具箱,用于在不同细胞环境中研究染色质相关蛋白质的染色蛋白相关的蛋白质。

      欧洲甜菜碱与蛋白质组学异染色素的分离

      除了用于分离细胞的完全染色质级分的方案之外,已经开发了几种分馏方法,以分离开放或“转录活性”区域,称为euchromatin,从闭合或“转录无活性”区域中称为杂粒素。虽然〜30%的人类基因组由监管要素组成(
      • 摩尔J.E.
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      • 等等。
      在人和小鼠基因组中扩增DNA元素的对细胞分子。
      ),仅在给定的单元格类型中只有一个小的这些子集是“活动”。在粗染色质级分的基于MS的分析中,丰富的结构染色质蛋白因此掩盖与这些活性位点相互作用的低丰富的调节蛋白。因此,基因组的欧氏蛋白或异铬胺区域的选择性富集是一种双目的:一方面,它将染色质蛋白质分类为与活性或抑制染色质有关,而另一方面则促进只有绑定的低丰富TFS的检测一个(子)欧洲地区的套。可以通过天然和交联的染色质制剂来实现这种分离。天然染色质可以暴露于洗涤剂以利用与染色质的蛋白质结合的强度,这取决于染色质特征,包括辅因子的结合和结构变异(
      • inukai s.
      • Kock K.H.
      • Bulyk M.L.
      转录因子-DNA结合:超出结合位点图案。
      )。使用不同量或时间点的微观核酸酶(MNA酶)消化本地核将首先释放与欧甲磺汀相关的蛋白质,并随后由于核细胞区域的偏好偏好而与稠合的异铬胺相关的蛋白质相关的蛋白质(
      • Axel R.
      用葡萄球菌核酸酶解核和染色质中DNA的切割。
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      选择性微核核酸酶消化后,母鸡输卵管染色质的分馏转移到转录活性和无活性区域。
      )。结合释放的级分的蛋白质组学分析,这揭示了与活性染色质相关的蛋白质的见解,以及蛋白质如何根据细胞背景迁移在染色质上(
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      染色质蛋白的差异结合将BAF60A / SMARCD1鉴定为胚胎干细胞分化的调节剂。
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      综合蛋白质组学分析揭示了PRC2依赖性表观遗传串扰,保持地态多能性。
      )(Fig. 1, DE)。正交方法是将天然核暴露于不同浓度的盐,因为TF结合主要由静电相互作用驱动(
      • Henikoff S.
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      盐分裂的基因组分析图染色质的物理性质。
      )。暴露于增加盐浓度的核的MS分析显示,在较低的盐浓度(〜250mM NaCl)下释放出欧元族因素,而异铬胺蛋白需要更高的盐浓度(〜600mM NaCl)(
      • 联邦A.J.
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      转录因子和核蛋白的高度平行量化和隔室定位。
      )(Fig. 1F)。分离Euchromatin和异叶蛋白称为梯度-SEQ的第三种方法使用与DEMAC相当的交联方法,并利用诸如蔗糖梯度中的粗染色质片段的超速离心。该方法根据其沉降率分离分子,其主要由分子的大小决定(Fig. 1G)。这与氯化铯梯度相反,分子基于其蛋白质-DNA比弥漫。梯度-SEQ方法已经用于研究难以超声的异铬甜素区域,并且该部分的基于MS的分析显示出与与单色区域相关的先前描述的蛋白质呈现良好的一致性(
      • Becker J.s.
      • 麦卡锡R.L.
      • Sidoli S.
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      • Zaret K.S.
      异铬胺的基因组和蛋白质组学分辨率及其对交替命运基因的限制。
      )。这些方法可与总染色质蛋白质蛋白组合使用,以鉴定新型TFS并研究两种染色质的动态分布。

