柿子羟基化是翻译后改性的可逆性改性

      氨基酸羟基化是一种常见的翻译后修饰,其通常调节蛋白质相互作用或添加可以进一步修饰的官能团。这种羟基化目前认为是不可逆的,需要降解和重新合成整个蛋白质以重置改性。在这里,我们提出了蜂窝机械可以在完整蛋白质上逆转介导的副烷基羟基化的证据。这些数据表明,天冬酰胺羟基化是一种柔性和动态的翻译后修饰,类似于调节信号网络的修饰,例如磷酸化,甲基化和泛醌。

      图形概要

      翻译后修饰(PTM)是氨基酸或蛋白质的化学改变,其增加蛋白质组的复杂性并允许细胞以动态或持续的方式改变蛋白质功能(
      • 沃尔斯C.T.
      • Garneau-Tsodikova S.
      • GTOTO JR,G.J.
      蛋白质后期改性:蛋白质组多样化的化学。
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      • 猎人T.
      酪氨酸磷酸化:三十年并计数。
      ,
      • Ciechorover A.
      蛋白水解:从溶酶体到泛素和蛋白酶体。
      ,
      • 段G.
      • Walther D.
      翻译后修改在蛋白质相互作用网络背景下的作用。
      )。这些修饰中的一些是不可逆转的,例如多肽链的切割导致蛋白质的活性改变。然而,大多数PTM是可逆的并且包括从大型寡糖链到几个原子的功能组的动态添加或消除,例如糖基化,磷酸化,乙酰化,甲基化或羧化。这些PTM的可逆性经常通过与相反的功能的酶类对的作用来实现,其中一个催化前进反应和另一种反应(
      • Tonks N.K.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶:从基因,起作用,疾病。
      ,
      • 特雷克S.C.
      • Mclaughlin P.J.
      • Allshire R.C.
      甲基化:在羟基化中丢失?
      ,
      • 灰色的灰色。
      • B.T.
      组蛋白乙酰化/脱乙酰化和癌症:“开放”和“关闭”案例?
      )。在热力学上的一种反应的情况下,反应可能不直观地是可逆的,因此包括中间产物。一个例子是半胱氨酸键的形成和溶解,其中键的形成可包括使半胱氨酸硫的氧化氧化成亚磺酸,然后通过与另外的半胱氨酸反应形成二硫键(
      • rehder d.s.
      • Borges C.R.
      半胱氨酸硫酸作为二硫键形成和非酶蛋白折叠的中间体。
      ,
      • OKA O.B.
      • Bulleid N.J.
      在内质网中形成二硫化物。
      )。
      在半胱氨酸以外的残留物上氧化或更精确的蛋白质羟基化在20世纪60年代被认为是PTM,当在胶原合成期间鉴定脯氨酸和赖氨酸的酶促羟基化时(
      • Kivirikko K.I.
      • Prockop D.J.
      吡啶羟基化与纯化的protocollagen羟化酶合成多肽。
      ,
      • 赫特顿Jr.,J.J.
      • Kaplan A.
      • udenfriend s。
      通过胶原脯氨酸羟化酶将氨基酸序列Gly-Pro-Pro转化为蛋白质至甘氨酸羟基溶液。
      )。随后,描述了由进化的2-氧基劳替依赖性二氧化基金酶(2G-OX)的进化保守家庭催化的羟基化的分子机制(
      • PLOUMAKIS A.
      • 科尔曼M.L.
      哦,你会去的地方!羟基化,基因表达和癌症。
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      • Loenarz C.
      • Schofield C.J.
      人2-氧氧化碳酸盐催化的羟基和羟基化和去甲基化的生理生化方面。
      )。 20Og-OX是由60多种蛋白质组成的蛋白质,其中所谓的HIF-羟基酶形成由四个羟基酶组成的亚组:3个羟基酶(PHD1,2和3)和浅氨基羟基酶“因子抑制HIF” (FIH)。 HIF-羟基酶作为细胞内氧水平的传感器。在常氧条件下,羟基酶(PHD1,2和3)催化HIF1的α亚基中的两种脯氨酸残基的特定羟基化,缺氧反应的主调节剂。一旦羟基化,HIF1α由von Hippel-Lindau遍基脲连接酶(VHL)复合物的结合,这促进了HIF1α的泛素化和快速蛋白酶体降解,导致蛋白质在常氧条件下烧蚀(
      • jaakkola p.
      • 鼹鼠D.R.
      • 田边
      • 威尔逊M.I.
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      • Ratcliffe P.J.
      用O2调节的脯唑羟基化靶向HIF-α到von Hippel-Lindau u多相色谱的含量。
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      • Ivan M.
      • Kondo K.
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      HIF.ALPHA靶向VHL介导的脯氨酸羟基化的破坏:对O2感测的影响。
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      • yu f.
      • 白人S.B.
      • 赵Q.
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      HIF.-1Alpha与VHL结合是通过刺激敏感的脯氨酸羟化的调节。
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      • Maxwell P.H.
      • 威森尔M.S.
      • 昌G.W.
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      • 凶手M.E.
      • Wykoff C.C.
      • pugh c.w.
      • maher e.r.
      • Ratcliffe P.J.
      肿瘤抑制蛋白VHL针对氧依赖性蛋白水解的缺氧诱导因子。
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      • appelhoff r.j.
      • 田边
      • raval r.r.
      • 托利H.
      • 哈里斯A.L.
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      • Ratcliffe P.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      脯氨酰羟基酶PHD1,PHD2和PHD3的差异函数在缺氧诱导因子调节中。
      )。 FIH,亚家族的其他组分,催化HIF1α的C末端中的天冬酰胺羟基化。在该残余物的羟基化后,阻抗形成有源转录因子复合物所需的共源的相互作用,导致在氧气存在下的HIF驱动转录的下调(
      • 马刚队
      • Hirota K.
      • Semenza G.L.
      fi-1:一种与HIF-1α和VHL相互作用的新蛋白,以介导HIF-1转录活性的抑制。
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      • Lando D.
      • peet d.j.
      • whelan d.a.
      • Gorman J.J.
      • Whitelaw M.L.
      HIF.反式激活结构域的天冬酰胺羟基化缺氧开关。
      )。
      在过去几年中,已经认为HIF1α不是由HIF-羟基酶羟基化的唯一蛋白质,并且已经假设和验证了几种附加底物,特别是FIH(
      • 凶手M.E.
      • Webb J.D.
      • Kramer H.B.
      • 凯斯勒光明
      • Ratcliffe P.J.
      基于蛋白质组学的鉴定抑制缺氧诱导因子(FIH)底物的新型因子的鉴定表明,含蒽醌重复域的蛋白质的广泛天冬酰胺基羟基化。
      )。以类似的方式在HIFα的背景下观察到,这些其他基材的羟基化通过FIH改变了羟基化结构域的物理化学性质。这些变化可以诱导或破坏最终控制底物活性,折叠或定位的蛋白质 - 蛋白质相互作用(
      • Scholz C.C.
      • Rodriguez J.
      • 泡菜C.
      • 毛刺S.
      • Fabrizio J.A.
      • nolan K.A.
      • Spielmann P.
      • Cavadas M.A.
      • 克利夫B.
      • Halligan D.N.
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      • peet d.j.
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      • von Kriegsheim A.
      • 康明斯e.p.
      • 泰勒C.T.
      fi通过脱氢素酶Otub1的羟基化调节细胞代谢。
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      • Rodriguez J.
      • Pilkington R.
      • 加西亚慕尼州A.
      • nguyen l.k.
      • rauch n。
      • 肯尼迪S.
      • Monsefi N.
