从质谱数据计算糖蛋白相似之处

开放访问发布:1月05,2021 DOI: //doi.org/10.1074/mcp.R120.002223

      强调

      • 可以使用HCD LC-MS明确地鉴定单糖基化肽。
      • 为了计算糖蛋白相似性,量化所有糖肽糖糖族。
      • 可以使用Tanimoto系数来计算糖蛋白相似之处。
      • 相似性计算需要糖蛋白酶LC-MS数据的高再现性。
      通过分泌途径中的生物合成步骤发生复合蛋白质糖基化,其产生结构和微观性的分泌途径。所有寿命形式所需的糖基化多样化并适应蛋白质相互作用,结合细胞表面和细胞外环境的相互作用。因为这些生物学效应来自结构和功能的异质性,所以有必要衡量其作为探索性质的一部分的变化。然而,通常,蛋白质组学的假设是后期修饰是可以使用基因组以作为模板进行建模的离散添加,其不适用于蛋白质糖基化。相反,有必要量化每种甘油化合物的糖基化分布,并将该信息汇集成在给定的生物系统中存在的成熟糖蛋白的群体。迄今为止,用于分配单糖基化肽的质谱法是良好的。但是必须准确地量化糖基化异质性,以便衡量在生物过程中发生的改变。任务是尽可能准确地量化糖基化肽形式,然后将适当的生物信息学算法应用于微观和宏观相似性的计算。在本文中,我们总结了当前蛋白质定量方法,因为它们适用于该糖蛋白相似性问题。

      图形概要

      关键词

      缩写:

      AGP. (α1-酸糖蛋白 ), CCS. (碰撞横截面 ), DIA (独立数据分析 ), ETD. (电子转移解离 ), ethcd. (电子转移更高的能量碰撞解离 ), FDR. (假发现率 ), HCD. (更高能源的碰撞解离 ), MRM. (多重反应监测 ), PRM. (并行反应监测 ), PTM. (后期修改 ), QTOF. (Quadrupole飞行时间 ), TDA. (目标诱饵分析)

      蛋白质糖基化的生物学作用

      复杂的分致蛋白质糖基化在内质网中用作蛋白质折叠质量控制和分泌途径中分类的手柄。初始聚糖核心通过生物合成酶在Golgi装置中阐述,其功能反射基底浓度,动​​力学和运输效果的复杂余额。得到的成熟蛋白显示糖基化的宏观和微均质性,其产生了成熟分子蛋白质族的群,具有结构和功能的分布(
      • 丹尼斯J.W.
      遗传码不对称通过使用后期修改进行实验支持多样性。
      )。这种糖基化异质性是一种进化机制,由此阐述了与凝集素结构域结合的蛋白质功能,从而在细胞表面和细胞外基质中引起组织网络,通过细胞与周围环境相互作用,其他细胞和病原体(
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      细胞糖基化的多级调节:从基因到结构的转录物。
      )。但是,仍然有关于糖蛋白特异性特异性糖基化如何根据不同生物系统的功能要求而变化的缺乏信息。
      该审查描述了在完整的糖肽上从自下而上的质谱实验中量化糖蛋白特异性糖基化的变化的目标进展。我们强调使用生物样品的无标记不相机凝结蛋白的无标记碰撞分离分析单糖基化肽。综述糖肽量化方法的最新进展,包括代谢标签方法,已审查其他地方(
      • delafield d.g.
      • Li L.
      甘草和糖肽定量分析方法的最新进展。
      )这里没有描述。