      用于MS的新合成染色质股线的分离

      当染色质与细胞或组织中分离时,样品含有细胞循环不同阶段的细胞,因此代表“旧”和“新”染色质的混合物。该领域中的一个开放问题仍然是在复制期间形成新的染色质,如何用染色质动力学集成DNA复制,以及将哪种染色质结构和蛋白质传递给新形成的染色质。因此,几种研究组使任务特异性地分离并表征了在复制期间产生的新合成的染色质链。这导致了两种类似方法称为蛋白质的分离在新生DNA上和新生染色质捕获(
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      活性,停滞和折叠复制叉的蛋白质动力学分析。
      )(Fig. 1, HI),其依靠孵育细胞短时间(10-20分钟),其胸苷类似物掺入新合成的DNA链中。在新生DNA方法上分离蛋白质的情况下,模拟是5-炔基-2'-脱氧尿苷,其在交联后可以与生物素 - 叠氮化物共价连接,允许使用链霉抗生素蛋白珠粒富集新生染色质。新生染色质捕获方案依赖于生物素-2'-脱氧尿苷,5'-三磷酸的整合,其在细胞裂解和染色质分离后可以直接使用用于使用链霉蛋白涂覆的珠粒的新生染色质分离的手柄。例如,这些方案例如揭示了FAM111A作为增殖细胞核抗原载荷的复制因子的重要作用,从而进行细胞周期的进展(
      • alabert C.
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      新生染色质捕获蛋白质组学在DNA复制过程中测定染色质动力学,并识别未知的叉组分。
      )。这些分离染色质的这些分离方案现在也适用于总染色质提取,其可以通过类似的工作流程获得,尽管延伸胸苷类似物至〜20h(
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      )(Fig. 1H)。结果,所得的所谓的DNA介导的染色质下拉工作流程易于进行有限的试剂,只要感兴趣的细胞类型正在增殖。
      共有许多工作流程已经开发出研究染色质蛋白质组,并且可以根据研究问题定制方法,实验室中的可用基础设施,可用的生物材料的量,以及该研究是否关注培养细胞或组织材料 (Fig. 1表格1)。
      表格1分离染色质总染色质,新生染色质或欧洲甜茶蛋白/异叶素用于蛋白质组学方法的方法概述
      技术#单元格输入XLink.简要描述;简介实验类型适用于组织需要活细胞参考
      原油分馏106–108细胞分级成细胞质,核和染色质馏分总染色质是的(
      • Shiio Y.
      • 艾森曼r.n.
      • yi e.c.
      • Donohoe S.
      • Goodlett D.R.
      • Aeberberold R.
      染色质相关因素的定量蛋白质组学分析。
      ,
      • van mierlo g.
      • Wester R.A.
      • 标记H.
      使用硅胶的定量亚细胞蛋白质组学揭示了多能地面状态的增强的代谢缓冲。
      ,
      • Chou d.m.
      • adamson b.
      • dephoure n.e.
      • 棕褐色X.
      • NOTTKE A.C.
      • Hurov K.E.
      • Gygi S.P.
      • Colaiacovo M.P.
      • elldege s.j.
      染色质定位筛选筛选聚(ADP核糖) - 调节抑制作用的抑制作用和NURD复合物对DNA损伤的部位。
      )
      CHEP.107是的变性条件下的差分提取总染色质是的(
      • Kustatscher G.
      • 遗嘱k.l.h.
      • 毛皮C.
      • Rappsilber J.
      染色体富集蛋白质组学。
      )
      德拉克108是的使用氯化铯超速离心的抗润肤剂密度分离总染色质是的
      a 表示可以在组织上使用的技术提供核隔离,并且可以获得足够的量。注意,原则上这些技术可用于从任何真核生物获得的细胞上。
      (
      • ginno p.a.
      • 汉堡L.
      • Seebacher J.
      • Iesmantavicius V.
      • Schübelerd。
      细胞周期分辨的染色质蛋白质组学揭示了基因组调控景观的有丝分裂保存的程度。
      )
      DM-CHP.106是的EDU标记(20小时),生物素点击,并进行链霉蛋白富集总染色质是的(
      • 阿兰达S.
      • alcaine-colet A.
      • 布兰科E.
      • 伯拉斯e.
      • Caillot C.
      • SabidóE.
      • di croce l.
      染色质捕获将代谢酶Ahcy链接到干细胞增殖。
      )
      D-Cap.106核洗涤和Mnase消化总染色质(紧密束缚)是的(
      • Alajem A.
      • Biran A.
      • Harikumar A.
      • Sailaja B.S.
      • Aaronson Y.
      • Livyatan I.
      • Nissim-Rafinia M.
      • Sommer A.G.
      • 大部分摩托车G.
      • Gerbasi v.r.
      • 金D.E.
      • Datta A.
      • SZE S.K.
      • Meshorer E.
      染色质蛋白的差异结合将BAF60A / SMARCD1鉴定为胚胎干细胞分化的调节剂。
      )
      差分mnase.106差分mnase消化Euchromatin / heterochromatin.是的(
      • Torrente M.P.
      • Zee B.M.
      • 年轻的N.L.
      • 巴利亚尔r.c..
      • Leroy G.
      • floudas c.a.
      • Hake S.B.
      • 加西亚B.A.
      人染色质的蛋白质组学询问。
      ,
      • van mierlo g.
      • Dirks R.A.M.
      • de clerck l.
      • Brinkman A.B.
      • Huth M.
      • kloet s.l.
      • Saksouk N.
      • Kroeze L.I.
      • 威廉斯。
      • Farlik M.
      • 博克C.
      • 詹森J.H.
      • Deforce D.
      • vermeulen M.
      • DéjardinJ.
      • 等等。
      综合蛋白质组学分析揭示了PRC2依赖性表观遗传串扰,保持地态多能性。
      )
      国际象棋 - DIA106差动盐提取Euchromatin / heterochromatin.是的(
      • 联邦A.J.
      • Nandakumar V.
      • Searle B.C.
      • stergachis a。
      • 王H.
      • Pino L.K.
      • Merrihew G.
      • 婷婷。
      • 霍华德N.
      • kutyavin t.
      • maccoss m.j.
      • Stamatoyannopoulos J.A.
      转录因子和核蛋白的高度平行量化和隔室定位。
      )
      梯度-SEQ.108是的蔗糖梯度中的差动超速离心Euchromatin / heterochromatin.是的
      a 表示可以在组织上使用的技术提供核隔离,并且可以获得足够的量。注意,原则上这些技术可用于从任何真核生物获得的细胞上。
      (
      • Becker J.s.
      • 麦卡锡R.L.
      • Sidoli S.
      • Donahue G.
      • Kaeding K.E.
      • 他Z.
      • 林S.
      • 加西亚B.A.
      • Zaret K.S.
      异铬胺的基因组和蛋白质组学分辨率及其对交替命运基因的限制。
      )
      iPond.108是的EDU标签(10分钟),生物素点击,并表达链霉蛋白浓缩新生染色质是的(
      • SIRBU下午
      • 沙发F.B.
      • Feigerle J.T.
      • Bhaskara S.
      • Hiebert S.W.
      • Cortez D.
      活性,停滞和折叠复制叉的蛋白质动力学分析。
      )
      NCC.108是的生物素-DUTP掺入和链霉抗生物素蛋白富集新生染色质是的(
      • alabert C.
      • Bukowski-Wills J.-C。
      • 李S.-B.
      • Kustatscher G.
      • Nakamura K.
      • de lima alves f.
      • 梅纳德
      • Mejlvang J.
      • Rappsilber J.
      • 植物A.
      新生染色质捕获蛋白质组学在DNA复制过程中测定染色质动力学,并识别未知的叉组分。
      )
      DUTP,2'-脱氧尿苷,5'-三磷酸; EDU,5-乙炔基-2'-脱氧尿苷; Ipond,蛋白质的分离在新生DNA上; NCC,新生染色质捕获;国际象棋 - DIA,染色质富集盐分离耦合到数据独立采集。
      “#单元格输入”表示应每次复制使用的估计单元数。 “XLINK”表示是否应该应用使用甲醛的交联。适用于组织指示该方法是否可用于例如来自动物或患者的组织切片,器官或活组织检查。
      a 表示可以在组织上使用的技术提供核隔离,并且可以获得足够的量。注意,原则上这些技术可用于从任何真核生物获得的细胞上。

