OpenPepxl:用于XL-MS中交联肽的敏感鉴定的开源工具

  • Eugen Netz.
    一致
    对于通信:Eugen Netz;奥利弗科尔巴赫
    隶属关系
    生物分子互动,Max Planck发育生物学研究所,德国

    德国杜宾根廷根大学生物信息学与医学信息学研究所

    应用生物信息学,德国廷根廷根大学计算机科学部
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  • Tjeerd M.H. Dijkstra.
    隶属关系
    生物分子互动,Max Planck发育生物学研究所,德国

    德国杜宾根廷根大学生物信息学与医学信息学研究所

    应用生物信息学,德国廷根廷根大学计算机科学部

    妇女健康中心,大学诊所Tübingen,德国
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  • Timo Sachsenberg.
    隶属关系
    德国杜宾根廷根大学生物信息学与医学信息学研究所

    应用生物信息学,德国廷根廷根大学计算机科学部
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  • Lukas Zimmermann.
    隶属关系
    生物分子互动,Max Planck发育生物学研究所,德国

    德国杜宾根廷根大学生物信息学与医学信息学研究所

    翻译生物信息学研究所,大学医院Tübingen,德国
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  • Mathias Walzer.
    隶属关系
    翻译生物信息学研究所,大学医院Tübingen,德国

    欧洲分子生物学实验室,欧洲生物信息学研究所(Embl-Ebi),Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,剑桥,英国
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  • 托马斯蒙科克
    隶属关系
    德国乌尔姆大学药物生物技术研究所X射线晶体学设施

    德国GöttingenGzMB,Georg-August-UniversityGZMB分子结构生物学研究所,Göttingen
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  • Ralf Ficner.
    隶属关系
    德国GöttingenGzMB,Georg-August-UniversityGZMB分子结构生物学研究所,Göttingen
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  • olexandr dybkov.
    隶属关系
    细胞生物化学部门普朗克生物物理化学研究所,德国哥廷根
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  • 钟宁Urlaub.
    隶属关系
    生物分析质谱法普朗克生物物理化学研究所,德国Göttingen

    生物分析术临床化学,大学医学中心,德国Göttingen
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  • 奥利弗科尔巴赫
    一致
    对于通信:Eugen Netz;奥利弗科尔巴赫
    隶属关系
    生物分子互动,Max Planck发育生物学研究所,德国

    德国杜宾根廷根大学生物信息学与医学信息学研究所

    应用生物信息学,德国廷根廷根大学计算机科学部

    翻译生物信息学研究所,大学医院Tübingen,德国

    德国杜宾根大学定量生物中心
    搜索本作者的文章
      交联MS(XL-MS)已被识别为有关蛋白质结构和相互作用的有效信息来源。与常规肽鉴定相反,XL-MS必须处理二次搜索空间,其中来自每种蛋白质的肽可能与任何其他蛋白质交联。为了应对这个搜索空间,大多数工具适用于减少搜索空间的不同启发式方法。我们介绍了一个新的开源XL-MS彩易福彩库搜索算法,OpenPepXL,与其他工具相比提供了更高的灵敏度。 OpenPepxl搜索XL-MS实验的完整搜索空间,而不使用启发式来减少它。由于高效的彩易福彩结构和内置并行化OpenPepxl实现了优异的运行时,并且也可以在大型计算集群和云服务上部署,同时保持纤细的内存占用空间。我们将OpenPepxl与其他几种常用工具进行比较,以识别在各种XL-MS实验上的不可置位标记和无标记的交联剂。在我们的第一次比较中,我们使用从细胞裂解物的一部分与128个目标和128个诱饵的蛋白质彩易福彩库中的彩易福彩组。在5%FDR,OpenPepxl发现7%至超过50%以上的独特残留对(URPS)而不是其他工具。在具有可用高分辨率结构的彩易福彩集上,用于交叉链路验证OpenPepXL报告从7%到超过40%的结构验证的URPS而不是其他工具。此外,我们使用了一个合成肽彩易福彩集,允许客观验证交叉链路而不依赖于结构信息,发现OpenPepxL报告的验证URP比其他工具更高12%。它是作为OpenMs套件的一部分构建,支持Windows,MacOS和Linux操作系统。 OpenPepxl还支持XL-MS识别结果的MzidentML 1.2格式。它在三个条款BSD许可证下免费提供 //openms.org/openpepxl.