      使用蛋白质组学方法分配糖肽

      来自串联质谱的糖肽的算法分配已涵盖近期评论(
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      自动糖蛋白分析的算法和设计策略。
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      糖蛋白位点特异性糖基化在样品队列中的自信比较的视角。
      )。简而言之,糖肽解离以产生诊断糖氧离子,来自前体离子的单糖的中性损失,以及肽骨架产物离子。含有所有三种类型产品离子的糖肽串联质谱通常会获得最自信的作业。
      关于仪器,需要区分光束型碰撞解离和离子阱共振局部解离。梁型解离在三重四极,Quadrupole飞行时间(QTOF)和四极炮轨道仪器中发生。前体离子和碰撞气体之间的多碰撞事件导致振动激发和解离。可以通过调节碰撞能量来控制前体离子的解离的程度。产物离子可能发生随后的解离。虽然在术语“更高能量碰撞解离(HCD)”之前使用光束型碰撞解离,但是在本综述中将使用HCD。在离子阱仪器中发生共振碰撞解离,由此指定的前体离子 m / z. 窗口是焦点兴奋的。得到的产品离子,具有不同 m / z. 来自前体离子的值,通过离子捕获浴气体快速冷却,导致与光束型解离的观察到的下离子的较低程度。离子陷阱相对于QTOF和orbitrap分析仪具有低质量精度。注意,离子阱 - 轨道仪器可用于产生具有高质量精度的光束型解离(HCD),具有低质量精度离子阱检测的前体的高度精度横谱检测或共振碰撞解离。
      目前,已经建立了高分辨率光束型碰撞解离串联质谱法(此处称为HCD),用于分配在糖肽上存在的糖基化成分(
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      )。糖苷键的解离比肽骨架的解离更容易地发生,导致甘草发生异化改性(PTM)的解离的情况改变了整个产物离子图案。由于传统的肽数据库搜索算法和定量工具不识别这种糖苷粘合裂解产物离子,因此糖肽需要专门的工具。在用单一的肽的情况下 N - 或者 O-glycan,HCD串联质谱可以定义肽序列,聚糖组合物和糖基化的位点。经常引用生产高质量HCD串联质谱的实践包括在串联MS之前的糖肽的富集(
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      Pglyco 2.0使精密N-糖蛋白酶具有综合质量控制和一步质谱法,用于完整糖肽鉴定。
      )。相比之下,其他人使用了单个高HCD离解能和长LC梯度以鉴定冠状病毒S-蛋白糖基化(
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      )最近的糖蛋白质出版物中引用了软件程序。
      在一个以上的糖脓肿 N - 或者 O在HCD串联MS中观察到的糖甘油的存在,通常会阻止分配在单个综合料体处存在的聚糖组合物。基于ETD的方法已被用于常量糖基化的 O-glycopeptides(
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      关于复杂完整O-糖肽混合物的高通量表征的状态报告。
      )。此外,β-O-GLCNAC改性SER和THR残基尤其是不稳定的,需要特殊的方法考虑,如最近的评论所述(
      • 马杰。
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      质谱法分析蛋白质O-甘氨酸。
      )。出于本讨论的目的,β-O-GlcNAC组在碰撞解离过程中容易分离,使得难以分配糖基化的位点(
      • 王Z.
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      通过化学/酶标记,光化学切割和电子转移解离质谱法组合通过组合富含N-乙酰葡糖胺的富集和位点测绘。
      )因此,优选基于ETD的方法(
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      通过使用化学酶标记,无铜咔哒化学,还原性切割和电子转移解离质谱法,通过组合的o-glcnac映射。
      )。紫外线光探测还显示出对β-分析的许多希望O - 甘油基化肽(
      • Escobar E.E.
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      使用紫外线光散质谱法在蛋白质中的O型N-乙酰甘氨酸胺位点的精确映射。
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      )。电子转移解离(ETD)可在许多商业质谱仪上获得,原则上,生产详细的肽骨架解离,比观察到碰撞解离的多种聚糖解离程度。为了获得最佳结果,必须对ETD产生的离子的补充激活是单独的电荷损失离子所必需的。可用的方法包括使用补充碰撞激活(
      • SABA J.
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      通过使用更高能量的碰撞解离式精确的质量 - 产物依赖性电子转移解离,提高糖肽分析的生产率。
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      驻留型糖基化肽下下分析的碰撞和电子的解离模式的比较。
      ),通常被称为电子转移更高能量碰撞解离(ethcd)和活化的ION ETD(
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      高泡孔 - 绕轴 - 线性离子捕获杂交质谱仪上活化离子电子转移解离的实施。
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      )。由于对糖肽聚糖的破碎,碰撞解离方法确定肽上的整体聚糖组合物。在有利的情况下,可以从糖基化肽骨架产物离子分配糖基化的部位。然而,如果存在多于一种聚糖,则碰撞解离通常定义整个聚糖组合物,但不能将组合物分化在单个肽位点(
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      复杂蛋白多糖的深度测序:一种新的糖胺聚糖连接肽的高覆盖和特异性鉴定的新策略。
      )。基于ETD的方法产生肽骨架的优先性切割,可用于分配常量糖基化肽(
      • 莱利n.m.
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      • Driesenen M.D.
      • Bertozzi C.R.
      对于N-和O-糖肽而不同的解离方法不同。
      )。由于离子离子反应和补充活化时间,ETD方法的占空比低于HCD。因此,基于来自HCD光谱的氧化氧铵离子的存在触发ETD光谱来保护分析仪时间(
      • SABA J.
      • DUTTA S.
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      通过使用更高能量的碰撞解离式精确的质量 - 产物依赖性电子转移解离,提高糖肽分析的生产率。
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      较高的能量碰撞解离(HCD)产物离子触发的电子传递解离(ETD)质谱分析N-连接糖蛋白。
      )。由于大多数公开可用的糖蛋白质数据集使用HCD方法并定义单糖基化肽,我们将重点关注这方面的审查。

