汽油葡萄酒的定量数据无关的血液蛋白质

开放访问发布:2020年12月21日DOI://doi.org/10.1074/mcp.RA120.002181

      强调

      • 开发自动糖蛋白顺序窗口采集所有理论质谱工作流程。
      • 应用于三对商业规模实验起泡葡萄酒。
      • 在老化过程中降低了Cuvée的蛋白质丰度。
      • 不同的酵母菌株产生不同水平的酵母蛋白。

      抽象的

      闪亮的葡萄酒是世界各地享用的酒精饮料。起泡酒的感觉特性取决于最终产品中化学和生化组分之间的复杂相互作用。糖蛋白已与起泡葡萄酒中的阳性和阴性品质有关,但先前未详细研究起泡葡萄酒的糖基化曲线。我们使用蛋白质和糖肽的方法分析了汽油葡萄酒的糖蛋白质。我们开发了一种自动工作流程,创建离子库,以分析所有理论质谱数据依赖性获取质谱数据的顺序窗口获取,基于γONON(蛋白质指标; 2.13.17版)鉴定的糖肽。我们将工作流程应用于三对实验起泡葡萄酒,以评估老化对李斯和不同酵母菌株的效果利口酒De Tirrage.用于二次发酵。我们发现,与8个月相比,LEE上的鼠标衰老了24个月,导致了一些蛋白质在特定位点的大型聚糖中的整体蛋白质丰度和富集的急剧下降。二次发酵雷司葡萄酒酿酒酵母酿酒酵母酵母菌株Siha4产生更多的酵母蛋白和糖蛋白比S. Cerevisiae.酵母菌株DV10。葡萄糖蛋白的丰度和糖基化曲线在葡萄品种之间也不同。为了我们的知识,这项工作代表了第一次深入研究葡糖葡萄酒中蛋白质和肽特异性糖基化的研究,并描述了所有理论质谱/数据独立的采集工作流程的定量糖蛋白顺序窗口广泛适用于其他样本类型。

      图形概要

      关键词

      缩写:

      达达 (数据依赖性收购), DIA (独立数据的收购), FDR. (假发现率), 小姐 (质谱), PCA. (主要成分分析), (顺序窗口获取所有理论), XIC. (提取离子色谱图)
      在庆祝活动和庆祝活动中享有世界各地的闪光葡萄酒。虽然闪亮的葡萄酒仅占葡萄酒市场的9%,但它是增长最快的葡萄衍生的酒精饮料,既生产销售和体积
      • di gianvito p.
      • Arfelli G.
      • Suzzi G.
      • Tofalo R.
      起泡葡萄酒生产的新趋势:酵母合理选择。
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      • Pomarici E.
      生长(好的)泡沫:洞察美国消费者的汽酒。
      )。起泡酒的最重要特征之一是其沸腾:泡沫的形成。气泡的数量,频率和寿命以及其他质量属性受到起泡葡萄酒生产中的许多因素的影响,包括酿酒技术,使用的葡萄品种,特定的酵母菌株和发酵条件(
      • KEMP B.
      • Conde B.
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      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
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      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
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      葡萄酒酿造酵母选择的新趋势。
      )。在起泡葡萄酒生产期间提取或产生许多复杂的生物分子,包括蛋白质,多糖,多酚和脂质,所有这些都可以影响最终产品的质地,风味,颜色和发泡性能(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
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      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
      )。尽管浓度低(4-20mg / L)(
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      在各种澄清处理之后,葡萄转化酶含量(使用PTA-ELISA)与葡萄酒总蛋白质含量的变化相反。与葡萄酒发泡性的关系。
      )葡萄酒和糖蛋白的蛋白质和糖蛋白,它们对于确定其感官特性尤为重要。他们可以改变清晰度和稳定性(
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      葡萄酒阿拉伯酰胺蛋白,可减少热诱导的葡萄酒蛋白雾霾。
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      酿酒酵母 甘养丁保护来自蛋白质雾麦的葡萄酒。
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      酿酒酵母酿酒酵母 甘露黄蛋白保护来自蛋白质的雾霾:在发酵和LEES联系期间的释放以及其行动机制的提案。
      )积极影响泡沫(
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      • Culbert J.A.
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      • Fuentes S.
      • 豪威尔K.S.
      可溶性蛋白质和氨基酸含量影响起泡葡萄酒的泡沫质量。
      )。发泡是闪亮的葡萄酒中的非常理想的质量,并且诸如泡沫高度和稳定性之类的测量通常用于评估质量(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
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      • vasserot y.
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      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
      )。糖蛋白在控制气泡形成和稳定性时尤其重要,因为它们环绕并稳定泡沫中的泡沫的气泡(
      • Blasco L.
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      蛋白质影响葡萄酒和啤酒中的泡沫形成:酵母的作用。
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      ProSecco酒的可发泡性:高分子量甘草化合物和葡萄酒PR-蛋白的合作效果。
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      由葡萄酒进行比较蛋白质剖面分析 Botrytis cinerea 感染和健康的葡萄揭示了一种新的生物标志物,用于涌出闪亮的葡萄酒。
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      用香槟界吸附的层的结构和化学成分。
      )。
      糖蛋白是用复合的寡糖翻译改性的蛋白质,其也称为聚糖。附加聚糖的数量,位置和结构强烈影响糖蛋白的生物活性和生物物理性质(
      • Henthent-Bechor D.
      • levy y。
      糖蛋白的折叠:朝向理解糖基化码的生物物理学。
      )。由于它们的非甲基型生物合成途径和单糖拓扑和糖苷键的许多可能的构型,Glycans是自然的异质的,并且(
      • Zacchi L.F.
      • Schulz B.L.
      N-Glycoprotein即药细胞:生物意义和蛋白质组学特征。
      )。存在于成熟糖蛋白上的最终聚糖结构取决于它们产生的生物(
      • Bertozzi C.R.
      • rabuka d.
      甘草多样性的结构基础。
      )。在酵母和植物蛋白上发现的聚糖显着不同。 酿酒酵母酿酒酵母 酵母产生高甘露糖 N - 链接和低omannose. O - 分别连接到Asn的侧链酰胺和Ser或Thr的侧链酰胺(
      • Lesage G.
      • Bussey H.
      细胞壁组件 酿酒酵母酿酒酵母.
      )。这个oligomannose. O糖基化已经在汽油葡萄酒中观察到蛋白质(
      • kupfer v.m.
      • vogt e.i.