      图形概要

      交联质谱(XL-MS)已被证明是研究蛋白质结构和相互作用的有价值的工具(
      • 刘F.
      • Heck A.J.
      通过交联质谱法询问蛋白质组件和蛋白质相互作用网络的结构。
      ,
      • SINZ A.
      • ARLT C.
      • Chorev D.
      • 沙龙M.
      化学交联和天然质谱:结构生物学的富有成效的组合。
      ,
      • 莱特纳A.
      • Faini M.
      • Stengel F.
      • Aeberberold R.
      交联和质谱:综合技术,了解分子机的结构和功能。
      ,
      • o'reilly f.j.
      • Rappsilber J.
      交联质谱:结构,分子和系统生物学中的方法和应用。
      ,
      • Chavez J.D.
      • 布鲁斯J.E.
      与质谱化学交联:系统结构生物学的工具。
      )。虽然XL-MS作为一种非常有用的方法,但是工作流程的每个步骤都有空间。特别是衍生自交联蛋白质样品的交联肽的富集步骤对XL-MS分析以及以下计算识别以及注释MS2光谱FDR的统计彩易福彩具有深刻的影响。在许多XL-MS实验中,样本仍然包含大量的非克罗斯联系, IE。 线性肽;因此,通常以低强度发生交联肽,因此在彩易福彩依赖性采集中也可能选择不太可能选择碎裂。因此,必须在来自未修饰的肽的大集光谱中鉴定相对较少的交联的前体和片段光谱。这是与线性肽的鉴定相比,使XL-MS彩易福彩进行更加困难的统计彩易福彩的问题之一。
      交联肽的片段光谱也更难以注释,因为它们含有来自两种肽的片段。评分整个十字链路片段谱匹配可能导致许多片段离子覆盖一种肽序列的标识,而第二肽仅通过其前体质量鉴定并仅匹配匹配的碎片离子。可靠鉴定其中一种肽序列不依赖于其他序列的正确鉴定。可以在彩易福彩库搜索中具有高分的交联肽对的鉴定,其中高分基于与一个正确的肽的合法良好匹配,但是与第二肽匹配不良。可靠的识别交联的交联,旨在用于建模蛋白质结构或复合物,需要对肽的校正鉴定,因此整个鉴定只能与两种肽的最常见的鉴定一样好(
      • trnka m.j.
      • 贝克P.R.
      • 罗宾逊P.J.J.
      • 伯灵名A.L.
      • Chalkley R.J.
      匹配交联肽光谱:仅与更糟糕的识别一样好。
      )。
      搜索每个片段频谱中的两种肽也具有对XL-MS识别软件的性能的影响。对于常规的MS基蛋白质鉴定的给定前体质量,可以通过应用'Averagine'模型来粗略估计可能匹配的线性肽的长度(
      • Senko M.W.
      • Beu S.C.
      • M单章锥体F.W.
      从分辨同位素分布中测定大型生物分子的单同位素质量和离子群。
      )。用于彩易福彩库搜索中匹配肽的候选者的数量主要取决于前体质量容差窗口的宽度和蛋白质彩易福彩库的大小。在XL-MS中,跨越两个肽的质量分布,并且只知道其群体的总和加上交联剂的质量。计算搜索空间包含交联肽的所有可能组合,其块的总和位于前体质量窗口内。搜索肽的所有组合而不是线性扫描所有肽都需要有效的算法来执行可接受的时间尺度的搜索。
      一些XL-MS搜索工具使用的最明显的解决方案是所有肽 - 肽对的蛮力计数,并通过前体质量过滤它们(
      • 加强M.
      • Pettelkau J.
      • Schaks S.
      • 博斯克。
      • ihling c.h.
      • Krauth F.
      • Fritzsche R.
      • Kühnu.
      • SINZ A.
      Stavrox-A软件,用于分析蛋白质相互作用研究中的交联产品。
      )。可以通过使用稳定的同位素在交联实验中使用稳定的同位素来加速搜索(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      ,
      • 莱特纳A.
      • Walzthoeni T.
      • Aeberberold R.
      使用LC-MS / MS和XQUEST / XProShet软件管道的蛋白质复合物的蛋白质复合物的特异性化学交联和识别交联位点。
      )。这种标记使交联光谱在MS1电平上容易识别,因此减少了彩易福彩库搜索工具搜索的相应MS2光谱的数量。几种常规的线性肽搜索工具(
      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      )以及XQuest(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      ,
      • 莱特纳A.
      • Walzthoeni T.
      • Aeberberold R.
      使用LC-MS / MS和XQUEST / XProShet软件管道的蛋白质复合物的蛋白质复合物的特异性化学交联和识别交联位点。
      ,
      • Walzthoeni T.
      • Claassen M.
      • 莱特纳A.
      • 赫罗特F.
      • Bohn S.
      • Försterf.
      • 贝克米
      • Aeberberold R.
      质谱法鉴定的交联肽的假发现速率估计。
      )和plink2(
      • Chen Z.-l.
      • 孟J.-M.
      • Cao Y.
      • yin j.-l.
      • 方r.-q.
      • 风扇S.-B.
      • 刘C.
      • 曾W.-f.
      • 丁Y.-h.
      • 棕褐色D.
      • 吴L.
      • 周W.-J.
      • Chi H.
      • 太阳r.-x.
      • 董M.Q.
      • 他是-M。
      高速搜索引擎PLINK 2,具有交联肽的蛋白质组尺度鉴定系统评价。
      )使用预先计算的片段离子索引以基于观察到的片段离子从蛋白质彩易福彩库中检索肽。就像stavrox一样(
      • 加强M.
      • Pettelkau J.
      • Schaks S.
      • 博斯克。
      • ihling c.h.
      • Krauth F.
      • Fritzsche R.
      • Kühnu.
      • SINZ A.
      Stavrox-A软件,用于分析蛋白质相互作用研究中的交联产品。
      ),XQuest片段一次和少量肽对。因此,使用标记的连接器与离子指数组合限制其计算存储器消耗,并使其适用于大蛋白质彩易福彩库。用于减少大型搜索空间的另一种方法是使用多通量评分。基于快速启发式或部分分数的第一评分步骤可以大大减少经受全面评分的候选者的数量,从而减少整体运行时。例如,kojak(
      • Hooopmann M.R.
      • Zelter A.
      • 约翰逊R.S.
      • Riffle M.
      • maccoss m.j.
      • 戴维斯T.N.
      • 莫里茨R.L.
      Kojak:高效分析化学交联蛋白质复合物。
      ),Xisearch(
      • 菲舍尔L.
      • Rappsilber J.
      交联/质谱中误差估计的奇数。
      )和plink2(
      • Chen Z.-l.
      • 孟J.-M.
      • Cao Y.
      • yin j.-l.
      • 方r.-q.
      • 风扇S.-B.
      • 刘C.
      • 曾W.-f.
      • 丁Y.-h.
      • 棕褐色D.
      • 吴L.
      • 周W.-J.
      • Chi H.
      • 太阳r.-x.
      • 董M.Q.
      • 他是-M。
      高速搜索引擎PLINK 2,具有交联肽的蛋白质组尺度鉴定系统评价。
      )从使用开放修改搜索策略开始使用线性肽搜索。 Kojak使用几百个批量肽,将它们结合成配对拟合前体质量,而Xisearch和Plink2仅保留一定数量的数量并再次搜索整个彩易福彩库,再次为第二肽。现有算法限制了搜索空间以进行全面评分。这意味着它们不会将它们的最终最差异分数应用于前体公差窗口内的每个候选交叉链路。这可能过早地解除一些候选肽,这些肽将具有高分作为肽对并降低有利于效率的敏感性。以前所表明,通过预刻度的线性肽(以下),可能在前几百个甚至一千个肽中发现了正确鉴定的交联的两种肽中的一个(
      • 戴J.
      • 江W.
      • yu f.
      • yu w.
      XOLIK:在线性时间内发现具有最大成对分数的交联肽。
      )。我们自己的实验还表明,对于一个片段谱的每种肽具有至少3个匹配片段的数千对,并且是一个片段谱的碎片和中等大小的彩易福彩库的实验也不罕见,并且是少于500种蛋白质的中等大小的彩易福彩库(彩易福彩未示出)。
      灵敏度被定义为由搜索工具标识的彩易福彩集中的实际交叉链路的比例。不幸的是,难以计算彩易福彩集中的真实交叉链路的真实交叉链路,因为晶体结构通常不完整,特别是对于较大的复合物。大多数蛋白质复合物的可能交联的理论数量非常高,并且通常鉴定它们的一小部分。此外,该号码对于任何固定的样本或搜索彩易福彩库也是相同的,并且不会影响工具的比较。因此,在本研究中,我们使用从目标蛋白质彩易福彩库中报告的交叉链路的数量给出了固定的fdr阈值作为搜索的真实敏感性的替代。
      在这项工作中,我们介绍OpenPepxl,一种有效的开源软件,用于鉴定片段质谱中的交联肽。它基于对每个前体质量所有可能的候选交联肽对的完全探索,以实现高灵敏度,但由于有效的指标彩易福彩结构和搜索算法,它可以实现大量改进的运行时间。 OpenPepxl支持标记和无标签,单声道和异常和异双功能不可粘合的交联剂。它基于OpenMS软件框架(
      • rost h.l.
      • Sachsenberg T.
      • Aiche S.
      • Bielow C.
      • Weisser H.
      • Aicheler F.
      • 和reotti s.
      • ehrlich h.-c.
      • Gutenbrunner P.
      • kenar e。
      • 梁X.
      • nahnsen s.
      • nilse l.
      • Pfreuffer J.
      • Rosenberger G.
      • RURIK M.
      • 施密特U.
      • veat J.
      • Walzer M.
      • Wojnar D.
      • Wolski W.E.
      • 席克宁o.
      • Choudhary J.s.
      • malmströml。
      • Aeberberold R.
      • Reinert K.
      • Kohlbacher O.
      OpenMs:用于质谱彩易福彩分析的灵活开源软件平台。
      )使用OpenMP API使用多核架构。 OpenPepxl是Openms蛋白质组学管道(TOPP)的一部分,包括标有标记和无标签量化,预处理和后处理的工具,以及光谱和识别彩易福彩的可视化。它可以安装在所有主要操作系统(Windows,MacOS和Linux)上,并且与大多数计算集群和云服务兼容,用于大规模彩易福彩分析。它可以作为命令行工具作为命令行工具,其中包含包含设置的预配置文件,或者作为使用可自由的图形用户界面构建的工作流的一部分,以便使用Knime Analytics平台(
      • Berthold M.R.
      KNIME:Konstanz信息矿工。
      )。 OpenPepXL支持XL-MS识别彩易福彩的多种输出格式,例如MzidentML 1.2格式(
      • VizCaino J.A.
      • Mayer G.
      • 珀金斯S.
      • Barsnes H.
      • Vaudel M.
      • Perez-Riverol Y.
      • Ternent T.
      • Uszkoreit J.
      • 艾森凯母线
      • 菲舍尔L.
      • Rappsilber J.
      • Netz E.
      • Walzer M.
      • Kohlbacher O.
      • 莱特纳A.
      • Chalkley R.J.
      • Ghali F.
      • Martínez-bartolomés。
      • 德意曲e.w.
      • 琼斯A.R.
      MzidentML彩易福彩标准版本1.2,支持蛋白质组信息学的进步。
      ),XQuest XML输出格式和简单的基于文本的表格格式。因此,输出可以很容易地集成到许多现有的XL-MS彩易福彩分析管道中,也与公共存储库骄傲兼容(
      • Riverol Y.
      • Csordas A.
      • 白j.
      • Bernal-Llinares M.
      • 赫瓦帕·纳拉纳S.
      • kundu d.j.
      • Inuganti A.
      • 怜悯J.
      • Mayer G.
      • 艾森凯母线
      • PérezE.
      • Uszkoreit J.
      • Pfreuffer J.
      • Sachsenberg T.
      • 伊利马萨斯。
      • Tiwary S.
      • Cox J.
      • 宣传E.
      • Walzer M.
      • Jarnuczak a.f.
      • Ternent T.
      • Brazma A.
      • VizcaínoJ.A.
      2019年的自豪彩易福彩库和相关工具和资源:提高对量化彩易福彩的支持。
      )这是Proteomexchange的一部分(
      • 德意曲e.w.
      • Csordas A.
      • 太阳Z.
      • Jarnuczak A.
      • Perez-Riverol Y.
      • Ternent T.
      • 坎贝尔D.S.
      • Bernal-Llinares M.
      • okuda s.
      • 卡瓦南斯。
      • 莫里茨R.L.
      • Carver J.J.
      • 王米
      • Ishihama Y.
      • Bandeira N.
      • Hermjakob H.
      • VizcaínoJ.A.
      2017年的蛋白质十一种联盟:支持蛋白质组学公共彩易福彩沉积的文化变化。
      )。我们将OpenPepXL与其他常用工具进行比较,以识别不可用于不可脱模的交联剂(PLink2(
      • Chen Z.-l.
      • 孟J.-M.
      • Cao Y.
      • yin j.-l.
      • 方r.-q.
      • 风扇S.-B.
      • 刘C.
      • 曾W.-f.
      • 丁Y.-h.
      • 棕褐色D.
      • 吴L.
      • 周W.-J.
      • Chi H.
      • 太阳r.-x.
      • 董M.Q.
      • 他是-M。
      高速搜索引擎PLINK 2,具有交联肽的蛋白质组尺度鉴定系统评价。
      ),Xisearch(
      • 菲舍尔L.
      • Rappsilber J.
      交联/质谱中误差估计的奇数。
      ),Kojak(
      • Hooopmann M.R.
      • Zelter A.
      • 约翰逊R.S.
      • Riffle M.
      • maccoss m.j.
      • 戴维斯T.N.
      • 莫里茨R.L.
      Kojak:高效分析化学交联蛋白质复合物。
      ),Stavrox(
      • 加强M.
      • Pettelkau J.
      • Schaks S.
      • 博斯克。
      • ihling c.h.
      • Krauth F.
      • Fritzsche R.
      • Kühnu.
      • SINZ A.
      Stavrox-A软件,用于分析蛋白质相互作用研究中的交联产品。
      )和xquest(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      ))在多样化的XL-MS实验中,表明它往往更敏感,同时仍然实现非常好的运行时间。 OpenPepxl可在三个条款BSD许可证下提供 //www.openms.de/openpepxl/.