      富集局部染色质室

      染色质蛋白质组的分析是高度信息性的,可用于识别用于细胞类型的候选调节染色质因子,以及它们的动态。如何使用基因组学工具进一步研究这些TFS用于调节细胞类型特异性基因表达,例如染色质免疫沉淀,然后在靶标和释放下进行测序或释放使用核酸酶。这可以与TF扰动结合,然后是基因表达分析,其产生全球图片,即如何,并且在某种程度上,该TF与特定细胞类型相关。然而,要详细了解TF功能,重要的是要了解它是功能性的染色质环境,以确定相关的PPI,以确定局部染色质特征如何定义PPI,以及如何受到a的影响(疾病诱导的疾病)蛋白质本身的突变或其与之相关的DNA。目前可以使用各种方法来研究染色质因子的蛋白质 - 蛋白和蛋白质-DNA结合。这些测定通常使用原油核提取物,然后使用抗体或引入蛋白质标签(如GFP)的蛋白质标签的TF的亲和纯化(AP)。
      • smits a.h.
      • vermeulen M.
      使用质谱分析蛋白质 - 蛋白质相互作用:挑战和机遇。
      )。或者,核提取物可以与携带特定改性的组蛋白尾部一起孵育(
      • vermeulen M.
      • Eberl H.C.
      • Matarese F.
      • 标记H.
      • Denissov S.
      • 黄油F.
      • 李克。
      • 奥尔森J.V.
      • Hyman A.A.
      • 斯坦尼贝格H.G.
      表观遗传组蛋白标记及其读者的定量相互作用蛋白质组学与基因组分析。
      ),重组(联合国)修饰的核胚序(
      • BARTKE T.
      • vermeulen M.
      • Xhemalce B.
      • 罗布森S.C.
      • KouzaridesT.
      通过DNA和组蛋白甲基化调节的核细胞组间蛋白质。
      )或含有特定DNA基序的DNA序列,用于鉴定与该序列相关的TFS(
      • Spruijt C.G.
      • Baymaz H.I.
      • vermeulen M.
      使用基于氧化硅酸的定量蛋白质组学鉴定特异性蛋白质-DNA相互作用。
      ,
      • 比尔米尔
      蛋白质组学研究DNA-结合和染色质相关基因调节络合物。
      ,
      • Makowski m.m.
      • Gräwec。
      • 福斯特下班
      • nguyen n.v.
      • BARTKE T.
      • vermeulen M.
      使用定量质谱法的全局蛋白质-DNA和蛋白质 - 核心结合亲源性。
      )。虽然这些测定是提供DNA结合特异性,组蛋白(修饰)结合潜力或鉴定蛋白质相互作用伴侣的信息,但这些测定具有它们的局限性。它们不区分染色质或核质上发生的相互作用,以及这可能如何调节蛋白质复合物的化学计量。没有周围的染色质环境减轻TF结合与附近的DNA或组蛋白修饰的影响。此外,TFS可以通过局部3D染色质结构或染色质室的相分离挤出,可能影响其行为和结合伴侣。这是由蛋白质复合物上染色体的蛋白质复合物差异不同的观点来证实(
      • 李X.
      • 王W.
      • 王J.
      • Malovannaya A.
      • XI Y.
      • 李W.
      • Guerra R.
      • 霍沃斯
      • 秦吉。
      • 陈杰。
      蛋白质组学分析显示不同的染色质相关和可溶性转录因子络合物。
      )。因此,近年来,已经开发了一系列基于MS的方法来研究染色质的TFS和TF近端蛋白质 在体内.
      初步努力表征TF的局部蛋白质组染色蛋白,在发芽酵母中使用串联AP标记的蛋白质,通过在300mM NaCl缓冲液中的第一裂解细胞和随后用dnasei消化DNA(
      • Tackett A.J.
      • Dilworth D.J.
      • Davey M.J.
      • O'Donnell M.
      • Aitchison J.D.
      • 溃败M.P.
      • Chait B.T.
      边界染色质复合物的蛋白质组学和基因组特征。
      )。通过迭代地执行这些纯化,作者在其数据集中识别出功能单元,例如在活性和沉默染色质的一些边界元件处存在YTA7。这种方法的变异是在没有DNASEI处理的情况下粘合低盐(100mM氯化钾)缓冲液中的细胞,但是使用超声处理仍然与相对大的DNA片段(〜1kb)相关的蛋白质复合物。使用蛋白质a串联AP标签作为亲和手柄,可以表征含有直接和间接(通过染色质)相互作用的蛋白质相互作用网络(
      • 兰伯特J.-P.
      • 米切尔L.
      • 鲁德纳A.
      • Baetz K.
      • FIGEYS D.
      一种新型蛋白质组学方法,用于发现染色质相关蛋白质网络。
      )。该改性芯片方法(称为MCHIP)被成功应用于大量酵母染色质相关蛋白(
      • 兰伯特J.P.
      • Fillingham J.
      • Siahbazi M.
      • GreenBlatt J.
      • Baetz K.
      • FIGEYS D.
      定义萌芽酵母染色质相关蛋白酶。
      )。在MS分析之前,在MS分析之前,在MS分析之前,在MS分析之前,在特异性复合物的生化纯化过程中的一般原理适用于许多有机体 果蝇 (
      • 王C.I.
      • Alekseyenko A.A.
      • Leroy G.
      • elia a.e.h.
      • Gorchakov A.A.
      • Britton L.-M.P.
      • elldege s.j.
      • kharchenko p.v.
      • 加西亚B.A.
      • Kuroda M.I.
      通过芯片质谱捕获的染色质蛋白质与果蝇中的剂量补偿相关联。
      )和人类细胞(
      • Zee B.M.
      • Alekseyenko A.A.
      • mcelroy K.A.
      • Kuroda M.I.
      简化交联染色质复合物的发现和通过质谱法通过质谱法进行相关的组蛋白修饰。
      ,
      • iglesias n。
      • 保罗J.A.
      • 鞑靼人A.
      • 王X.
      • 爱德华兹A.L.
      • Bhanu N.v.
      • 加西亚B.A.
      • 哈斯W.
      • Gygi S.P.
      • 莫扎德D.
      天然染色质蛋白质组学揭示了异染色素组织和维护中特定核偶杂环蛋白的作用。
      )。
      这些所谓的芯片MS工作流程依赖于将标记的蛋白质引入细胞。然而,这可能是难以转染或已经固定的细胞类型的挑战,并且由于标记蛋白的表达(过度)表达,可以引入伪影。这种所需的芯片MS工作流程适应使用抗体对感兴趣的蛋白质,导致染色质蛋白质组学(CHROP)的方法(
      • Soldi M.
      • Bonaldi T.
      CHOP方法将芯片和质谱结合以剖析染色质的特异性蛋白质组景观。
      ),定量端粒染色质分离方案(
      • 格罗米德L.
      • 阿贝E.
      • 哈梅林R.
      • armand f.
      • Chiappe D.
      • 黑人米
      • Lingner J.
      定量直接染色质分离方案识别不同的端粒状态。
      ),芯片MS(
      • ji x.
      • 爸爸D.B.
      • 亚伯拉罕B.J.
      • Lee T.I.
      • Jaenisch R.
      • 布拉德纳J.E.
      • 年轻的R.A.
      染色质蛋白质组学分析显示与组蛋白标记的基因组区域相关的新蛋白质。
      ,
      • Engelen E.
      • Brandsma J.H.
      • 莫森M.J.
      • Signorile L.
      • DEKKERS D.H.W.
      • demmers J.
      • kockx c.e.m.
      • ozgürz.
      • van ijcken w.f.j.
      • van den berg d.l.c。
