单细胞蛋白质组学:进步与前景

      基于MS的蛋白质组分析已经越来越全面和定量,但持续的缺点是实现深入测量所需的相对较大的样品。这种散装样品通常包括成千上万的细胞或更多,提供人口平均值并模糊重要的细胞异质性。单细胞蛋白质组学能力具有转变生物医学研究的潜力,并实现具有新粒度水平的生物系统的理解。最近的样品处理,分离和MS仪器的进步现在可以量化>来自个体哺乳动物细胞的1000个蛋白,覆盖程度,几年前只需要数以千计的细胞。本次审查讨论了应在单电池和其他低输入测量的工作流程中优化的重要因素和参数。它还突出了最近的发展,提出了进一步发展的领域和机会。

      图形概要

      复杂的生物过程植根于各个细胞之间的动态相互作用,通常跨越多个细胞类型以及给定的细胞类型内的不同状态,命名和敏感性。全球基于MS的蛋白质组测量历史上仅限于包含数千或数百万个细胞的散装样品。这种测量可以提供蛋白质表达的定量和几乎全面的概况(
      • Richards A.L.
      • Merrill A.E.
      • Coon J.J.
      蛋白质组测序深入。
      )但它们未能考虑样品内的异质性。单细胞蛋白质测量可以解析该异质性,但是普遍的基于抗体的方法,例如免疫荧光,流式细胞术和质量细胞术具有有限的特异性,并且限制为测量每个细胞的少量预选的蛋白质。填充这种间隙以在单细胞内实现蛋白质表达的深入和无偏曲线,预计通过例如阐明促进或抑制肿瘤生长的微环境因素具有广泛的影响(
      • Binnewies M.
      • 罗伯茨·艾文
      • Kersten K.
      • 陈文。
      • fearon d.f.
      • Merad M.
      • 表达L.M.
      • Gabrilovich D.I​​.
      • Ostrand-Rosenberg S.
      • Hedrick C.C.
      • vonderheide r.h.
      • Pittet M.J.
      • jain r.k.
      • zou w.p.
      • Howcroft T.K.
      • 伍德豪斯e.c.
      • Weinberg R.A.
      • KRUMMEL M.F.
      了解肿瘤免疫微环境(时间)有效治疗。
      )并识别新型细胞群(
      • 乌鸦M.
      • 保罗A.
      • Ballouz S.
      • 黄Z.J.
      • 吉利斯J.
      用Metaneighbor表征单细胞RNA测序数据定义的细胞类型的可复制性。
      )或发育轨迹(
      • 朱y
      • Scheibinger M.
      • Ellwanger D.C.
      • Krey J.f.
      • Choi D.
      • 凯莉r.t.
      • 地狱家。
      • Barr-Gillespie P.G.
      单细胞蛋白质组学揭示毛细胞发育期间表达的变化。
      )可能在批量测量中遮挡。开发单细胞蛋白质组学的新技术也呈现出许多其他有限的样品,例如从全血和细针穿刺活检中分离的罕见循环肿瘤细胞,并且使蛋白质表达能够在具有高空间分辨率的组织中映射(
      • 斯奈德M.P.
      • 等等。
      人体在细胞分辨率下:NIH人体生物分子地图集计划。
      )。
      虽然单细胞和其他低输入蛋白质组学的许多分析要求已经到达了一段时间,但包括有效的纳米射线分离(
      • 沉Y.
      • tolic n.
      • 马萨隆C.
      • PASA-TOLIC L.
      • 营地D.G.
      • 赫克森k.k.
      • 赵立
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      超敏感蛋白质组学,使用高效在线微型SPE-NANOM-NANONES和MS / MS。
      )和敏感的MS仪器(
      • Belov M.E.
      • 戈尔茨赫科夫M.V.
      • UDSeth H.R.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      Zeptomole敏感性电喷雾电离 - 傅立叶变换离子蛋白质的共振质谱。
      ),样品处理的创新已经滞后。因此,成千上万的哺乳动物细胞或大单细胞(例如 卵母细胞或胚泡)已经需要达到深入测量(
      • 陈W.D.
      • 王S.
      • Adhikari S.
      • 邓Z.H.
      • 王L.J.
      • 陈L.
      • 柯米
      • 杨p.Y.
      • 田R.J.
      基于Spintip的简单和集成的基于Spintip的技术应用于深度蛋白质组分析。
      ,
      • 太阳L​​.L.
      • Dubiak K.m.
      • Peuchen E.H.
      • 张Z.B.
      • 朱G.J.
      • Huber P.W.
      • dovichi n.j.
      使用青蛙(Xenopus Laevis)卵石从早期胚胎中分离的单细胞蛋白质组学,形成蛋白质含量的几何进展。
      ,
      • Lombard-Banek C.
      • 穆迪S.A.
      • NEMES P.
      用于发现蛋白质组学的单细胞质谱:量化16-细胞青蛙(外爪瓣)胚胎中的转化细胞异质性。
      )。随着近期采样制备和实验设计的创新,2018年公布了来自单一哺乳动物细胞分析数百种蛋白质的第一报告(
      • 朱y
      • piehowski p.d.
      • 赵立
      • 陈杰。
      • 沉Y.F.
      • 摩尔r.j.
      • Shukla A.K.
      • petyuk v.a.
      • Campbell-Thompson M.
      • mathews c.e.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      纳米二波波加工平台,用于深度和定量蛋白质组谱的10-100哺乳动物细胞。
      ,
      • Budnik. B.
      • 征收E.
      • HARMANGE G.
      • Slavov N.
      范围 - MS:单一哺乳动物细胞的质谱测量细胞分化期间的蛋白质组异质性。
      )。由于这些初始报告,该领域已迅速推进。现在可以使用无标记的单细胞可靠地分析超过1000个蛋白质组(
      • Cong Y.
      • Motiamechaboki K.
      • misal s.a.
      • 梁Y.
      • 欺骗A.J.
      • Truong T.
      • Huguet R.
      • 普利·普利
      • 朱y
      • Lopez-Ferrer D.
      • 凯莉r.t.
      超敏感的单细胞蛋白质组学工作流程识别>每哺乳动物细胞1000个蛋白质组。
      ),也是异交标记工作流程(
      • 窦。
      • Clair G.
      • Tsai C.f.
      • 徐k.r.
      • 克里斯勒W.B.
      • Sontag R.L.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 刘涛。
      • PASA-TOLIC L.
      • 史密斯r.d.
      • shi t.j.
      • Adkins J.N.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      • ansong c.
      • 朱y
      高通量单细胞蛋白质组学通过多路复用等离子蛋白标记在纳米进样品制备平台中实现。
      ,
      • Tsai C.-f.
      • 赵立
      • 威廉姆斯三
      • 摩尔r.j.
      • Schultz K.
      • 克里斯勒W.
      • PASA-TOLIC L.
      • 罗德兰克。
      • 史密斯r.d.
      • Shi T.
      • 朱y
      • 刘涛。
      一种改进的增强,用于扩增具有异巴尺寸(Ibasil)策略的信号,用于精确定量单细胞蛋白质组学。
      ,
      • SPECHT H.
      • Emmott E.
      • petelski a.a.
      • 灰色霍夫曼r.
      • Perlman D.H.
      • 塞拉米
      • kharchenko p.
      • Koller A.
      • Slavov N.
      单细胞质谱测量巨噬细胞异质性的出现。
      ),〜6000个蛋白质基团可以从包含几百个细胞的样品中分布(
      • 窦。
      • 朱y
      • 李耀A.
      • 梁Y.R.
      • 陈杰。
      • piehowski p.d.
      • 徐k.r.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 阿特金森M.A.
      • mathews c.e.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      Nanowell介导的二维液相色谱可实现深蛋白质组谱<1000个哺乳动物细胞。
      )。因此,样品大小和蛋白质组覆盖之间的权衡仍然存在,但它已大大移位有利于更小的样品。这些进展已被应用于各种细胞和组织类型,包括如下所述的解离细胞和微小细胞组织。
      对于这样的纳米级分析成功,必须仔细优化工作流的每个方面。本文详细研究样品隔离和制备,液相分离和电离,以及气相分离和MS。对于每个步骤,讨论了影响样品回收和检测的重要因素,描述了实施例,并且突出了持续发展的机会。还考虑了无标记和等离性标记工作流的相对优势。数据分析当然是任何实验的重要组成部分,但由于目前使用标准设置的现有软件包,因此仅用于单细胞蛋白质组学,只有在这里轻轻触摸数据分析。希望本工作能够强调迄今为止的进展和前进的巨大机遇,推进单细胞和低输入蛋白质组学的新生领域。

