深入表征 金黄色葡萄球菌 磷脂蛋白质揭示了STK1的新目标

  • Nadine Prust.
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,乌得勒德,荷兰
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  • 萨尔van der laarse
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    生物分子质谱和蛋白质组学,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,乌得勒德,荷兰
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  • Henk W.P. van denorn.
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,乌得勒德,荷兰
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  • Nina M. Van Sorge
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    医学微生物学,大学医疗中心Utrecht,乌得勒支大学,荷兰乌得勒支

    荷兰阿姆斯特丹大学阿姆斯特丹大学医学中心医学微生物学和荷兰参考实验室
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  • Simone Lemeer.
    一致
    通信:Simone Lemeer
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    生物分子质谱和蛋白质组学,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,乌得勒德,荷兰
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开放访问发布:1月11日2021年 DOI: //doi.org/10.1074/mcp.RA120.002232

      强调

      • 革兰氏阳性细菌的优化磷酸富集方案
      • 广泛的蛋白质磷酸化 金黄色葡萄球菌
      • 激酶STK1的七十四个下游靶 S.金黄色葡萄球菌 were identified
      • 广泛的磷酸化表明存在其他激酶转移酶的存在

      抽象的

      金黄色葡萄球菌是全世界感染的主要原因,感染导致各种疾病。毫不奇怪,蛋白质磷酸化是信号级联的重要游戏玩家,并且已被证明参与其中S.金黄色葡萄球菌毒力。尽管长期被忽视,真核型丝氨酸/苏氨酸激酶S.金黄色葡萄球菌已经涉及这种复杂的信号级联。由于蛋白质磷酸化的倒产物性质和缺乏合适的分析工具,然而,迄今为止,这些级联的知识仍然有限。在这里,应用优化的磷酸富集富集通过 Fe3+-imac之后是LC-MS / MS,以更好地了解蛋白质磷酸化对致病性涉及的复杂信号网络的影响。通过从耐甲氧丙氨酸抗甲氧基/苏氨酸激酶和磷酸酶突变体进行分析S.金黄色葡萄球菌突变库,我们产生了最综合的磷酸溶解组数据集S.金黄色葡萄球菌迄今为止,帮助更好地了解细菌中的信号。通过识别3800级P-Sites,与最近的文献相比,我们能够将标识数量增加超过21次。此外,我们能够识别唯一报告的真核型SER / Thr激酶的74个下游靶S.金黄色葡萄球菌菌株USA300,STK1。这项工作允许对细菌磷酸酯组进行广泛的分析,表明Ser / Thr激酶信号传导比以前预期的更丰富S.金黄色葡萄球菌.

      图形概要

      关键词

      缩写:

      CAA (2-氯乙酰胺 ), est (真核型丝氨酸/苏氨酸激酶 ), FDR. (假发现率 ), HCD. (更高能量的碰撞诱导的解离 ), imac. (固定化金属离子亲和层析 ), LC. (液相色谱法 ), Moac. (金属氧化物亲和层析 ), MRSA. (methicillin-resistant 金黄色葡萄球菌 ), PTM. (后期修改 ), rr. (响应监管机构 ), SDC. (脱氧核酸钠 ), TCEP. (Tris(2-羧乙基)膦 ), TCS. (双组件系统)
      蛋白质磷酸化是各种生物体中细胞过程的主要调节因子。真核蛋白磷酸化通常发生在丝氨酸,苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)残基上,并且它长时间假设类似的后期改变(PTMS)仅在原核生物中发挥着小的作用。相反,提出了蛋白质组氨酸(H)磷酸化,例如用于所谓的双组分系统(TCSS),是主要调节PTM(
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      细菌磷蛋白酶分析显示蛋白质磷酸化与细菌致病性之间的相关性。
      )。发现真核型丝氨酸/苏氨酸激酶(erks)和许多PS / PT肽的鉴定改变了这种感知。现在已经鉴定了革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(包括重要人类病原体)的发生(
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      细菌磷蛋白酶分析显示蛋白质磷酸化与细菌致病性之间的相关性。
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      大肠杆菌细胞蛋白质激酶活性分析。
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      蛋白质磷酸化的倒档性质不仅需要高效的样品制备,而且需要在质谱分析之前具有高效的富集方法。迄今为止,缺乏从革兰氏阳性细菌的含量磷酸肽富集的有效方法限制了这些细菌中的信令途径的信息。大多数富集技术利用带负电荷的磷酸肽朝向金属氧化物如TiO的亲和力2,这主要用于金属氧化物亲和层析(MOAC)(
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      使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
      )或金属离子如Ti4+ 和 Fe3+ 用于固定化金属亲和层析(IMAC)(
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      固定化镓(III)磷酸肽的亲和层析。
      )。富集策略以及碎片,质谱检测和磷酸化现场定位评估的最新发展允许鉴定成千上万的磷酸化位点(
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      )。然而,我们最近表明DNA / RNA和磷脂中的标准样品制备方案的污染扰乱了FE3+-imac浓缩(
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      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )。因此,除去这些污染物大大改善了革兰氏阴性细菌的鉴定 大肠杆菌 (
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )。这种改进促进了我们还进一步优化了革兰氏阳性细菌的样品制剂,这需要由于厚的肽聚糖层的存在而需要更严格的细胞裂解。
      这种优化来自革兰氏阳性细菌的磷酸肽鉴定可帮助理解重要人群的信号通路,例如 金黄色葡萄球菌 (S.金黄色葡萄球菌 )。 S.金黄色葡萄球菌 对公共卫生是一个很大的威胁,因为它是全世界感染的主要原因(
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      )。由于各种毒力因子及其特殊的通用性,这种病原体能够引起广泛的感染范围从轻度皮肤感染到危及危及危及危及毒性休克综合征和败血症的感染(
      • 福斯特T.J.
      The 金黄色葡萄球菌 “superbug”.
      )。从临床角度来看,抗生素抗性菌株的演变( 例如 ,耐甲氧西林 S.金黄色葡萄球菌 (MRSA))是复杂的预防和治疗 S.金黄色葡萄球菌 感染,渲染 S.金黄色葡萄球菌 根据世界卫生组织的高优先级病原体(
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      )。尽管如此,我们仍然远离对从事毒力的细胞内信号传导途径的潜在机制的全面理解。
      S.金黄色葡萄球菌 含有各种各样的毒力因子,允许在时间内进行细菌适应和生存(
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      Regulation of 金黄色葡萄球菌 Virulence.
      )和宿主组织特异性方式(
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      Surface protein adhesins of 金黄色葡萄球菌.
      )。基因表达通过复杂的调节机制调节,包括蛋白质磷酸化 通过 TCSs (
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      Differential target gene activation by the 金黄色葡萄球菌 two-component system saeRS.
      )。 TCSS检测特定的环境变化,例如pH或营养浓度,并通过影响基因转录来将这些细胞外刺激转化为细胞内反应,其中包括毒力因子(
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      )。 S.金黄色葡萄球菌 包含16至18个已知的TCS,已知参与毒力基因规定,细胞壁代谢,营养感应和对抗微生物剂的反应(
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      Transcribing virulence in 金黄色葡萄球菌.
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      )。除了这些TCSS, S.金黄色葡萄球菌 USA300还表达了两种丝氨酸激酶(HPRK和RSBW)和一个Astk(
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      两种独特的磷酸化驱动的信号通路串扰在金黄色葡萄球菌中,用于调节细胞壁电荷:STK1 / STP1符合GRASR。
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      ),最重要的是丝氨酸/苏氨酸激酶1(STK1,也称为PKNB,蛋白激酶B)。 STK1及其相应的磷酸酶STP1,已被证明通过在丝氨酸/苏氨酸残留物上添加/除去额外的磷酸盐来微调某些TCS响应调节剂(RR)的响应(
      • Junecko J.m.
      Transcribing virulence in 金黄色葡萄球菌.
      )。这种调节是临床相关的,因为STK1的RRS VRAR和GRAR的磷酸化已与万古霉素抗性有关(
      • 弗里曼姆
      • 威廉姆斯G.D.
      • muzamal U.
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      • Siu K.W.M.
      • Golemi-Kotra D.
      两种独特的磷酸化驱动的信号通路串扰在金黄色葡萄球菌中,用于调节细胞壁电荷:STK1 / STP1符合GRASR。
      )。在这里,我们优化了革兰氏阳性细菌的磷肝蛋白酶研究的样品制备工作流程。第一次测试了这种优化的工作流程对非遗传模型生物体进行了测试 枯草芽孢杆菌 随后应用于 S.金黄色葡萄球菌。此外,我们进行了无标记的定量(LFQ)磷蛋白酶研究,并确定了STK1和STP1的74个潜在的新靶标,这将有助于阐明信号转导和毒力的角色STK1和STP1。此外,我们的数据显示更多,未知的Ser / Thr Kinases,涉及信令 S.金黄色葡萄球菌.