      糖肽鉴定方法

      糖肽串联质谱的解释取决于肽和聚糖部分解离的完整性。为了碰撞解离,这取决于聚糖,肽序列和前体离子电荷状态的大小(
      • Hinneburg H.
      • Stavenhagen K.
      • Schweiger-Hufnagel U.
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      销毁艺术:优化基于糖肽的糖蛋白酶糖蛋白酶(Q-TOF)仪器中的四极型 - 时间中的碰撞能量。
      )。控制糖肽的肽和甘油部分的假发现率(FDR)是很重要的(
      • 刘M.Q.
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      Pglyco 2.0使精密N-糖蛋白酶具有综合质量控制和一步质谱法,用于完整糖肽鉴定。
      )。为此,有必要模拟糖肽的肽+ Y离子的模式与糖肽的模式与经验无效模型进行比较。为了尽可能有效地解散许多不同的糖肽,研究人员使用了阶梯式碰撞能量(
      • Hinneburg H.
      • Stavenhagen K.
      • Schweiger-Hufnagel U.
      • 彭莱利S.
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      • 等等。
      Pglyco 2.0使精密N-糖蛋白酶具有综合质量控制和一步质谱法,用于完整糖肽鉴定。
      )以串联MS选择的前体离子数量的牺牲品。如图所示 表格1 ,存在许多单糖组合,可以导致糖肽的模糊串联MS分配。
      表格1 单糖组合可以导致模糊的串联MS分配
      糖1质量(DA)糖2质量(DA)错误(da)
      NeuAc. 291.0954 f 2292.1151.02
      Neuac,NH.3 (adduct)308.121十六进制,FUC308.1100.011
      赫奈克 2 , 所以 3 (substitution)486.115 十六进制 3486.1580.0429
      赫奈克 2,FUC,Neuac21134.407 十六进制 71134.3690.037
      Neuac,Hex.453.148Neugc,FUC453.1480.0
      为了增加支持对肽的给定聚糖的证据,研究人员使用了色谱保留时间建模(
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      相对保留时间估计通过LC-MS / MS改善了N-糖肽鉴定。
      )。使用反相色谱法,已知将单糖残基添加到糖肽聚糖中,诱导保持时间一致(
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      通过使用更高能量的碰撞解离式精确的质量 - 产物依赖性电子转移解离,提高糖肽分析的生产率。
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      驻留型糖基化肽下下分析的碰撞和电子的解离模式的比较。
      )。保留时间偏移与相对于相同色谱系统中的裸肽的渗透肽的疏水性的改变有关(
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      活化的离子电子转移解离使全面的上下蛋白质碎裂能够。
      )。我们开发了一种用于糖肽的线性建模方法,并将其应用于两个公布的研究 N-glycopeptides(
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      相对保留时间估计通过LC-MS / MS改善了N-糖肽鉴定。
      )。我们表明,由于不足或含糊不清的单糖和加合物组合,该模型能够纠正Glycan作业中的常见错误。我们还确定糖肽产生碰撞横截面的线性趋势线(CCS) 相对 质量计费比(
      • 格拉斯蛋白R.S.
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      • Zaia J.
      • Costello C.E.
      构建糖肽,聚糖和IM-MS测定的肽的碰撞横截面值数据库。
      )。这些观察结果支持结论,糖肽CCS的建模可用于增强糖肽的作用。
      应用目标诱饵分析(TDA)(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )对于糖肽需要产生合适的诱饵。 TDA的一个关键假设是靶和诱饵的得分模式在很大程度上等同于被认为是阳性或真实的东西的阈值。如果两组在此阈值前得分良好的分歧,则假设已破坏,TDA低估FDR。糖肽的适当诱饵必须产生假得分,直至现实的阈值。在TDA中使用的诱饵糖肽可以采用几种形式。一些软件,如glycresoft(
      • Klein J.
      • Carvalho L.
      • Zaia J.
      网络平滑对甘草LC-MS分析的应用。
      ),使用具有相同甘油质量的逆转肽,糖化物组合物没有变化;这使得依赖于FDR检测的肽离子的结果。 pglyco软件(
      • 刘M.Q.
      • 曾温
      • 方P.
      • 曹W。 Q.
      • 刘C.
      • 燕G.Q.
      • 张Y.
      • 彭C.
      • 吴j.q.
      • 张X.J.
      • 涂H.J.
      • Chi H.
      • 太阳r.x.
      • Cao Y.
      • 董M.Q.
      • 等等。
      Pglyco 2.0使精密N-糖蛋白酶具有综合质量控制和一步质谱法,用于完整糖肽鉴定。
      ,
      • 曾温
      • 刘M.Q.
      • 张Y.
      • 吴j.q.
      • 方P.
      • 彭C.
      • 聂王子。
      • 闫佳
      • 曹W。
      • 刘C.
      • Chi H.
      • 太阳r.x.
      • 黄C.C.
      • 他是的
      • 杨P.
      pglyco:通过使用HCD-和CID-MS / MS和MS3鉴定完整的N-甘肽的管道。
      )在产生逆转肽和未改性的聚糖的理论片段后,使用质量转移产生诱饵;它的继任者Pglyco2进一步逐步,并使用肽和聚糖FDR的联合与糖肽FDR减去作为重叠的重叠;这是全面的,但像GlycreSoft一样,在计算重叠FDR时分析是组成无关的,运行去除假糖肽的风险。更复杂的实现可以帮助调整此类,例如置换生成类似质量的新聚糖;允许的和非乳糖诱饵可以与逆转的肽和未反向的肽组合,以产生更全面的诱饵,可以组合使用,以确保更完全核对误报。这是在GlycreSoft MultiPart搜索选项中提供的。 glycopep评估员(
      • 朱诗。
      • 苏X.
      • 去E.P.
      • Desaire H.
      新的糖蛋白软件软件,Glycopep评估器产生诱饵糖肽De Novo,并为小型数据集进行准确的假发现速率分析。
      )通过在一组规则下产生肽和聚糖,产生对靶糖肽具有异质量的糖肽,其通过在一组规则下粗略地匹配靶标的质量。这可以创造成功的诱饵,但它冒着创造诱饵的风险,这实际上是真正的阳性而不是误报。一些软件(
      • 伯尔尼姆。
      • kk y.j.
      • Becker C.
      否决:晚期肽和蛋白质识别软件。
      ,
      • plasky d.a.
      • yu f.
      • TEO G.C.
      • nesvizhskii a.i.
      使用Msfrgager-Glyco快速综合的N-和O-糖蛋白酶分析。
      )完全逆转蛋白质,并找到新的血糖系和胰蛋白酶消化。挑战是,这些挑战可以在质量和一般组合物中偏远,以类似于靶组中的任何糖肽。 glycofragwork(
      • Mayampurath A.
      • yu c.y.
      • 歌曲E.
      • 巴兰J.
      • Mechref Y.
      • 唐H.
      用于鉴定复杂样品中完整糖肽的计算框架。
      )使用线性判别分析结合CID和ETD评分系统,以产生单个TDA样评分。