      • Herrero A.
      • 泰勒C.T.
      • von Kriegsheim A.
      在不同的信号通路中的PHD3和FIH簇的基质被捕获的互动器。
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      • Kiriakidis S.
      • Henze A.T.
      • Kruszynska-ziaja I.
      • Skobridis K.
      • Theodorou V.
      • 古地球拍
      • Mazzone M.
      人血管内皮细胞存活需要因子抑制HIF-1(FIH-1)。
      ,
      • 凯特天仁
      • Duffield M.
      • Scrimgeour n.r.
      • 淹没L.
      • LIM W.L.
      • 达拉斯M.L.
      • Scragg J.L.
      • Chicher J.
      • 戴夫K.A.
      • Whitelaw M.L.
      • 同伴C.
      • Gorman J.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      • rychkov g.y.
      • peet d.j.
      通过FIH氧依赖性羟基化调节TRPV3离子通道。
      ,
      • Janke K.
      • Brockmeier U.
      • Kuhlmann K.
      • 艾森凯母线
      • nolde J.
      • Meyer H.E.
      • Mairbaurl H.
      • Metzen E.
      因子抑制HIF-1(FIH-1)调节凋亡刺激P53结合蛋白2(ASPP2)的蛋白质相互作用。
      )。
      目前,已经提示由HIF-羟基酶介导的羟基化是不可逆的方法,并且羟基化只能通过降解和新的非羟基化蛋白质的新合成重置(
      • 戈尔斯K.L.
      • Raines R.T.
      脯氨酰4-羟化酶。
      ,
      • Schofield C.J.
      • Ratcliffe P.J.
      HIF.羟基酶的氧气感应。
      ,
      • Chan D.A.
      • Sutphin P.D.
      • 日元。
      • 吉亚西亚A.J.
      缺氧诱导因子1α氧依赖性降解域的坐标调节。
      )。一种质谱测量监测2封FIH介导的Rabankyrin-5静脉化位点,因为没有发现脱羟基化的证据(
      • 单身龙。
      • 特鲁德D.C.
      • 菲舍尔r.
      • 凯斯勒光明
      • Ratcliffe P.J.
      • 凶手M.E.
      定量质谱显示因子抑制缺氧诱导因子催化羟基化的动态。
      )。尽管如此,一些作者提出了存在脱羟基化机制(
      • 凯特天仁
      • Duffield M.
      • Scrimgeour n.r.
      • 淹没L.
      • LIM W.L.
      • 达拉斯M.L.
      • Scragg J.L.
      • Chicher J.
      • 戴夫K.A.
      • Whitelaw M.L.
      • 同伴C.
      • Gorman J.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      • rychkov g.y.
      • peet d.j.
      通过FIH氧依赖性羟基化调节TRPV3离子通道。
      ,
      • 吉亚西亚A.
      • Siim B.G.
      • 约翰逊R.S.
      HIF.-1作为药物开发的目标。
      ),但是这个概念仅在假设PTM通常应该是可逆的假设。一些数据暗示暗示亚氨羟羟基化毕竟可以是可逆的PTM。首先,与HIF的脯氨酸羟基化相反,FIH介导的天冬酰胺羟基化不会导致蛋白质半衰期的快速降低。这表明FIH-底物是较长的蛋白质,因此该细胞将受益于以更具动态,无损方式重置羟基化水平的机制(
      • 凶手M.E.
      • Webb J.D.
      • Kramer H.B.
      • 凯斯勒光明
      • Ratcliffe P.J.
      基于蛋白质组学的鉴定抑制缺氧诱导因子(FIH)底物的新型因子的鉴定表明,含蒽醌重复域的蛋白质的广泛天冬酰胺基羟基化。
      )。一个这样的例子是瞬时受体电位香草3(TRPV3),离子通道通过FIH羟基化。在天冬酰胺残基上的羟基化降低了TRPV3介导的电流,而缺氧,FIH抑制或天冬酰胺残留物的突变增强而不影响蛋白质稳定性。有趣的是,通过通道的电流的增加在不到1小时的缺氧或FIH抑制中可观察到的。这种快速响应表明蛋白质必须是非常快速的成交量,或者羟基化可以逆转,而不会破坏并重新合成TRPV3(
      • 凯特天仁
      • Duffield M.
      • Scrimgeour n.r.
      • 淹没L.
      • LIM W.L.
      • 达拉斯M.L.
      • Scragg J.L.
      • Chicher J.
      • 戴夫K.A.
      • Whitelaw M.L.
      • 同伴C.
      • Gorman J.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      • rychkov g.y.
      • peet d.j.
      通过FIH氧依赖性羟基化调节TRPV3离子通道。
      )。此外,来自数学建模的间接证据表明,信号网络需要可逆透明羟基化的可逆性。 nguyen. 等等。 发布了一个全面的基于颂的数学模型,即时HIF网络(
      • nguyen l.k.
      • Cavadas M.A.
      • Scholz C.C.
      • fitzpatrick s.f.
      • 啰嗦的美国。
      • 康明斯e.p.
      • Tambuwala m.m.
      • Manresa M.C.
      • Kholodenko B.N.
      • 泰勒C.T.
      • 昌恩。
      缺氧诱导因子1Alpha(HIF-1Alpha)网络的动态模型。
      )。有趣的是,数学模型假设脯氨酸羟基的不可逆转性,但包括未定义的反应,导致N-末端天冬酰胺残基的脱羟基化(Fig. 1A)。模型需要柿子羟基化的可逆性来繁殖实验数据,这表明HIF蛋白水平和转录输出的瞬时诱导。除去未指明的脱羟基化反应后,模型预测HIF水平和活性将以持续的方式增加,这与实验观察结果有所增加(Fig. 1B1E)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1A,HIF-1α信号通信网络的修改动力学模型的示意图,其中从原始模型中移除了代表天冬酰胺脱羟基化的假定反应(
      • nguyen l.k.
      • Cavadas M.A.
      • Scholz C.C.
      • fitzpatrick s.f.
      • 啰嗦的美国。
      • 康明斯e.p.
      • Tambuwala m.m.
      • Manresa M.C.
      • Kholodenko B.N.
      • 泰勒C.T.
      • 昌恩。
      缺氧诱导因子1Alpha(HIF-1Alpha)网络的动态模型。
      )(由此表示表示 红色的 交叉线)。简而言之,细胞溶质HIF-1α蛋白质可以是逐氨基乙酰羟基化,用下标n(牛)表示,通过FIH;或多甲基 - 羟基化,用下标p(牛),通过羟基酶(PHD),并靶向von Hippel-lindau(VHL)介导的降解。在缺氧中,将pHD灭活,导致HIF-1α蛋白质稳定(未羟基化或浅酰胺基 - 羟基化形式)和骨髓易位(由下标n表示)。 HIF-1α也可以出口。核不羟基化的HIF-1α可以通过核化学核和/或核化羟基化的核化吡啶基 - 羟基化,并靶向核VHL介导的降解。如果没有发生羟基化,则核HIF-1α可以与HIF-1β微二胺,产生二聚化转录复合物(HIF1D),其可以结合靶基因的HIF响应元件(HRE),诱导其mRNA转录和蛋白翻译。 HIF-1二聚体还可以与PHD基因内的HRE结合,导致PHD蛋白的上调,导致负反馈。 (b-c)在存在下对Dmog或JNJ1935对HIF-1A稳定化的硅预测作用的比较(B)或缺席(C)天冬酰胺脱羟基化,前者匹配实验数据中观察到的瞬态动力学(
      • nguyen l.k.
      • Cavadas M.A.
      • Scholz C.C.
      • fitzpatrick s.f.
      • 啰嗦的美国。
      • 康明斯e.p.
      • Tambuwala m.m.
      • Manresa M.C.
      • Kholodenko B.N.
      • 泰勒C.T.
      • 昌恩。
      缺氧诱导因子1Alpha(HIF-1Alpha)网络的动态模型。
      )后者展示了持续的模式。
      总体而言,尽管这些数据给出了假设的初始基础,但天冬酰胺羟基化是可逆的,但没有产生可逆性的直接证据。值得注意的是,氨基酸甲基化最初被认为是静态改性(
      • 兰卡坦尼S.
      • Bhattacharya S.K.
      • Cervoni N.
      • SZYF M.
      DNA甲基化是可逆的生物信号。
      )随后被证明是通过2-牛的作用逆转的。考虑到这一点,我们首先通过使用定量MS来检查天冬酰胺羟基化的潜在可逆性。