      • Ziegler T.
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      • Niessen L.
      由葡萄酒进行比较蛋白质剖面分析 Botrytis cinerea 感染和健康的葡萄揭示了一种新的生物标志物,用于涌出闪亮的葡萄酒。
      )。这 N - 葡萄的链接聚糖(vitis Vinifera)通常是高甘露糖或假素酰胺结构,通常与β(1,2) - 链接木糖和核心α(1,3) - 链接岩藻糖(
      • 霍瓦斯A.
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      • 范杜塞尔A.
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      • jegou s.
      • Schaeffer-Reiss C.
      使用质谱法的组合的葡萄浆果真空转化酶的深入糖蛋白表征。
      )。 N - 在从葡萄纯化的葡萄菌逆变酶上观察到与这些结构一致的糖基必须(
      • 霍瓦斯A.
      • Alayi T.D.
      • 范杜塞尔A.
      • Marchal R.
      • jegou s.
      • Schaeffer-Reiss C.
      使用质谱法的组合的葡萄浆果真空转化酶的深入糖蛋白表征。
      )。 O - 葡萄糖蛋白上的链接聚糖通常通过羟脯氨酸的羟基连接,主要含有阿拉伯糖和/或半乳糖(
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      香槟酒葡萄酒II型阿拉伯酰亚胺蛋白的纯化与结构表征。
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      葡萄亚洲吡喃蛋白结构的新研究。
      )。
      闪亮的酒可以用几种不同的方法生产(
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      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
      )。在传统方法中(Fig. 1),挑选葡萄并压制以产生葡萄必须用于原发性发酵。可以混合由该初级发酵产生的基础葡萄酒以在最终产品中获得不同的感官属性(
      • Liger-Belair G.
      香槟和闪闪发光的葡萄酒中的泡腾:从葡萄收获到泡沫上升。
      )。然后将混合的碱葡萄酒经历第二发酵和老化李斯(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
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      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
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      • 罗利德B.
      • Marchal R.
      生产阶段对瓶发酵泡葡萄酒质量的影响。
      )。第二种发酵是起泡葡萄酒生产的关键步骤。糖和酵母的混合物,称为 利口酒De Tirrage.,加入混纺基础葡萄酒,允许生产额外的CO2 碳酸葡萄酒(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
      • Marchal R.
      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
      )。闪亮葡萄酒的李斯由酵母细胞组成,少量的辅酶植物,促进酵母在活性发酵结束时沉降(
      • KEMP B.
      • 亚历山大H.
      • 罗利德B.
      • Marchal R.
      生产阶段对瓶发酵泡葡萄酒质量的影响。
      )。在已知的过程中,在第二发酵过程中,闪闪发光的葡萄酒刻意与LEE接触 苏谎言 改善最终葡萄酒的感官素质(
      • KEMP B.
      • 亚历山大H.
      • 罗利德B.
      • Marchal R.
      生产阶段对瓶发酵泡葡萄酒质量的影响。
      )。在此期间,发生酵母的自水解,以及脂质,蛋白质和多糖的降解,它们一起改变闪亮葡萄酒的分子复杂性和性质(
      • Cavagna M.
      • 戴尔也
      • 蒙蒂F.
      • 罗西F.
      • 托里亚尼S.
      使用ATR-FTIR MicroStroscopy监测Autolys 酿酒酵母酿酒酵母 贱酒中的细胞。
      )。通常和二次发酵通常使用纯粹的起动菌株,通常是 S. Cerevisiae.,控制发酵并限制瓶瓶变异性。大量纯粹的 S. Cerevisiae. 菌株可用于商业用途。尽管这些商业葡萄酒菌株的遗传相似性(
      • Bangeman A.R.
      • 努力A.H.
      • Kolouchova R.
      • 弗雷泽J.A.
      • 施密特S.A.
      整个基因组比较揭示了跨越商业葡萄酒株谱的高水平繁殖和应变冗余 酿酒酵母酿酒酵母.
      ),所用酵母菌的菌株可以对最终闪亮葡萄酒产品的质量和风味概况产生显着影响(
      • Marti-Raga M.
      • 马丁V.
      • 吉尔米
      • Sancho M.
      • Zamora F.
      • Mas A.
      • 贝尔特兰G.
      酵母和基础葡萄酒补充对汽酒组成的贡献。
      )。传统方法与其他方法分开,因为第二种发酵发生在相同的密封瓶中,闪亮葡萄酒最终将被消耗(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
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      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
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      • KEMP B.
      • 亚历山大H.
      • 罗利德B.
      • Marchal R.
      生产阶段对瓶发酵泡葡萄酒质量的影响。
      )。在李斯的时间结束时,瓶子在称为riddling的过程中旋转,在去除前收集瓶颈中的酵母沉积物。除去沉积物后,a 剂量 通常由糖和葡萄酒组成的溶液加入瓶子(
      • KEMP B.
      • 亚历山大H.
      • 罗利德B.
      • Marchal R.