      • Poot R.A.
      结合由组蛋白改性染色质免疫沉淀和质谱法鉴定的调节区域的蛋白质。
      ),内源性蛋白的快速免疫沉淀MS(霜)(
      • 穆罕默德H.
      • D'Santos C.
      • Serandour A.A.
      • Ali H.R.
      • 棕色G.D.
      • 阿特金斯A.
      • Rueda O.M.
      • 福尔摩斯K.A.
      • Theodorou V.
      • 罗宾逊J.L.L.
      • Zwart W.
      • Saadi A.
      • Ross-Innes C.S.
      • 钦S.-f.
      • Menon S.
      • 等等。
      内源性纯化显示GREB1作为关键雌激素受体调节因子。
      ),以及一种改进的更可扩展的rime,定量多路复用reme(qplex-reme)(
      • papachristou e.k.
      • Kishore K.
      • 拿着A.N.
      • 哈维克。
      • roumeliotis t.i.
      • Chilamakuri C.S.R.
      • Omarjee S.
      • Chia K.m.
      • Swarbrick A.
      • 酸橙。
      • Markowetz F.
      • Eldridge M.
      • Siersbaek R.
      • D'Santos C.S.
      • Carroll J.s.
      一种基于定量的质谱 - 监测内源性染色质相关蛋白复合物动力学的方法。
      )(Fig. 2, AB)。这些方法使用类似的原理作为MChip,但仅需要用于感兴趣的蛋白质的抗体和可以以足够的量获得的细胞类型,使得它们在几乎每个实验室中可实现,因此这些测定通常如此。虽然基于抗体的方法也可能受到由抗体的非特异性结合或阻断抗体识别的表位引起的偏差的影响,但它们具有能够靶向组蛋白或其他蛋白质的翻译后修饰的优点。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2分析感兴趣的染色质蛋白近端蛋白质蛋白质的策略. AC,使用标记蛋白表达的基于芯片的方法(A,Chip-MS,MChip,BiotAP-XL和天然染色质捕获),抗抗内源性蛋白的抗体(B,芯片 - ms,rime,qplex-rime,q-tip,chrop)和与(B)但后面是结束 - 生物素化 通过 末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)和捕获(C,sicap)。 DF,使用用生物素连接酶的表达或标记蛋白质的近似性 - 生物素化方法(D),表达染色质标记的读者结构域( 浅绿色),融合给生物素连接酶(E)或融合到HRP的原发性(或二级)抗体(F)。 BL表示生物素连接酶。请注意,图像是说明性的,并且为面板表示10nm DF 表示生物素化距离,而不是 本身 三个核体跨越10nm。还应该注意的是,尽管10nm是前面观察到核孔隙络合物的标记距离,但是生物素连接酶可以在染色质上实现的确切标记距离仍然必须通过实验地解决。芯片MS,染色质免疫沉淀 - MS; Chrop,染色质蛋白质组学; HRP,马萝卜过氧化物酶; MCHIP,修改芯片;霜,内源蛋白的快速免疫沉淀MS; SiCAP,选择性分离染色质相关蛋白。
      然而,这些基于芯片的方法也有一些限制。首先,这些方法的应用不涉及染色质分离步骤,而是使用超声处理的核作为IP的输入。这导致从“搭便车”蛋白质的污染程度较高,与高度电荷的DNA骨架结合(
      • OHTA S.
      • Bukowski-Wills J.-C。
      • Sanchez-Purido L.
      • Alves F. de L.
      • 木头L.
      • 陈Z.A.
      • Platani M.
      • 菲舍尔L.
      • 哈德森D.F.
      • 分割C.P.
      • Fukagawa T.
      • expershaw w.c.
      • Rappsilber J.
      使用络合物组合蛋白质组学确定有丝分裂染色体的蛋白质组成。
      )并且允许纯化与不与染色质结合的蛋白质相关的抗体,这可能导致通过交联伪像通过交联伪像使蛋白质如蛋白质的蛋白质含有更高的污染物蛋白质(
      • Mellacheruvu D.
      • 赖特Z.
      • Couzens A.L.
      • 兰伯特J.-P.
      • st-denis n.a.
      • 李T.
      • Miteva Y.v.
      • 哈利斯。
      • Sardiu M.E.
      • 低T.Y.
      • Halim V.A.
      • Bagshaw R.D.
      • 哈伯纳N.C.
      • Al-Hakim A.
      • Bouchard A.
      • 等等。
      克拉佩:一种用于亲和纯化质谱数据的污染物库。
      )。此外,这些方法使用相对大量的抗体(通常为2-5μg),其在MS分析期间也测量,并且可以抑制来自染色质蛋白的肽信号。原则上,污染物蛋白不会造成一个主要问题,只要诱饵特异性富集和测序,并且可以与其相互作用伙伴一起测序,并且可以进行适当的异常统计数据以鉴定富集的蛋白质。然而,抗体衍生的肽确实干扰MS测量,从而掩盖低丰富且小,更难以定量的蛋白质。此外,应该注意,在介导PPI的蛋白质表面内靶向表位的非固定材料中的抗体也可以与相互作用伴侣进行结合竞争,导致观察到不完全的蛋白质相互作用网络。
      为了克服这些问题,开发了染色质相关蛋白(Chip-SiCAP)方法的芯片和选择性分离(
      • Rafiee M.-r.
      • Girardot C.
      • Sigismondo G.
      • Krijgsveld J.
      通过选择性分离染色质相关蛋白的分离来扩展多能性的电路。
      )。这种方法在芯片-SMS工作流程上构建,但在IP步骤之后,使用生物素化核苷酸的末端脱氧核苷酸转移酶用生物素标记所获得的DNA片段。这允许富集蛋白质-DNA片段对链霉蛋白涂覆的珠子,而具有高浓度洗涤剂的洗涤允许除去抗体和其他剩余的污染物(Fig. 2C)。 CHIP-SICAP已成功地用于鉴定与胚胎干细胞中多能性网络相关的蛋白质,揭示TRIM24作为新型多能性相关蛋白(
      • Rafiee M.-r.
      • Girardot C.
      • Sigismondo G.
      • Krijgsveld J.
      通过选择性分离染色质相关蛋白的分离来扩展多能性的电路。
      )。虽然芯片-SiCAP程序比芯片MS更加艰苦,但它产生较少的污染蛋白,同时同时获得预期蛋白质的更高强度,直接比较芯片 - MS和霜,因此目前似乎产生“最清洁”的MS数据(
      • Rafiee M.-r.
      • Girardot C.
      • Sigismondo G.
      • Krijgsveld J.
      通过选择性分离染色质相关蛋白的分离来扩展多能性的电路。
      )(表2.)。
      表2.用于素质染色质蛋白质蛋白蛋白质的方法概述
      技术使用的生物体#单元格输入简要描述;简介XLink.Transf。必需的苹果。到ptms.参考
      天然染色质捕获酵母107内源蛋白标记或标记的染色质域特异性蛋白的表达是的(
      • iglesias n。
      • 保罗J.A.
      • 鞑靼人A.
      • 王X.
      • 爱德华兹A.L.
      • Bhanu N.v.
      • 加西亚B.A.
      • 哈斯W.
      • Gygi S.P.
      • 莫扎德D.
      天然染色质蛋白质组学揭示了异染色素组织和维护中特定核偶杂环蛋白的作用。
      )
      mChip.酵母1010感兴趣的标记染色质蛋白的内源蛋白标记或过表达是/否是的(
      • 兰伯特J.-P.
      • 米切尔L.
      • 鲁德纳A.
      • Baetz K.
      • FIGEYS D.
      一种新型蛋白质组学方法,用于发现染色质相关蛋白质网络。
      )
      芯片女士果蝇109介绍MSL-HTB融合蛋白是的是的(