      实验步骤

      除非另有说明,否则所有试剂均可从英国吉拉姆,吉尔明汉,吉尔明郡购买。

       细胞培养

      HEK293T细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养,补充有2米m 谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,Ca)和10%胎牛血清(Invitrogen)。根据供应商的说明用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染质粒。 Silac媒体是由缺乏的定制DMEM培养基产生的 l-Arginine和 l-Lysine(Thermo Fisher Scientific)。这媒体补充了 l-Arginine-13C 15n(r10)和 l-Lysine-13C 15n(k8)(剑桥同位素Laboratories,Inc。,莱斯特,英国),但没有FCS,以防止融合 12C-赖氨酸或精氨酸。

       材料

      所有抗体来自商业来源:抗标志M2过氧化物酶从Sigma Aldrich获得(F4042,1:1,000稀释),抗HIF1α来自BD生物学(610958 1:1,000稀释),抗GFP和抗Myc来自从Santa Cruz(SC-8035,1:1,000稀释)购买抗微管蛋白(SC-8035,1:1,000稀释)和抗-V5从Invitrogen(R96025,1:5000稀释)获得抗微管蛋白。从Cayman Chemical(71210)获得DMOG,DFO和环己酰胺购自SIGMA(D9533-C4859)。对于免疫沉淀抗标志-M2珠粒(Sigma Aldrich),使用抗Myc珠粒(Cell Signaling-9B11)和抗GFP(GFP-Trap磁性琼脂糖 - Chromotek,慕尼黑,德国)。

       质粒

      GFP-HIF1A是来自ALX Chong(Aston University),Flag-TNKS2的赠品,来自Addgene(#34691)。

       细胞裂解和免疫印迹

      细胞在冰冷裂解缓冲液中裂解(1%Triton X-100,20米m Tris-HCl(pH 7.5),150米m NaCl),补充有蛋白酶(5μg/ ml Leupeptin,2,2μg/ ml抑肽蛋白),磷酸酶抑制剂(20米m β-甘油磷酸盐)。通过以20,000×离心来清除裂解物的裂解物 g 台式离心机(4°C)中10分钟。通过SDS-PAGE分馏总裂解物并转移到硝酸纤维素过滤器上。通过用辣根过氧化物酶 - 缀合的第二抗体(Bio-rad Laboratories)的增强化学发光检测(GE Healthcare),通过增强化学发光检测(GE Healthcare)来观察免疫复合。

       体外脱羟基化反应

      Thioredoxin-6组氨酸(TRX-6H)标记的人HIF-2αCAD(774-874)和麦芽糖结合蛋白(MBP)标记的人FIH在BL21(DE3)中表达 大肠杆菌 如前所述(
      • Lando D.
      • peet d.j.
      • Gorman J.J.
      • whelan d.a.
      • Whitelaw M.L.
      • 布鲁克r.k.
      fi-1是一种氨氨基羟基酶,其调节缺氧诱导因子的转录活性。
      )。用0.5米诱导蛋白质表达m IPTG。 CAD在30℃下诱导8小时,并使用HISTRAP HP柱(GE Healthcare,Sydney,Australia)纯化。 FIH在16℃下诱导16小时,并使用MPBTRAP HP柱(GE Healthcare)纯化。蛋白质被交换成150米m NaCl, 20 mm 使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)Tris-HCl pH8。十μ.m CAD通过与10μ孵育而羟基化m FIH, 112.5 mm NaCl, 65 mm Tris-HCl, 4 mm 抗坏血酸钠,500μm DTT, 30 μm FeSO4 and 40 μm 在37℃下为2.5小时的2-氧氧化盐,并使用Histrop HP列(GE Healthcare)进行恢复。 fih - / - hela细胞(
      • 陈D.Y.
      • Fabrizio J.A.
      • 威尔金斯S.E.
      • 戴夫K.A.
      • Gorman J.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      • 弗莱明S.B.
      • peet d.j.
      • Mercer A.A.
      Ankyrin ORF病毒的重复蛋白对细胞缺氧响应途径影响。
      )在冰冷的裂解缓冲液中裂解(1%Triton X-100,20米m Tris-HCl(pH 7.5),150米m NaCl),补充了无稳定的EDTA蛋白酶抑制剂)。蛋白质浓度为约0.5mg / ml。将1μg羟基化的CAD在37℃下在37℃下孵育,用1ml FIH - / - Hela裂解物3小时(或0小时进行控制)。用Ni-NTA-琼脂糖珠(QIAGEN)沉淀并用胰蛋白酶和胰蛋白酶和Gluc消化并如所述处理。使用Lumos Fusion(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)质谱仪进行质谱仪,耦合到RLS-Nano UHPLC(Thermo Fisher Scientific)。肽通过5-30%乙腈,0.05%乙酸的40分钟的线性梯度分离。质量范围为646.5-653.5。产生XIC的宽度(646.6980-646.7140)/(652.0300-653.0440),用于非羟基化/羟基化肽。使用羟基化/非羟基化标准物校准肽洗脱时间。