      生产阶段对瓶发酵泡葡萄酒质量的影响。
      )。然后被认为是完整的酿酒过程,并且在消费前剩下葡萄酒。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1采用传统方法概述闪亮葡萄酒生产.
      葡萄和酵母糖蛋白在整个闪闪发光的酿酒过程中释放,但被认为在二次发酵期间浓缩,并在LEE上老化(
      • Nunez Y.P.
      • Carrascosa A.v.
      • Gonzalez R.
      • polo m.c.
      • Martinez-Rodriguez A.J.
      酵母加速自分解对香菇法阐述闪亮葡萄酒组成及发泡性能的影响。
      )。糖蛋白是一种重要的大分子,可控制泡沫生产和泡沫质量在起泡酒中(
      • Blasco L.
      • Vinas M.
      • 别墅T.G.
      蛋白质影响葡萄酒和啤酒中的泡沫形成:酵母的作用。
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      • Douillard R.
      用香槟界吸附的层的结构和化学成分。
      )。由酵母和来自酵母自肠分解的蛋白质分泌的糖蛋白被认为是增加发泡的主要蛋白质贡献者(
      • Vincenzi S.
      • Crapisi A.
      • Curioni A.
      ProSecco酒的可发泡性:高分子量甘草化合物和葡萄酒PR-蛋白的合作效果。
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      • Marti-Raga M.
      • 马丁V.
      • 吉尔米
      • Sancho M.
      • Zamora F.
      • Mas A.
      • 贝尔特兰G.
      酵母和基础葡萄酒补充对汽酒组成的贡献。
      )。然而,酵母和葡萄糖蛋白的结合存在产生了最佳的可发作性,突出了糖蛋白与两种物种的重要性(
      • Vincenzi S.
      • Crapisi A.
      • Curioni A.
      ProSecco酒的可发泡性:高分子量甘草化合物和葡萄酒PR-蛋白的合作效果。
      )。糖蛋白牵连控制闪亮和仍然葡萄酒的口感(
      • Vidal S.
      • 弗朗西斯L.
      • 威廉姆斯P.
      • kwiatkowski m.
      • Gawel R.
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      葡萄酒中的多糖和花青素的嘴感染味道如培养基。
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      • Gawel R.
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      多糖对白葡萄酒味道和口感的影响。
      )。葡萄阿拉伯乳糖蛋白(
      • 水e.j.
      • Pellerin P.
      • 布里穆特星期日。
      葡萄酒阿拉伯酰胺蛋白,可减少热诱导的葡萄酒蛋白雾霾。
      )和酵母甘露黄蛋白(
      • 水e.j.
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      酿酒酵母 甘养丁保护来自蛋白质雾麦的葡萄酒。
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      • 琼斯G.P.
      • 威廉姆斯P.J.
      • 水e.j.
      酿酒酵母酿酒酵母 甘露黄蛋白保护来自蛋白质的雾霾:在发酵和LEES联系期间的释放以及其行动机制的提案。
      )也可以保护葡萄酒从阴霾形成,而其他葡萄病发生相关的糖蛋白如甲磺肽样蛋白和几丁蛋白酶会导致危险(
      • 范斯普莱特S.C.
      • McRae J.M.
      • Falconer R.J.
      • 史密斯P.A.
      • Bacic A.
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      • Marangon M.
      葡萄酒蛋白雾霾:预防的形成机制和进步。
      )。雾度是葡萄酒中的不良质量,因为聚集蛋白质会导致清晰度的可见变化,大大降低产品的价值。
      尽管糖蛋白对葡萄酒和起泡葡萄酒质量的影响,但先前没有在葡萄酒中对蛋白质特异性糖基化的高通量调查。在这里,我们开发了一种新的量化糖蛋白和蛋白质组学方法,其将完整性糖肽的测量综合到数据无关的采集(Dia)分析工作流程。使用这种方法,我们调查了老化对李斯和在第二发酵过程中使用不同酵母菌株的影响对汽酒的分子复杂性和组成。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      本研究的目的是测量汽油糖的糖蛋白组和蛋白质组,以评估老化在第二发酵过程中使用的李比和不同酵母菌株的影响。我们在8个月或24个月内调查了与酵母EC1118发酵的8个月或24个月的时间长度; Sauvignon Blanc碱与酵母菌菌株DV10和16个月唑仑的第二发酵;和酵母菌菌株DV10和17个月的SiHa4的第二次发酵林曲型葡萄酒。所有六种起泡葡萄酒样品都是制备技术三份(n = 18)。使用Microsoft Excel(对于Mac;版本16.16.10)在质谱(MS)分析之前随机进行样品。未使用保留时间标准,并获得MS1数据。使用来自每个实验条件的数据依赖性采集(DDA)测量的样本来创建图书馆(在数据分析中描述)(n = 6)。使用MSSTATS(版本2.4)在R软件中进行统计分析所有理论(SWATH)质谱的获取(
      • 崔m.
      • chang c.y.
      • 克劳T.
      • Broudy D.
      • Killeen T.
      • 麦克莱恩B.
      • Vitek O.
      小姐 STATS:用于定量质谱型蛋白质组学实验统计分析的R包。
      )具有意义的阈值 p = 10−5 如前所述(
      • Kerr E.D.
      • Caboche C.H.
      • Schulz B.L.
      翻译后修饰驱动蛋白质稳定性来控制动态啤酒酿造蛋白质组。
      ,
      • Kerr E.D.
      • Phung T.K.
      • Caboche C.H.
      • 福克斯G.P.
      • Platz G.J.
      • Schulz B.L.
      响应真菌感染的大麦种子的内在和调节蛋白质组。
      )。翻译后修改的网站特异性不是本研究的要求。