      • 王C.I.
      • Alekseyenko A.A.
      • Leroy G.
      • elia a.e.h.
      • Gorchakov A.A.
      • Britton L.-M.P.
      • elldege s.j.
      • kharchenko p.v.
      • 加西亚B.A.
      • Kuroda M.I.
      通过芯片质谱捕获的染色质蛋白质与果蝇中的剂量补偿相关联。
      )
      biotap-xl.哺乳动物/果蝇108–109生物熟标记的蛋白质的表达是的是的(
      • Zee B.M.
      • Alekseyenko A.A.
      • mcelroy K.A.
      • Kuroda M.I.
      简化交联染色质复合物的发现和通过质谱法通过质谱法进行相关的组蛋白修饰。
      )
      Chrop.哺乳动物108感兴趣的蛋白质的抗体是/否是的(
      • Soldi M.
      • Bonaldi T.
      CHOP方法将芯片和质谱结合以剖析染色质的特异性蛋白质组景观。
      )
      Q-tip.哺乳动物107–108感兴趣的蛋白质的抗体是的是的(
      • 格罗米德L.
      • 阿贝E.
      • 哈梅林R.
      • armand f.
      • Chiappe D.
      • 黑人米
      • Lingner J.
      定量直接染色质分离方案识别不同的端粒状态。
      )
      芯片女士哺乳动物108感兴趣的蛋白质的抗体是的是的(
      • ji x.
      • 爸爸D.B.
      • 亚伯拉罕B.J.
      • Lee T.I.
      • Jaenisch R.
      • 布拉德纳J.E.
      • 年轻的R.A.
      染色质蛋白质组学分析显示与组蛋白标记的基因组区域相关的新蛋白质。
      ,
      • Engelen E.
      • Brandsma J.H.
      • 莫森M.J.
      • Signorile L.
      • DEKKERS D.H.W.
      • demmers J.
      • kockx c.e.m.
      • ozgürz.
      • van ijcken w.f.j.
      • van den berg d.l.c。
      • Poot R.A.
      结合由组蛋白改性染色质免疫沉淀和质谱法鉴定的调节区域的蛋白质。
      )
      哺乳动物107感兴趣的蛋白质的抗体是的是的(
      • 穆罕默德H.
      • D'Santos C.
      • Serandour A.A.
      • Ali H.R.
      • 棕色G.D.
      • 阿特金斯A.
      • Rueda O.M.
      • 福尔摩斯K.A.
      • Theodorou V.
      • 罗宾逊J.L.L.
      • Zwart W.
      • Saadi A.
      • Ross-Innes C.S.
      • 钦S.-f.
      • Menon S.
      • 等等。
      内源性纯化显示GREB1作为关键雌激素受体调节因子。
      )
      qplex-reme.哺乳动物106感兴趣的蛋白质的抗体是的是的(
      • papachristou e.k.
      • Kishore K.
      • 拿着A.N.
      • 哈维克。
      • roumeliotis t.i.
      • Chilamakuri C.S.R.
      • Omarjee S.
      • Chia K.m.
      • Swarbrick A.
      • 酸橙。
      • Markowetz F.
      • Eldridge M.
      • Siersbaek R.
      • D'Santos C.S.
      • Carroll J.s.
      一种基于定量的质谱 - 监测内源性染色质相关蛋白复合物动力学的方法。
      )
      Sicap.哺乳动物107对蛋白质的抗体,DNA-末端生物素化和链霉抗生物素蛋白富集是的是的(
      • Rafiee M.-r.
      • Girardot C.
      • Sigismondo G.
      • Krijgsveld J.
      通过选择性分离染色质相关蛋白的分离来扩展多能性的电路。
      )
      邻近生物素化哺乳动物/植物/酵母106–108利用生物素化蛋白质片段标记蛋白质(Bioid / Apex2 /涡轮增长)是的(
      • kochanova n.y.
      • Schauer T.
      • Mathias G.P.
      • Lukacs A.
      • 施密特A.
      • FLANLY A.
      • Schepers A.
      • Thomae A.W.
      • imhof A.
      基于邻近的生物素化揭示的间晶络的多层结构。
      ,
      • Uusküla-reimand L.
      • 侯H.
      • Samavarchi-Tehrani P.
      • 鲁丹M.V.
      • 梁马
      • 麦地那 - 河南A.
      • 穆罕默德H.
      • 施密特D.
      • Schwalie P.
      • 年轻的e.j.
      • Reimand J.
      • Hadjur S.
      • Gingras A.-​​C.
      • 威尔逊M.D.
      最佳oisomeraseIIβ在拓扑结构域边界处与休肽和CTCF相互作用。
      ,
      • 兰伯特J.-P.
      • Tucholska M.
      • 去C.
      • 骑士J.D.R.
      • Gingras A.-​​C.
      邻近生物素化和亲和纯化是染色质相关蛋白复合物的互动映射的互补方法。
      )
      铬三哺乳动物107染色质 - 读取器结构域偶联到生物素连接酶的表达是的是的(
      • VillaseñorR.
      • Pfaendler R.
      • Ambrosi C.
      • 贝茨S.
      • Giuliani S.
      • 布莱恩E.
      • sh h t.w.
      • 山墙A.L.
      • Schmolka N.
      • Manzo M.
      • Wiz J.
      • 贝尔C.
      • von mering c.
      • Aeberberold R.
      • voigt p.
      • 等等。
      染色体识别染色质标记的蛋白质蛋白酶。
      )
      Bar-MS和Spplat哺乳动物106初级抗体,继发性HRP缀合,生物素化和链霉抗生物素蛋白富集是的是的(
      • 李X.-w.
      • Rees J.s.
      • 薛诗
      • 张H.
      • Hamaia S.W.
      • 桑德森B.
      • Funk P.E.
      • Farndale R.W.
      • Lilley K.S.
      • Perrett S.
      • 杰克逊A.P.
      使用蛋白质组学邻近标记测定法进入DT40b细胞受体簇的新见解。
      ,
      • 酒吧D.Z.
      • Atkatsh K.
      • Tavarez U.
      • erdos m.r.
      • Gruenbaum Y.
      • 柯林斯F.S.
      通过抗体识别生物素化 - 一种邻近标记的方法。
      )
      酒吧 - MS,抗体识别的生物素化;使用酪酰胺的选择性蛋白质组学接近标记测定。
      “#单元格输入”表示每次复制必须使用的单元格数。 “XLINK”表示应该使用与甲醛的交联。 “transf。必需“表示是否必须转染细胞。 “苹果。 PTMS“表示该方法是否可以专门应用于翻译后修改。