      样品隔离和制备

       小型化

      用于自下而上蛋白质组学的样品制备工作流程旨在(1)(1)从分离的细胞或组织中定量提取蛋白质,(2)化学和酶促处理所提取的蛋白质以产生肽,(3)将肽递送到准备的分离平台 - 分析形式和足够的数量以实现稳健的测量。包含细胞裂解和蛋白质溶解的蛋白质提取通常需要苛刻的化学或机械条件,例如Sds洗涤剂,尿素或珠子搅拌以破坏组织和释放蛋白质,然后需要进行广泛的清洁和缓冲液,以除去不溶性碎片和试剂可能会干扰下游分析(

      (2008)蛋白质组学样品制备,Wiley-Blackwell,Hoboken,NJ。

      )。在这些清洁步骤中,并且在整个样品制备过程中,蛋白质和肽暴露于由于非特异性吸附而导致损失的各种表面(
      • Goebel-Stengel M.
      • Stengel A.
      • Tachéy.
      • Reeve Jr,J.R.
      在涉及肽的研究中使用最佳塑料软件和玻璃器皿的重要性。
      )。假设这些表面包含有限数量的吸附部位,对于批量分析可能可以忽略不计的样本损耗可能变得令人满意的或甚至总共对于经过相同的工作流程的小样本。作为这个的证据,吴 等等。 对于50μg蛋白质样品的多个样品转移步骤,延续了15%的样品损失,其增加到2μg样品的89%损耗(
      • 吴R.
      • 兴S.
      • 糟糕的m.
      • 迪德尔T.F.
      • 卢y.
      纳米蛋白分析纳米蛋白酶分析样本处理回收产量的逐步评估和优化。
      )。对于含有较少蛋白质少量次数的单细胞大小样品,这些损失无疑远未越来越大。因此,最小化吸附是对痕量样品分析至关重要的,因为没有表面可以消除所有蛋白质和肽的吸附(
      • Goebel-Stengel M.
      • Stengel A.
      • Tachéy.
      • Reeve Jr,J.R.
      在涉及肽的研究中使用最佳塑料软件和玻璃器皿的重要性。
      ),这可以通过大大减少样品处理体积来避免尽可能多的表面接触来最有效地实现。
      蛋白质组学样品加工的另一个关键考虑因素是样品和试剂浓度对反应速率的影响。例如,胰蛋白酶消化遵循Michaelis-Menten动力学,并且在低底物浓度的条件下,消化速率与酶(胰蛋白酶)和基材(蛋白质样品)浓度直接成比例(
      • 纳尔逊D.L.
      • Cox m.m.
      )。因此,由于大大降低的蛋白质浓度,当在相同体积中处理单个细胞时,在数十微升的标准处理体积中适用于大量微升的批量样品的消化条件可能变得无效。显着增加胰蛋白酶的浓度可以部分地抵消降低的底物浓度的影响,但是可能的限制超出了其自分解和所得的胰凝乳物质活性(
      • Keil-dlouháv.v.
      • Zylber N.
      • imhoff J.
      • 桐氮。
      • Keil B.
      假药蛋白的蛋白水解活性。
      )来自过量的胰蛋白酶会干扰分析。因此,最小化样品处理体积提供降低表面吸附和增加样品浓度的双重益处,因此应显着增强单细胞蛋白质组学。

       简化

      虽然小型化样品制备可能具有挑战性,但在准备小样品时,工作流程的一些方面变得更加有利。缓冲器交换和样品清洁变得越来越不必要,因为盐和不溶性细胞碎片可能是不充分的量来干扰下游分析。类似地,考虑单个电池具有比通过芯针活检获得的组织样品大的表面积对体积比(SA:V),其比例大于多倍。因此,样品处理试剂可以更容易地进入单细胞及其内容物,而不需要侵略性的组织破坏和蛋白质提取方法。避免这些步骤可以消除在制备过程中将痕量样品暴露于珠粒或过滤器的表面,进一步减少吸附损失。鉴于这些因素,样品准备工作流程 较小更简单 比他们的批量级对应物似乎是单细胞蛋白质组学的胜利组合。