       在细胞脱羟基化样品制备中

      通过用指示的不同质粒转染HEK293T细胞。转染后24小时进行不同的处理。为了防止再羟基化,所有裂解和洗涤缓冲液都含有1米m Nog,泛羟化酶抑制剂。后处理,细胞在裂解缓冲液中裂解(1%Triton X-100,150米m NaCl, 20 mm Tris–HCl pH 7.5, 1 mm EDTA pH 7.5)。在翠鸟Duo机器人站(Thermo Fisher Scientific)上进行免疫沉淀,洗涤和消化。分别在100μl中稀释5μl磁性抗体胎圈浆料,抗标菌-M2珠粒(Sigma Aldrich),抗Myc珠粒(Cell Signing-9b11)和抗GFP(GFP-Trap磁性琼脂糖 - Chromotek)稀释裂解缓冲液并装入96深孔板的行H.将500μl裂解物加载到行g中,将300μl裂解缓冲液加载到行E和F.300μl洗涤缓冲液中(150μmm NaCl, 20 mm Tris–HCl pH 7.5, 1 mm EDTA pH 7.5)加载到行B-D中。排A含有100μl消化缓冲液(2米尿素,50米m Tris–HCl pH 7.5, 1 mm DTT,5μg/ ml猪胰蛋白酶(Promega,南安普顿,英国)5μg/ ml Gluc(Promega))。机器人在行h中拾起珠子,将它们运送到行g并释放并混合它们2小时。珠子在其中拾取并随后释放到尺度f至b中,在其中1分钟混合。然后将洗涤的珠子输送到排A中并在混合下消化27℃持续30分钟。然后在37℃下除去并消化的珠子在37℃下继续8小时。在碘乙酰胺改性和酸化后,使用自制C18尖端脱盐肽混合物。将脱盐和冻干肽重悬于0.1%TFA中,并通过反相纳米LC-MS / MS进行质谱分析

       质谱

      使用纳米终极3000液相色谱系统和Qexactive Plus或Lumos融合质谱仪(两者都是Thermo Fisher Scientific)的反相纳米-1C-MS / MS分析5μL重悬浮的肽。流速为400 nL / min。使用67 min梯度缓冲液A,2%乙腈0.5%乙酸,缓冲B,80%,将肽装载到自填充的分析柱(Uchrom,纳米溶液,oroville,oroville,ca; 1.6,0.075mm×25cm)上。乙腈,0.5%乙酸; (0-16 min:2%缓冲b,16-56 min:3-35%缓冲b,56-62 min:99%缓冲b; 62-67 min 2%缓冲b. Qexactive在Top-12中运行,具有30-s动态排除范围的数据相关模式。在壁图中的全扫描光谱录制在范围内 m/z 350 to m/z 1,650(分辨率:70,000; AGC:3E6离子)。使用1.4,AGC 5E4,HCD碰撞能量为26的隔离窗口进行MS2,扫描范围为140至200ms的最大喷射时间。 LUMOS以数据相关模式操作,具有10-S动态排除范围。在壁图中的全扫描光谱录制在范围内 m/z 350 to m/z 1400(分辨率:240,000; AGC:7.5e5离子)。 MS2在离子阱中进行,隔离窗口0.7,AGC 2E4,HCD碰撞能为28,快速扫描速率,扫描范围145-1,450 m/z,50 ms最大喷射时间和整个周期时间为1 s。

       羟基化占用的计算

      为了计算相对摩尔电离效率,我们设计了一种假设肽主要存在于两个分子状态,羟基化和未改性的肽的方法。通过确定关于参考强度的任何物种的相对丰度,我们估计了未改性或羟基化肽的相对电离效率。为了确定未改性肽的相对电离效率,我们分别在光和重标记的样品中检测到的TNKS2 / HIF1A / TRPV3肽列表,排除了含M含肽的肽(和TNKS2的含N肽)和总结后一个时间点的沉重通道中的强度。然后,通过该和将未修饰的含有重肽的强度划分为在参考强度上产生非羟基化肽的相对强度。
      rel。IonizationEfficiencyN803=IntensityH(N803)HifpeptidenHifpeptideIntensityH


      在FIH表达诱导的肠化学计量羟基化(例如HIF1A的N803)的情况下,我们总结了未处理样品(在时间点0)的光通道中相同肽的强度,并将羟基化肽的强度分开和
      相应强度的比率等于摩尔电离强度的比率。
      rel。IonizationEfficiencyN803rel。IonizationEfficiencyNox803=MolarIonizationEfficiencyN803MolarIonizationEfficiencyNox803


      如果羟基化出现不为单胞计量,例如在TRPV3中,则包括另外的步骤。我们计算了重生条件下非羟基化肽的比率。这给了我们未改性肽的相对电离效率的比率。我们重复该步骤为标记的光,在时间点0.未修饰的肽。未修饰肽的相对电离效率的差异允许计算DMOG处理的样品与控制之间的占用差异,允许我们计算占用占占用率的控制未改性的肽。知道该占用率,然后允许通过将占用率乘以具有羟基化肽的光的比例乘以占状肽的比例来计算羟基化肽和相对电离强度的占用率。这些计算产生了未改性/羟基化肽的分子电离效率的比率。我们使用它来改变修改/未经修改的比率,以通过MaxQuant进入摩尔比来计算。通过将比例分开+1,将摩尔比转化为估计的占用;
      Occupancy=RatioRatio+1


      使用Perseus软件(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Sinitcyn P.
      • 卡尔森A.
      • 嘿m.y.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      Perseus综合分析(Prote)OMICS数据的计算平台。
      )。在我们无法计算摩尔电离效率的比率的情况下,我们估计是1。

       实验设计与统计理由统计分析

      总体而言,分析了150个生物重复样品。 8用于确定DMOG效率(两个控制器),48和48用于TNKS2 DMOG和TNKS2 DMOG / CHX实验(每个样本集中的24个控制),20对于TNKS2 DFO实验(10个控制),6用于TNPV3 DMOG HIF1A DMOG实验(4个控制)的实验(2个控制),16个用于HIF2A的4个样品 体外 二羟基化实验。使用Excel = RAND()命令随机化MS分析的样本序列。使用GraphPad Prism 8进行统计测试(多次T测试),假设分布是正常的。蛋白质强度和羟基化占用显示出具有表示平均值(S.E.)的标准误差的误差条。

       数据库搜索参数和验收标准进行标识

      MAXQUANT和ANDROMEDA(1.6.10.43)软件包分析MS原始数据(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )使用预选的分析条件(特定蛋白酶,2个错过的裂解,7个氨基酸最小长度)。将蛋白酶设置为TNKS2 / TRPV3或HIF1A下拉的胰蛋白酶或胰蛋白酶+ GLUC。选择氨基甲酰化(C)作为固定改性。可变修饰是N-末端乙酰化(蛋白质),氧化(MPN)和重标记的氨基酸(K8R10)。 FDR设定为0.01。搜索MS / MS SPECTRA对人的UNIPROT数据库(09/2019 UP000005640_9606.FASTA; 20,656条目)和MAXQUANT污染物数据库(246个条目),其质量精度为4.5ppm(用于MS)和20 ppm或0.5 da( MS / MS OT或IT)。选择峰值匹配,并限制在0.7分钟的洗脱窗口内,质量精度为4.5ppm。