      使用邻近生物素化染色质蛋白的接近蛋白质组

      在基于芯片的方法中诱导的潜在交联伪影旁,这些还需要染色质的超声染色。这是一个可变过程,并且它不可能可重复地获得相同长度的片段,这又可以导致芯片效率和鉴定的蛋白质之间的实验之间的变化(
      • pchelintsev n.a.
      • 亚当斯P.D.
      • 尼尔森下午
      高分子重量蛋白有效超声处理及改善染色质免疫沉淀的关键参数。
      )。此外,一些基于芯片的协议非常详细,需要几天时间进行。对基于芯片的方法有吸引力的替代方案可以是使用邻近生物素化的使用。该方法依赖于将生物素连接酶融合到感兴趣的蛋白质,这允许在10nm范围内标记蛋白质(
      • roux k.j.
      • 金D.I.
      • Raida M.
      • 伯克B.
      一种混杂的生物素连接酶融合蛋白鉴定哺乳动物细胞中的近端和相互作用蛋白。
      ,
      • 金D.I.
      • KC B.
      • 朱W.
      • Motiamechaboki K.
      • DOYE V.
      • roux k.j.
      具有邻近依赖性生物素化的核孔隙复合体系结构。
      )。使用接近生物素化在样品递及的方面具有一些主要优点,如在生物素化反应之后,可以裂解细胞,并提取物可以直接与链霉抗生物素蛋白涂覆的珠子一起温育(Fig. 2D)。此外,由于诱饵近端蛋白成为生物素化的,因此在细胞裂解和随后的亲和富集期间可以使用变性条件。由于生物素 - 链霉蛋白相互作用极强,因此可以在高浓度的盐和洗涤剂存在下进行IP和洗涤,这强烈降低了污染物的数量。最常用的酶是称为尖端的工程化大豆抗坏血酸过氧化物酶,以及一种混杂的突变体 大肠杆菌 Biotin连接酶Bira,其称为Bioid,其最近被衍生给增强和更快速的酶(迷你)涡轮增强(广泛审查(
      • Samavarchi-Tehrani P.
      • Samson R.
      • Gingras A.-​​C.
      邻近依赖性生物素化:关键酶及其适应蛋白质组学方法。
      )))。其中,APEX2和(MINI)涡轮增压器需要最短的标记时间(1-10分钟),因此目前是时间分辨接近标记工作流程的选择的酶。较慢的生物素连接酶酶的使用可以使得能够在多个细胞背景下发生生物素化反应(例如,细胞周期阶段)能够通过使用更快的酶来识别可能可能遗漏的伴侣。虽然这种测定可用于任何感兴趣的蛋白质,但它们特别有用于研究染色质蛋白的局部蛋白质(
      • kochanova n.y.
      • Schauer T.
      • Mathias G.P.
      • Lukacs A.
      • 施密特A.
      • FLANLY A.
      • Schepers A.
      • Thomae A.W.
      • imhof A.
      基于邻近的生物素化揭示的间晶络的多层结构。
      ,
      • Uusküla-reimand L.
      • 侯H.
      • Samavarchi-Tehrani P.
      • 鲁丹M.V.
      • 梁马
      • 麦地那 - 河南A.
      • 穆罕默德H.
      • 施密特D.
      • Schwalie P.
      • 年轻的e.j.
      • Reimand J.
      • Hadjur S.
      • Gingras A.-​​C.
      • 威尔逊M.D.
      最佳oisomeraseIIβ在拓扑结构域边界处与休肽和CTCF相互作用。
      ,
      • 兰伯特J.-P.
      • Tucholska M.
      • 去C.
      • 骑士J.D.R.
      • Gingras A.-​​C.
      邻近生物素化和亲和纯化是染色质相关蛋白复合物的互动映射的互补方法。
      )。这种生物素化测定可以进一步定制以解决不同的问题,例如,以确定与感兴趣的两种染色质因子相关的局部蛋白质组(例如,Tf和染色质调节剂)当这些紧密邻近时 在体内。在这种情况下,生物素连接酶可以在两种染色质蛋白上“分裂”,并且只有当这些靠近时,重构酶活性,然后导致近端环境的生物素化(
      • 四分之三。
      • Amaya Ramirez C.C.
      • debeljak J.
      • Kreibich E.
      • Skribbe M.
      • 野生K.
      • BéthuneJ.
      分裂生物蛋白的条件蛋白质组学方法,用于监测起始血液定义蛋白质复合物的组成。
      ,
      • 韩义。
      • 布兰森T.C.
      • 马马特J.D.
      • Boassa D.
      • Shechner D.
      • Ellisman M.H.
      • A.
      分裂透顶过氧化物酶的定向演变。
      ,
      • CHO K.F.
      • 布兰森T.C.
      • Rajeev S.
      • Svinkina T.
      • Udeshi N.D.
      • Thoudam T.
      • Kwak C.
      • Rhee H. -w。
      • lee i. -k。
      • carr s.a.
      • ting a.y.
      分裂涡轮增压器能够在细胞中实现接触依赖性邻近标记。
      )。该原理用于获得内质网和线粒体之间接触部位的接近蛋白质组(
      • CHO K.F.
      • 布兰森T.C.
      • Rajeev S.
      • Svinkina T.
      • Udeshi N.D.
      • Thoudam T.
      • Kwak C.
      • Rhee H. -w。
      • lee i. -k。
      • carr s.a.
      • ting a.y.
      分裂涡轮增压器能够在细胞中实现接触依赖性邻近标记。
      )。最近的研究进一步强调了通过将生物素连接酶融合到可以识别染色质修饰的蛋白质读取器结构域来突出邻近标记的值,这提供了有希望的工具,以鉴定蛋白质在邻近无棒蛋白质形式的蛋白质(如组蛋白标记)
      • VillaseñorR.
      • Pfaendler R.
      • Ambrosi C.
      • 贝茨S.
      • Giuliani S.
      • 布莱恩E.
      • sh h t.w.
      • 山墙A.L.
      • Schmolka N.
      • Manzo M.
      • Wiz J.
      • 贝尔C.
      • von mering c.
      • Aeberberold R.
      • voigt p.
      • 等等。
      染色体识别染色质标记的蛋白质蛋白酶。
      )(染色体; Fig. 2E)。最后,邻近生物素化也可以通过辣根过氧化物酶(HRP)进行,这是一种可以偶联与抗体的酶。通过将抗体-HRP缀合物靶向细胞内的蛋白质,可以获得用于任何感兴趣蛋白质的近侧蛋白质组,提供了特异性抗体(
      • 李X.-w.
      • Rees J.s.
      • 薛诗
      • 张H.
      • Hamaia S.W.
      • 桑德森B.
      • Funk P.E.
      • Farndale R.W.
      • Lilley K.S.
      • Perrett S.
      • 杰克逊A.P.
      使用蛋白质组学邻近标记测定法进入DT40b细胞受体簇的新见解。
      ,
      • 酒吧D.Z.
      • Atkatsh K.
      • Tavarez U.
      • erdos m.r.
      • Gruenbaum Y.
      • 柯林斯F.S.
      通过抗体识别生物素化 - 一种邻近标记的方法。
      )(通过抗体识别使用酪酰胺和生物素化的选择性蛋白质组织邻近标记测定; Fig. 2F)。这种方法已被证明适用于染色质因子(
      • 酒吧D.Z.
      • Atkatsh K.
      • Tavarez U.
      • erdos m.r.
      • Gruenbaum Y.
      • 柯林斯F.S.
      通过抗体识别生物素化 - 一种邻近标记的方法。
      )但是应该注意,这种方法仅在固定材料中工作,因为HRP在细胞溶胶或细胞的其他还原环境中不起作用(
      • 李杰。
      • 王Y.
      • Chiu S.-L.
      • Cline H.T.
      膜靶向辣根过氧化物酶作为相关荧光和电子显微镜研究的标志物。
      )。
      占据了一个大型工具箱,现在可以进行局部蛋白质的局部染色蛋白环境,以及方法的选择取决于可用材料的量,所用的生物体,无论是遗传修改的细胞类型是否可以转基因,和如果有合适的抗体。此外,只有涉及抗体或染色体的那些方法,鉴于读者域和靶是特异性的,可以针对特定的翻译后修改(表2.Fig. 2)。通常,虽然在基于芯片的方法之间进行了一些比较,但与基于生物素化的方法相比,评估这些工作流的性能至关重要。评估的重要方面将富含对照样品的诱饵和相关因素以及非黑溴酚蛋白的污染程度。