       打开格式

      一个完美的样本处理平台将没有任何值,无需通过一种方式将样品传输到平台的位置。虽然封闭的微通道的微流体装置(
      • 尼尔森J.B.
      • Hanson R.L.
      • Almughamsi H.M.
      • 庞C.
      • 鱼T.R.
      • Woolley A.T.
      微流体:材料的创新及其制造和功能化。
      )首先出现,是一种理想的是操纵纳米纳米卷,使单细胞分析有益,所谓的“世界平移”界面问题(
      • 刘杰。
      • 汉森C.
      • quake s.r.
      用微流体矩阵求解“世界平移”界面问题。
      )可能很难克服。相比之下,开放的微流体平台(
      • Garcia-cordero J.L.
      • 范Z.H.
      用于化学和生物测定的术式液滴。
      )减少尺寸,但保持微孔板的一般形状因子可以直接与所有常见的单细胞样品隔离技术直接界面,​​包括限制稀释度(
      • 朱y
      • piehowski p.d.
      • 赵立
      • 陈杰。
      • 沉Y.F.
      • 摩尔r.j.
      • Shukla A.K.
      • petyuk v.a.
      • Campbell-Thompson M.
      • mathews c.e.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      纳米二波波加工平台,用于深度和定量蛋白质组谱的10-100哺乳动物细胞。
      ,
      • 窦。
      • 朱y
      • 李耀A.
      • 梁Y.R.
      • 陈杰。
      • piehowski p.d.
      • 徐k.r.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 阿特金森M.A.
      • mathews c.e.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      Nanowell介导的二维液相色谱可实现深蛋白质组谱<1000个哺乳动物细胞。
      ,
      • 徐k.r.
      • 梁Y.R.
      • piehowski p.d.
      • 窦。
      • Schwarz K.C.
      • 赵立
      • Sontag R.L.
      • 摩尔r.j.
      • 朱y
      • 凯莉r.t.
      基准兼容的样本处理工作流程,用于蛋白质组分析<100哺乳动物细胞。
      ),微单程(
      • Cong Y.
      • Motiamechaboki K.
      • misal s.a.
      • 梁Y.
      • 欺骗A.J.
      • Truong T.
      • Huguet R.
      • 普利·普利
      • 朱y
      • Lopez-Ferrer D.
      • 凯莉r.t.
      超敏感的单细胞蛋白质组学工作流程识别>每哺乳动物细胞1000个蛋白质组。
      ,
      • Cong Y.
      • 梁Y.
      • Motiamechaboki K.
      • Huguet R.
      • Truong T.
      • 赵立
      • 沉Y.
      • Lopez-Ferrer D.
      • 朱y
      • 凯莉r.t.
      使用窄孔填充纳米柱和超敏感质谱法改善单细胞蛋白质组覆盖。
      ),FACS(
      • 朱y
      • Scheibinger M.
      • Ellwanger D.C.
      • Krey J.f.
      • Choi D.
      • 凯莉r.t.
      • 地狱家。
      • Barr-Gillespie P.G.
      单细胞蛋白质组学揭示毛细胞发育期间表达的变化。
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      • 窦。
      • Clair G.
      • Tsai C.f.
      • 徐k.r.
      • 克里斯勒W.B.
      • Sontag R.L.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 刘涛。
      • PASA-TOLIC L.
      • 史密斯r.d.
      • shi t.j.
      • Adkins J.N.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      • ansong c.
      • 朱y
      高通量单细胞蛋白质组学通过多路复用等离子蛋白标记在纳米进样品制备平台中实现。
      ,
      • 朱y
      • Clair G.
      • 克里斯勒W.B.
      • 沉Y.F.
      • 赵立
      • Shukla A.K.
      • 摩尔r.j.
      • 米拉拉斯。
      • Pryhuber G.S.
      • 史密斯r.d.
      • ansong c.
      • 凯莉r.t.
      微流体纳米型纳米射线样品制备和超敏纳米 - MS使单一哺乳动物细胞的蛋白质组学分析。
      )和激光捕获微量碎石(LCM)(
      • 朱y
      • piehowski p.d.
      • 赵立
      • 陈杰。
      • 沉Y.F.
      • 摩尔r.j.
      • Shukla A.K.
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      • Campbell-Thompson M.
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      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      纳米二波波加工平台,用于深度和定量蛋白质组谱的10-100哺乳动物细胞。
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      • Cong Y.
      • Motiamechaboki K.
      • misal s.a.
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      • Truong T.
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      • 普利·普利
      • 朱y
      • Lopez-Ferrer D.
      • 凯莉r.t.
      超敏感的单细胞蛋白质组学工作流程识别>每哺乳动物细胞1000个蛋白质组。
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      • 窦。
      • 朱y
      • 李耀A.
      • 梁Y.R.
      • 陈杰。
      • piehowski p.d.
      • 徐k.r.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
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      • mathews c.e.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      Nanowell介导的二维液相色谱可实现深蛋白质组谱<1000个哺乳动物细胞。
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      • 窦。
      • Schwarz K.C.
      • 赵立
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      • 摩尔r.j.
      • 朱y
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      基准兼容的样本处理工作流程,用于蛋白质组分析<100哺乳动物细胞。
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      • 窦。
      • piehowski p.d.
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      • Chu R.K.
      • 克里斯勒W.B.
      • 史密斯J.N.
      • Schwarz K.C.
      • 沉Y.F.
      • Shukla A.K.
      • 摩尔r.j.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      激光捕获微小组织的空间分离蛋白质组映射与自动样品转移到纳米辊。
      ,
      • 梁Y.R.
      • 朱y
      • 窦。
      • 徐k.r.
      • Chu R.K.
      • 克里斯勒W.B.
      • 赵立
      • 赫克森k.k.
      • 凯莉r.t.
      空间解决的蛋白质组分析<通过将激光捕获微散纤维与纳米泵样品制备集成激光捕获微粉,来自番茄果皮200细胞。
      ,
      • 朱y
      • Podolak J.
      • 赵立
      • Shukla A.K.
      • 摩尔r.j.
      • 托马斯G.V.
      • 凯莉r.t.
      使用免疫密集度富集,激光捕获微粉,纳米射回样品加工和超敏纳米 - MS,从全血中分离出1至5个尖刺循环肿瘤细胞的蛋白质组分析。
      ,
      • piehowski p.d.
      • 朱y
      • 布拉姆L.M.
      • stratton k.g.
      • 赵立
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • 元J.
      • 米切尔H.D.
      • 高雅。
      • Webb-Robertson B.-J.M.
      • Dey S.K.
      • 凯莉r.t.
      • Burnum-Johnson K.E.
      从2000多个蛋白质的自动质谱成像从组织切片以100μM空间分辨率的影响。
      ),提供与悬浮液中的细胞以及组织切片的空间分离区域的广泛相容性。此外,开放式反应器最小化表面曝光,并通过纳米档来实现样品检索。这并不是说没有封闭的基于频道的微流体的前景,用于制备和分析痕量蛋白质组物样品,而是似乎似乎是用于这种发展的大量逆风。

       进步

      已经使用各种方法来制备痕量样品和单细胞进行蛋白质组分析(
      • 朱y
      • piehowski p.d.
      • 凯莉r.t.
      • 钱W.J.
      纳米蛋白酶具有年龄。
      ),其中许多许多如上所述结合了小型化和简化的益处。此处描述了几个例子以用于说明目的,并被描绘 Fig. 1。邵 等等。 报道综合蛋白质组分析装置(iPad)(
      • 邵X.
      • 王X.
      • 关斯。
      • 林H.
      • 闫佳
      • 高米
      • 邓C.
      • 张X.
      用于快速单细胞蛋白质分析的综合蛋白质组分析装置。
      )其中将包括胰蛋白酶和杂交胍丁胺的试剂的混合物直接加入到细胞的悬浮液中。然后将单细胞和添加的试剂快速吸出来的毛细管,其体积仅由空气塞包围,以产生纳米醇反应器(Fig. 1A)。细胞裂解和消化在升高的温度和超声处理时发生,之后将毛细血管连接到短分离柱,用于用30分钟的梯度快速测量LC-MS分析。整个制备工作流程包括细胞裂解和胰蛋白酶消化,并且在反相分离柱上发生了任何样品清洁。使用这种方法,作者通过MS / MS和271鉴定了128个蛋白质基团的平均值,包括使用MaxQuant在运行(MBR)算法之间的MaxQuant匹配的MS1级特征匹配的标识。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1基于(A)iPad,(B)OAD,(C)纳米泊茨和(d)范围-sms。适用于参考的许可
      • 朱y
      • Podolak J.
      • 赵立
      • Shukla A.K.
      • 摩尔r.j.
      • 托马斯G.V.
      • 凯莉r.t.
      使用免疫密集度富集,激光捕获微粉,纳米射回样品加工和超敏纳米 - MS,从全血中分离出1至5个尖刺循环肿瘤细胞的蛋白质组分析。
      ,
      • piehowski p.d.
      • 朱y
      • 布拉姆L.M.
      • stratton k.g.
      • 赵立
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • 元J.
      • 米切尔H.D.
      • 高雅。
      • Webb-Robertson B.-J.M.
      • Dey S.K.
      • 凯莉r.t.
      • Burnum-Johnson K.E.
      从2000多个蛋白质的自动质谱成像从组织切片以100μM空间分辨率的影响。
      ,
      • Belov M.E.
      • 戈尔茨赫科夫M.V.
      • UDSeth H.R.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      Zeptomole敏感性电喷雾电离 - 傅立叶变换离子蛋白质的共振质谱。
      , 和
      • 陈W.D.
      • 王S.
      • Adhikari S.
      • 邓Z.H.
      • 王L.J.
      • 陈L.
      • 柯米
      • 杨p.Y.
      • 田R.J.
      基于Spintip的简单和集成的基于Spintip的技术应用于深度蛋白质组分析。
      , 分别。
      等等。 开发了一次性油气液滴(OAD)装置(
      • 李Z.Y.
      • 黄山
      • 王x.k.
      • 朱y
      • 李继夫
      • Wong C.C.L.
      • 方Q.
      纳米型尺度油 - 空气液滴芯片的单细胞蛋白质组学分析。
      )(Fig. 1B其中依次加入其中纳米升细胞和试剂中的细胞体积和试剂,并在由低结合聚丙烯或疏水化玻璃制成的反应器中温育,用于样品限制。在样品上悬浮的油盘可以用毛细管纳米纤维尖端渗透,然后在去除尖端后自动重新密封以使液滴蒸发最小化。在消化之后,将该装置插入高压室中,用于将样品直接转移到LC柱的头部以进行分析。平均为35和108个蛋白质分别从1和10 HeLa细胞中鉴定出来。
      我们的小组开发了纳米波特(纳米泊水加工在追踪样品中的一个锅中)平台(
      • 朱y
      • piehowski p.d.
      • 赵立
      • 陈杰。
      • 沉Y.F.
      • 摩尔r.j.
      • Shukla A.K.
      • petyuk v.a.
      • Campbell-Thompson M.
      • mathews c.e.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      纳米二波波加工平台,用于深度和定量蛋白质组谱的10-100哺乳动物细胞。
      )(Fig. 1C其中纳米浮炉将纳米凝胶体积的细胞和试剂顺序地将纳米潮凝胶体积分配给纳米孔。纳米孔是~1毫米直径的玻璃基座,其在标准玻璃显微镜载玻片上图案化;每个纳米孔被疏水性屏障包围。通过分配加湿室内的试剂,然后在纳米辊阵列上施加可去除覆盖以进行延长温育来最小化蒸发。然后可以将制备的样品装载到毛细管中并转移到随后与纳米柱接合的固相提取塔。最小的样品损失和高效制剂,与高敏感的纳米 - MS,使能的211和1517个蛋白质组分别与1和〜10 HeLa细胞鉴定,其平均为669和3092份与相同样品的鉴定包括MBR识别(
      • 朱y
      • piehowski p.d.
      • 赵立
      • 陈杰。
      • 沉Y.F.
      • 摩尔r.j.
      • Shukla A.K.
      • petyuk v.a.
      • Campbell-Thompson M.
      • mathews c.e.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      纳米二波波加工平台,用于深度和定量蛋白质组谱的10-100哺乳动物细胞。
      ,
      • 朱y
      • Clair G.
      • 克里斯勒W.B.
      • 沉Y.F.
      • 赵立
      • Shukla A.K.
      • 摩尔r.j.
      • 米拉拉斯。
      • Pryhuber G.S.
      • 史密斯r.d.
      • ansong c.
      • 凯莉r.t.
      微流体纳米型纳米射线样品制备和超敏纳米 - MS使单一哺乳动物细胞的蛋白质组学分析。
      )。
      Budnik. 等等。 使用串联质量标签(TMT)工作流程为SCOPE-MS准备的单细胞进行分析。在第一代平台中(
      • Budnik. B.
      • 征收E.
      • HARMANGE G.
      • Slavov N.
      范围 - MS:单一哺乳动物细胞的质谱测量细胞分化期间的蛋白质组异质性。
      ),通过10μL体积的超声处理裂解单细胞,并且在将单细胞样品与较大的载体样品组合以进行分析之前,在将单细胞样品组合之前,在总体积的〜12μl中加工。在第二次迭代(范围2)(
      • SPECHT H.
      • Emmott E.
      • petelski a.a.
      • 灰色霍夫曼r.
      • Perlman D.H.
      • 塞拉米
      • kharchenko p.
      • Koller A.
      • Slavov N.
      单细胞质谱测量巨噬细胞异质性的出现。
      ),通过在1μl体积的混合中通过冷冻/解冻和热的组合完成裂解。尽管该制备工作流程没有小型化到纳米纳米级范围,但是相对于标准散装制剂仍然大大简化,因此避免了与清除相关的损失。