      材料和方法

       算法概述

      OpenPepxL属于算法的类别,其在不对实验频谱中与交联剂共价连接的两种肽的整个候选分子,而不首先对线性肽进行开放修改。在这种情况下,它与XQuest有更多的共同之处(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      )和stavrox(
      • 加强M.
      • Pettelkau J.
      • Schaks S.
      • 博斯克。
      • ihling c.h.
      • Krauth F.
      • Fritzsche R.
      • Kühnu.
      • SINZ A.
      Stavrox-A软件,用于分析蛋白质相互作用研究中的交联产品。
      )而不是用plink2(
      • Chen Z.-l.
      • 孟J.-M.
      • Cao Y.
      • yin j.-l.
      • 方r.-q.
      • 风扇S.-B.
      • 刘C.
      • 曾W.-f.
      • 丁Y.-h.
      • 棕褐色D.
      • 吴L.
      • 周W.-J.
      • Chi H.
      • 太阳r.-x.
      • 董M.Q.
      • 他是-M。
      高速搜索引擎PLINK 2,具有交联肽的蛋白质组尺度鉴定系统评价。
      ),Kojak(
      • Hooopmann M.R.
      • Zelter A.
      • 约翰逊R.S.
      • Riffle M.
      • maccoss m.j.
      • 戴维斯T.N.
      • 莫里茨R.L.
      Kojak:高效分析化学交联蛋白质复合物。
      )或Xisearch(
      • 菲舍尔L.
      • Rappsilber J.
      交联/质谱中误差估计的奇数。
      )。 OpenPepxl在后面的情况下保留所有线性肽的列表及其群众 在Silico. 消化蛋白质彩易福彩库。然后针对每个MS2谱前体质量枚举候选肽对(Fig. 1)。以这种方式只创建必要的对。通过使用线性肽表的索引以在一对中引用肽,该候选肽对枚举仅需要最小量的额外记忆。在此步骤中也考虑了循环链接和单键链接。然后产生含有预期的肽对预期的所有线性和交联片段的理论光谱。默认情况下,B&Y离子系列包括NH的中性损耗 3 和 H2考虑O,但也可以产生A-,C-,X和Z-离子以适应不同的碎片方法。频谱匹配算法与这些理论和实验光谱之间的峰值匹配。从匹配的峰的数量计算候选肽对的匹配赔率分数(更多关于下面的分数)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1OpenPepxL肽对候选枚举和鉴定概述。 在Silico消解之后,保留由质量分选的修饰肽的彩易福彩库。对于每个MS2光谱,前体质量(1)用于确定α肽(较重)的质量范围。通过该清单(2)迭代,对于每一个α肽,确定β肽的质量范围(3),并列举一对成对列表。对于每个候选对,对理论光谱产生并评分对一个实验MS2光谱(标签自由实验)或一种线性离子和一个交联离子光谱(标记的交联剂实验)。
      对于使用标记的交联剂的实验,需要几个额外的预处理步骤。将由光和重的同位素连接的相同肽对的MS2光谱与标记的交联剂标记的交联剂,并且必须检测横跨质量迹线和保留时间的MS1特征和配对。我们使用用于MS1标签(FeatureFindermultiplex)的OpenMS工具,以根据特征质量转移检测从轻型和重链接的MS1特征对。然后,OpenPepXL将MS2频谱前体映射到各自的特征。然后将MS2谱映射到特征对进行配对并处理(Fig. 2)从线性和交联碎片中获取峰值集,具有降低的噪声。当与这些峰集匹配理论光谱时,仅线性理论片段峰与实验线性峰值匹配,反之亦然。该预处理步骤源自XQUEST算法,并将匹配和评分集中到较小的峰值,以减少假正峰值匹配的可能性。线性和交联离子匹配的分数组合到候选者排名和过滤之前的一个分数。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2标记接头实验对实验谱对的预处理。 DSS. D0/ D. 12 用作示例。来自相同肽对的两个实验光谱,但不同的接头质量匹配而没有质量偏移,并且考虑到多次电荷,标记物质量差的质量偏移。结果是具有未知电荷的线性离子光谱和具有已知离子电荷的交联离子光谱。这允许与理论峰值更约束和靶向匹配。

       比赛 - 赔率分数

      OpenPepxL中使用的匹配赔率分数基于来自XQuest算法的相同名称的分数(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      )。考虑到质量耐受窗口,基于从实验片段离子谱之间的任何峰之间的随机匹配和理论片段离子光谱中的任何峰之间的概率 ,质量范围 r,理论片段谱中的峰值数量 s 以及所有理论峰的审议费数 c。将一个随机匹配与片段离子峰的概率计算为:
      p=1(12×tol12r)s/c
      (1)