      实验步骤

       细菌培养

      B.枯草芽孢杆菌 168在37℃下在50ml Luria肉汤(LB)中在N = 3生物重复中搅拌过夜。转座子突变体Ne98(无关表面蛋白质编码基因的破坏 SDRE. ),NE217(蛋白质编码基因中断 PKNB. )和NE1919(中断基因SAUSA300_1112编码STP1),所有含有红霉素抵抗标志物 S.金黄色葡萄球菌 USA300 JE2菌株从内布拉斯加州转座突变体突变库(NTML)获得(
      • FEY P.D.
      • endres J.L.
      • yajaala v.k.
      • widhelm t.j.
      • Boissy R.J.
      • Bose J.L.
      • 拜耳K.W.
      A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential 金黄色葡萄球菌 genes.
      )。突变体在n = 4生物学复制中生长,在25mL TODD Hewitt肉汤(THB)中过夜,在37℃下补充有5μg/ ml红霉素的搅拌。通过离心收获细菌(15分钟,4℃,3200rpm),随后除去上清液。

       优化的细胞裂解

      如potel所述进行细菌细胞裂解 等等。 (2018) (
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )优化革兰氏阳性细菌。将一个体积细菌颗粒重悬于五个体积的裂解缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.5,7M尿素,5mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP),30mM 2-氯乙酰胺(CAA)中,10 U / ML DNase I,1毫米氯化镁(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany),1%(v / v)苯并酶(Merck Millipore,Darmstadt,德国),1mM钠钒酸钠,磷酸磷酸磷酸酶抑制剂(罗氏),并完成迷你无谷蛋白酶抑制剂)。在2850rpm(破坏性Genie,Scientific Industries)的情况下,通过珠子搅拌17.5分钟(1.5分钟,2分钟)进行裂解。 B.枯草芽孢杆菌 和3200 RPM(Mini-Beadbeater-24,Bio Spects Inc) S.金黄色葡萄球菌。随后,通过离心(2分钟以3000rpm)来沉积珠粒,其中1%(v / v)triton x-100 B.枯草芽孢杆菌 1%(v / v)triton x-100加上1%(v / v)脱氧胆酸钠(SDC,最终浓度) S.金黄色葡萄球菌 被添加到细菌裂解物中。使用Bioruptor Plus的超声处理45分钟(20秒,40秒)达到完全裂解。通过超速离心除去细胞碎片(45,000rpm,在4℃下为1小时)。测定上清液的蛋白质浓度 通过 双辛酸(BCA)测定。减少SDC集中度<0.4%,将上清液用稀释缓冲液稀释2.5次(100mM Tris-HCl pH8.5,7M尿素,5mM TCEP,30mM Caa,1mM氯化镁(Sigma-Aldrich,Steinheim,德国),1mM钠OrthovanaTate,磷酸磷酸磷酸酶抑制剂(Roche),以及完全迷你EDTA蛋白酶抑制剂)。将一个百分比(v / v)苯并酶加入上清液中,并在室温下温育2小时。随后,如前所述进行甲醇/氯仿沉淀(
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )。然后将沉淀物重悬于消化缓冲液(100mM Tris-HCl pH8.5,30M CaA,1%(v / v)Sdc(Sigma-Aldrich)和5mM Tcep)中。使用胰蛋白酶和Lys-C的混合物分别以1:25和1:100(w / w)的比例在室温下在室温下进行蛋白质消化过夜。使用10%甲酸(Sigma-Aldrich)将蛋白质消化酸化至pH3.5,通过离心(1400rpm,5分钟)除去沉淀的SDC。将上清液加载到C18 Sep-Pak(3CC)树脂柱(水)上以进行脱盐。将负载样品用0.1%(v / v)甲酸洗涤两次,用600μl40%乙腈和0.06%甲酸洗脱结合的肽。将洗脱的肽分成2mg级分,并将用于全蛋白质组分析的样品在液氮中冷冻并冷冻干燥。