       前景

      虽然在纳米级蛋白质组样品加工中具有毫无疑问的尚未显眼的改进,但几点变得明确:
      • 最小化样品制备体积有利于减少吸附损失和增加样品浓度,以便与胰蛋白酶和其他试剂更有效地反应。
      • 在最小化SA:V方面,开放的微流体处理平台在封闭系统中具有实质的优势:V,并且他们促进了与广泛使用的样品隔离策略的直接耦合,包括微操纵,FAC和LCM。
      • 基于溶液的样品处理可减少相对于固定化酶促反应器的表面暴露(
        • 黄娥。
        • piehowski p.d.
        • orton d.j.
        • 摩尔r.j.
        • 钱W.J.
        • 凯西C.P.
        • 太阳x.f.
        • Dey S.K.
        • Burnum-Johnson K.E.
        • 史密斯r.d.
        SNAPP:简化的纳米蛋白质平台,用于可再生全局蛋白质组学分析的纳米蛋白量。
        )和基于滤波器的协议(例如fasp(
        • wisniewski J.R.
        • 邹格曼A.
        • Nagaraj N.
        蛋白质组分析的通用样品制备方法。
        )和微量扣环(
        • 张Z.B.
        • Dubiak K.m.
        • Huber P.W.
        • dovichi n.j.
        用于高通量的小型化滤波器辅助样品制备(微型FASP)方法,超细蛋白质组学样品制备揭示了Xenopus Laevis胚胎的蛋白酶组不对称。
        ))迄今已证明对微量样本更有效。然而,尽管有一些预期的样品损失,仍可能需要珠粒,柱或官能化的基于表面的方法,以富集翻译后改性的蛋白质等。
      • 对于低输入样品,可能不需要样品清洁和腐蚀性蛋白质提取步骤,从而可以不需要对散装工作流程进行的,从而提供机会简化样品制备并进一步减少损耗。
      由于图片变得更清晰,有与低输入样品准备有关的其他区域,等待探索。首先,在将样品处理体积减少到几百纳米铅蛋白具有极大的单细胞蛋白质组学中,单细胞蛋白质组学具有极大的单细胞蛋白质组学,但单个电池的内容物(具有少量皮热剂)仍然被〜100,000倍稀释。是否达到了进一步的小型化将提供大量额外收益或者已经达到了递减的点。样品制剂的其他方面,包括试剂组合物,孵育时间和温度可以进一步优化,以提供更高的样品回收,时间储存和与诸如福尔马林固定的石蜡包埋组织的更具挑战性样品。在潮湿和干燥条件下延伸储存期间制备样品的稳定性可能与散装样品的延长储存相差,并且应仔细研究。最后,自动进样器通常与纳米升音量不兼容,并且在很大程度上需要具有分离的单细胞准备。自动化整个工作流程将有助于将单细胞蛋白质组学传播到许多额外的实验室。为此,威廉姆斯 等等。 已开发出用于纳米推纳特样本的自定义自动进样器(
      • 威廉姆斯三
      • 李耀A.v.
      • Tsai C.-f.
      • 摩尔r.j.
      • orton d.j.
      • 克里斯勒W.B.
      • 长边m.j.
      • 刘涛。
      • 史密斯r.d.
      • 凯莉r.t.
      • PASA-TOLIC L.
      • 朱y
      纳米辐射样品制备与液相色谱 - 质谱法自动耦合,用于高通量单细胞蛋白质组学。
      )但是进一步自动化和简化的机会仍然存在。

      分离和电离

      高效的化学分离降低了在给定时间内进入质谱仪的样品组合物的复杂性,膨胀动态范围并降低电离抑制。结合精确质量测量的特征洗脱时间还可以提供用于使用例如精确质量和时间标签的识别信息(
      • pasa-tolićl。
      • 马萨隆C.
      • 巴里·克里。
      • 沉Y.
      • 史密斯r.d.
      蛋白质组学分析使用精确的质量和时间标签策略。
      )或MBR(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )方法。降低分离的流速及其相应的电喷雾电离(ESI)源至低纳米醇/每分钟甚至每分钟均可,可以显着提高电离效率并进一步降低电离抑制(
      • 威尔m。
      纳米电子涂布离子源的分析性能。
      ,
      • Marginean I.
      • 唐k.q.
      • 史密斯r.d.
      • 凯莉r.t.
      微微电离电离质谱法使用窄孔化学蚀刻发射器。
      )。另外,以低流速操作增加由肽而不是溶剂污染物产生的离子的比例。下面讨论了已证明对低输入样本成功的各种分离策略。