      用样本大小的二项分分布的累积分布函数 s 和概率 p 用于确定超过的可能性 k 随机偶然的实验和理论片段离子光谱之间的匹配峰:
      P(X>k)=i=k+1s(is)pi(1p)si
      (2)


      对于更高的数量,这种概率将降低0 k 在较小概率表示更好的匹配情况下,因为它不太可能发生在偶然的情况下。使用-log()函数,概率变为较高的分数,表示更好的匹配:
      m=日志(P(X>k))
      (3)


      我们称之为匹配赔率分数 m 它与前体误差相结合 PE. (ppm的理论和实验前体质量之间的差异)在下列公式中以获得最终OpenPepxl评分:
      score=0.2*日志(107+m)0.03*|pe|
      (4)


      该公式由线性回归和线性判别分析之间的协议确定,以找到最佳的线性组合以在几个XL-MS彩易福彩集上单独从诱饵命中的目标(有关详细信息,请参阅补充方法)。

       CRM复合物的质谱

      人CRM1,SNP1和携带Q69L突变的三聚体复合物与双(磺琥珀酰亚胺)的Suberate(BS3)交联并注入易于易于达到Q辐射质谱仪(Thermo Fisher Scientific)的Easy-NLC 1000 HPLC系统中使用50 min方法在三个标准化碰撞能量(NCE)条件下重复。 MS1和MS2分辨率分别设定为70,000和17,500。为NCE 20,24或28%的MS2碎片选择十五个具有3-7的充电前体(有关实验程序的更多细节,请参阅补充方法)。对于蛋白质彩易福彩库,仅使用三个UNIPROT序列O14980,O95149和P62826。手动修改它们以反映在蛋白质表达和纯化期间进行的修饰(
      • 蒙哥克T.
      • GüttlerT.
      • Neumann P.
      • Dickmanns A.
      • Görlichd。
      • Ficner R.
      核出口受体CRM1的晶体结构与Snurportin1和Rangtp复合物。
      )。包括改性蛋白质序列的MS蛋白质组学彩易福彩已经沉积在Proteomexchange联盟(
      • 德意曲e.w.
      • Csordas A.
      • 太阳Z.
      • Jarnuczak A.
      • Perez-Riverol Y.
      • Ternent T.
      • 坎贝尔D.S.
      • Bernal-Llinares M.
      • okuda s.
      • 卡瓦南斯。
      • 莫里茨R.L.
      • Carver J.J.
      • 王米
      • Ishihama Y.
      • Bandeira N.
      • Hermjakob H.
      • VizcaínoJ.A.
      2017年的蛋白质十一种联盟:支持蛋白质组学公共彩易福彩沉积的文化变化。
      )通过骄傲(
      • Riverol Y.
      • Csordas A.
      • 白j.
      • Bernal-Llinares M.
      • 赫瓦帕·纳拉纳S.
      • kundu d.j.
      • Inuganti A.
      • 怜悯J.
      • Mayer G.
      • 艾森凯母线
      • PérezE.
      • Uszkoreit J.
      • Pfreuffer J.
      • Sachsenberg T.
      • 伊利马萨斯。
      • Tiwary S.
      • Cox J.
      • 宣传E.
      • Walzer M.
      • Jarnuczak a.f.
      • Ternent T.
      • Brazma A.
      • VizcaínoJ.A.
      2019年的自豪彩易福彩库和相关工具和资源:提高对量化彩易福彩的支持。
      )与彩易福彩集标识符PXD014359的合作伙伴存储库。

       公共彩易福彩集

      除了上述CRM复杂彩易福彩集之外,还从公共存储库下载了三个彩易福彩集,或者通过其他实验室善待我们。
      我们选择了从HEK293细胞裂解物的尺寸排阻色谱法获得的BS3交联的粗核糖体级分的更复杂的公开彩易福彩集(ProteomeXchange ID PXD006131)(
      • Kolbowski L.
      • Mendes M.L.
      • Rappsilber J.
      优化三纤体质谱仪中交联肽片段化的参数。
      )。所得样品是大于1700多种蛋白质的复杂混合物,其通过无标记的线性肽定量定量。利用此彩易福彩,提供了多个蛋白质彩易福彩库。从含有32个最丰富的蛋白质的含量开始,尺寸加倍,直至512个最丰富的蛋白质。我们将该彩易福彩集的HCD分割子集搜索,该彩易福彩集由约170.000个HCD分段的MS2光谱组成,其与128个最丰富的蛋白质和128个反向序列诱饵的彩易福彩库组成。
      此外,我们分析了标有DSS-D的彩易福彩集0/ D.12 和 PDH-d0/ D.10 (Pimelic酸二酰肼)交联剂。商业牛血清白蛋白(BSA; Sigma-Aldrich)在单独的实验中与标记的DSS或PDH交联剂交联。使用HCD碎片和高分辨率MS / MS检测(Orbitrap Fusion Lumos)或离子捕获CID碎片,具有低分辨率MS / MS检测(Orbitrap Elite),独立地分析了两个样品。此彩易福彩集以前作为更大研究的一部分发布(
      • Iacobucci C.
      • piotrowski c.
      • Aeberberold R.
      • Amaral B.C.
      • 安德鲁斯P.
      • 伯尔福克。
      • 博赫斯C.
      • brodie n.i.
      • 布鲁斯J.E.
      • Cao Y.
      • Chaignepain S.
      • Chavez J.D.
      • Claverol S.
      • Cox J.
      • 戴维斯T.
      • Degliesposti G.
      • 董M.Q.
      • 埃林格纳。
      • Emanuelsson C.
      • 同性恋
      • GötzeM.
      • Gomes-Neto F.
      • Gozzo F.C.
      • Gutierrez C.
      • Haupt C.
      • heck a.j.r.
      • 赫罗特F.
      • 黄兰
      • Hooopmann M.R.
      • Kalisman N.
      • Klykov O.
      • kukačkaz.
      • 刘F.
      • maccoss m.j.
      • Mechtler K.
      • Mesika R.
      • 莫里茨R.L.
      • Nagaraj N.
      • Nesati V.
      • Neves-ferreira a.g.c.
      • 忍者R.
      • NovákP.
      • o'reilly f.j.
      • Pelzing M.
      • Petrotchenko E.
      • Piersimoni L.
      • Plasencia M.
      • Pukala T.
      • 兰德K.D.
      • Rappsilber J.
      • Reichmann D.
      • 水手C.
      • Sarnowski C.P.
      • 施泰米r.a.
      • 施密特C.
      • Schriemer D.C.
      • 施y.
      • Skehel J.M.
      • Slavin M.
      • Sobott F.
      • solis-mezarino五。
      • Stephanowitz H.
      • Stengel F.
      • Stieger C.E.
      • Trabjerg E.
      • Trnka M.
      • Vilaseca M.
      • Viner R.
      • Xiang Y.
      • 伊利马萨斯。
      • Zelter A.
      • Ziemianowicz D.
      • 莱特纳A.
      • SINZ A.
      第一个群社区,比较交联质谱研究。
      )由Alexander Leitner善待我们,请根据要求向我们提供。
      此外,我们使用Beveridge发布的交联合成肽彩易福彩集 等等。 (Proteomexchange ID PXD014337)(
      • 贝弗里奇R.
      • Stadlmann J.
      • Penninger J.M.
      • Mechtler K.
      一种用于基于蛋白质和蛋白质复合物的交联质谱的合成肽库。
      )。而不是使用胰蛋白酶消化的蛋白质,而不是来自胰蛋白酶的胰蛋白酶 S. pyogenes 在该研究中合成了具有一个内赖氨酸的Cas9蛋白。修饰肽末端以确保DSS不能与N末端或C末端赖氨酸交联。肽在12个单独的基团中保持不重叠肽序列。每组与DSS交联,并在MS彩易福彩采集三种技术复制之前混合交联肽溶液。这意味着与来自同一组的两个交联肽的交联几乎肯定是有效的鉴定,而来自不同组的肽之间的交联肯定是错误的识别。我们使用的蛋白质彩易福彩库是 S. pyogenes CAS9序列具有10个另外的蛋白质,来自该彩易福彩集的原始出版物的补充材料。