      糖肽量化

      如(
      • carr s.a.
      • Abbatiello S.E.
      • Ackermann B.L.
      • 博赫斯C.
      • Domon B.
      • 德意曲e.w.
      • 授予R.P.
      • Hoofnagle A.N.
      • r h.u.
      • Komen J.m.
      • Liebler D.C.
      • 刘涛。
      • 麦克莱恩B.
      • MANI D.R.
      • 曼斯菲尔德E.
      • 等等。
      生物学和药物中的靶向肽测量:使用拟合方法的质谱法的质谱型测定显影的最佳实践。
      ),使用无标记或异级标记的探索性蛋白质组学研究结果导致低至中等程度的定量精度。使用多反应监测(MRM)或并联反应监测(PRM)的靶向定量增加了定量精度。对于每种肽靶标,最精确的相对定量测定采用稳定的同位素标记标准。在蛋白质组学中,有针对性的量化工具,包括天际线(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
      • 芬尼G.L.
      • Frewen B.
      • 肯尼尔·
      • Tabb D.L.
      • Liebler D.C.
      • maccoss m.j.
      天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
      )和peptidaatlas(
      • 德意曲e.w.
      • 林H.
      • Aeberberold R.
      PeptidAtlas:用于出现目标蛋白质组学工作流的目标选择的资源。
      )支持使用串联MS产物离子量化肽的方法的开发。这些工具允许化学定义的PTM,包括磷酸化,乙酰化和甲基化。如前所述,聚糖PTM本身在串联MS期间经历解离。这些聚糖解离与糖基化异质性联合,不允许定量蛋白质组学工具。
      使用MS反应监测的糖肽定量已经详细审查了其他地方(
      • delafield d.g.
      • Li L.
      甘草和糖肽定量分析方法的最新进展。
      )。以下讨论面向使用MS反应监测的蛋白质相似度测量。许多组已发表MRM / PRM方法以定量糖肽(
      • 袁W.
      • 桑达米
      • 吴j.
      • Komen J.
      • 高盛
      LC-MS-MRM在肝病中的免疫球蛋白亚类和亚类特异性糖基化的定量分析。
      ,
      • 达巴纳P.
      • 诺瓦克P.
      • kucera r.
      • 最佳 olcan O.
      • 桑达米
      • 高盛
      • Pompach P.
      全MS扫描FT-ICR定量结直肠癌和肝细胞癌患者N-和O-糖肽表达的变化及多重反应监测。
      ,
      • 歌曲E.
      • Pyreddy S.
      • Mechref Y.
      多反应监测液相色谱/串联质谱法定量糖肽。
      ,
      • 洪问:
      • Ruhaak L.R.
      • stroble c.
      • Parker E.
      • 黄杰。
      • Maverakis E.
      • lebrilla c.b.
      一种综述血清糖蛋白的综合血糖映射和直接定量的方法。
      )。因为肽骨干解离导致低丰度产物离子,所以串联MS过渡通常从前体和氧鎓离子采用中性糖损失。可以在靶标MS实验中定量的肽的数量受分析速度的限制。如图所示 图1,通过在窄的保留时间窗口上从反相色谱柱中复制糖基化酶改性的典型糖肽的异质糖族。为了定义糖蛋白相似性,必须量化观察到的每种糖族。这种量化需要跨越EIC峰的6至8点。结果,基于丰度选择前体的数据依赖性分析,从而导致前体离子选择的随机模式,适用于异质糖肽的完全取样。因此,很多 N - 使用串联MS过渡,存在分析仪的分析速度不足以量化所有糖族。这种共蛋白糖肽的模式也使得构建目标MS方法的任务,因为重叠的EICS,随着样本复杂性增加而增长的问题。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1重叠AGP糖肽25至42 LVPVPitn(n)ATLDQITGK从已发布数据中提取的离子色谱图 (
      • Khatri K.
      • Klein J.A.
      • 白色m.r.
      • 授予O.C.
      • Leymarie N.
      • 伍兹r.j.
      • Hartshorn K.L.
      • Zaia J.
      集成的常规常规和计算糖生物学揭示了流感病毒聚糖微肾微型物质性和宿主相互作用的结构基础。
      )。血液化为括号。
      数据无关的分析(DIA)方法已广泛应用于蛋白质组学(
      • 查普曼J.D.