       磷酸富集

      Fe. 3+-IMAC富集如前所述进行(
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )。简而言之,将2mg冻干肽重悬于加载缓冲液A(30%乙腈和0.07%TFA)中,如果需要,使用10%TFA将pH调节至2.3。将样品装载到Fe上3+-imac列(Propac IMAC-10 4×5 mm列,Thermo Fischer Scientific)。用洗脱缓冲液B洗脱结合的磷酸肽(0.3%NH4哦)。相应的梯度描述于 补充表S1。在柱的出口处重新校正波长为280nm的UV-ABS信号,并手动收集洗脱磷肽。随后,将磷酸肽在液氮中冷冻并冷冻干燥。

        LC. -MS / MS

      使用Agilent 1290(Agilent Technologies,Middelburg,Netherlands)进行纳米射线LC-MS / MS / MS分析,耦合到Orbitrap Q-Exactive HF-X(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Bremen)。将冻干磷酸肽或全蛋白质组样品分离成20mM柠檬酸(Sigma-Aldrich),1%(v / v)甲酸或2%(v / v)甲酸。重新悬浮,对应于1.6mg或200ng的全蛋白质组样品,被捕获,捕获并在捕获柱(100μm×2cm,用3μmC18树脂包装,Rechosil Pur Aq,Maisch博士,填充 - 房间)以5μl/ min的流速为5分钟,100%缓冲液A(0.1aF,在HPLC级水中)。随后将肽转移到分析塔(75μm×60cm Poroshell 120EC-C10 EC-C18,2.7μm,叠加的内部),并在室温下以85分钟的线性以300nl / min的流速分离从8%至32%缓冲液B(0.1%Fa,80%ACN)或115分钟的线性梯度,从13%至44%缓冲液B.使用1.9 kV喷射电压和320°C的毛细管温度进行电喷雾电离。质谱仪以数据相关的采集模式操作:以60,000个分辨率在斜拉瓣中获取全扫描MS光谱(M / Z 375-1600),以获得20ms的最大喷射时间,AGC目标值为3E6电荷。选择最多12个用于磷酸磷蛋白酶组样品的前体,并选择最多15个前体用于全蛋白酶样品进行后续碎裂。使用27%的归一化碰撞能量产生高分辨率HCD MS2光谱。触发MS2光谱的强度阈值分别设置为2E5,并且分别动态排除至12或16。 MS2扫描在斜面质量分析仪中以30,000(分离窗口为1.4°)的分辨率,具有1E5的AGC目标值和50ms的最大离子注射时间。从碎片中排除了具有未分配电荷状态的前体离子以及1+或优于/等于6+的电荷状态。

       数据分析

      使用MaxQuant软件(1.6.3.4版)处理原始文件,Andromeda搜索引擎用于搜索A B.枯草芽孢杆菌 168(Uniprot / Trembl,2017年12月,4247条目)或 S.金黄色葡萄球菌 USA300数据库(UNIPROT,2018年6月,5954个条目)具有以下参数的磷脂蛋白酶体分析:胰蛋白酶消化,最多三个错过的裂解,半胱氨酸氨基甲酰化(57.02DA)作为固定改性,甲硫氨酸氧化(15.99DA),N-蛋白质N-末端(42.01A)的乙酰化,以及丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸和组氨酸残基(79.96AD)的磷酸化作为可变改性。在MS1级和MS2水平的MS1水平和20ppm的大众耐受度设定为4.5ppm。使用目标 - 诱饵方法将假发现率(FDR)设定为肽谱匹配(PSM)和蛋白质鉴定,在改性肽的情况下使用40的分数截止值,并且最小的肽长度是设置为七个残留物。运行功能之间的匹配已启用,其中匹配时间窗口为0.7分钟,并为20分钟的对齐时间窗口。 MaxQuant生成的表“证据.TXT”和“磷酸(HSTY)位点。用于分别计算鉴定的独特磷酸肽和磷酸盐的数量,并滤出已知的污染物。对于全蛋白质组分析,应用以下偏差:胰蛋白酶消化,最多两个错过的切割,半胱氨酸(57.02Da)的氨基甲酰化作为固定改性,蛋氨酸氧化(15.99Da),蛋白质N-末端的N-乙酰化(42.01) da)作为可变修改。使用MAXLFQ算法进行相对标记的定量,最小比计数设置为2。

       MS2光谱中DNA / RNA污染的鉴定

      原始文件与蛋白质组发现(Vers.2.3.0.523)转换为类似蛋白质组发现的。随后使用内部制作脚本进行分析MGF文件,用于搜索MS2 Spectra以获得330.06 M / Z峰值,具有0.02Da容差。

       统计数据分析

      对于磷蛋白酶组和全蛋白质组分析,Maxquant生成的“磷光(HSTY)站点。分别用于R Studio(R版本3.6.0)的后续统计数据分析。分析了每种突变体的四种生物重复。将数据过滤,以“逆转”和“潜在的污染物”。在磷蛋白质的情况下,需要大于0.75的andromeda定位得分。在全蛋白质组分析的情况下,磷蛋白酶组数据或LFQ强度的强度是对象转化。对于每种磷酸盐或蛋白质,减去每个样品计算的中值以补偿系统的测量效果。只有在一个条件下具有至少三个有效值的蛋白质,并且至少在至少一个其他条件下有两个有效值。在完成每种磷酸盐或蛋白质上的单向ANOVA之前检查数据进行正常分布,之后 p - 用本杰里尼 - Hochberg程序调整值。 HOC Tukey诚实的差异(HSD)方法用于识别各组之间的改变P-Site。一个tukey hsd. p-价值cutoff of 0.05 and a fold change cutoff of the mean ± one standard-deviation of the data were used to select for significantly changing phosphosites or proteins between two groups.

       实验设计与统计理由

      将每个样品在n = 4生物学复制中生长,富集并单独注入LC-MS / MS系统。使用MaxQuant软件单独处理每个原始文件。该分析足以使检测到的磷酸水的数量饱和。

       磷素环境分析

      在“磷酸(HSTY)位点”中列出的磷酸圈具有至少0.75的定位概率,用于进一步分析R.以评估是否在蛋白质的柔性区域上进行磷酸化事件,存在于a中的氨基酸的相对发生计算磷酸水之前和之后的五个氨基酸的窗口 S.金黄色葡萄球菌, E. 科利 和人磷蛋白蛋白质。将所得氨基酸频率分成五组,即柔性(A / G / P),酸性(D / E),碱(K / R),芳族(F / W / Y)等。调查保护 S.金黄色葡萄球菌 在不同生物体上的磷酸水,将鉴定的磷蛋白映射回其相应的基因名称(Uniprot检索ID / Mapping工具)。 PSP数据库(下载5月8日,2020)也被映射回基因名称,并且对于MS数据和PSP数据库中的所有基因名称,两个组中的所有相应蛋白都对齐(MSA包可用 通过 生物体, http://www.bioinf.jku.at/software/msa/ (
      • Bodenhofer U.
      • Bonatesta E.
      • Horejš-kainrath C.
      • Hochreiter S.
      MSA:用于多个序列对齐的R包。
      ))使用具有默认设置的Clustalw算法。对于每个基因名称,通过计算整个对准的全保守氨基酸的分数来计算身份分数( IE。 ,在一个对齐的蛋白质序列中存在间隙降低了身份得分)。可以根据要求提供脚本。