       彩易福彩处理

      所有彩易福彩集的.RAW文件使用ProteOWIzard Toolkit版本3.0.10577转换为MzML,MZXML和MGF文件。二进制编码精度设置为64位。写入索引和TPP兼容性已打开。没有压缩用于MZML文件。使用TOPP工具DECOYDATABASE从靶蛋白彩易福彩库产生反转的序列诱饵蛋白质彩易福彩库。由于它创建了自己的诱饵,因此仅向Plink2提供目标彩易福彩库。 OpenPepXLLF 1.1(OpenPepXL标签)使用TopP工具XFDR进行虚假发现率(FDR)估计,XISearch 1.6.731与XIFDR 1.1.27进行FDR估计,TPP 5.1.0带有Kojak 1.6.0和FDR估计的PeTideProclet, XQuest 2.1.3使用其内置FDR估计算法的FDR估计以及Plink 2.3.5和Stavrox 3.6.5的PLINK 2.3.5和Stavrox 3.6.5用于识别无标签彩易福彩集中的交叉链接。不同工具的参数被设置为相等的值,否则可能是合理或相似的值(补充表S1, 表S2, 表S3)。为OpenPepxl和XQuest输出的TopP Tools IdFilter,iDmerger和TextExporter部分完成了额外的过滤和后处理,否则使用R脚本。除非另有说明,否则交联频谱匹配(CSM)级别上的FDR截止值为5%的截止值(CSM)级别和所有彩易福彩集。另外,在该截止后,在保持至少两个剩余的CSMS支持的独特残留对(URP)之后。而且,将用于链路距离的过滤器施加到肽内连杆或环链路上。只有在彩易福彩库序列中除以至少4个残留物,才保持连接的残留对。这样做是为了进一步协调工具结果,因为这种截止在工具之间是不同的,并且具有短序列距离的连接残留对并不是非常有信息。使用一个CPU核心的Intel(R)核心(TM)I5-6500 CPU和8 GB RAM相同的Windows 10 PC进行比较所有工具。
      具有标记交叉链接器的彩易福彩集仅使用OpenPepXL和XQuest进行处理。 TopP工具FeatureFinderMultiplex用于检测OpenPepxL的MS1功能对。否则,应用了相同的处理步骤和过滤规则,如前两个无标签彩易福彩集。
      使用OpenPepXL处理合成肽彩易福彩集,搜索设置和筛选标准匹配的贝尔奇奇(Beveride)的原始出版物中使用的那些 等等。 (
      • 贝弗里奇R.
      • Stadlmann J.
      • Penninger J.M.
      • Mechtler K.
      一种用于基于蛋白质和蛋白质复合物的交联质谱的合成肽库。
      )。搜索结果其他工具是从出版物中获取的。这包括从搜索中的5和1%的CSM-FDR结果 S. pyogenes Cas9序列10额外的蛋白质。对于此彩易福彩,仅应用CSM-FDR截止,并跳过其他过滤步骤,使得结果与原始出版物的结果直接相当。
      来自CRM彩易福彩集的MS蛋白质组学彩易福彩,包括本研究中所有工具的搜索结果已被沉积在Proteomexchange联盟(
      • 德意曲e.w.
      • Csordas A.
      • 太阳Z.
      • Jarnuczak A.
      • Perez-Riverol Y.
      • Ternent T.
      • 坎贝尔D.S.
      • Bernal-Llinares M.
      • okuda s.
      • 卡瓦南斯。
      • 莫里茨R.L.
      • Carver J.J.
      • 王米
      • Ishihama Y.
      • Bandeira N.
      • Hermjakob H.
      • VizcaínoJ.A.
      2017年的蛋白质十一种联盟:支持蛋白质组学公共彩易福彩沉积的文化变化。
      )通过骄傲(
      • Riverol Y.
      • Csordas A.
      • 白j.
      • Bernal-Llinares M.
      • 赫瓦帕·纳拉纳S.
      • kundu d.j.
      • Inuganti A.
      • 怜悯J.
      • Mayer G.
      • 艾森凯母线
      • PérezE.
      • Uszkoreit J.
      • Pfreuffer J.
      • Sachsenberg T.
      • 伊利马萨斯。
      • Tiwary S.
      • Cox J.
      • 宣传E.
      • Walzer M.
      • Jarnuczak a.f.
      • Ternent T.
      • Brazma A.
      • VizcaínoJ.A.
      2019年的自豪彩易福彩库和相关工具和资源:提高对量化彩易福彩的支持。
      )与彩易福彩集标识符PXD014359的合作伙伴存储库。用标识符PXD014520和具有标识符PXD014523的BSA彩易福彩集沉积重排族核糖体馏分彩易福彩集。用标识符PXD021417沉积合成肽彩易福彩集的OpenPepxL结果。

       敏感性和特异性

      在这项研究中,我们使用从目标蛋白质彩易福彩库的固定FDR阈值下报告的交叉链路的数量作为搜索的真实敏感性的替代品。由于灵敏度和特异性之间的权衡,我们在CSM级别比较了所有工具的敏感性5%的FDR设置。另外,保留与至少两个光谱匹配的URP。对于OpenPepxl,我们还通过将诱饵点击通过滤波步骤并重新计算FDR为过滤的URPS列表来重新计算FDR以唯一的链接级别。在可以的情况下,我们验证了针对先前发布的结构彩易福彩的URP。对于合成肽彩易福彩集,可以比使用蛋白质结构更客观地验证所识别的交联。

       结构验证

      最佳olink(
      • 法拉利A.J.R.
      • Clasen M.A.
      • Kurt L.
      • Carvalho P.C.
      • Gozzo F.C.
      • MartínezL.
      拓扑链:使用化学交联距离约束评估结构模型。
      )用于分析交联残留物之间的溶剂可接近的表面距离(SASD)。选择了35埃的截止值。在Cβ原子之间测量SASD,同时忽略超出其Cβ原子的所有侧链。
      UCSF Chimera(
      • Pettersen e.f.
      • 戈达德T.D.
      • 黄阁
      • 沙发G.S.
      • 格林·下午。
      • 萌m
      • 菲尔明T.E.
      UCSF嵌合体 - 一种用于探索性研究和分析的可视化系统。
      )与XLink分析仪(
      • Kosinski J.
      • von appen a。
      • ori A.
      • 卡里斯K.
      • MüllerC.W.
      • 贝克米
      XLink分析仪:在三维结构的上下文中分析和可视化交联彩易福彩的软件。
      )插件用于可视化PDB结构上所识别的交叉链路。选择了35埃的欧几里德距离截止值,用于链接着色。与结构一致的交叉链接是彩色的蓝色,不一致的交叉链接红色。
      CRM彩易福彩集在具有PDB ID的X射线晶体术结构上验证 3GJX (
      • 蒙哥克T.
      • GüttlerT.
      • Neumann P.
      • Dickmanns A.
      • Görlichd。
      • Ficner R.
      核出口受体CRM1的晶体结构与Snurportin1和Rangtp复合物。
      )并且BSA彩易福彩集在来自X射线晶体学结构的链A上验证了PDB ID 4F5S。核糖体馏分彩易福彩集在较大一组X射线晶体学和冷冻 - EM结构上验证。