       在Silico建模中

      在Silico中预测推定的脱羟基化可能对HIF-1α信号通路的动态行为有关的效果,我们修改了我们之前开发的HIF途径的良好校准的数学模型(
      • nguyen l.k.
      • Cavadas M.A.
      • Scholz C.C.
      • fitzpatrick s.f.
      • 啰嗦的美国。
      • 康明斯e.p.
      • Tambuwala m.m.
      • Manresa M.C.
      • Kholodenko B.N.
      • 泰勒C.T.
      • 昌恩。
      缺氧诱导因子1Alpha(HIF-1Alpha)网络的动态模型。
      ),除去代表该模型中代表天冬酰胺脱羟基化的步骤(Fig. 1A)。这是通过将描述这些反应速率的动力学参数来完成的,这是通过在模型的常微分方程中为空的速率。在各种条件下的完整和调整模型的模拟(IE。 Dmog和JNK的羟化酶抑制,1和3%缺氧, Fig. 1B1E)显示除去天冬酰胺的脱羟基化步骤未能再现HIF-1α表达的实验模式。

      结果

      有几种分析技术可以应用于PTMS变化的定量,例如使用改性特异性抗体或在页面中表观分子量的变化监测(
      • Snell C.E.
      • 托利H.
      • McIntyre A.
      • 李德。
      • Masiero M.
      • Schofield C.J.
      • 工平k.c.。
      • 哈里斯A.L.
      • Pezzella F.
      脯氨酸 - 羟基化缺氧诱导因子1α(HIF-1Alpha)上调人肿瘤。
      ,
      • 罗W.
      • 林B.
      • 王Y.
      • 钟杰。
      • o'meally R.
      • COLE R.N.
      • Pandey A.
      • Levchenko A.
      • Semenza G.L.
      博士3介导的非气体肌动蛋白的脯氨酰羟基化损害聚合和细胞活性。
      )。遗憾的是,上述方法都不是普遍的,因此,我们决定使用定量MS(QMS)来研究羟基化是可逆过程。 QMS在相对定量方面被证明是优于Western印迹,并且是一种广泛用于监测蛋白质羟基化状态变化的方法(
      • jaakkola p.
      • 鼹鼠D.R.
      • 田边
      • 威尔逊M.I.
      • Gielbert J.
      • Gaskell S.J.
      • von Kriegsheim A.
      • hebestreit h.f.
      • Mukherji M.
      • Schofield C.J.
      • Maxwell P.H.
      • pugh c.w.
      • Ratcliffe P.J.
      用O2调节的脯唑羟基化靶向HIF-α到von Hippel-Lindau u多相色谱的含量。
      ,
      • Scholz C.C.
      • Rodriguez J.
      • 泡菜C.
      • 毛刺S.
      • Fabrizio J.A.
      • nolan K.A.
      • Spielmann P.
      • Cavadas M.A.
      • 克利夫B.
      • Halligan D.N.
      • Nathan J.A.
      • peet d.j.
      • 温格·R.H.
      • von Kriegsheim A.
      • 康明斯e.p.
      • 泰勒C.T.
      fi通过脱氢素酶Otub1的羟基化调节细胞代谢。
      ,
      • Rodriguez J.
      • Pilkington R.
      • 加西亚慕尼州A.
      • nguyen l.k.
      • rauch n。
      • 肯尼迪S.
      • Monsefi N.
      • Herrero A.
      • 泰勒C.T.
      • von Kriegsheim A.
      在不同的信号通路中的PHD3和FIH簇的基质被捕获的互动器。
      ,
      • 单身龙。
      • 特鲁德D.C.
      • 菲舍尔r.
      • 凯斯勒光明
      • Ratcliffe P.J.
      • 凶手M.E.
      定量质谱显示因子抑制缺氧诱导因子催化羟基化的动态。
      ,
      • 罗W.
      • 林B.
      • 王Y.
      • 钟杰。
      • o'meally R.
      • COLE R.N.
      • Pandey A.
      • Levchenko A.
      • Semenza G.L.
      博士3介导的非气体肌动蛋白的脯氨酰羟基化损害聚合和细胞活性。
      )。最初,我们计划监测富乙基底物脂肪酶2(TNKS2)上的天冬酰胺羟基化的动态。
      甲吡酶是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白质超级家族的构件,其参与WNT /β-Catenin信号传导途径中的降解复合物的调节(
      • Mariotti L.
      • Templeton C.M.
      • 帕拉克罗斯P.
      • Cronin N.
      • Beuron F.
      • 莫里斯E.
      • Guetller S.
      不需要SAM结构型聚合以支持WNT-Beta-catenin信号传导。
      ,
      • 杨E.
      • tacchelly-enfite O.
      • 王Z.
      • 兰德尔米普
      • 天啊
      • Benchabane H.
      • Freemantle S.
      • Pikielny C.
      • Tolwinski N.S.
      • 李娥。
      • 艾哈迈德Y.
      ADP-核糖化的WNT途径激活。
      ,
      • Waaler J.
      • 马赫o.
      • Tumova L.
      • Dinh H.
      • Korinek V.
      • 威尔逊S.R.
      • Paulsen J.E.
      • Pedersen n.m.
      • eide t.j.
      • 马蹄娃O.
      • GRADL D.
      • Voronkov A.
      • von kries J.P.
      • Krauss S.
      一种新的Tankyrase抑制剂在结肠癌细胞中降低了规范Wnt信号传导,并降低了条件APC突变小鼠的肿瘤生长。
      )。 TNKS2的特征在于FIH底物,其在几个ankyrin重复域(ARD)中包含FIH共有型图案[LXXXXXV / IN](
      • 凶手M.E.
      • Webb J.D.
      • Kramer H.B.
      • 凯斯勒光明
      • Ratcliffe P.J.
      基于蛋白质组学的鉴定抑制缺氧诱导因子(FIH)底物的新型因子的鉴定表明,含蒽醌重复域的蛋白质的广泛天冬酰胺基羟基化。
      ,
      • 凶手M.E.
      • Webb J.D.
      • Ratcliffe P.J.
      依赖于胆素重复域的蛋白质的FIH依赖性天酰胺羟基化。
      )。这样,TNKS2含有多个羟基化位点,并且尚未据报道对TNKS2的羟基化对其稳定性产生任何影响。多种羟基将使我们能够在同一实验中监测几个位点,从而改善我们检测一个或多个羟基化的检测机会,如果一个或多个羟基化因统计学意义而降低。
      作为一种实验方法,我们将脉冲稳定同位素标记与细胞培养(氧化硅酸)中的氨基酸进行调整,已成功地用于测量蛋白质和PTM营业额(
      • Boisvert F.-M.
      • Ahmad Y.
      • gierlińskim.
      • CharrièreF.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      ,
      • ohsumi Y.
      蛋白质营业额。
      )。用V5标记的FIH和标志标记的TNKS2转染HEK 293T细胞。转染后24小时将培养基含有氧化培养基(含有 13C-和 15n标记的精氨酸和 13C-和 15在不同的时间点制备N-标记的赖氨酸氨基酸(R10K8))和细胞裂解物。为了进一步将未标记的氨基酸的潜在掺入掺入蛋白质中,我们还在无血清条件下工作,因此,标记的氨基酸掺入的全面性仅受同位素纯度的限制(一般>99%)和通过未标记蛋白质的降解引起的未标记氨基酸的再循环。在这些约束中,用重质硅酸氨基酸脉冲使我们能够区分TNKS2从氧化硅加入(轻硅酸)之前的TNKS2合成的脉冲(重质硅酸)。为了避免在硅酸脉冲之后可能的肽的再氢化,用二甲基 - 氧基甘氨酸(Dmog)处理细胞,并且裂解缓冲液含有N-氧基甘氨酸(NOG),两者都是泛羟基化酶抑制剂(
      • 布鲁克r.k.
      • Mcknight S.L.
      脯氨酰-4-羟基酶的保守家庭,其改性HIF。
      )。因此,如果羟化酶抑制成分,则重型硅酸肽应缺乏羟基化。通过跟踪羟基化和非羟基化的肽强度之间的比率如何变化,我们可以监测羟基化的比例是否颠倒(Fig. 2A)。该实验装置允许我们跟踪TNKS2(光)初始群体的秋天羟基化水平,并通过测定重型硅酸溶胶TNKS2的相对羟基化变化来确定有效DMOG抑制羟基化反应。为了建立抑制FIH介导的TNKS2羟基化所需的浓度,脉冲细胞随着4小时的增加Dmog和重型氧化氧化培养基。然后量化了羟基化肽的重标记百分比 相对 车辆控制评估DMOG浓度与FIH抑制之间的关系。正如预期的那样,越来越有效地抑制DMOG抑制(Fig. 2B, 补充图。S1),2米m 减少98%的活动。 1米m and 0.5 mm Dmog仅部分抑制FIH,因此我们使用了最高浓度的所有进一步的实验。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2A,基于MS的羟化酶筛网的示意图。光标记的细胞/蛋白质是蓝色的,蛋白质合成后脉冲呈红色。在羟化酶抑制剂存在下,细胞脉冲重质硅酸氨基酸。细胞被裂解,消化蛋白质。改变未改性和羟基化肽对随时间的强度比(底部面板)表示翻译后修改的逆转。 B,HEK293T细胞与标志标记的TNKS2转染。 24小时后转染后培养基被重型氧化硅酸组成,细胞用不同浓度的Dmog或载体处理4小时。标记标记的蛋白质被免疫沉淀,消化和通过MS分析。图表表示DMSO / DMOG存在下重标记的羟基化TNKS2肽的平均百分比,100%设置为DMSO水平 n = 2,6肽。 C,HEK293T细胞与标志标记的TNKS2转染。 24小时后转染后培养基被重型氧化硅酸替代,用不同时间的DMSO或DMOG处理细胞。将细胞溶解,并在页面上分离蛋白质,用指示的抗体进行光印迹和检测。 D,HEK293T细胞用标记标记的TNKS2和V5 FIH转染。用CHX和DMOG处理转染细胞后24小时。收获细胞并在不同时间的CHX / DMOG / SILAC处理中裂解,然后用指示的抗体进行蛋白质印迹分析。 E,通过MS免疫沉淀,消化和分析的标志标记的蛋白质。图表代表DMSO / DMOG处理中免疫沉淀光标志-TNKS2的强度。误差栏是标准偏差 n = 6. F,如在e中,但代表重型旗帜-TNKS2。 G,XIC羟基化/未改性光TNKS2肽(HGVV-nVadlwk.)沿DMOG治疗0,1,2和4小时。 H,图表代表了轻硅胶TNKS2肽的羟基化占用率。误差条代表S.E.和 n = 6.