      结果与讨论

       增强素染色细菌B.枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的磷酸肽鉴定

      可逆蛋白质磷酸化允许在改变碳可接近或pH变化的环境条件时快速有效的信号转导。这种适应对于不同宿主的细菌定植尤其重要,但也侵入并扩散到不同的组织后。最近,Potel. 等等。 (
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )从革兰氏阴性细菌的磷酸肽鉴定的优化样品制备。在这里,我们展示了该方案的延伸,用于含有革兰氏阳性细菌的应用,其含有厚的肽聚糖层,因此需要更严格的裂解方案。开发了一种三步裂解方案,用珠跳动和随后的超声处理使用椎间相色剂和洗涤剂来组合化学裂解和洗涤剂(参见 实验步骤)。在样品清洁和蛋白质消化后,富集磷肽 通过 Fe3+-imac并由LC-MS / MS分析(Fig. 1A)。优化最初在革兰氏阳性模型生物上进行测试 B. 枯草芽孢杆菌 168,在将优化方法应用于致病细菌的裂解之前 S. 金黄色葡萄球菌 (菌株的转座突变体Ne98 S.金黄色葡萄球菌 USA300 JE3含有不相关的表面蛋白质编码基因的破坏 SDRE. (看 实验步骤)))。用于革兰氏阳性细菌的优化裂解方案导致鉴定283磷肽(PS,Pt,Py和pH) B.枯草芽孢杆菌 (补充图。S1A, 补充表S2)。在过滤Antromeda定位概率时,在我们的研究中鉴定了146级蛋白质上的I类磷酸水。与Ravikumar的研究相比,这略有增加 等等。 (
      • Ravikumar V.
      • Shi L.
      • 克鲁格克。
      • 德鲁奇阿。
      • 塞尔C.
      • 表弟C.
      • Kobir A.
      • Mijakovic I.
      • MACEK B.
      定量磷脂蛋白酶组分析 枯草芽孢杆菌 揭示激酶PRKC和磷酸酶PRPC的新型基材。
      )( Fig. 1B)。为了 S. 金黄色葡萄球菌 改善更加引人注目。这里,在三种生物重复中至少两个中鉴定了3800种磷酸肽(PS,Pt,Py和pH),使其成为最大的磷化数据集 S.金黄色葡萄球菌 迄今为止,与垃圾最近的研究相比,增加了21倍的增加 等等。 ,(
      • 炼林
      • MaaβS.
      • 奥托阿。
      • Michalik S.
      • Morgenroth F.
      • 杰斯州U.
      • Hecker M.
      • BECHER D.
      Spectral library based analysis of arginine phosphorylations in 金黄色葡萄球菌.
      )仅鉴定173种磷酸肽(PS,Pt和Py) S.金黄色葡萄球菌 strain COL (补充图。S1B补充表S2)。还鉴定I类磷酸水(2852, Fig. 1C)与以前的工作相比,提高了17倍以上(
      • 炼林
      • MaaβS.
      • 奥托阿。
      • Michalik S.
      • Morgenroth F.
      • 杰斯州U.
      • Hecker M.
      • BECHER D.
      Spectral library based analysis of arginine phosphorylations in 金黄色葡萄球菌.
      )。为了确认这种改进因降低DNA / RNA污染而导致的,我们在MS2光谱中寻找330.06 m / z的诊断离子。如前所述,在样品制备期间使用DNase和苯并酶的使用降低了含有330.06m / z离子的MS 2光谱的百分比,对于人样品约为35%至8%,75%至13% 大肠杆菌,从而提高磷酸肽鉴定(
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )。对于革兰氏阳性细菌,污染量在类似的范围内;所有MS2光谱的3.5% B.枯草芽孢杆菌 和大约18%的MS2光谱 S.金黄色葡萄球菌 含有330.06 m / z离子(Fig. 1D)。相比之下,垃圾的所有MS2光谱的50% 等等。 (
      • 炼林
      • MaaβS.
      • 奥托阿。
      • Michalik S.
      • Morgenroth F.
      • 杰斯州U.
      • Hecker M.
      • BECHER D.
      Spectral library based analysis of arginine phosphorylations in 金黄色葡萄球菌.
      )研究含有330.06 m / z离子(Fig. 1D),揭示这些污染物的清晰结合。因此,通过使污染物与Fe的结合最小化,使用DNase和苯并酶在我们的优化样品制备方案中使用磷酸肽鉴定改善了革兰氏阳性细菌3+-imac列。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1实验工作流程与文献比较。 A,通过使用化学和机械裂解的混合物引入三步裂解来优化细胞裂解。在样品清理和消化后,使用Fe富集磷酸肽3+-imac列并分析 通过 LC-MS / MS。 B,识别的类I数量(Andromeda本地化得分>0.75)磷酸水(176) B.枯草芽孢杆菌 与最近的Ravikumar进行了比较 等等。 (
      • Ravikumar V.
      • Shi L.
      • 克鲁格克。
      • 德鲁奇阿。
      • 塞尔C.
      • 表弟C.
      • Kobir A.
      • Mijakovic I.
      • MACEK B.
      定量磷脂蛋白酶组分析 枯草芽孢杆菌 揭示激酶PRKC和磷酸酶PRPC的新型基材。
      )并显示1.3倍增加。 C总共鉴定了2852级I类磷化水osposites S.金黄色葡萄球菌 导致与垃圾相比增加17倍 等等。 (
      • 炼林
      • MaaβS.
      • 奥托阿。
      • Michalik S.
      • Morgenroth F.
      • 杰斯州U.
      • Hecker M.
      • BECHER D.
      Spectral library based analysis of arginine phosphorylations in 金黄色葡萄球菌.
      )。 D,含有诊断离子330.06m / z的MS2光谱的百分比,用于人细胞系, E.coli., S.金黄色葡萄球菌 , 和 B.枯草芽孢杆菌.