       进步

       窄孔包装柱

      大多数蛋白质组学分离使用具有75μm的颗粒包装的反相液相色谱(LC)柱m 钻孔和在〜300 nl / min工作(
      • 威尔逊S.R.
      • 奥尔森C.
      • Lundanes E.
      纳米液相色谱柱。
      )。然而,并非所有这些柱都是相同的,并且高效率,低死体柱,例如由离子光学产生的柱,可以在更高的洗脱浓度下产生含有肽的非常窄的峰,以改善检测(
      • Sandow J.J.
      • infusini G.
      • Dagley L.F.
      • 拉森r.
      • Webb A.I.
      SINSTOF PRO的深度蛋白质组分析简化的高通量方法。
      )。然而,需要更低的流速来完全收获纳米尼提供的灵敏度效益(
      • 施密特A.
      • Karas M.
      • DülcksT.
      不同溶液流速对纳米ESI MS中分析物离子信号的影响,或:ESI何时变成纳米ESI?
      )。高效率定制填充纳米柱,内径为15μm 并通过沉发射和评估在〜20 nL / min的最佳工作 等等。 in the early 2000s (
      • 沉Y.
      • tolic n.
      • 马萨隆C.
      • PASA-TOLIC L.
      • 营地D.G.
      • 赫克森k.k.
      • 赵立
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      超敏感蛋白质组学,使用高效在线微型SPE-NANOM-NANONES和MS / MS。
      ,
      • 沉Y.
      • 赵立
      • Berger S.J.
      • 安德森G.A.
      • Rodriguez N.
      • 史密斯r.d.
      高效纳米级液相色谱法在线偶联,与质谱法使用纳米电子喷雾电离进行蛋白质组学。
      ,
      • 沉Y.
      • 托利ć
      • 马萨隆C.
      • Paša-tolićL.
      • 营地II D.G.
      • 李pton M.S.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      纳米级蛋白质组学。
      ),从而通过近二十年来预测单细胞蛋白质组分析。这些分离需要高度定制的设备,因为它们达到纳米孔配件,能够提供可靠的编程线性梯度和商业纳米泵的纳米泵。当然,它们的单个细胞和现代质谱仪的有效样品处理方法也是基本上捕获的有效样品处理方法,其可以在这种小型样本上迅速地进行串联MS测量。尽管存在这些挑战,作者令人印象深刻地识别75中存在的标准肽 zMOL量并从低纳米样品中鉴定数百种蛋白质(
      • 沉Y.
      • tolic n.
      • 马萨隆C.
      • PASA-TOLIC L.
      • 营地D.G.
      • 赫克森k.k.
      • 赵立
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      超敏感蛋白质组学,使用高效在线微型SPE-NANOM-NANONES和MS / MS。
      )。
      最近,我们在单细胞分析和现代MS仪器的背景下重新审视了类似的纳米柱。我们显示30-μ的蛋白质组覆盖率大幅增加m-ID。柱相对于标准75-μM〜50 nL / min操作m-ID。列 (
      • 朱y
      • 赵立
      • piehowski p.d.
      • 摩尔r.j.
      • LIM S.
      • 孤儿v.j.
      • PASA-TOLIC L.
      • 钱W.J.
      • 史密斯r.d.
      • 凯莉r.t.
      亚网上蛋白质组学:LC柱选择,MS仪表和数据分析策略对痕量样品的蛋白质组覆盖的影响。
      ),和这些30-μm 从那以后,专栏已被用于大部分工作。在用这些柱分析单纳米池制备的HELA细胞时,我们使用横向融合探测器质谱仪平均鉴定211个蛋白质基团/细胞,其增加到669(包括MBR鉴定)(
      • 朱y
      • Clair G.
      • 克里斯勒W.B.
      • 沉Y.F.
      • 赵立
      • Shukla A.K.
      • 摩尔r.j.
      • 米拉拉斯。
      • Pryhuber G.S.
      • 史密斯r.d.
      • ansong c.
      • 凯莉r.t.
      微流体纳米型纳米射线样品制备和超敏纳米 - MS使单一哺乳动物细胞的蛋白质组学分析。
      )。自从进一步将单细胞蛋白质组学的LC分离进一步小型化为20-μm-ID。在〜20 nl / min工作的列( Fig. 2A),并且平均MS / MS衍生的标识增加>使用相同的细胞类型,制备方法和质谱仪40%至近300种蛋白质组(
      • Cong Y.
      • 梁Y.
      • Motiamechaboki K.
      • Huguet R.
      • Truong T.
      • 赵立
      • 沉Y.
      • Lopez-Ferrer D.
      • 朱y
      • 凯莉r.t.
      使用窄孔填充纳米柱和超敏感质谱法改善单细胞蛋白质组覆盖。
      )。这说明了进一步小型化分离的益处,尽管具有可重复准备和操作这些20-μ的挑战 m-ID。 (或更小的)包装列可能会阻止其日常使用。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2单细胞和其他痕量样品的分离方法。 A,窄孔包装LC柱。 B,多孔层打开管状柱。 C,具有电动驱动的鞘流界面的毛细管电泳。 D,纳米孔介导的2D LC。适用于参考的许可
      • 尼尔森J.B.
      • Hanson R.L.
      • Almughamsi H.M.
      • 庞C.
      • 鱼T.R.
      • Woolley A.T.
      微流体:材料的创新及其制造和功能化。
      ,
      • 沉Y.
      • 托利ć
      • 马萨隆C.
      • Paša-tolićL.
      • 营地II D.G.
      • 李pton M.S.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      纳米级蛋白质组学。
      ,
      • de Malsche W.
      • eghbali H.
      • Clicq D.
      • vangelooven J.
      • 栀子H.
      • Desmet G.
      有序无孔柱阵列中的压力驱动的反相液相色谱分离。
      • Cong Y.
      • Motiamechaboki K.
      • misal s.a.
      • 梁Y.
      • 欺骗A.J.
      • Truong T.
      • Huguet R.
      • 普利·普利
      • 朱y
      • Lopez-Ferrer D.
      • 凯莉r.t.
      超敏感的单细胞蛋白质组学工作流程识别>每哺乳动物细胞1000个蛋白质组。
      , 分别。

       绘制栏目

      鉴于填充纳米柱极端小型化的困难,已经探索了各种替代方法。一个高度有前途的选择是使用单片或窄孔多孔层打开管状(绘图)柱(Fig. 2B)。悦 等等。 最初开发~4-m长,10μm-ID。绘制利用的LC列 原位 - 作为固定相的聚合的聚(苯乙烯 - 二乙烯基)(
      • 悦乐
      • 罗Q.
      • 张继夫
      • wu s.-l.
      • karger b.l.
      UltraTrace LC / MS蛋白质组学分析使用10-μm-i.d。多孔层露天管聚(苯乙烯 - 二乙烯基苯)毛细管柱。
      )。这些在〜20 nl / min操作,低 - fMOL负载能力并实现了〜400的令人印象深刻的峰值容量。最近,相同的组将类似的绘制柱应用于低输入蛋白质组学(
      • 李S.Y.
      • PLOUFFE B.D.
      • Belov上午
      • 雷斯
      • 王X.Z.
      • Murthy S.K.
      • karger b.l.
      • Ivanov A.R.
      全血稀有细胞的分离,加工和质谱蛋白质组学分析的集成平台。
      )。他们实现了10-100的检测限 zmol for spiked peptides并鉴定>2500个蛋白质基团,来自尖刺MCF-7细胞的等分试样,对应于全血捕获的〜100个细胞。

       μpac.