      • Goodlett D.R.
      • 马克伦C.D.
      用于全球蛋白质组分析的多路复用和数据无关串联质谱。
      )。虽然优点是所有前体离子被解离,但对解释解释的挑战是对Dia蛋白质组学数据的挑战是保持足够的选择性鉴定Coeluting肽。因此,通过减小用于逐步通过质量范围的四极窗的尺寸,选择性增加但扫描速率和灵敏度降低。为了解释DIAM串联质谱数据,已经描述了以肽为中心的和谱形的方法(
      • 婷婷。
      • Egertson J.D.
      • Payne S.H.
      • 金斯。
      • 麦克莱恩B.
      • Kall L.
      • Aeberberold R.
      • 史密斯r.d.
      • 贵族W.S.
      • maccoss m.j.
      以肽为中心的蛋白质组分析:分析串联质谱数据的替代策略。
      )。以频谱为中心的方法,包括DIA-UMPIRE(
      • tsou c.-c。
      • Avtonomov D.
      • 拉森B.
      • Tucholska M.
      • Choi H.
      • Gingras A.-​​C.
      • nesvizhskii a.i.
      DIA -UMPIRE:数据无关的采集蛋白质组学的综合计算框架。
      )和openswath(
      • rost h.l.
      • Rosenberger G.
      • Navarro P.
      • 吉拉特L.
      • Miladinovic S.M.
      • Schubert O.T.
      • Wolski W.
      • 柯林斯B.C.
      • Malmstrom J.
      • Malmstrom L.
      • Aeberberold R.
      OpenSwath启用了对独立于数据的采集MS数据的自动化,有针对性的分析。
      ),寻求鉴定每个直接串联质谱的单个肽,并使用参考文库分配来自DIA数据的肽。以肽为中心的方法,如山核桃(
      • 婷婷。
      • Egertson J.D.
      • Bollinger J.G.
      • Searle B.C.
      • Payne S.H.
      • 贵族W.S.
      • maccoss m.j.
      山核桃:无自然采集串联质谱数据的无图书馆肽检测。
      )使用肽特异性产物离子查询肽的存在肽的存在。因此,这些方法能够更好地耐受分配肽的存在,而不是以谱为中心的方法。
      许多共面糖肽糖族的存在驱动了需要适当的高选择性的DIA方法。 SWATH型DIA用于分析IgG糖型,其中异质性受到限制,来自无机的人血浆(
      • 桑达米
      • 高盛
      无机血浆样品中IgG糖族的数据独立分析。
      )。用于分析生物合成截短的粘蛋白类型的基因方法 O已经描述了 - 甘油肽 在Silico. 增强的甘油 - Dia光谱文库用于将糖肽从未成分血清分配(
      • 你Z.
      • 毛泽东。
      • 克劳森H.
      • vakhrushev s.y。
      Glyco-Dia:用硅增强糖肽文库定量o-糖蛋白酶的方法。
      )。使用目标DIA方法检测59 N从富含Hilic--富含血清的血清蛋白,手动计算糖肽Y离子的糖蛋白,进口到天际线中以产生量化过渡(
      • 林C.-h.
      • Krisp C.
      • 包装机N.H.
      • Molloy M.P.
      发展数据独立采集质谱工作流程,以使得能够在没有预定义的聚糖组成知识的情况下进行糖肽分析。
      )。 khoo. 等等。 注意到,虽然糖肽的最佳碰撞能量取决于肽序列,但对甘油组合物的依赖性相比较小(
      • PAN K.T.
      • 陈C.C.
      • Urlaub H.
      • Khoo K.H.
      适应基于质谱的蛋白质位点特异性N-糖基化分析的数据无关的采集。
      )。因此,它们表明,设定碰撞能量以优化肽+六烷基Y1离子的丰度允许定义特异于肽序列但允许检测任何甘油组合物的串联MS转变。该方法允许使用直径识别出意想不到的糖族。
      虽然仍然没有用于糖蛋白质的现有蛋白质组学的DIA分析软件,因此由于前面提到的糖基化异质性和糖苷键解离,但基于分析的DIA方法是为了比较而开发了己内纳酸和唾液酸氧化氧鎓离子的丰度。常量糖基化生物治疗糖蛋白的相似性。称为宽带碰撞诱导的解离(BBCID),该方法用于将糖肽从标准蛋白分配(
      • couto n ..
      • Davelyatova L.
      • 埃文斯C.A.
      • 赖特P.C.
      宽带碰撞诱导解离(BBCID)质谱法在蛋白质糖基化和磷酸化分析中的应用。
      )。为此,使用氧鎓离子来表示MS1扫描从该MS1扫描,从该MS1扫描从该MS1手动分配前体和从相应的串联质谱分配的糖肽。