       金黄色葡萄球菌的磷酸盐分布

      真核生物和原核生物的磷酸盐分布在很大程度上不同。虽然约80%至90%的所有真核磷酸化位点都在丝氨酸上局部化,但丝氨酸的磷酸化仅占原核表中所有磷酸化事件的40%至60%,这取决于物种(
      • GE R.
      • 山W.
      细菌磷蛋白酶分析显示蛋白质磷酸化与细菌致病性之间的相关性。
      ,
      • Sharma K.
      • d'souza r.c.j.
      • Tyanova S.
      • Schaab C.
      • WiśniewskiJ.
      • Cox J.
      UltraDeep人磷蛋白质显示出Tyr和Ser / Thr的信号传导的明显调节性质。
      ,
      • 潘Z.
      • 王B.
      • 张Y.
      • 王Y.
      • 尤拉斯。
      • j
      • 刘Z.
      • 薛Y.
      DBPSP:原核生物中的蛋白质磷酸化位点的治疗数据库。
      )。除了明显的氨基磷酸化外,原核生物还表现出与真核生物相比的蛋白质组氨酸磷酸化的偏好。我们最近通过鉴定来自人细胞系的80%的磷酸化而达到丝氨酸的80%,相反,只有57% 大肠杆菌 peptides (Fig. 2, AB )(
      • Lemeer S.
      • Heck A.J.
      磷蛋白质数据爆炸。
      )。观察到类似的偏好 S.金黄色葡萄球菌,只有55%的磷酸化位点均为丝氨酸,但苏氨酸近30%(55%PS,29.6%Pt,7.3%Py和7.9%pH)。有趣的是, B.枯草芽孢杆菌 显示出更高百分比的丝氨酸磷酸化(73%PS,12.7%Pt,7.5 Py,6.7%pH(Fig. 2, CD),同意以前的磷蛋白酶研究 B.枯草芽孢杆菌 (
      • Ravikumar V.
      • Shi L.
      • 克鲁格克。
      • 德鲁奇阿。
      • 塞尔C.
      • 表弟C.
      • Kobir A.
      • Mijakovic I.
      • MACEK B.
      定量磷脂蛋白酶组分析 枯草芽孢杆菌 揭示激酶PRKC和磷酸酶PRPC的新型基材。
      ,
      • MACEK B.
      • Mijakovic I.
      • 奥尔森J.V.
      • GNAD F.
      • Kumar C.
      • Jensen P.R.
      模型芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷脂体。
      )。不仅是磷酸盐分布,而且在真核生物和原核生物之间的磷酸化多种磷酸化不同(
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )。在这里,我们可以确认革兰氏阳性细菌的多种磷酸肽类似于革兰氏阴性细菌 大肠杆菌 并有利于单独磷酸化的肽。实际上,我们发现超过90%的所有已识别的原核磷酸肽都是单磷酸化的(Fig. 2E),而真核生物显示出广泛的多种磷酸化肽。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2人细胞磷酸化特征的比较 (
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      ), 大肠杆菌 (
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      ), B.枯草芽孢杆菌 , 和 S.金黄色葡萄球菌. AD,鉴定的磷酸岩,I类磷酸水(Andromeda定位概率)的数量>鉴定为0.75)和磷蛋白以及丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸和组氨酸磷酸的分布。 E,单独,双重,三重,四等,和近型鉴定所有四种生物的磷酸化肽的百分比。 F,具有1,2,3,4,5,或更多四种生物的磷酸蛋白的百分比。
      有趣的是,我们可以表明这一点 S.金黄色葡萄球菌 还赞成多种磷酸化蛋白几乎与单磷酸化蛋白相同程度,而 大肠杆菌B.枯草芽孢杆菌 表现出单独磷酸化蛋白质的高偏好(Fig. 2F)。具有多种磷酸化位点的蛋白质能够产生不同的蛋白质常规,其能够满足差异功能,这允许对病原体的更复杂和精确的调节(
      • GE R.
      • 山W.
      细菌磷蛋白酶分析显示蛋白质磷酸化与细菌致病性之间的相关性。
      )。以前的工作表明,具有较小基因组大小和较少数量的细菌转录起始因子(所谓的Sigma因子)的物种显示更多多种磷酸化蛋白质,表明调节主要由PTMS在这些细菌中驱动(
      • GE R.
      • 山W.
      细菌磷蛋白酶分析显示蛋白质磷酸化与细菌致病性之间的相关性。
      )。 S.金黄色葡萄球菌 确实具有相当较小的基因组和略微数量的Σ因素与两者相比 大肠杆菌B.枯草芽孢杆菌。