      生物化学挑战和机遇

      讨论的CHOP方法需要相对大量的输入材料,从数百万到数百万个细胞(表12)。然而,克隆或蛋白质组学研究的巨大挑战通常是许多生物样品,例如胚胎,有机体和临床材料,只能以有限的量取出。因此,需要改编工作流程以促进具有低输入样本的应用。最近对此目的的创新是一种基于微流体的AP-MS平台,可用于识别从小到12.000输入单元的PPI(
      • 毛皮C.
      • Dirks R.A.M.
      • 托马斯P.C.
      • 琼斯·罗克。
      • 王J.
      • 林奇M.
      • 标记H.
      • vermeulen M.
      微流体平台上小型化相互作用蛋白质组学,具有超低输入要求。
      )。还可以考虑与样品制备相关的额外工作流程适应性。其中一种潜在的方法可以是在染色蛋白蛋白质组学应用中整合一次盆栽固相增强的样品制备程序(
      • 休斯C.S.
      • Foehr s.
      • 加菲尔德D.A.
      • Furlong E.E.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      采用顺磁珠技术的超敏感蛋白质组分析。
      )。该方法使用顺磁珠在单个管中有效地捕获蛋白质和肽,并且该工作流已经结合在先前描述的芯片-SiCAP过程中(
      • Rafiee M.-r.
      • Girardot C.
      • Sigismondo G.
      • Krijgsveld J.
      通过选择性分离染色质相关蛋白的分离来扩展多能性的电路。
      )。最后,在质谱仪的水平下,可以使用一系列新的数据采集方法,应该特别适用于低输入应用程序(
      • Gauchier M.
      • van mierlo g.
      • vermeulen M.
      • DéjardinJ.
      特定染色质基因菌的纯化和富集。
      )。探索的重要大道是独立于数据的采集(DIA)。很长一段时间,数据相关的采集,依赖于用于MS / MS采集的自动仪器控制,这是MS的标准采集方法。在数据依赖性采集中,基于肽丰度测序肽,这意味着通常不会被高丰富的肽对非常低的肽进行测序或掩盖。由于存在高富裕的组蛋白,这可能尤其可能在染色质的基于MS的分析中提出问题。用指定的DIA,肽 m/z 范围是全面的,无论那种肽的丰富性如何 m/z range (
      • 婷婷。
      • Egertson J.D.
      • Payne S.H.
      • 金斯。
      • 麦克莱恩B.
      • KällL.
      • Aeberberold R.
      • 史密斯r.d.
      • 贵族W.S.
      • maccoss m.j.
      以肽为中心的蛋白质组分析:分析串联质谱数据的替代策略。
      )。因此,原则上,DIA应该提供对肽的更全面的分析,结果可能更适合于染色质(结构域)的MS分析。最后,当特异性染色质因子或TFS是研究的主题时,选择性反应监测可用于专门测量数百至数百种预选的蛋白质的丰度在各种丰富(
      • Gillespie M.A.
      • Palii C.G.
      • Sanchez-Taltavull D.
      • Shannon P.
      • Longabaugh W.J.r.
      • Dowes D.J.
      • Sivaraman K.
      • Espinoza H.M.
      • 休斯J.R.
      • 价格N.D.
      • Perkins T.J.
      • ranish j.a.
      • 品牌M.
      转录因子的绝对量化揭示了促红细胞生成的基因调控原理。
      )。
      需要进一步的研究来优化和实施这些MS数据采集方法,用于低输入染色质蛋白质组学研究,但重要的课程可能会从单细胞蛋白质组学的新兴领域中学到,这涉及极低量的输入样品(
      • Budnik B.
      • 征收E.
      • HARMANGE G.
      • Slavov N.
      范围 - MS:单一哺乳动物细胞的质谱测量细胞分化期间的蛋白质组异质性。
      )。
      第二次挑战在于染色质蛋白质组学工作流程的可扩展性。虽然可获得深度蛋白质组分析的高吞吐量工作流程(
      • 张Z.
      • 吴S.
      • Stenoien D.L.
      • Paša-tolićL.
      高通量蛋白质组学。
      ),开发用于更多有针对性的方法,如染色质( - 污染)蛋白质组学的高通量应用仍然滞后。这种工作流程可能非常希望破译给定染色质结构域的动态组成在细胞刺激或扰动时。值得注意的例子包括端粒。这些结构保护染色体的末端,对于维持蜂窝完整性是必不可少的。此外,端粒维持经常在癌症等疾病中受到影响。端粒体的靶向和端粒延长酶,端粒酶逆转录酶,提供癌症治疗癌症的潜在治疗途径(
      • jafri m.a.
      • ansari s.a.
      • Alqahtani M.H.
      • Shay J.W.
      端粒和端粒酶在癌症中的作用,以及端粒酶靶向疗法的进步。
      )。要了解端粒靶向药物功能,它与调查如何,以及它们影响重要的端粒结合蛋白如避难所复合物的结合相关。可以有效地纯化通过互补生物素化的锁定的核酸探针有效地纯化端粒(和其他重复元件),尽管这目前需要相对大量的输入材料(108–109 cells) (
      • DéjardinJ.
      • 金斯顿r.e.
      纯化与特定基因组基因座相关的蛋白质。
      ,
      • Saksouk N.
      • Barth T.K.
      • Ziegler-Birling C.
      • Olova N.
      • 不wak A.
      • 雷伊E.
      • Mateos-Langerak J.
      • urbach s.
      • Reik W.
      • Torres-padilla m.e.
      • imhof A.
      • DéjardinJ.
      在仔细区域形成沉默染色质的冗余机制依赖于Bend3和DNA甲基化。
      ),从而损害自动化和高吞吐量应用。对于基于芯片的方法,可用自动化工作流(
      • 迪恩斯r.
      • Gardeux V.
      • Llimos G.
      • Alpern D.
      • 江j.y。
      • Meireles-filho a.c.a.
      • Deplancke B.
      高度平行的自动平台,可实现组蛋白标记和转录因子的个体或顺序芯片。
      ,
      • Dirks R.A.M.
      • 托马斯P.
      • 琼斯·罗克。
      • 斯坦尼贝格H.G.
      • 标记H.
      用于标准化敏感的低输入染色质免疫沉淀的插头和微流体平台。
      ),但目前尚不清楚这些是否允许纯净足够的蛋白质量用于基于MS的研究。在这方面,鉴于相对简单的工作流程,省略交联以及严格洗涤的可能性,邻近生物素化可以提供良好的替代方案。因此,可以想到,将链霉抗生物素蛋白IP与自动化微流体系统偶联将允许高通量的染色质域蛋白质组学蛋白质组学,例如靶向表观酶的药物。另外,使用等异质标记方法,例如串联质量标签将允许样品复用而不损害肽检测,从而允许增加吞吐量而不增加MS测量时间。
      最后,染色质地的讨论较讨论的挑战是单轨道蛋白质组学。如果已知该基因座的蛋白质组,则只能完全理解,诸如启动子或增强子等基因组中的单个基因座的生物学。虽然方法可用于以可重复的方式(以可重复的方式)诸如端粒的重复元素(
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      )并且正在纯化单一基因组基因座的进步,仍然需要准确地确定非接收基因座的局部蛋白质表所需的实质性改进(审查(
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      特异性染色质染色质分离。
      )))。芯片-S和单轨道蛋白质组学之间的可能中间溶液可以是使用前述分裂生物素连接酶的使用。在这种情况下,酶的一部分可以融合到感兴趣的TF,另一端融合到特异性蛋白质或方法特异性蛋白质。作为一个例子,表观遗传蛋白复杂的核心重塑和脱乙酰酶(NERD)定位于许多基因座,不仅调节基因表达,而且募集到DNA损伤的部位(
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      Zmynd8与Nurd in靶基因共同定位,并调节Poly(ADP-Ribose) - 依赖Gatad2a / Nurd募集到DNA损伤的部位。
      )。分裂的生物素连接酶方法可以是将酶零件融合给NERD亚基和DNA损伤蛋白,这将允许在DNA损伤反应的上下文中确定NERD近端蛋白质。正交方法可以是标记特异性蛋白质,例如具有生物素受体肽的组蛋白变体,并用Bira连接酶熔断TF,其仅生物素化该受体肽,在基于测序的实验中均匀良好(
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      活性和压抑的染色质域在DNA复制期间表现出不同的核心偏析。
      )。然后,这两种蛋白质的共表达将允许芯片MS,例如实验,但使用生物素化的受体肽作为亲和富集手柄。然后,这将导致染色质蛋白质组的富集和分析,这些蛋白质紧邻的区域。