       糖蛋白相似性计算统计分析方法

      为了评估糖蛋白糖基化在生物机制中的作用,需要确定糖蛋白的突变形式是否类似于野生葡糖蛋白。这需要与每个站点的糖族的丰度相结合,并使用统计指标来评估相似性,因为通过统计功率的更加传统的统计分析是HAMSTRUNG。在化学信息学领域中,分子相似度是指结构或功能分子特性的相似性(
      • WILLETT P.
      化学格式学 - 化学图书馆的相似性和多样性。
      )。它用于药物设计研究以及筛选具有相似化学性质的可用化合物的化学结构数据库(
      • Haranczyk M.
      • Holliday J.
      聚类和复合选择相似系数的比较。
      )。分子相似性类似于描述符空间中的一对化合物之间的逆距离。为了使大型化合物数据库的相似性筛选,可以使用分子筛或分子指纹表示分子。许多商业(
      • 弗朗科P.
      • Porta N.
      • Holliday J.D.
      • WILLETT P.
      使用2D指纹方法来支持孤儿药物立法中结构相似性的评估。
      )和公众(
      • 弗朗科P.
      • Porta N.
      • Holliday J.D.
      • WILLETT P.
      孤儿药物许可中的分子相似性考虑。
      )指纹数据库已被用于根据相似性筛选孤儿药物候选者。然后使用相似度测量来通过指纹信息进行比较分子结构。 Tanimoto系数(
      • 罗杰斯D.J.
      • tanimoto t.t.
      用于分类工厂的计算机程序。
      )是使用分子指纹比较化学结构的最常用的相似度量(
      • Bajusz D.
      • RáczA.
      • HébergerK.
      为什么谷本指数基于指纹的相似度计算一个合适的选择?
      )。 Tanimoto系数最初开发为植物,使用二元存在/缺席数据来评估揭示生物或化学物质之间关系的共同发生。 Tanimoto系数对应于物种对的交叉与工会的比率。基于存在/缺位数据的有机体相似性的假设试验是使用Tanimoto系数进行引导和测量浓度算法(
      • Chung N.C.
      • Miasojedow B.
      • STARKEK M.
      • 甘蓝A.
      jaccard / Tanimoto相似性测试和生物存在缺失数据的估算方法。
      )。
      糖蛋白含有一组含有生物合成的糖族的分布。糖蛋白质实验决定了每种观察到的糖肽糖族的单糖组合物和丰度。糖蛋白糖基化模式的复杂性需要适当的统计测量来测量分子相似度。我们最近开发了一种修改形式的Tanimoto系数,以确定基于糖肽糖族的含量和丰度对糖蛋白制剂对的统计相似性,并将其应用于比较野生型和突变流感病毒血凝素糖基化(
      • 张D.
      • Hackett W.E.
      • 钟L.
      • WAN X.F.
      • Zaia J.
      测量流感病毒变体之间的特异性糖基化相似性,具有统计确定性。
      )。为此目的,我们使用了Tanimoto系数的修改形式,如下所示:
      T=igAiPA,iBiPB,iKd(Ai,Bi)ig(AiPA,i)2+ig(BiPB,i)2igAiPA,iBiPB,iKd(Ai,Bi)


      AB 对应于两个糖蛋白样品的糖肽丰度载体。这些丰度是对数缩放的并且标准化,以屈服于0至1的连续范围内的值。糖肽丰富在平均的技术重复中测量。 P.A 和 PB vectors包含观察值的比例对技术复制的总值,从而占缺失值。 K 是一个距离缩放术语 [1+mean(PA,PB)] , 和 d(a,b)是曼哈顿之间的距离 AB。得到的曲线显示了两个相似系数的分布,空假设分布和测试假设分布。零假设Tanimoto系数分布由随机组合计算,替代样本的所有重复 AB 为了模拟联合分布。测试假设Tanimoto系数由随机组合计算 A 到那些 B。如理想化的情况所示 图2,Null和测试分布的重叠程度决定了我们可以量化样品组之间的糖基化相似性的置信度。 X轴显示了Tanimoto相似性和Y轴分布密度。 null和测试分布类似于统计推理中使用的空和替代假设。如果NULL和测试分布不显着重叠,则拒绝零假设,并且样本是不同的。如果没有拒绝零假设,则样品对不相似。交叉点的右侧的区域类似于I误差(α),对应于假阳性率,因为该区域的结果可能来自测试比较,而是从零点处具有更高的可能性,因此负面比较。交叉点左侧的区域类似于II型错误(β),对应于假负速率。虽然该地区的结果可能来自零比较,但它们具有从测试比较的似然具有更高的可能性,因此具有正面比较。该曲线显示窄的空和测试分布以及I型和II型错误的可接受水平。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2该相似性比较的该示例显示了两种缩放材料,其彼此可分离,如通过低的分布重叠所确定的。 这些血糖系列在相同蛋白质上是相同的部位,但是由于其他糖蛋白注入和加工的其他糖蛋白与其混淆信号,因此具有比另一个更差的数据。