       优化的样品制备允许识别总共74个潜在的STK1目标

      尽管长期以来假设原核生物主要用于蛋白质组氨酸磷酸化,但现在显然,Ser / Thr激酶也在蛋白质信号中发挥着重要作用(
      • Cozzone A.J.
      蛋白质磷酸化对细菌病原体毒力中丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的作用。
      )。取决于应变, S.金黄色葡萄球菌 包含16至18个TCS,但只有一个estks(
      • Junecko J.m.
      Transcribing virulence in 金黄色葡萄球菌.
      ,
      • Villanueva M.
      • 加西亚B.
      • 瓦尔J.
      • rapúnb.
      • Ruiz de los Mozos I.
      • Solano C.
      • MartíM.
      • PenadésJ.R.
      • 托莱多 - arana a。
      • LASA I.
      Sensory deprivation in 金黄色葡萄球菌.
      ,
      • 张A.
      • 杜尚B.
      Stp1 and Stk1: The Yin and Yang of vancomycin sensitivity and virulence in vancomycin-intermediate 金黄色葡萄球菌 strains.
      )。因此,我们进行了磷脂蛋白酶研究以阐明STK1的靶点以及同源磷酸酶STP1。 HERETO,从内布拉斯加州转座子突变体文库(NTML)中获得的转座子突变体NE217和NE1919(
      • FEY P.D.
      • endres J.L.
      • yajaala v.k.
      • widhelm t.j.
      • Boissy R.J.
      • Bose J.L.
      • 拜耳K.W.
      A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential 金黄色葡萄球菌 genes.
      )被使用。 NE217和NE1919具有灭活的基因破坏 PKNB. (编码STK1)或编码蛋白质磷酸酶2C畴蛋白STP1的基因编码。这些突变体将分别进一步称为STK1突变体和STP1突变体。 NE98用作对照样品,允许分析与这两种酶的活性相关的磷脂体变化。通过PCR,全蛋白酶和磷脂蛋白酶分析证实基因破坏和不存在各个突变体中的三种蛋白质(补充图S2S3 )。
      确定更改 S.金黄色葡萄球菌 突变体,三种菌株(n = 4个生物重复)培养,裂解和消化。使用Fe富集磷肽3+-imac列并分析 通过 LC-MS / MS。由于STK1和STP1被报告为作家橡皮擦对(
      • 郑W.
      • CAI X.
      • 李S.
      • 李Z.
      Autophosphorylation mechanism of the Ser/Thr kinase Stk1 from 金黄色葡萄球菌.
      ),激酶或磷酸酶的潜在靶标应显示相反的行为。因此,与STK1突变体中的对照和不足或甚至不存在于STK1突变体中的磷酸水超过STP1突变体,并且显示出完全蛋白质组水平没有显着变化最有可能是这些酶的基质(补充图S4)。我们在STP1突变体和对照中鉴定并定量了2716个磷酸水(见 实验步骤, Fig. 3, 补充表S3)。总共有15%的网站都显着变化(Tukey HSD p-价值cutoff of 0.05 and a fold change cutoff of x¯±σ 数据)。总共241种这些磷酸盐在与对照相比的STP1突变体中显着超过了167个磷酸水,而在STP1突变体中(Fig. 3B)。在完全蛋白质组水平上,量化了1373种蛋白质,其中两个条件之间有3.7%显着差异(Fig. 3A, 补充表S4)。因此,大多数变化都在磷酸膜水平上而不是蛋白质组水平,这在不存在STK1或STP1时符合我们的期望。 50s核糖体蛋白L9(RPLI)的S92上的磷酸化表现出显着的超额陈述(Tukey HSD p-价值<0.01)在STP1突变体与对照进行比较,而这种磷酸化不能用于STK1突变体。在完全蛋白质组水平上,根据Tukey HSD,该蛋白质不会显着变化(Fig. 3C)。对推定的丝氨酸蛋白酶HTRA(SAUSA300_1674的磷酸盐PT12,观察到相同的行为(SAUSA300_1674, Fig. 3D)。总共鉴定了20种磷酸水,显示出这种特征(见 表格1补充图S5S6)。此外,在STP1突变体中专门鉴定了54个磷酸盐,而蛋白质水平在全蛋白质组水平上没有显着影响或未检测到(表2.)。因此,LFQ对三个突变体(STP1,STK1和CTRL)的定量分析允许鉴定74电位STK1 / STP1相关磷酸水,其分布在鉴定的磷酸肽的整个动态范围内以及磷蛋白(补充图S7 )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3鉴定的磷酸化和蛋白质变化 S.金黄色葡萄球菌. A,Volcano图比较STP1突变体和CTRL之间的蛋白质,鉴定51个具有显着变化的蛋白质(Tukey HSD p-价值cutoff of 0.05 and a fold change cutoff of x¯ 数据的±σ)。二十五个蛋白质不足(粉红色点),26个蛋白质覆盖(绿点 )。 B,Volcano Plot比较磷酸化位点,识别STP1突变体和CTRL之间的408变化(Tukey HSD p-价值cutoff of 0.05 and a fold change cutoff of x¯ 数据的±σ)。两百四十 - 一种磷酸座位效果(粉红色的小点)和167种磷酸水覆盖(绿点 )。 C,与CTRL相比,STP1突变体中RPL中S92磷酸化的过度陈述(Tukey HSD p-价值<0.01),在STK1突变体上没有磷酸化(右侧面板)。在三个突变体之间没有观察到蛋白质丰度的变化(左侧面板 )。 D,与CTRL相比,STP1突变体中SAUSA300_1674对SAUSA300_1674的THR12磷酸化过度陈述(Tukey HSD p-价值<0.05)并且在STK1突变体中没有磷酸化(右侧面板)。在蛋白质组水平上,在三个突变体中没有检测到显着的变化(左侧面板)。对于所有条形图,中心值表示N = 4生物独立复制的标准偏差(S.D.)表示平均值和错误。
      表格1磷酸水超过STP1突变体/ CTRL,但在STK1中未识别,没有显着变化对全蛋白质组水平
      基因 uniprot ID.蛋白质名称蛋白质内的位置
      Ftna. Q2FFK2细菌不血脂铁蛋白T98
      地图 A0A0H2XG88.甲硫氨酸氨基肽酶(MADAP)T153
      RPL. Q2FKP150s核糖体蛋白L9S92
      RPLQ. Q2FER650s核糖体蛋白L17T33
      ruvb. Q2FG86Holliday结合ATP依赖性DNA Helicase RuvbS9
      Sausa300_0236.a0a0h2xgk7.PTS系统,IIBC组件S475
      Sausa300_0905.a0a0h2xgc0.推定的腺苷酸环酶T3
      Sausa300_1230a0a0h2xis0.无表达蛋白质T5
      Sausa300_1240a0a0h2xft2.UPF0154蛋白SAUSA300_1240T80
      Sausa300_1674.a0a0h2xgv4.推定的丝氨酸蛋白酶htraT12
      Sausa300_1856.a0a0h2xhr8.无表达蛋白质T89
      Sausa300_1909.a0a0h2xey2.无表达蛋白质T143
      secA1Q2FIN8蛋白质易位酶亚单位SENA 1S702
      secA1Q2FIN8蛋白质易位酶亚单位SENA 1S565
      表2.磷酸水超过STP1突变体/ CTRL,但在STK1中未识别,没有识别全蛋白质组
      基因 uniprot ID.蛋白质名称蛋白质内的位置
      PKNB. a0a0h2xgg5.蛋白质激酶T166
      PKNB. a0a0h2xgg5.蛋白质激酶T288
      PKNB. a0a0h2xgg5.蛋白质激酶T314
      Sausa300_1574Q2FGA9UPF0297蛋白质SAUSA300_1574T7
      RPLS HMPREF0776_2241A0A0E1VS6350s核糖体蛋白L19(片段)T11