      结果

       基准结果

      为了评估OpenPepxL的性能,我们将其与五个目前流行的XL-MS搜索引擎进行比较(Stavrox(
      • 加强M.
      • Pettelkau J.
      • Schaks S.
      • 博斯克。
      • ihling c.h.
      • Krauth F.
      • Fritzsche R.
      • Kühnu.
      • SINZ A.
      Stavrox-A软件,用于分析蛋白质相互作用研究中的交联产品。
      ),XQuest(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      ,
      • 莱特纳A.
      • Walzthoeni T.
      • Aeberberold R.
      使用LC-MS / MS和XQUEST / XProShet软件管道的蛋白质复合物的蛋白质复合物的特异性化学交联和识别交联位点。
      ,
      • Walzthoeni T.
      • Claassen M.
      • 莱特纳A.
      • 赫罗特F.
      • Bohn S.
      • Försterf.
      • 贝克米
      • Aeberberold R.
      质谱法鉴定的交联肽的假发现速率估计。
      ),plink2 [13],kojak(
      • Hooopmann M.R.
      • Zelter A.
      • 约翰逊R.S.
      • Riffle M.
      • maccoss m.j.
      • 戴维斯T.N.
      • 莫里茨R.L.
      Kojak:高效分析化学交联蛋白质复合物。
      )和Xisearch(
      • 菲舍尔L.
      • Rappsilber J.
      交联/质谱中误差估计的奇数。
      ))在许多彩易福彩集上。尽可能多,使用与尽可能相似的设置(参见 补充表S1, S2S3 对于所有设置)。使用的彩易福彩集不同的大小和复杂性:将OpenPepx1施加到千分之一蛋白质的更复杂的核糖体馏分样本,识别敏感性和性能,但我们只能在结构上验证三分之一的交叉链接。因此,第二比较评估CRM复合物的高度纯化样品的敏感性和特异性与已知的三维结构。最后,OpenPepXL应用于标有交叉链接器和不同的交联剂化学生成的彩易福彩,以证明其多功能性。
      为了评估OpenPepxl与其他工具相比的敏感性,我们在核糖体馏分彩易福彩集上进行了搜索。在桌面PC上搜索约170,000 MS2光谱,并在具有8 GB内存的台式PC上进行128个目标和128名诱饵蛋白。 128个目标蛋白质彩易福彩库是OpenPepxl和Xisearch可以在不到3天的合理运行时间内处理的最大彩易福彩库。 OpenPepxl识别110个独特的残留对(URP),然后是PLink2(
      • Chen Z.-l.
      • 孟J.-M.
      • Cao Y.
      • yin j.-l.
      • 方r.-q.
      • 风扇S.-B.
      • 刘C.
      • 曾W.-f.
      • 丁Y.-h.
      • 棕褐色D.
      • 吴L.
      • 周W.-J.
      • Chi H.
      • 太阳r.-x.
      • 董M.Q.
      • 他是-M。
      高速搜索引擎PLINK 2,具有交联肽的蛋白质组尺度鉴定系统评价。
      )102(Fig. 3A)。应用过滤器施加后的OpenPepxL计算的URP级FDR(URP-FDR)估计为8.8%。显示工具之间标识重叠的Venn-ame 补充图S5。 Stavrox(
      • 加强M.
      • Pettelkau J.
      • Schaks S.
      • 博斯克。
      • ihling c.h.
      • Krauth F.
      • Fritzsche R.
      • Kühnu.
      • SINZ A.
      Stavrox-A软件,用于分析蛋白质相互作用研究中的交联产品。
      )由于计算机内存要求无法完成搜索。 XQuest(
      • rinner o.
      • Seebacher J.
      • Walzthoeni T.
      • 穆勒L.N.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • 穆勒M.
      • Aeberberold R.
      鉴定大序列彩易福彩库的交联肽。
      )没有超过可用的内存,但是在一周之后搜索被取消,因为在这些条件下的预计剩余的运行时间是不合理的。这里必须注意到,XQuest可以是并行化的并且可以在群集中运行,因此通常使用限量的计算机内存完成此搜索可能在其功能范围内。它还可以分析大多数彩易福彩集,在可行的运行时标记的交叉链接器。 OpenPepXL的敏感性以完全搜索平方搜索空间的成本和与此相关联的运行时增加。为了分析使用一个CPU核心PLINK2的核糖体馏分彩易福彩集35分钟,KOJAK约3小时,OPENPEPXL 28 H和XISECH 36 H(Fig. 3B)。 OpenPepxl也可以安装在Linux计算群集上,通过在25个核心上运行该工具可以实现加速度为15(补充图。S1)。证明核糖体馏分彩易福彩集的结构验证是困难的,因为大多数鉴定的交联链接在现有PDB结构中未解决的残留物对。可以验证的链接结果显示在 补充图S3S4。好奇地,任何工具中发现的任何链接都没有与结构不一致。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3核糖体馏分彩易福彩集的分析结果。 A,具有128个蛋白的目标彩易福彩库的核糖体馏分彩易福彩中鉴定的独特残留对(URP)的数量。 OpenPepxl标识了110个URP,PLink2标识了102 URP,Kojak 67 URP和Xisearch 54 URP。介绍了这些交联的结构验证 S4。 Stavrox超出了8 GB的可用内存,无法完成搜索。 XQuest没有超过可用的内存,但搜索被取消,因为这些条件下的预计运行时间是不合理的。 B,在使用一个CPU核心的彩易福彩库中分析核糖体馏分彩易福彩和128个诱饵蛋白的彩易福彩库所需的核段。 plink2只花了15分钟。 Kojak拍了3小时,OpenPepxl 28 H和Xisearch 36 H.
      为了表明,OpenPepx1报道的交联用于对蛋白质结构进行建模并且高灵敏度不会被报告更多的假阳性,测量了三维结构的三聚体CRM复合物的高度纯化的样品所有比较工具分析。 openPepxl和Plink2每个报告的总共78​​个URP,Kojak报告了61.可以映射到结构上的交叉链接为OpenPepxl,41个用于Kojak的URPS,然后用40个URPS(Fig. 4A)。应用过滤器施加后的OpenPepxL计算的URP-FDR估计为12%。通过计算连接的残留物之间的溶剂可接近的表面距离(SASD)并施加35埃的截止值来验证这些URP。使用PDB ID的结构计算SASD 3GJX。 OpenPepxl报告了一个与结构不一致的URP,Kojak仅报告了一致的URP和Plink2报告了与结构不一致的2个URP(Fig. 4A, Fig. 5)。此彩易福彩集的OpenPepxL的错误率大致等于具有可比灵敏度的其他工具的误差率。 OpenPepxl识别14个URP,其中任何其他工具未定义,其中6个在结构上验证(补充图S6)。每个14个URP的最高评分CSM的注释光谱显示在 补充图S9.S22.
      图缩略图GR4.