       TNKS2蛋白质转换不会通过羟基改变

      为了确定SILAC媒体和DMOG是否影响了TNKS2蛋白质稳定性,我们首先通过Western印迹验证,TNKS2或FIH的表达不受任何时间点治疗的影响(Fig. 2C)。此外,为了估计TNKS2蛋白质营养器,我们用环己酰亚胺封闭蛋白质合成,一种快速作用的真核蛋白质合成抑制剂(
      • 麦克马洪D.
      环己酰亚胺不是体内蛋白质合成的特异性抑制剂。
      ,
      • 凯杰尔。
      • Korner A.
      环己酰亚胺对培养人淋巴细胞蛋白质和核糖核酸合成的影响。
      )常用于蛋白质营业液体研究(
      • 在努力硕士
      • Ahmad Y.
      • Kirkwood K.J.
      • LY T.
      • Lamond A.I.
      使用定量蛋白质组学的蛋白质降解的全局亚细胞表征。
      )。我们最初监测CHX如何通过Western印迹抑制蛋白质合成,并观察到Flag-TNKS2和V5-FIH的水平降低,近似为6小时的TNK2(Fig. 2D)。接下来,我们确定TNKS2羟基化水平如何在硅胶和DMOG脉冲上动态地变化。我们免疫沉淀的标志TNKS2,消化了蛋白质上的蛋白质,通过LC-MS / MS分析了肽并使用MaxQuant定量了TNKS2表达。这证实了我们初步观察,即与DMSO控制相比,DMOG不会影响TNKS的稳定性(Fig. 2E)还允许我们通过检测重标记的TNKS2的增加来监测重型硅胶的掺入(Fig. 2F)。基于标签数据,我们计算了TNKS2蛋白半衰期为7小时。这与基于蛋白质的估计相匹配,表明新合成的TNKS2蛋白在用重氨基酸脉冲时主要是重标记,并且Dmog处理不会影响外源表达TNKS2的表达和稳定性。