       磷蛋白酶分析揭示了STK1的新目标

      我们鉴定了传感器蛋白激酶HPTS(HPTRS TCS的一部分)作为STK1的靶标(PT272, 补充表S3)。之前的研究表明,STK1磷酸化至少两种TCSS的RRS:GRARS和VRARS(
      • 弗里曼姆
      • 威廉姆斯G.D.
      • muzamal U.
      • 猎人H.
      • Siu K.W.M.
      • Golemi-Kotra D.
      两种独特的磷酸化驱动的信号通路串扰在金黄色葡萄球菌中,用于调节细胞壁电荷:STK1 / STP1符合GRASR。
      ,
      • Canova M.J.
      • 巴隆尼亚G.
      • Brelle S.
      • Cohen-Gonsaud M.
      • Bischoff M.
      • Molle V.
      A novel mode of regulation of the 金黄色葡萄球菌 Vancomycin-resistance-associated response regulator VraR mediated by Stk1 protein phosphorylation.
      )。随着我们的HPTS作为特定目标的识别,我们将STK1调控的TCSS的曲目扩展到HPTR。但与GRARS和VRAR相比,RR磷酸化,这里STK1磷酸化了传感器样组氨酸激酶HTP。 HPTRS属于己糖磷酸盐输送系统(HPT),其部分原因是可以在不同宿主生物之间变化的细胞外糖的摄取(
      • 公园J.Y.
      • kim J.W.
      • 月亮B.Y.
      • 李杰。
      • 福蒂斯y.j.
      • 奥斯汀F.W.
      • 杨S.J.
      • SEO K.S.
      Characterization of a novel two-component regulatory system, HptRS, the regulator for the hexose phosphate transport system in 金黄色葡萄球菌.
      ,
      • 杨Y.
      • 胡米
      • yu K.
      • 曾X.
      • 刘X.
      基于质谱的蛋白质组学方法,用于研究致病细菌宿主相互作用。
      ,
      • 芦苇准备
      • 奥尔森S.
      • Brees D.f.
      • 格里芬C.E.
      • 树林r.a.
      • 戴维斯P.J.
      • Kachman S.D.
      • Adamec J.
      • Somerville G.A.
      Coordinated regulation of transcription by CcpA and the 金黄色葡萄球菌 two-component system HptRS.
      ,
      • 舒马赫M.A.
      • 艾伦G.S.
      • Diel M.
      • Seidel G.
      • Hillen W.
      • Brennan r.g.
      磷蛋白HPR-SER46-P转录调节剂CCPA的构建控制结构基础。
      )。因此,能够在可用的碳源之间快速有效地切换,对于细菌的存活和定植至关重要。
      HPTR的转录由Catabolite Concem蛋白A(CCPA)调节。据报道,CCPA在T18和T33上以STK1依赖性方式磷酸化 S.金黄色葡萄球菌 strain N31540。两种磷酸水都位于CCPA的DNA结合位点内,磷酸化似乎干扰DNA结合(
      • leiba J.
      • Hartmann T.
      • cluzel m. -e.
      • Cohen-Gonsaud M.
      • Delolme F.
      • Bischoff M.
      • Molle V.
      A novel mode of regulation of the 金黄色葡萄球菌 catabolite control protein A (CcpA) mediated by Stk1 protein phosphorylation.
      )。在这里,我们确定了八个丝氨酸和苏氨酸磷酸酯,包括Pt18,但在三个突变体之间没有任何这些位点显着变化。因此,我们假设STK1 / STP1可能不是CCPA磷酸化的唯一调节因子。
      还可以发生CCPA激活 通过 糖依赖性方式,涉及含组氨酸蛋白(HPR)(
      • leiba J.
      • Hartmann T.
      • cluzel m. -e.
      • Cohen-Gonsaud M.
      • Delolme F.
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      细菌中的碳分解代谢物抑制:许多方式充分利用营养素。
      )。在所有三个突变体中鉴定PS46-HPR,没有任何重大变化。然而,在S294上仅在STP1突变体中鉴定HPRK / P的磷酸化,而不改变蛋白质表达水平。因此,我们表明STK1的HPRK / P的磷酸化不会对S46上的磷酸化HPR的能力产生负面影响。尽管STK1似乎在CCPA调节机制内磷酸化重要蛋白质,但我们不能将这些磷酸化事件与CCPA调节的丰富蛋白质的变化相关联。尽管如此,我们的数据表明了广泛的监管 CCPA 调节件在多个层面上,强调其重要性。
      最后,伸长因子Tu(EF-TU)是具有在STP1突变体中专门鉴定的磷酸族蛋白质之一。先前据报道,EF-TU被STK1磷酸化,但没有关于磷酸化位点的信息。这里,PT34和PT257被鉴定为EF-TU上的两种磷酸水(补充表S3)。 EF-Tu是最丰富的细菌蛋白质之一,包括三个功能结构域,域I(氨基酸1-199),包括GTP / GDP结合结构域,结构域II(氨基酸200-299)和结构域III(氨基酸300-394)调节域I的活性(
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      )。该蛋白质的主要和最研究功能正在介导蛋白翻译伸长率。萨吉特 等等。 (
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      结核分枝杆菌伸长因子Tu与GTP的相互作用通过磷酸化调节。
      )表明了这一点 结核分枝杆菌 EF-Tu在11个苏氨酸残基上由STK1同源物磷酸化。 PT259中的一种是EF-TU中鉴定的PT257同源 S.金黄色葡萄球菌。但是,萨吉特 等等。 无法确定磷酸化对蛋白质合成的负面影响 玉米菌菌。在我们的研究中,对于STK1和STP1突变体,观察到使用全培养基的血琼脂平板或液体培养物中没有生长缺陷,这与先前的研究(
      • Débarbouillém.
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      • debarbouille m.
      • DRAMSI S.
      • Dussurget O.
      • 等等。
      Characterization of a serine/threonine kinase involved in virulence of 金黄色葡萄球菌.
      )。鉴于EF-TU在蛋白质合成中的基本作用,它仍然难以捉摸STK1 / STP1影响EF-TU调节。
      以前的工作表明,STK1和STP1突变体显示细胞划分和细胞壁结构的缺陷,影响抗生素易感性(
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      Modulation of cell wall structure and antimicrobial susceptibility by a 金黄色葡萄球菌 eukaryote-like serine/threonine kinase and phosphatase.
      )。随着新的STK1 / STP1基板的识别,未来的研究可以更关注这些靶蛋白和它们的磷酸化位点如何参与这些细胞过程。