      Fig. 4CRM复合体和BSA彩易福彩集的分析结果。 A,CRM彩易福彩集中的识别URP的数量。确定链接PDB结构涵盖的残留物的URP 3GJX 通过拓扑电话分析。红色杆是连接残留物的支架的比例,无论是不可接近的残留物,还是根据SAS距离更远的距离。绿色棒是结构未被结构覆盖的URP的比例。 OpenPepxl标识了78个URP。验证了44个URP,一个链接与链接残留物之间的结构(IWS)不一致。 Kojak确定了61个URP,其中41次验证。 PLink2标识的78个URPS验证了38,两个是IWS,包括相同的37.4Å链接为OpenPepxL,另外的IWS链接与40.4Å距离。 Stavrox确定了48个URP,其中28件被验证,一个是IWS。 XISEARCH发现36个URP,其中24个验证了24个,其中XQUEST验证了14个。 B,BSA彩易福彩集中的识别URP的数量。将OpenPepxl和Xquest进行比较离子阱和轨道片段光谱彩易福彩,具有两种不同的标记接头DSS-D0/ D.12 和 PDH-d0/ D.10。确定了链接PDB结构覆盖的残留物的交联链接 4F5S 通过拓扑电话分析。红色杆是连接残留物的支架的比例,无论是不可接近的残留物,还是根据SAS距离更远的距离。 OpenPepXL在DSS orbitrap彩易福彩集中识别出65个URP,包括三个IWS链接,所有这些都在低于40埃以下。它在PDH orbitrap彩易福彩集中识别了22个URP,包括一个IWS链接,距离为59.3Å。 XQuest在PDH orbitrap彩易福彩集中识别16个URP,包括3个IWS链接。它在DSS orbitrap彩易福彩集中识别了21个URP,包括一个IWS链接。 XQuest在PDH离子阱彩易福彩集中识别9个URP,DSS离子阱彩易福彩集中的57个URPS,包括一个IWS链接,距离为70.2Å。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5映射到CRM复合体的PDB结构的交叉链路。 CRM彩易福彩集中标识的交叉链接(A)OpenPepxl,(B)Kojak和(C)PLINK2,映射到PDB结构上 3GJX。跨越大于35埃以上的跨越跨越距离的交叉链路是着色的红色。那些跨越距离的人是彩色的蓝色。
      为了评估具有标记的交联剂和不同连接反应化学的彩易福彩对彩易福彩的敏感性,并且BSA彩易福彩集与标记的交联剂DSS-D交联0/ D.12 和 PDH-d0/ D.10 用OpenPepxl和XQuest分析。 XQuest已经开发出特别是对于稳定的同位素标记的交联剂。使用由Orbitrap Instruments记录的HCD碎片化MS2光谱校准OpenPepxL的分数。此外,OpenPepxL中的频谱对准和解剖算法依赖于高分辨率片段谱。同时,XQuest主要用于由离子陷阱仪器记录的CID分段MS2光谱。 XQuest也不申请解剖学,但主要依赖于用于去噪光谱的稳定同位素标签,并且没有纠正错误分配的单向异位峰的特征。我们获得了一种彩易福彩集,其中等于样本与两个不同标记的交联剂交联并使用两种仪器类型分析。对于具有非常简单的目标系统的彩易福彩集,我们选择不仅选择赖氨酸和N末端DSS交联,而且还包括丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸作为潜在的连接位点。对于用PDH交联的样品,我们将天冬氨酸,谷氨酸和C末端设置为潜在的交联位点。 OpenPepxL识别HCD碎片化射频谱中的65个DSS和22个PDH URP,而XQuest鉴定了CID分割离子捕集谱中的57个DSS和9个PDH URPS(Fig. 4B)。在将DSS orbitrap和PDH orbitrap彩易福彩集应用于DSS Orbitrap和PDH orbitrap彩易福彩集的滤波器后计算出的URP-FDR分别估计为1.5%和7.1%。使用具有PDB ID的结构的链A验证这些URP 4F5S。 OpenPepXL报告了三个DSS URP和一个超过SASD截止的PDH URP为35Å。 XQuest确定了超过截止的DSS URP(Fig. 4B, Fig. 6)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6交叉链接映射到BSA的PDB结构。 BSA彩易福彩集中识别的交叉链路并映射到PDB结构的链A中 4F5S。跨越大于35埃以上的跨越跨越距离的交叉链路是着色的红色。那些跨越距离的人是彩色的蓝色。 A,DSS URP由OdeNpepxl在Orbitrap彩易福彩集中标识。 B,在orbitrap彩易福彩集中的OpenPepxl标识的PDH URP。 C,DSS URP通过XQuest识别的ION陷阱彩易福彩集。 D,通过XQuest在离子陷阱彩易福彩集中标识的PDH URP。
      使用刚性结构的交联的结构验证不能考虑蛋白质动力学和非特异性交联的形成。另外,交联在我们没有结构彩易福彩的蛋白质区域中形成高趋势, 例如 在非常灵活或非结构化的地区。在我们的核糖体分数彩易福彩集的交联的结构验证中可以看到一个很好的例子(补充图S3)。因此,我们选择在合成肽彩易福彩集上评估OpenPepxL,允许客观验证报告的交叉链接独立于可用结构信息。对于此彩易福彩,设置除OpenPepxl之外的所有彩易福彩都从Beveridge获取 等等。 (
      • 贝弗里奇R.
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      • Mechtler K.
      一种用于基于蛋白质和蛋白质复合物的交联质谱的合成肽库。
      因此,从比较中省略了XQuest,因为在该出版物中没有考虑。对于Kojak结果,仅适用于5%CSM-FDR搜索的独特交联级别。从可用于Kojak的几种可用的FDR控制方法,选择了使用仅使用独特的交叉链路的渗滤器的结果。通过设计这种合成彩易福彩集,它只有两个比较级别:CSMS和唯一链接。在这种情况下,独特的交联肽对,独特的交联和独特的残留对(URP)是等同的。结果显示在 Fig. 7补充图S7S8补充表S4S7。 5%FDR OpenPepxl平均报告242验证的URP,平均计算的URP级别FDR为7.9%。 Plink2平均报告了217个验证的URP,平均计算的URP级别FDR为11.4%(Fig. 7, 补充表S5)。在1%FDR OpenPepxL,平均报告168验证的URP,平均计算的URP级别FDR为1.7%。 Plink2平均报告207验证的URP,平均计算的URP级别FDR为6.9%(补充表S7)。与本研究中的其他彩易福彩集相比,该彩易福彩集在工具之间报告的URPS中具有更强大的重叠。补充图S7)。 5%FDR OpenPepXL查找由PLink2,Stavrox或Xisearch找不到的22个URP。 17中的17种也被Kojak搜索鉴定,平均计算的FDR为22.7%。查看5和1%FDR搜索之间的差异,5%FDR搜索结果在复制之间的已验证链接中显示了清晰的模式(Fig. 7)。对于每个工具,第二个复制具有最多报告的链接,第三个复制最少。 1%fdr搜索结果看起来嘈杂(补充图S8, 辅助表S6S7)。复制之间的差异中的模式几乎无法辨认。虽然Plink2报告了最高数量的交叉链路,但它也具有一个异常高计算的FDR,CSM级达到4.1%,第三次复制的URP级别为11.6%。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7分析在5%FDR截止值下的合成肽彩易福彩分析。 显示所有三个复制R1,R2和R3。蓝宝条显示有效的CSM /交叉链路和负负面的红条数 y 轴显示假正识别的数量。除了OpenPepxl之外的所有彩易福彩都是从菲律馆取出的 等等。 (
      • 贝弗里奇R.
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      一种用于基于蛋白质和蛋白质复合物的交联质谱的合成肽库。
      )。 XQuest被遗漏,因为在该出版物中没有考虑。 A,报告的CSM数量。确切的数字在 . B,识别的URP的数量。确切的数字在 .
      我们还研究了OpenPepxl和其他工具使用的光谱数量(补充图S8)。记录了5022毫秒的三个重复的第一个谱。 OpenPepXL将结果分配到总共4185个频谱。 2029年的目标,2156人是诱饵。验证的交叉链接超过5%FDR截止的截止值为822个光谱。 OpenPepXL报告了截止值下方的80个已验证的URP。 PLINK2将结果分配到总共1389个光谱。 1006项是靶标,384个是诱饵。在截止值上方的验证交叉链路被分配到639个光谱,并且在5%FDR截止4次额外的URPS下进行了报道。 XISEARCE分配了结果到4363谱。 1686人的目标,2677人是诱饵。 491分配给验证的交叉链接以上截止值,11例额外的URPS报告在5%FDR截止值以下。虽然XISEARCE将结果分配给最多MS光谱,但它分配了四倍的诱饵作为目标。与其他工具相比,这可能会非常严格。它在CSM和URP级别上的此彩易福彩上计算的FDR值低于Kojak和Plink2,但与OpenPepxL的不同( 补充表S4S5)。 Plink2似乎在不应用FDR截止的情况下为极少的光谱分配结果。这部分是因为它在实际搜索之前使用了几种启发式滤除光谱和肽,并且许多潜在的候选者不足以足够长以达到FDR估计步骤。这种方法使它非常快,但也意味着即使在FDR估计之前,也可能已经过滤了一些正确的CSMS,并且少数诱饵可能是与OpenPepxl,Xisearch相比略小于FDR控制的原因。和stavrox。 OpenPepxl近1:1的目标和诱饵分配。在比较工具中,它分配了最多的目标并经过验证到频谱的交叉链路。许多正确分配的CSMS主要基于前体质量,没有足够的片段匹配以进行自信的识别。然后在FDR估计后滤除这些,并表示低于5%FDR截止值的80个验证的URP。同时,这也导致在截止值上方报告的更正确的CSM和URP。在此比较方面,OpenPepxL将最正确的识别分配给Spectra,但可能仍然可能是从错误的CSMS分离正确的改进空间。