       糖肽量化和混合复杂性

      定量糖肽术面临定量蛋白质组学没有的挑战;专注于糖蛋白质本质上乘以离子分集并减少定量点。蛋白质组学在尝试衡量单个蛋白质的定量时,蛋白质组学的益处是引用多种肽的能力;相反,只能用相同综合的错过裂解来评估糖蛋白剂。不仅必须对糖蛋白酶的完全定量测定比不糖基化的蛋白质组成的可能性,但它也必须面临完全样品的能力的降低,以定量糖肽糖族化合物。为了更好地解释规模,考虑1000个蛋白质ort的蛋白质组。假设沿LC洗脱曲线和每种蛋白质的五种肽的八点,该蛋白质组可以通过40,000个成功的肽谱匹配,成功收购量为40,000个蛋白质组。接下来,考虑相关的糖蛋白组:基于每个糖类的20种糖族,平均50%的蛋白质糖基化,并且每种糖基化蛋白的两种糖基质,存在预期的20,000个糖蛋白剂。为了沿着洗脱曲线秉承类似标准的八分,以满足全量化,需要160,000个成功的糖肽谱比赛,160,000个成功的收购。这种估计量化糖蛋白组所需的采样功率的四倍增加可能低估了糖基化的乘法力,因为许多糖蛋白具有多于两种综合材料。
      在DDA和DIA实验中还必须考虑前体离子配合的可能性。两种糖肽前体离子的基因溶解是比两个未修饰的肽的分配更苛刻的问题。在许多情况下,仍然可以识别肽,假设它们的序列无关,但即使是不是确定性。然而,具有常见肽序列的糖肽显示出给定肽序列的一组糖族的缩小范围的LC保留次数 m / z. 空间;当这些糖肽被成分和解离时,许多相同的肽+ Yn 对于两种前体,观察到离子和氧鎓离子。前体离子阳离子加合物,如果存在,增加了彼此鉴定糖肽所需的计算工作。如图所示 表格1 (
      • Klein J.
      • Zaia J.
      相对保留时间估计通过LC-MS / MS改善了N-糖肽鉴定。
      ),有几种常见的单糖和加合物的常见组合,导致前体离子质量可能导致错误鉴定。在含有不相关的肽序列时的糖肽的情况下,来自肽骨架解离的产物离子的事实通常在丰度低的情况下可能导致峰值险不明。
      鉴于使用糖肽糖糖族使用的能力受到分析速度的限制,DIA方法对于定量糖蛋白晶体糖粉是有意义的。对于这样的DIA研究,重要的是要估计扫描窗口中多个前体离子的概率。作为这种患病率的保守实例,我们研究了先前公布的数据集检查纯化的α1-酸糖蛋白(AGP)样品(
      • Khatri K.
      • Klein J.A.
      • Zaia J.
      使用明智的搜索空间最大限度地提高了糖蛋白糖基化的特异性特异性分配的信心。
      )。我们创建了一个简单的模型来估计来自10个U窗口的实验所期望的Coisolation程度。该模型基于23种在AGP中的五种不同含有的聚糖组合物。基于分析数据,一些位点与三种聚糖组合物有少量,并且一些含有多达20的甘油组合物,总共60颗糖肽在65分钟的梯度方面观察到。 图3. 显示在给定时间观察到的糖肽的数量和糖肽的数量,其具有大于90%的概率。基于窗口尺寸,10ppm的质量误差,从2至5的阳性电荷状态和观察到的糖肽的时间窗来确定概率;假设如果糖肽高于信号阈值,则它将产生串联质谱。用于生成这些数据的糖肽谱匹配来自已发布数据的GlycreSoft搜索(
      • Khatri K.
      • Klein J.A.
      • Zaia J.
      使用明智的搜索空间最大限度地提高了糖蛋白糖基化的特异性特异性分配的信心。
      ),它们应该远离糖肽,以便在搜索被设置为处理此类实例时,因此可以作为具有基同的任何糖肽的糖肽可能是边缘情况。总共12颗糖肽预期存在于同一10 U窗中或20%鉴定的糖肽中存在。这种易感性表明需要区分存在于同一DIA窗口中存在的糖肽。随着糖肽混合物的复杂性增加,搜索空间膨胀,并且需要区分在同一DIA窗口中的糖肽的增加。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3这表明在纯化的糖蛋白样品中观察到的糖肽的数量( 蓝色 )和基同事件的数量( 红色的 )那是可能的(p >0.90)给定10 U窗口大小。 由于减少糖肽观察的数量,因此由于凝聚肽观测的数量,因此可能偏向。