       广泛的S / T磷酸化表明S / T激酶活性在S.UUREUS菌株USA300中

      鉴定超过3000个磷酸水,位于Ser和Thr(Fig. 1D)表示S / T激酶信号和活动远高于先前预期的。通过删除唯一已知的ESTK,STK1,我们仍然可以识别大约2700个磷酸水,位于SER / THR上(见 补充图S8, 补充表S2)。此外,仅在Ser或Thr上局限的2977个磷酸盐的量化仅74个潜在的STK1靶的定量提出了这些其他磷酸水源的来源的问题。这 S.金黄色葡萄球菌 菌株USA300具有另外两个丝氨酸蛋白激酶,HPRK和RSBW。但是,目前报告的这些激酶的目标数量低(
      • Miyazaki E.
      • 陈准。
      • ko c.
      • Bishai W.R.
      The 金黄色葡萄球菌 rsbW (orf159) gene encodes an anti-sigma factor of SigB.
      )。这表明了 S.金黄色葡萄球菌 USA300必须具有其他目前未知的SER / THR激酶。
      为了支持这一假设,我们试图识别特定的基序,并分析佩尔和PTH中的侧翼氨基酸(±5个氨基酸),并将其与研究良好的人磷酸化数据(Hela磷酸溶解物(
      • Potel C.M.
      • 林米 -
      • heck a.j.r.
      • Lemeer S.
      击败Fe 3 + -imac磷酸富集的主要污染物。
      )))。正如预期的那样,我们可以看到脯氨酸和丝氨酸的较高频率,与人细胞系中的磷磷酸盐相邻。没有观察到这种模式 S.金黄色葡萄球菌大肠杆菌 如果酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)以及碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)略微邻近磷酸盐(见 补充图S9)。我们的分析还直接表明所鉴定的磷酸肽没有明显的基质,通过使用ICelogo的富集的基序(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )或plogo(
      • o'shea J.P.
      • Chou m.f.
      • Quader S.A.
      • Ryan J.K.
      • 教堂。
      • 施瓦茨D.
      plogo:一种可视化序列图谱的概率方法。
      )。因此,大多数鉴定的磷酸化事件 S.金黄色葡萄球菌 似乎在高度特定的蛋白质主题中尚未发生。此外,我们无法使用MEME获得潜在的磷酸化图案(
      • Bailey T.L.
      • 博登
      • buske f.a.
      • Frith M.
      • 格兰特C.E.
      • Clementi L.
      • ren J.
      • 李W.W.
      • 贵族W.S.
      MEME SUITE:主题发现和搜索的工具。
      )。然而,我们不能排除在大量分析的磷酸水上埋入的更具体的主题。
      我们还将在本研究中确定的已识别的普遍存在网站与DBPSP中的条目进行了比较(
      • 潘Z.
      • 王B.
      • 张Y.
      • 王Y.
      • 尤拉斯。
      • j
      • 刘Z.
      • 薛Y.
      DBPSP:原核生物中的蛋白质磷酸化位点的治疗数据库。
      )。在这里,我们可以根据其基因名称匹配286磷蛋白。没有基因名称的蛋白质,但只有基因座位ID,不包括在分析中。从286个基因中,我们鉴定了在不同物种之间保守的15个磷酸盐。这些蛋白质的对准显示保护热点(超过五个随后的氨基酸,粉红色),特别是围绕保守磷(绿色)(Fig. 4, 补充图S10)。其中一个保守的磷酸水,PS62,在GPMI上(Fig. 4B已知是磷素中间体(Uniprot,Unirule:Ur000100531);然而,这是唯一鉴定的网站作为代谢磷素中间体。尽管我们只能在超过3000个鉴定的磷酸盐中映射到已经报告的磷酸化事件,但观察到的保护热点特别强调高度保护,特别是在磷酸水上。此外,我们还可以识别保护热点,我们识别出磷酸水 S.金黄色葡萄球菌,但在其他物种中没有检测到磷酸化(Fig. 5)。在鉴定的磷酸盐中,这种相当低的重叠,但是某些区域的高度保守是细菌磷蛋白蛋白酶覆盖率的反映。这清楚地突出了该研究的重要性,其中改善的样品制剂显示出对细菌磷酸化介导的信号传导的极端低估。尽管重叠低,但我们的结果仍然表明,即使没有识别出特定的主题,磷酸化事件也不是随意的。在使用NCBI蛋白爆炸的同源搜索时寻找额外的冲击(//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)使用pfam与图案搜索(
      • El-Gebali S.
      • 朦胧J.
      • Bateman A.
      • 艾迪S.R.
      • 卢西亚岛A.
      • 陶器S.C.
      • Qureshi M.
      • Richardson L.J.
      • Salazar G.A.
      • 聪明的A.
      • Sonnhammer e.l.l.
      • hirsh l.
      • 圣骑士L.
      • Piovesan D.
      • Tosatto S.C.E.
      • 等等。
      PFAM蛋白质家族数据库于2019年。
      ),我们没有获得任何结果。因此,我们建议彻底表征 S.金黄色葡萄球菌 蛋白质组,以鉴定新的激酶。那些激酶可以在该病原体的毒力和多功能性中发挥重要作用,因此鉴定这些激酶可以有助于理解和打击其致病性。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4用NCBI BLASTP获得的序列对齐(//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 搜索 A ,dps, B,GPMI和 C,AHPC。 突出了保守的磷酸水 绿色 和高保(超过五个后续氨基酸)的区域被突出显示 粉色的 。 DPS中的PS39是保守的 C. Jejuni 甚至到目前为止没有报告磷酸化, L.单核细胞增生 在此位置包含S / T替换。 PS62在GPMI中被保守 H. salinarum., 大肠杆菌, L.单核细胞增生, B.枯草芽孢杆菌和r.paulustris。 AHPC中的PS148是保守的 大肠杆菌。所有三种蛋白质在磷酸化物质周围显示出高度保护。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5用NCBI BLASTP获得的RPL序列对准(//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )。 SER / THR磷酸酯在绿色和高保守区域(超过五个后续氨基酸)以粉红色突出显示。总的来,根据DBPSP,确定了七种磷酸盐,其中三(PS13,PS21和PS38)保存(
      • 潘Z.
      • 王B.
      • 张Y.
      • 王Y.
      • 尤拉斯。
      • j
      • 刘Z.
      • 薛Y.
      DBPSP:原核生物中的蛋白质磷酸化位点的治疗数据库。
      )和NCBI BLASTP。

      数据可用性

      支持本研究结果的所有原始数据都通过Proteomexchange通过具有数据集标识符PXD020226的骄傲伙伴存储库存放在Proteomexchange中。

      利益冲突

      作者声明没有竞争的财务利益。

      致谢

      我们承认Pieter Van Breugel进行技术援助。 S.L.通过Vidi Grant(项目723.013.008),承认荷兰科学研究(NWO)的支持。

      作者捐款

      N.P.,N.M。v。S.和S. L.设计了实验; N.P.进行实验; N. M. V.S.和S. L.监督实验; N.P.,S. V.D。 L.和H.W.P.V。D. T.分析了数据; N.P.,N.M.V.S.和S. L.写了稿件。所有作者讨论了结果并对手稿评论。

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