       OpenPepxl功能

      可以根据Windows,MacOS和Linux的当前版本安装OpenPepXL。它适用于所有标签和无标签的不可脱模交联剂。它利用标记的链接器来限制搜索空间以改善运行时和欺骗MS2光谱,以与XQUEST类似的方式。 OpenPepxl是我们了解唯一能够有效地结合高分辨率轨道片段光谱的匹配置信度的唯一工具,其具有来自稳定同位素标记的交联光谱预处理的额外益处。
      要将XL-MS的字段移动到成熟度,因此需要尽可能多的分析工具来支持由社区成员达成的标准化文件格式。 OpenMS支持Hupo-PSI等大多数打开的文件格式,如MS MS彩易福彩和MS识别彩易福彩格式MzientML。扩展此支持以包括MZIDENTML 1.2规范的XL-MS彩易福彩扩展(
      • VizCaino J.A.
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      • 琼斯A.R.
      MzidentML彩易福彩标准版本1.2,支持蛋白质组信息学的进步。
      )。
      OpenMS蛋白质组学管道(TOPP)包含许多用于MS彩易福彩处理和分析的额外工具,包括单同位素峰值分配和几种量化方法的校正。 OpenPepxl完全集成到该管道中,可以轻松地与许多这些工具组合,以构建复杂的处理管道。
      TOPP包括光谱和肽标识的图形可视化工具TOPPVIEW。它扩展了XL-MS彩易福彩,并且可以在MS1地图,MS1和MS2峰光谱上可视化MS1和MS2峰值光谱,包括MS2光谱的前体隔离窗口,匹配的MS2峰的片段注释和交联肽的序列覆盖(Fig. 8)。频谱可视化允许缩放,峰值标签完全可编辑和可移动,以帮助手动验证和用于出版图像的图像。手动添加或编辑注释可以保存在OpenMS内部蛋白质组学识别文件格式IDXML中。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8用注释匹配峰和肽序列覆盖在TopPView中的可视化。 在右侧是包含所识别的物种和几个匹配质量指标的描述表。在左侧是带有序列覆盖指示器的注释光谱。单侧箭头是指从标记残留物开始并在箭头方向上含有其余肽或肽对的片段。双箭头意味着从标记残余物开始并含有两种方向上的其余肽或肽对的片段。

      讨论& CONCLUSION

      OpenPepxl是一种新的XL-MS识别算法,可在可行的运行时提高灵敏度。它可用作所有主要操作系统的开源软件,并符合HUPO-PSI标准格式。在我们的基准中,OpenPepxL旨在成为一个非常敏感的XL-MS识别算法。它与标记的交叉链接器彩易福彩一样有效,如无标签彩易福彩。其错误率也类似于具有可比灵敏度的其他工具。由于完整的二次搜索空间上的不受约束的搜索,所可能性增加的灵敏度最有可能。 OpenPepxL的特异性是一种彻底的频谱匹配算法,其考虑从标记的连接器的同位素图案或光谱对的预处理中确定的相对质量公差和离子电荷状态。整个搜索空间的探索的组合,非常严格的理论和实验光谱之间的峰值和高效彩易福彩结构和算法之间的匹配标准使OpenPepxL具有可行的运行时和内存要求的敏感工具。 OpenPepxl比Xisearch和XQuest更快,但落后于Kojak,特别是Plink2。由于高效的彩易福彩结构和内置并行化OpenPepxl即使在大型计算集群和云服务上也可以实现非常好的加速,同时保持其瘦内存占据占据占据占据占据措施。因此,在大多数情况下,可以补偿对二次搜索空间完全探索的增加的计算工作。对于几个其他工具,这不是这种情况,如 例如 PLINK2仅作为Windows可执行文件和PLink2,Stavrox和Xisearch依赖于GUI,因此与许多远程计算环境不兼容。 OpenPepxl的实施仍然有改进的空间,我们正在探讨方式使其更有效,而不会牺牲其独特的敏感性。序列标签和离子指数如媒体彩易福彩分析已经采用的一些其他XL-MS识别工具已经采用的一些概念,并且我们计划将这些想法在未来实施OpenPepxl,只要它们对最终的不利输出。 OpenPepxl可以自由地使用,修改和重新分发,以便在三个条款BSD许可证下进行私人,学术和商业应用。

      彩易福彩和软件可用性

      来自CRM彩易福彩集的MS蛋白质组学彩易福彩,包括本研究中所有工具的搜索结果已被沉积在Proteomexchange联盟(
      • 德意曲e.w.
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      2017年的蛋白质十一种联盟:支持蛋白质组学公共彩易福彩沉积的文化变化。
      )通过骄傲(
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      2019年的自豪彩易福彩库和相关工具和资源:提高对量化彩易福彩的支持。
      )与彩易福彩集标识符的合作伙伴存储库 PXD014359.
      来自核糖体分数彩易福彩集的MS蛋白质组学彩易福彩(原始彩易福彩最初来自 PXD006131 (
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      优化三纤体质谱仪中交联肽片段化的参数。
      )),包括所有工具的搜索结果,在该研究中沉积在Proteomexchange联盟(
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      2019年的自豪彩易福彩库和相关工具和资源:提高对量化彩易福彩的支持。
      )与彩易福彩集标识符的合作伙伴存储库 PXD014520.
      来自BSA彩易福彩集的MS蛋白质组学彩易福彩,包括OpenPepxl和XQuest的搜索结果已被存放到Proteomexchange联盟(
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      2019年的自豪彩易福彩库和相关工具和资源:提高对量化彩易福彩的支持。
      )与彩易福彩集标识符的合作伙伴存储库 PXD014523.
      来自合成肽彩易福彩集的MS蛋白质组学彩易福彩(原始彩易福彩来自 PXD014337. (
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      一种用于基于蛋白质和蛋白质复合物的交联质谱的合成肽库。
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      2017年的蛋白质十一种联盟:支持蛋白质组学公共彩易福彩沉积的文化变化。
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      )与彩易福彩集标识符的合作伙伴存储库 PXD021417.
      软件:OpenPepxl可以免费使用,修改和重新分发,以便在三个条款BSD许可证下进行私人,学术和商业应用程序。 Windows,MacOS和Linux的安装程序以及源代码链接 //www.openms.org/openpepxl/.

      致谢

      我们感谢亚历山大莱特纳从苏黎世伊斯里奇提供了BSA彩易福彩集。

      补充材料

      参考

        • 刘F.
        • Heck A.J.
        通过交联质谱法询问蛋白质组件和蛋白质相互作用网络的结构。
        Curr。拍摄。结构。 BIOL。 2015; 35: 100-108
        • SINZ A.
        • ARLT C.
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