       葡萄酒生产

      葡萄酒来自德国雷劳地区的Sekt生产商Schloss Vaux。葡萄酒以商业规模制作,具有不同的实验治疗方法。闪闪发光的葡萄酒是用不同的基础葡萄酒制成,由白葡萄酒葡萄的林蛙葡萄,Sauvignon Blanc葡萄或Cuvée(混合物)制成。二次发酵用不同的商业 S. Cerevisiae. 葡萄酒酵母(Lalvin EC1118,Lalvin DV10,Laffort Zymaflore,或Siha4)和在炙手可热前的不同时期为老化。酿酒协议是这个闪亮的葡萄酒屋的标准做法,并在治疗之间标准化。

       样品制备

      蛋白质基本上如前所述制备(
      • Kerr E.D.
      • Caboche C.H.
      • Schulz B.L.
      翻译后修饰驱动蛋白质稳定性来控制动态啤酒酿造蛋白质组。
      )。对于每个葡萄酒样品,通过加入1ml甲醇/丙酮(1:1V / v)并在-20℃下孵育过夜,沉淀250μl的重复。将沉淀的蛋白质在18,000 rcf下离心10分钟,将蛋白质颗粒重悬于50μl含有10mM二硫醇的50mM碳酸氢铵中,并在室温下孵育10分钟。制备含有0.02μg/μl测序级猪胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的50mM碳酸氢铵的缓冲液,并在3分钟内加入50μL,加入重悬浮的颗粒中。将样品在37℃下温育16小时。脱盐肽并用C18 Ziptip(10μL移液管,0.6μl树脂床; Millipore)浓缩。将样品干燥并以100μl01%的甲酸重构。

       质谱

      通过使用纳米PrayIII界面的LC-Electrospray Ionization-MS / MS通过基本上如前所述(
      • Zacchi L.F.
      • Schulz B.L.
      Swath-MS糖蛋白质揭示了糖基化机械中缺陷的后果。
      )。将肽和糖肽用溶剂A(0.1%乙腈在0.1%[V / V]甲酸中)和溶剂B(含有0.1%[V / V]甲酸)的溶剂B(含有0.1%[V / V]甲酸)分离17分钟内为3至40%的溶剂B.对于DDA,注射了50μl的胰蛋白酶消化物(n = 6)。对于SWATH / DIA分析,注射了10μL的胰蛋白酶消化物(n = 18)。质谱仪以正离子模式操作,并根据需要调节气体和电压设置。全MS扫描获得了一系列 m / z. 对于DDA和DIA的350至1600,分别为0.5和0.05秒的累积时间。用于DDA的高灵敏度模式,选择具有2至5的充电状态的前20个最强烈的前体,为抗碰撞能量为40V的碎片和15V的碎片选择。 0.05秒的累积时间用于扫描范围 m / z. 在两种选择后,40至1600次,并排除前体5秒。高灵敏度模式用于在其中定义34个窗口的DIA m / z. 400至1250的范围,隔离窗口为26 m / z. 和 overlap of 1 m / z.。每个都使用自动滚动碰撞能量 m / z. 窗口范围为15 V差和0.1秒的累积时间。