       TNKS2 N-羟基是可逆的

      确认这一点,我们开始使用该设置来确定羟基化蛋白质是否可以在细胞中脱羟基化。最初,我们分析了含有羟基化的含羟烷基化的天冬酰胺586的光标记的TNKS2肽的离子色谱图,并检测到与Dmog治疗相关的羟基化肽强度的降低,同时我们检测到绝对水平的增加未修饰的肽(Fig. 2G),表明可以再恢复羟基化残余物。为了提高确定性,我们将实验性重复的数量增加到六个并以自动方式分析了几个羟基化位点。我们选择了用羟基化天酰胺的定位特异性鉴定的肽,其大于0.8,其中羟基化和非羟基化物同种型在六个重复中的至少四个中检测到。通过首先通过摩尔电离效率的比例校正改性过化肽的强度比估计肽的羟基化占据估计(表I., 实验步骤)。随后,我们将羟基化的羟基化肽的比例转化为占用
      表I.
      基因电离效率肽未修饰/修饰
      TNKS2VN. 427aldnlgqtslhr.0.500652
      TNKS2kganin.394EK.1.82884
      TNKS2HGVVN.586Vadlwk.0.745932
      HIF.1AVN. 803APIQGSR.0.93733
      TRPV3rqgdiaalliaag adv.com.242Ahak.0.848233
      使用这种自动化分析方法,我们监测了几种透光羟基化肽的占用方式如何随时间变化(Fig. 2H, 补充图S2, 补充表S1)。相对于阴性对照,六个位点显示羟基化占患者的统计学显着降低。某些地点的入住只会被几个百分点改变,而其他网站的占用率高达50%,表明可逆性的梯度。
      要排除用重型氨基酸的脉冲没有全面地废除蛋白质合成光标记蛋白的可能性,我们使用CHX作为额外控制重复实验。我们将CHX与重型硅胶和DMOG / DMSO脉冲合并,以消除DMOG治疗时间过程中的TNKS2合成。重型硅酸脉冲进一步允许我们确定如何有效地耗尽蛋白质合成。我们首先监测CHX抑制LC-MS的蛋白质合成,并与对照相比,观察到重标记的TNKS2产生的近乎完全删除(Fig. 3A)。总的来说,在CHX存在下,TNKS2合成超过98%,因此可以被认为是残留的。一旦确认了,我们将从HEK293T细胞的免疫沉淀标志TNKS2免疫脉冲,并如上所述分析LC-MS / MS的羟基化。当监测用DMOG脉冲时改变光标羟基化的相对占用的相对占用方式,我们能够观察到几种天冬酰胺残留物的显着减少(Fig. 3B3D, 补充表S2)。令人惊讶的是,与先前的实验相比,观察到观察到的羟基化占用率的减少较小。我们进一步未能观察潜伏期之间的比例和羟基化占用的减少。这一最初令人费解的观察可能表明,由于重要的是,我们在前一个实验中高估了脱羟基化 德诺维 浅标记TNKS2的合成。如果是这种情况,则新合成的TNKS2的大约四分之三将不得不标记为光线。这与我们以前的观察结果不一致,其中基于CHX脉冲实验的重型标签结合匹配估计的半衰期估计。另一种解释是,在CHX处理时脱羟烷基化酶或基本的共同因子迅速降解。如果酶催化脱羟基化反应的酶存在短的半衰期,这将导致在实验的初始时间点期间部分脱羟基化,然后是高原。这是一个与我们所观察到的内容不相似( Fig. 3B3D)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3A,HEK293T细胞用标记标记的TNKS2和V5 FIH转染。用CHX和DMOG处理转染细胞后24小时,培养基被重硅胶替换。条形图代表控制/ CHX治疗期间标志TNKS2强度重/轻硅酸的比率。误差条代表S.E.和 n = 6 BD,图表代表了轻硅胶TNKS2肽的羟基化占用率。误差栏代表标准偏差和 n = 6. E,HEK293T细胞与标记标记的TNKS2和V5 FIH转染,培养基被重质氧化硅酸置代,用DFO处理细胞。收获细胞并在不同时间的DFO / SILAC治疗中裂解。用页面,用指示的抗体分离蛋白质。 F,标记标记的TNKS2蛋白质被免疫沉淀,消化和分析。条形图代表DFO处理中免疫沉淀光标志-TNKS2的强度。误差栏是标准偏差 n = 2. G条形图表示DFO处理期间重型标志TNKS2的强度。误差栏是标准偏差 n = 2. HI,图表代表了轻硅胶TNKS2肽的羟基化占用率。误差条代表S.E.和 n = 2.
      为了排除Dmog治疗的非特异性副作用,我们使用了第二种,结构性和功能性无关的抑制剂,其通过在活跃中心螯合铁来抑制FIH(
      • Prass K.
      • Ruscher K.
      • 卡尔赫米
      • isaev n.
      • Megow D.
      • Priller J.
      • Scharff A.
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      脱硫辛诱导体内和体外脑缺血的延迟耐受性。
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      • 夏普F.R.
      • 伯纳丁米
      HIF.1和大脑中的氧气感应。
      )。首先,正如我们以前为DMOG做过的那样,我们通过Western Blot和DFO没有影响蛋白质稳定性的MS检查(Fig. 3E)和重型硅胶的融合(Fig. 3F, 3G)。其次,我们量化了两个以前特征的位点的占用率。如前所述,我们观察到在轻氧化铝样品中的DFO处理时羟基化/非羟基化比的降低(Fig. 3H, 3I, 补充表S3)。

       TRPV3 N-羟基的快速逆转

      为了确定脱羟基是否在其他底物上进行,我们决定研究TRPV3对羟基化位点的可逆性。如引用中所述,TRPV3在天冬酰胺242上通过FIH羟基化(
      • 凯特天仁
      • Duffield M.
      • Scrimgeour n.r.
      • 淹没L.
      • LIM W.L.
      • 达拉斯M.L.
      • Scragg J.L.
      • Chicher J.
      • 戴夫K.A.
      • Whitelaw M.L.
      • 同伴C.
      • Gorman J.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      • rychkov g.y.
      • peet d.j.
      通过FIH氧依赖性羟基化调节TRPV3离子通道。
      )羟基化调节TRPV3活性而不影响其表达。有趣的是,TRPV3活性迅速响应羟化酶抑制,表明可以进行脱羟基化。在HEK 293T细胞中复制我们的实验设置并过度表达Myc标记的TRPV3,我们最初证实了DMOG的抑制和与氧化氧化介质孵育的抑制不影响TRPV3蛋白表达。通过Western Blotting,我们证实了先前观察结果,即TRPV3蛋白质稳定性不受羟化酶抑制的影响(Fig. 4A)。然后,我们用胰蛋白酶消化的免疫沉淀MyC-Trpv3并通过MS分析得到的肽。光标记的TRPV3的总体强度超过2小时改变,我们检测到少于20%的重标签(Fig. 4B),表明TRPV3是具有长半衰期的蛋白质。此外,我们容易检测到报告的N242羟基化。我们可以进一步确定对于浅标记的N242,在DMOG治疗时,羟基化占用率随着时间的推移而迅速降低( Fig. 4C, 补充图S3A, 补充表S4)。这些数据在一起表明TRPV3中N242的羟基化是可逆的。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4A,HEK293T细胞用MYC标记的TRPV3和V5 FIH转染。转染后24小时将培养基取代重硅胶,细胞用Dmog处理,细胞在不同时间裂解Dmog / Silac处理。通过Western Blot分析所指出的蛋白质的表达(B)用胰蛋白酶免疫沉淀的Myc标记的蛋白质并通过MS分析。图显示了DMOG治疗期间轻型和重型MYC-TRPV3的强度。误差栏是标准偏差 n = 2. (C)图显示了Dmog治疗期间轻质硅酸TRPV3肽的估计羟基化占用率。误差条显示S.E.和 n = 2.