      最近的令人兴奋的发展是微流体柱阵列柱(μPAC)的商业化(
      • de Malsche W.
      • eghbali H.
      • Clicq D.
      • vangelooven J.
      • 栀子H.
      • Desmet G.
      有序无孔柱阵列中的压力驱动的反相液相色谱分离。
      )通过药物的纳米液。而不是将分离介质随机包装到毛细管中,而μPAC列具有有序的固定相的微型晶片上的硅晶片。这些有序的分离减少了分散,并且在比典型的纳米柱的操作压力下提供高效的分离。他们还承诺改善鲁棒性,无堵塞玻璃料,并表现出出色的保留时间重现性。但是,列的成本是典型包装列的几倍。目前,μPAC列旨在以类似于75-μ的流动制度操作m-ID。柱子 (>100 NL / min)但是创造较窄的支柱床,应尽最佳地运行。使用商业50-cm-longμpac列,Stadlmann 等等。 (
      • Stadlmann J.
      • Hudecz O.
      • KrššákováG.
      • Ctortecka C.
      • van raemdonck G.
      • op de beeck J.
      • Desmet G.
      • Penninger J.M.
      • 雅各布斯P.
      • Mechtler K.
      使用微米阵列的色谱法改善了低输入蛋白质组学的敏感性。
      )可重复地确定>来自10ng细胞裂解物消化的2400个蛋白质基团,表明该分离技术具有进一步的小型化的实质性许可。

       毛细管电泳

      毛细管电泳(CE)分离也证明了纳米级自下而上蛋白质组学的能力很强(
      • 张Z.
      • qu y.
      • dovichi n.j.
      毛细管区电泳 - 质谱,用于自下而上的蛋白质组学。
      )。 Ce根据其电场中的差动迁移速率分离液相离子物质。因为CE缺乏固定阶段,原则上应该减少在LC分离中可能发生的任何吸附损失。 CE在很大程度上与LC分离相同,具有分析无疗程或完全保留在RPLC柱上的物种的优点。电离源的最新改进,例如电动泵浦鞘流电喷雾界面(
      • 太阳L​​.L.
      • 朱G.J.
      • 张Z.B.
      • MOU S.
      • dovichi n.j.
      第三代电流泵浦鞘流纳米普通接口,具有改善的毛细管区电泳分析复合蛋白质组消化的自动毛细管区电泳分析的稳定性和灵敏度。
      )(Fig. 2C)使敏感性分析具有低至1 Zmol的检测限度(
      • Amenson-Lamar E.A.
      • 太阳L​​.
      • 张Z.
      • Bohn p.w.
      • dovichi n.j.
      使用电动泵浦鞘流电喷雾界面的毛细管区电泳检测1Zmol注射血管紧张素的血管紧张素。
      )。张 等等。 identified >3500个蛋白质组,来自48 ng哺乳动物蛋白质消化(
      • 张Z.
      • Hebert A.S.
      • Westphall M.S.
      • qu y.
      • Coon J.J.
      • dovichi n.j.
      通过单次毛细管区电泳 - 质谱法通过组合产生超过27 000份肽和近4400蛋白鉴定,通过非常低电渗涂层毛细管,第三代电动泵浦鞘流纳米普通接口,围绕熔化融合Lumos Tribriat质谱仪和先进峰值测定算法。
      )。 CE已被广泛用于单细胞蛋白质组学,但到目前为止分析的细胞通常是卵母细胞和胚泡等(
      • 太阳L​​.L.
      • Dubiak K.m.
      • Peuchen E.H.
      • 张Z.B.
      • 朱G.J.
      • Huber P.W.
      • dovichi n.j.
      使用青蛙(Xenopus Laevis)卵石从早期胚胎中分离的单细胞蛋白质组学,形成蛋白质含量的几何进展。
      ,
      • Lombard-Banek C.
      • 穆迪S.A.
      • NEMES P.
      用于发现蛋白质组学的单细胞质谱:量化16-细胞青蛙(外爪瓣)胚胎中的转化细胞异质性。
      ,
      • 张Z.B.
      • Dubiak K.m.
      • Huber P.W.
      • dovichi n.j.
      用于高通量的小型化滤波器辅助样品制备(微型FASP)方法,超细蛋白质组学样品制备揭示了Xenopus Laevis胚胎的蛋白酶组不对称。
      ,
      • yan x.j.
      • 太阳L​​.L.
      • 朱G.J.
      • COX O.F.
      • dovichi n.j.
      来自Xenopus Laevis受精卵消化的超过4100种蛋白质鉴定,使用反相色谱预选,然后是毛细管区电泳 - 电泳电离电离 - 串联质谱分析。
      ,
      • Baxi A.B.
      • Lombard-Banek C.
      • 穆迪S.A.
      • NEMES P.
      高分辨率质谱法通过高分辨率质谱法蛋白质颈部掺杂细胞克隆的蛋白质组学表征。
      ,
      • Lombard-Banek C.
      • 穆迪S.A.
      • Manzin M.C.
      • NEMES P.
      微内采样毛细管电泳质谱使复杂组织中的单细胞蛋白质组学能够:显影Xenopus Laevis和斑马鱼胚胎中的细胞克隆。
      ),所有这些都比典型的哺乳动物细胞大得多。 CE相对于LC的一个电流缺点是填充的LC柱在梯度洗脱之前自然地清除并预先浓缩到塔入口处的聚焦塞中,而在分离CE之前的有效预浓度不太直接。尽管如此,基于CE的分离可能会继续对纳米级蛋白质组学进行重要贡献。

       2D分离

      实现深度蛋白质组覆盖范围>5000个蛋白质基团通常需要多维分离,其提供比一维分离的峰值容量更大。然而,分馏方案通常在两个分离尺寸之间丢失大量样品到收集血管,从而对低输入蛋白质组学产生重大挑战(
      • 袁H.
      • 江伯士
      • 赵b.
      • 张L.
      • 张Y.
      蛋白质组分析多维分离的最新进展。
      )。为了解决此问题,我们最近开发了纳米孔介导的2DLC,其中用于纳米波特样品制备的相同玻璃芯片用作纳米级两维之间的馏分收集器(
      • 窦。
      • 朱y
      • 李耀A.
      • 梁Y.R.
      • 陈杰。
      • piehowski p.d.
      • 徐k.r.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 阿特金森M.A.
      • mathews c.e.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      Nanowell介导的二维液相色谱可实现深蛋白质组谱<1000个哺乳动物细胞。
      )(Fig. 2D)。降低的表面损失使得能够鉴定近6000个裂解物以及从包含几百个细胞的低输入纳米乐蛋白制备的细胞和组织样品。为LC实现了类似的分馏方案,与离子迁移光谱相耦合(
      • 窦。
      • Chouinard C.D.
      • 朱y
      • NAGY G.
      • 李耀A.v.
      • 易卜拉欣Y.M.
      • 史密斯r.d.
      • 凯莉r.t.
      Nanowell介导的多维分离结合Nanolc与Slim IM-MS进行快速,高峰容量蛋白质组学分析。
      ),并且随着一些谦虚的上升,平台兼容商业自动进样器和微孔板(
      • 窦。
      • Tsai C.f.
      • piehowski p.d.
      • 王Y.
      • fillmore t.l.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 张P.F.
      • 钱W.J.
      • 史密斯r.d.
      • 刘涛。
      • 凯莉r.t.
      • shi t.j.
      • 朱y
      自动纳米射线二维反相液相色谱系统使纳米级样品的深入蛋白质组和磷脂蛋白酶谱能够。
      )。后一种实施将6700个蛋白质组从100ng裂解物样品和来自100μg样品的样品中的20,000种磷酸肽鉴定出6700个蛋白质基团。尽管尚未在单细胞层面评估这些2D分离,但进一步的优化应该使具有更大覆盖深度的单细胞分析,尽管具有测量吞吐量的显着权衡。