      结束语和未来的观点

      染色质蛋白质组学领域的最新发展允许分析整个染色质蛋白质组或其子区段。这些方法,也是在与基因组学方法集成时,将形成强大的基础,以发现与细胞稳态,发展和疾病相关的新型TFS。
      通过在粗细胞提取物或溶液中确定它们的组成和结构来频繁地研究表观遗传蛋白和复合物。然而,蛋白质的行为通常是不同的,只要它们被取出其本地背景,通过染色质和染色体上的蛋白质复合物的存在而下划线(
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      蛋白质组学分析显示不同的染色质相关和可溶性转录因子络合物。
      )。在未来,当蛋白质与染色质有关时,也会评估使用AP-MS方法获得的PPI的程度很重要。这也适用于邻近生物素化测定。在标准方案中,在生物素化反应后,细胞在变性缓冲液中裂解,之后将全细胞裂解物与链霉抗生物素蛋白珠孵育。核心近端生物素化的良好比较 相对 因此,染色质分数是未来的重要目标。
      当它们与染色质模板相关时,蛋白质复合物的3D组织进一步改变。因此,确定蛋白质和蛋白质复合物与染色质结合的拓扑和3D结构是高度信息的。一种方法是将交联-Sms(XL-MS)与先前描述的任何染色质域富集程序组合。虽然潜在的生物化学上挑战性,但XL-MS很容易被证明适用于完整的核(
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      通过在完整细胞核中的交联质谱法可视化的组蛋白相互作用景观。
      ),为获得富集的染色质片段的交联图提供了重要步骤。如果XL-MS可以适用于染色质富集工作流程,这将具有额外的益处,因为它允许将直接与间接蛋白质相互作用的直接区分,这与所述染色质(结构域)富集策略目前尚不可能。这可以与从纯化蛋白质重构或直接从天然(染色质)环境(
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      )。
      染色质生物学的另一个重要方面正在变得越来越明显是相分离。相分离的方法产生液体缩合物,其可以限制蛋白质和核酸在单独的膜隔室中。最近的进展已经证明,重构的染色质纤维可以相分开,这可以通过组蛋白修饰来调节(
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      )。在诸如ALS的疾病中观察到异常相分离并且可以从癌症中具有TFS的蛋白质融合,从评估TF的相分离影响(局部)染色质蛋白质蛋白质的分离是相关的。由于膜细胞器对洗涤剂敏感,但尤其是相分离促进和干扰条件的染色质因子的邻近生物素化测定将提供一个强大的工具。
      虽然本综述主要集中在TFS上,但外延蛋白酶非常复杂。许多不同的RNA分子与染色质有关,并且可以化学改性DNA,以及与其相关的RNA和蛋白质。就染色质提取而言,信息分析将是使用本综述中描述的技术来评估蛋白质和RNA是否在与染色质(隔室)结合时具有特异性修饰。这些信息将被要求推进我们对当地规模的染色质调节的理解,以及如何在细胞命运过渡或扰动中的动态。
      总之,由于硬件,软件和方法的改进,我们设想染色质蛋白质组学将在常规表观遗传研究中占据一席之地。即使在少量的输入材料可用时,旨在获得令人沮丧的未来改进将允许获得全局和局部染色质蛋白质蛋白。最后,旨在提高产量的努力将允许屏幕调查药物或化合物如何调节(局部)染色质蛋白质组。

      利益冲突

      作者声明没有竞争利益。

      致谢

      对于由于空间限制而无法引用的同事向同事致歉。我们感谢Jorieke Weiden和Suzan Stelloo在文章中提供输入。

      资金和其他信息

      G. v。和M.和M. V.由持仓机构支持,部分由荷兰癌症协会(KWF)提供资金。

      作者捐款

      G. v。M.和M. V.写了稿件。

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