       HIF. N803羟基化是可逆的

      最后,我们检查了我们的发现是否可以推断为最佳研究的FIH基底,HIF1α的α亚基(
      • 马刚队
      • Hirota K.
      • Semenza G.L.
      fi-1:一种与HIF-1α和VHL相互作用的新蛋白,以介导HIF-1转录活性的抑制。
      ,
      • Lando D.
      • peet d.j.
      • whelan d.a.
      • Gorman J.J.
      • Whitelaw M.L.
      HIF.反式激活结构域的天冬酰胺羟基化缺氧开关。
      )。用GFP标记的HIF1α质粒转染HEK293T以过表达蛋白质。如前所述,我们检查了GFPHIF1α的总水平是否受到DMOG或重型氧化铝治疗的影响。通过Western Blotting,我们惊奇地检测到HIF1α表达在常氧的条件下似乎是稳定的,并且DMOG仅限于略微,如果有的话,HIF1α蛋白质水平增加(Fig. 5A)。我们重复了同样的实验并使用MS,我们观察到了光标记HIF1α水平的减少,同时我们检测到重标记的GFPHIF1α的诱导(Fig. 5B)。最后,我们研究了N803的氧化水平(通过FIH羟基化羟基化羟基化),我们观察到N803的氧化比在DMOG治疗时迅速降低(Fig. 5C, 补充图。S3B, 补充表S5)。当我们表达全长HIF1α时,我们决定另外监测报告的脯氨酸位点的羟基化。然而,我们通过易于和超过50毫秒/ ms鉴定未改性的肽,我们不能置信地检测识别402和564脯氨酸羟基化位点的单个MS / MS。因此,我们得出结论,过表达HIF1α压倒内源性Phd1-3酶的能力,使脯氨酸残基羟基化学物质递送,为什么我们可以检测到常氧中的HIF蛋白表达为什么。总的来说,这些结果与我们获得的TNKS2和TRPV3获得的数据匹配,表明存在天冬酰胺脱羟基化反应。为了确定其他修饰是否可以在羟基化肽上发生,我们重复了包括依赖性肽匹配选项的数据分析,其允许无偏鉴定“碱”肽的改性衍生物。该算法检测到局部化为N803的几种修改,其中一个是消除两种氢( 补充图S4)。我们只能在光标记的肽上检测到这种修饰,表明DMOG的存在降低了前体的量,表明不同的N803衍生自羟基的N803。这与潜在的脱羟基化反应中的中间产物一致,其中从羟基侧链中除去水。然而,这是猜测,因为除了不同的肽的丰度是微量的,防止我们在样品中可靠地定量它。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5A,HEK293T细胞用GFPHIF1α和V5 FIH转染。用Dmog处理转染细胞后24小时,培养基被重质硅胶替换。收获细胞并在不同时间的Dmog / Silac治疗中裂解并裂解。探测总裂解物的总裂解物用于免疫印迹。 B,GFP标记的蛋白质被免疫沉淀,用胰蛋白酶和Gluc消化并由MS分析。条形图代表沿DMOG处理的免疫沉淀光和重型GFP-HIF的强度。误差栏是标准偏差 n = 2. C,图表显示了Dmog治疗期间轻硅酸盐HIF肽的估计羟基化占据。误差栏代表S.E.和 n = 2. D,用FIH - / - Hela裂解物孵育3小时之前和孵育3小时之前和之后未改性和羟基化的HIF2α肽的代表性XIC。 E,条形图显示了与FIH - / - Hela裂解物孵育之前和之后的羟基化的HIF2α肽上未改性的羟基化比。误差栏代表S.E.和 n = 3.
      为了确定我们是否可以观察到无细胞反应中的天冬酰胺脱羟基化,通过将HIF2α(CAD)的重组C-末端转移结构域与重组FIH一起培养,得到羟基化蛋白。为了防止通过FIH再羟基化,重新纯化羟基化的CAD,随后与衍生自FIH敲除HELA细胞的细胞裂解物温育(
      • 陈D.Y.
      • Fabrizio J.A.
      • 威尔金斯S.E.
      • 戴夫K.A.
      • Gorman J.J.
      • 闪闪发光的J.M.
      • 弗莱明S.B.
      • peet d.j.
      • Mercer A.A.
      Ankyrin ORF病毒的重复蛋白对细胞缺氧响应途径影响。
      )。 3小时后,CAD是亲和纯化,消化和使用MS分析。在羟基化肽上的非羟基化肽与对照样品的比例大约是在与裂解液混合时立即纯化的对照样品的两倍(Fig. 5D5E)。重要的是,我们观察到非羟基化肽的增加。虽然总量很小,但比率增加到羟基化强度的小于1/100,这对于与HeLa细胞裂解物温育的羟化肽的羟化肽的重要性水平没有意外。
      在一起,从三种不同FIH底物中获得的数据支持天冬酰胺羟基化是可以在细胞内逆转的翻译后修饰的假设,其额外的证据可以逆转羟基化 体外。

      讨论

      蛋白质功能可以通过不同的PTMS接通和断开,例如磷酸化,糖基化等(
      • 沃尔斯C.T.
      • Garneau-Tsodikova S.
      • GTOTO JR,G.J.
      蛋白质后期改性:蛋白质组多样化的化学。
      ,
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      酪氨酸磷酸化:三十年并计数。
      ,
      • Ciechorover A.
      蛋白水解:从溶酶体到泛素和蛋白酶体。
      ,
      • 段G.
      • Walther D.
      翻译后修改在蛋白质相互作用网络背景下的作用。
      ),它允许细胞和生物动态地响应环境的变化。羟基化的假设可逆性可以解释急性缺氧和雷诺如何引发快速反应,而不管蛋白质降解如何。这可能在肿瘤中尤为重要,因为循环/间歇性缺氧和蛋白质羟基是癌症标志(
      • ARAOS J.
      • Slememan J.P.
      • Garvalov B.K.
      缺氧信号传导在转移中的作用:以将基础生物学知识转化为新型抗肿瘤策略。
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      • 阮克。
      • 欧阳G.
      缺氧在人类癌症标志中的作用。
      )。
      我们尚未确定负责假设反应的酶。我们最初采用候选方法和击倒蛋白质,其通常与几种N-羟基化蛋白结合。然而,这些扰动都没有对碱基羟基化水平的影响,这表明最好的选择是设计基因组屏幕并使用N-羟基化依赖性蛋白质 - 蛋白质相互作用或抗体作为读出。鉴定负责的酶也将允许设计定制的 体外 测定可以揭示反应的参数和分子机制,我们目前只能推测的精确性。出乎意料地,我们在CHX的存在下进行的实验可能已经缩小了搜索区域。推测脱羟基化酶是短寿命的蛋白质是有吸引力的,因为这将实现其活性的快速和动态调节。快速降解还将赋予系统动态适应蜂窝需求的能力。它还可以符合理的是,这种系统可以包括羟基酶下游的额外调节,其是HIF通路的转录靶或直接PHD / FIH衬底。实际上,大多数报道的PHD介导的羟基可能导致蛋白质稳定化,尽管有些讨论已经出现了PHDS是否有来自HIF的任何基材(
      • 凶手M.E.
      • Lippl K.
      • 田边
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      在报道的非HIF基材上缺乏重组HIF脯氨酰羟基羟基酶(PHDS)的活性。
      )。无论哪种方式,这样的前馈回路广泛用于信令网络,因为它们在面对扰动时增加了系统的动态响应。此外,假设的脱羟基的快速换档提供了可能的解释,以使用CHX-Chase实验未观察到脱羟基化(单身 等等。,2011)。我们的工作和试图检测脱羟基的进一步差异,是对我们缓冲区的NOG增加。当稀释细胞间抑制剂的浓度时,这可以防止裂解后的裂解后裂解,如果需要更长的单次样品的处理,例如在免疫沉淀期间需要较长的甲状腺样品。
      当搜索潜在的脱羟基化酶时,我们也可以看出如何在细胞中催化相似的反应。通常,它们涉及通过消除水形成短寿命的中间体,然后是所得的不饱和键的氢化。无偏见的天冬酰胺修饰的筛选确实检测到这种潜在的中间体,但未来的工作将确定这是否是脱羟基化机制。脱羟基化酶/ s的发现还将提供一组可能的新治疗靶标来治疗癌症或其他人类病理学。因此,鉴定酶应该是优先权,是我们计划的一部分。

      数据可用性

      MS-DATA沉积在Proteomexchange PXD013116.

      致谢

      我们感谢DAN PEET和ALEX CHEONG用于TRPV和HIF1α质粒;安德鲁·芬奇和Arkadiusz Welman进行更正和批判性阅读。

      补充材料

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