       质量标准和可重复性

      对生物过程中糖蛋白糖基化的变化的评估需要仔细注意LC-MS再现性。虽然存在各种质量评估工具,但没有标准。糖蛋白研究人员使用的许多工具都是重新培养的蛋白质组学工具或通用质谱工具的扩展。虽然这些工具是精心设计的,但有自己的优点,但它们都缺乏评估糖蛋白实验所需的完整视图;它们不是旨在这样做的。糖蛋白质需要增加蛋白质组学的标准因误差可能性,并且需要具体的考虑来处理其识别过程的特质和量化。关于FDR,TDA(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )对糖肽鉴定不适用于糖肽鉴定,因为它依赖于诱饵模拟目标足够严格地通过评分算法对目标混淆。随着我们得分和鉴定糖肽的能力提高,我们FDR估计的可靠性 通过 TDA减少。如上所述,各种不同的软件已经尝试解决糖肽诱饵问题,但没有找到完美的解决方案。虽然近年来,后误差概率已经提升(
      • Kall L.
      • Storey J.D.
      • maccoss m.j.
      • 贵族W.S.
      后误码概率和假发现率:同一硬币的两侧。
      ,
      • Kall L.
      • Storey J.D.
      • 贵族W.S.
      与串联质谱鉴定的肽相关的后误差概率的非参数估计。
      ,
      • Kall L.
      • Storey J.D.
      • 贵族W.S.
      Qvality:Q值和后误差概率的非参数估计。
      ,
      • yi x.
      • 锣F.
      • 傅y.
      转移肽鉴定的后误差概率估计。
      ),它尚未实施,测试和标准化糖蛋白质,并且许多方法依赖于目前不可行的系统知识。
      Quameter是一种质量指标,提供关于实验中的底层光谱的大量指标,并且可以应用于任何复合类(
      • 马Z.Q.
      • Polzin K.O.
      • Dasari S.
      • Chambers M.C.
      • 席克宁B.
      • 吉布森B.W.
      • Tran B.Q.
      • Vega-Montoto L.
      • Liebler D.C.
      • Tabb D.L.
      Quameter:LC-MS / MS蛋白质组学仪表的多用户性能指标。
      )。 Quameter对串联MS覆盖率的评估,强度映射和噪声评估对于执行一致的实验和调整批量效应是有用的(
      • 马Z.Q.
      • Polzin K.O.
      • Dasari S.
      • Chambers M.C.
      • 席克宁B.
      • 吉布森B.W.
      • Tran B.Q.
      • Vega-Montoto L.
      • Liebler D.C.
      • Tabb D.L.
      Quameter:LC-MS / MS蛋白质组学仪表的多用户性能指标。
      )。它产生的度量可以与基准进行比较,以便测量实验一致性,但不介绍识别和定量质量。
      天际线(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
      • 芬尼G.L.
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      • Tabb D.L.
      • Liebler D.C.
      • maccoss m.j.
      天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
      )质量工具专注于肽定量。在使用用于糖肽量化的地平线的同时,必须仔细实施,以防止在单独的糖蛋白质之间的信号污染。目前,必须单独添加并鉴定它们的糖肽及其片段,这使得糖肽数据设定耗时的分析,特别是如果实验正在检查更复杂的混合物,例如整个组织。 Skyline有一个直观的定量评估工具,使用可视化来允许用户确保峰值边界是正确的,可视显示,以确保在样本组一致性内(
      • SABA J.
      • DUTTA S.
      • Hemenway E.
      • Viner R.
      通过使用更高能量的碰撞解离式精确的质量 - 产物依赖性电子转移解离,提高糖肽分析的生产率。
      )。糖肽需要在maxquant中被视为普通的ptms,并且MaxQuant不允许片段PTM贡献一个单一识别并因此有助于定量(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
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      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )。这导致假阳性标识,因为留下了大规模偏移。 MaxQuant可以确保用于产生糖蛋白质搜索空间的蛋白质组学数据中的高质量标识,但目前不能直接施加到糖蛋白质数据中,这意味着其概率性FDR系统不能应用于糖肽鉴定。

      结论

      严格和完全定量糖肽数据对于使得符合新兴人体健康问题所需的生物医学发现是必要的。研究人员需要工具来正确评估糖类蛋白酶结果的置信度。这将需要开发特定工具和标准化,以提高实验之间的互操作性。光谱质量工具,虽然重要,但不要涂上整个画面。它们缺乏光谱质量变异如何影响糖肽鉴定和定量的解释。在洗脱液中特定时间的信号降解可能导致导致杂散结论的结果的大移位。为了解决这个问题,需要开发整体工具,这些工具通知您可能基于光谱信息,搜索空间数据和相关的示例信息的误差的糖肽的糖肽。虽然研究人员可以自己调查所有这些途径,但这任务的复杂性和范围必然会导致错误,并且不利于生成一组标准。
      展望未来,有一种金色的机会来增加糖蛋白质的标准化。所有糖蛋白实验必须具有已知的搜索空间。在这种已知的搜索空间和预测由糖基化引起的预期保留时间偏移之间的能力之间,应该可以创建综合数据质量分析。该信息可用于产生糖肽的肽似然模型以及预测最容易换热的候选物,其密切地模仿聚糖质量偏移。这两种模型与光谱数据相结合,将确定更可能产生量化误差的糖肽。先前描述的统计相似性方法允许在实验组内进行综合检查,并且可以识别有问题的糖肽和整体样品。通过将所有这些方法一起使用,研究人员可以在糖肽量化数据的可靠性建立共识。

      利益冲突

      作者声明没有竞争利益。

      资金和其他信息

      作者由NIH授权U01CA221234和R01GM133963支持。内容完全是作者的责任,不一定代表国家卫生研究院的官方意见。

      作者捐款

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