       前景

      无论是使用LC还是Ce,尖端分离都倾向于以不小于20nl / min的最小流速操作。这不是因为在这些流速下实现了最佳条件,而是越来越难以通过进一步的流量减少维持稳定的电喷雾。为了探索子纳米射线的制度,我们开发了具有2-μ的化学蚀刻熔融二氧化硅发射器 m 内径,在流量速率下提供稳定的操作,低至400 pl / min(
      • Marginean I.
      • 唐k.q.
      • 史密斯r.d.
      • 凯莉r.t.
      微微电离电离质谱法使用窄孔化学蚀刻发射器。
      )。在直接输注实验中,我们发现检测限度在接近1nL / min的流动中显着降低。最近,湘 等等。 employed 2-μm-ID。用于痕量蛋白质组学分析的开放管状“PICOLC”柱(
      • Xiang P.L.
      • 朱y
      • 杨Y.
      • 赵Z.T.
      • 威廉姆斯三
      • 摩尔r.j.
      • 凯莉r.t.
      • 史密斯r.d.
      • 刘S.R.
      Picoflow液相色谱 - 质谱,用于使用2-mu m-i.d的超敏性自下而上蛋白质组学的质谱。打开管状柱。
      )。在仅790pL / min的分离下操作,并实现了78和949个蛋白质基团的相应蛋白质组覆盖率,7.5和75 pg细菌裂解物胰蛋白酶消化,其蛋白质远低于典型的哺乳动物细胞。该平台还没有准备好单个电池应用,因为它目前缺乏无损样品引入的机制,但这些研究强烈表明,进一步的分离小型化与〜1 nL / min范围的分离将大大有益于单细胞和亚细胞蛋白质组分析。

      质谱和气相分离

      为了确定从作为单个哺乳动物细胞的样品中的蛋白质表达,必须小心地最小化通过每种样品制备和分析步骤的分析物损失。在可以考虑这种痕量分析之前,MS仪器必须更有效地在传递电喷雾离子,该电喷雾离子通常在大气压下产生至质量分析仪的高真空区域。常规的气体导电限制孔,例如加热的毛细管入口和撇料器必须窄,以实现具有适度尺寸的粗泵的有效差动泵送。这些最初是能够对离子的高真空进行采样和传输并将其传递给高真空,其中更有效的离子光学器件可以通过质量分析仪传达离子和检测器(
      • 史密斯r.d.
      • lo j.a.
      • edmonds c.g.
      • Barinaga C.J.
      • UDSeth H.R.
      生物化学质谱的新发展:电喷雾电离。
      )。幸运的是,更高效的离子传输,由电动离子漏斗(
      • 凯莉r.t.
      • tolmachev a.v.
      • Page J.S.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      离子漏斗:理论,实现和应用。
      )和相关的进步,如旋转源(
      • Page J.S.
      • 唐克。
      • 凯莉r.t.
      • 史密斯r.d.
      用纳米电子涂布源和界面进行脱模压力电离,用于改善质谱中的灵敏度。
      ),使得可以电离和传递〜50%的溶液相分子到质谱仪的高真空区域(
      • Marginean I.
      • Page J.S.
      • tolmachev a.v.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      用纳米电子果粥实现脱模压力电离的50%电离效率。
      )。对于对单细胞蛋白质组学感兴趣的研究员而言,离子传输效率和MS敏感度的许多前提都被纳入商业仪器,使得人们不必是MS仪器的专家来利益。实际上,低输入蛋白质组分析工作通常已经利用了如下所述的未修改的商业MS仪器。

       进步

       orbitrap女士

      绝大多数低输入蛋白质组分析使用了基于orbitrap的仪器,并且在离子传输效率,检测器灵敏度,占空比和分辨率(
      • Eliuk S.
      • Makarov A.
      露天质谱仪的演化。
      ,
      • 挖掘D.
      • Malek R.
      • Makarov A.
      现代质谱中的离子陷阱。
      )。我们在不同的orbitrap平台上评估了这些累积益处。在分析2种细菌裂解物胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶中,我们通过与LTQ orbitrap XL质谱仪相比,我们使用横向熔点鉴定了近3倍的独特肽(
      • 朱y
      • 赵立
      • piehowski p.d.
      • 摩尔r.j.
      • LIM S.
      • 孤儿v.j.
      • PASA-TOLIC L.
      • 钱W.J.
      • 史密斯r.d.
      • 凯莉r.t.
      亚网上蛋白质组学:LC柱选择,MS仪表和数据分析策略对痕量样品的蛋白质组覆盖的影响。
      )。最近,我们观察到肽和蛋白质覆盖率分别增加36%和20%,当时与玻璃素融合卢斯()相比分析了最新一代orbitrap Eclipse质谱仪(
      • Cong Y.
      • 梁Y.
      • Motiamechaboki K.
      • Huguet R.
      • Truong T.
      • 赵立
      • 沉Y.
      • Lopez-Ferrer D.
      • 朱y
      • 凯莉r.t.
      使用窄孔填充纳米柱和超敏感质谱法改善单细胞蛋白质组覆盖。
      )。在所有情况下,MS采集设置往往与用于批量研究的那些往往不同。最重要的是,对于无标记分析,与痕量样品相关的降低的离子丝量需要更长的MS2离子注入时间来到达AGC目标。因此,使用典型的最大喷射时间, 例如 50毫秒将导致少数可用光谱。另一方面,过度长的最大喷射时间将过度减少占空比,再次减少了生产性MS2光谱的数量。对于使用用于MS2的斜拉瓣质量分析仪的单细胞研究,我们通常将最大喷射时间设定为约500毫秒。对于采用载体通道的基于TMT的研究,增加AGC目标超出标准(依赖仪器依赖性)设置是有益的,以确保来自样本通道的足够数量的肽(例如 单细胞)与载体肽一起被捕获(
      • Tsai C.-f.
      • 赵立
      • 威廉姆斯三
      • 摩尔r.j.
      • Schultz K.
      • 克里斯勒W.
      • PASA-TOLIC L.
      • 罗德兰克。
      • 史密斯r.d.
      • Shi T.
      • 朱y
      • 刘涛。
      一种改进的增强,用于扩增具有异巴尺寸(Ibasil)策略的信号,用于精确定量单细胞蛋白质组学。
      ,
      • 张T.K.
      • 李C.Y.
      • 拜耳F.
      • McCoy A.
      • Kuster B.
      • 玫瑰c.m.
      定义单细胞蛋白质组学的载体蛋白质组列限制。
      )。较高的AGC目标降低了仪器的占空比,但确保了足够的报告器离子信号以准确定量。

       离子流动性

      漂移管的离子迁移率光谱(IMS)和高场不对称离子迁移率(FAIMS)可以从一般用于鉴定和定量的繁殖肽中增加选择性并分离或过滤单一的物种,用于在自下而上的蛋白质组学中(
      • 面包师E.S.
      • Burnum-Johnson K.E.
      • 易卜拉欣Y.M.
      • orton d.j.
      • Monroe M.E.
      • 凯莉r.t.
      • 摩尔r.j.
      • 张X.
      • Therberge R.
      • Costello C.E.
      • 史密斯r.d.
      增强具有离子迁移率分离的自下而上和自上而下的蛋白质组学测量。
      ,
      • Bekker -Jensen D.B.
      • 马丁内斯 - 瓦A.
      • Steigerwald S.
      • ruther p.
      • 堡垒K.L.
      • arrey t.n.
      • 更难A.
      • Makarov A.
      • 奥尔森J.V.
      具有FAIMS界面的紧凑型四极磁体 - 横谱仪可提高短LC梯度的蛋白质组覆盖率。
      )。除去单反的物种对于痕量样品分析特别有益,因为批量研究中可能可忽略不计的溶剂簇和污染物可以成为低投入研究的主要原因。这些污染物增加了光谱复杂性并占据了离子捕获仪器的有限充电能力,有效地挤出了繁殖的带电肽。通过将Faims Pro接口纳入我们的工作流程并鉴定每种细胞〜1100蛋白基团,通过将密切相关的神经元亚型的~1100蛋白基团分析了人脊柱组织的单次Hela细胞和微小的神经元,基于无标记量化量化(
      • Cong Y.
      • Motiamechaboki K.
      • misal s.a.
      • 梁Y.
      • 欺骗A.J.
      • Truong T.
      • Huguet R.
      • 普利·普利
      • 朱y
      • Lopez-Ferrer D.
      • 凯莉r.t.
      超敏感的单细胞蛋白质组学工作流程识别>每哺乳动物细胞1000个蛋白质组。
      )。这种前所未有的覆盖范围表示添加的选择性远远超过通过FAIMS接口传输过程中发生的信号衰减。虽然我们在我们研究中扫描了两个补偿电压(CVS)之间,但增加了来自额外CV的选择性可以提供额外的覆盖范围。其他基于离子​​流动性的策略也在低输入蛋白质组学中承受。例如,在Brüker公司的研究人员报告了使用其捕获的离子迁移率(TIMS)TOF平台鉴定3300个独特的肽和近700个蛋白质组,尽管采用在常规流速下操作的LC分离(
      • Kosinski T.
      • 陈恩
      • 玛武E.
      • 沉闷米
      )。这些结果突出了用于显着增强单细胞蛋白质组学分析的离子迁移率方法的承诺。

       前景

      单细胞蛋白质组学仅随着合适的MS仪器的发展而成为可能,并且新的几代乐器只会改善灵敏度和速度。但是,即使没有进一步的改进,也可以通过仪器设置,采集模式(包括数据独立采集(包括数据独立采集(包括数据独立采集(
      • Saha-Shah A.
      • Esmaeili M.
      • Sidoli S.
      • Hwang H.
      • 杨杰。
      • Klein P.S.
      • 加西亚B.A.
      单细胞蛋白质组学通过数据独立于数据获取研究Xenopus Laevis的胚胎不对称性。
      ),BoxCar MS(
      • 梅尔F.
      • Geyer P.E.
      • 弗莱拉冬季S.
      • Cox J.
      BoxCar采集方法使单次蛋白质组学能够在100分钟内以10,000个蛋白的深度。
      )等)和数据分析策略。此外,给定最近有Faims和其他离子移动平台的结果,气相分离和过滤将导致单个细胞水平和附近的测量增强。

       tmt或不tmt

      单细胞蛋白质组的分析力量雇用了无标记和异烟标记工作流程。对于后一种方法,样品用不同的串联质量标签(TMT)试剂标记并在单个LC-MS实验中汇集并分析。对于低输入蛋白质组学的特别感兴趣,可以在存在更大的载体样品的存在下进行样品,其提供强的MS1和MS2光谱,同时仍然基于报道离子强度能够定量每个样品。罗素首次使用这种一般方法 等等。 使用载体通道中的固体组织样品识别体液中的低丰度蛋白质(
      • 罗素C.L.
      • Heslegrave A.
      • Mitra V.
      • Zetterberg H.
      • Pocock J.M.
      • 沃德米
      • 派克I.
      组织和流体蛋白质组学与串联质量标签,以鉴定外周体液中疾病的低丰度蛋白质生物标志物:阿尔茨海默病案例研究。
      )通过Budnik引入了其对单一哺乳动物细胞的蛋白质组分析的应用 等等。 在scope-ms工作流程(
      • Budnik. B.
      • 征收E.
      • HARMANGE G.
      • Slavov N.
      范围 - MS:单一哺乳动物细胞的质谱测量细胞分化期间的蛋白质组异质性。
      )。
      与批量蛋白质组分析一样,无标记和等离性标记实验,每个都具有必须仔细考虑的优缺点(
      • muntel J.
      • Kirkpatrick J.
      • 布鲁德尔R.
      • 黄T.
      • Vitek O.
      • ori a。
      • 重新勒
      用固定仪器时间对复杂背景中蛋白质定量的比较。
      )。在单个LC-MS分析中测量多个样品的能力使TMT实验是清晰的产量优势,特别是与现在可用的16-PLEX试剂。来自载体和样本通道的组合信号还能够检测如果单独分析,并且复用分析可以在分离期间降低表面损耗的情况下可能检测到可能低于检测限度的肽。
      • Budnik. B.
      • 征收E.
      • HARMANGE G.
      • Slavov N.
      范围 - MS:单一哺乳动物细胞的质谱测量细胞分化期间的蛋白质组异质性。
      )。然而,TMT实验也存在潜在的缺陷。虽然来自前体共同的比率压缩是许多TMT研究的常见,但对于单细胞实验可能更为重要,其中离线分馏和其他策略如MS3(
      • L.
      • RAD R.
      • Gygi S.P.
      • 哈斯W.
      MS3消除了异巴里复用定量蛋白质组学中的比率变形。
      )通常不习惯。在样品制备期间添加的步骤,以及在分析之前将样品组合在较大的孔或小瓶中也提供额外的表面暴露,具有损失可能性。最后,尽管使用载体通道可以改善检测,但它可以同时损害定量作为载体肽限制质量分析仪中的样品离子群。因此,多组(
      • 窦。
      • Clair G.
      • Tsai C.f.
      • 徐k.r.
      • 克里斯勒W.B.
      • Sontag R.L.
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • 刘涛。
      • PASA-TOLIC L.
      • 史密斯r.d.
      • shi t.j.
      • Adkins J.N.
      • 钱W.J.
      • 凯莉r.t.
      • ansong c.
      • 朱y
      高通量单细胞蛋白质组学通过多路复用等离子蛋白标记在纳米进样品制备平台中实现。
      ,
      • Tsai C.-f.
      • 赵立
      • 威廉姆斯三
      • 摩尔r.j.
      • Schultz K.
      • 克里斯勒W.
      • PASA-TOLIC L.
      • 罗德兰克。
      • 史密斯r.d.
      • Shi T.
      • 朱y
      • 刘涛。
      一种改进的增强,用于扩增具有异巴尺寸(Ibasil)策略的信号,用于精确定量单细胞蛋白质组学。
      ,
      • 张T.K.
      • 李C.Y.
      • 拜耳F.
      • McCoy A.
      • Kuster B.
      • 玫瑰c.m.
      定义单细胞蛋白质组学的载体蛋白质组列限制。
      已经表明,限制载体蛋白质组的尺寸对于维持准确定量至关重要。重要的是,张 等等。 已开发出一个名为单胞单元蛋白质组学伴侣的程序,分析了等因素标签数据集,以评估数据质量并建议改进性能的MS采集参数的修改(
      • 张T.K.
      • 李C.Y.
      • 拜耳F.
      • McCoy A.
      • Kuster B.
      • 玫瑰c.m.
      定义单细胞蛋白质组学的载体蛋白质组列限制。
      )。鉴于无标签和等离的标签工作流程之间的权衡,似乎两种方法都将继续开发并应用于单细胞研究。无论选择的方法如何,实验将极大地受益于优化工作流程的每个步骤,从样品制备到分离和MS分析,如上所述,以降低样本损失并提高灵敏度。

      概括

      单细胞蛋白质组学的领域仍处于起步阶段,但正在推进非常迅速。例如,我们已经看到无标记的蛋白质组覆盖率从〜200蛋白组增加单一Hela细胞(没有MS1级特征匹配)>通过改进的分离,MS仪器和Faims滤波的融合等1000个蛋白质组。进展类似地对等因素标签工作流程(
      • Tsai C.-f.
      • 赵立
      • 威廉姆斯三
      • 摩尔r.j.
      • Schultz K.
      • 克里斯勒W.
      • PASA-TOLIC L.
      • 罗德兰克。
      • 史密斯r.d.
      • Shi T.
      • 朱y
      • 刘涛。
      一种改进的增强,用于扩增具有异巴尺寸(Ibasil)策略的信号,用于精确定量单细胞蛋白质组学。
      ,
      • SPECHT H.
      • Emmott E.
      • petelski a.a.
      • 灰色霍夫曼r.
      • Perlman D.H.
      • 塞拉米
      • kharchenko p.
      • Koller A.
      • Slavov N.
      单细胞质谱测量巨噬细胞异质性的出现。
      )。虽然该技术有所改善,但低输入和单细胞蛋白质组学的应用空间也从培养的细胞扩大到空间分辨的哺乳动物和植物组织(
      • 朱y
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