       数据分析

      使用来自每个样本的一次重复的DDA文件进行肽鉴定用蛋白质pilot 5.0.1(sciex)进行。搜索文件的组合蛋白质数据库 V. Vinifera (葡萄)(国家生物技术信息中心Refseq下载2018年8月2日,含有41,219个蛋白质和国家生物技术信息中心RVX08988)(
      • Astashyn A.
      • Shkeda A.
      • vatsan a.r.
      • 泡菜A.
      • Badretdin A.
      • 罗伯特B.
      • Rajput B.
      • 史密斯白B.
      • Farrell C.M.
      • Schoch C.
      • 瓦林C.
      • HAFT D.
      • Rausch D.
      • Ako-adjei D.
      • 韦伯D.
      • 等等。
      NCBI的参考序列(REFSEQ)数据库:当前状态,分类管理扩展和功能注释。
      ), S. Cerevisiae. (酵母)(UNIPROT蛋白质组合UP000002311,2018年4月20日,患有6049个蛋白质)和污染物蛋白(2014年11月11日创建的定制数据库,298蛋白)。标准搜索设置包括样本类型,识别;消化,胰蛋白酶;仪器,三重岩5600; cys烷基化,没有;和搜索努力,彻底。使用蛋白滴的假发现率(FDR)分析在所有搜索上进行。鉴定的肽具有大于99%的置信度和局部FDR的含量小于1%的局部FDR,以进一步分析。
      对于糖肽分析,我们使用Byonic(蛋白质标准,版本2.13.17)来搜索所有DDA文件。进行了两次搜索,每个搜索均针对先前描述的酵母和葡萄蛋白数据库。对于酵母搜索,将裂解特异性设定为Arg / Lys和半特异性(一个末端可能不同意),允许最多两个错过的切割,并且分别对前体和片段离子施加20和50ppm的大规模公差。可变修改设定为常见的1允许每种修饰在肽一次上存在并包括单氧化的符合和脱胺。 Deydro Cys被设置为常见的2,允许修饰在肽上出现两次。设置稀有1,允许每次修饰在肽上存在一次,包括在内 N - 链接的单糖组合物六十一1–2 和 HexNAc2十六进制1–15 在共识序列N-X-S / T和 O - 链接的单糖组合物六角1-HEX.10 在任何SER或THR残留物(六十八) N - 乙酰己糖胺;十六进制,hexose)。每种肽最多允许两种常见修饰和一种稀有改性。
      对于葡萄搜索,裂解特异性被设定为半特异性,最多允许错过的裂解事件,并分别将20和50ppm的大众公差分别应用于前体和片段离子。 Pro的氧化被设定为常见的4,其允许每种修饰在肽上存在四次。罕见的1种设置包括52种植物 N-glycans(补充表S1)在共有序列N-X-S / T中含有含有戊糖(PET)的17种单糖组合物。这 O正在寻找的链接的单糖组合物1 - 便士8 + 15.9949在任何Pro残留物。每种肽最多允许四种常见修饰和一种稀有改性。
      手动检查和验证在核心搜索中确定的独特糖肽。对于接受的任务,必须存在相关的氧鎓离子,以确认连接的聚糖的单糖组合物。这是对脱氧(DHEX)的存在或在一个中存在 N-Glycan。当可能时,通过糖肽Y离子证实单糖存在。此外,必须存在糖肽Y0离子 O - 甘油肽和Y1离子 N-glycopeptides,以及也是如此 b 或者 y 肽离子(≥3)。如果肽 by 离子强度低,保留时间信息和其他糖族的洗脱用于验证鉴定。如果没有Y0或Y1离子,那么都是 by 必须存在肽离子(总共≥3)。仅接受来自Lys / Arg-Pro或N-ragged裂解的裂解事件的肽仅接受 by 除了Y0外,存在肽离子(≥3) O-glycopeptides或Y1离子 N-glycopeptides。所有搜索中最好的独特糖肽鉴定用于产生用于血管肽库的糖肽库。通过调试的调试模式用于导出所识别的糖肽的细节。我们编写了一个Python脚本,它从导出的详细信息创建了一个峰值视图条款库。可以找到用于填充峰值view库的每列的数据的概述 补充表S2。通过识别的肽分组给成的调试报告文件。我们的脚本与相关报告文件中的验证糖肽列表中的扫描号匹配,并返回相应的前体电荷和理论前体质量。理论前体 m / z. 然后计算(Q1)。还收集片段离子信息,包括片段型(Y0,Y1,Y2,B和Y),肽序列内的片段位置(例如,B1或Y6),理论片段离子 m / z. (Q3),片段离子电荷和片段离子强度。由于来自附着的聚糖的另外的片段离子,糖肽的MS / MS光谱比肽的更复杂。为了适应PeakView离子库的结构内的这种复杂性,我们被分配为“a“离子糖肽片段离子Y0,Y1和Y 2以及 by 离子 with HexNAc1 从肽序列中的位置4和以上(表格1)。这意味着 by 离子 with HexNAc1 在肽序列内的位置1至3处不包括在DIA库中。肽 by 与整个甘草仍然附着的离子被分配为“c“离子库中的离子(表格1)。值得注意的是,这些作业没有代表实际指定 ac 由肽碎片术语定义的离子(
      • 斯丁H.
      ABC的肽测序的(和XYZ)。
      )。组合调试文件与来自手动验证的结果文件的信息合并。从结果文件中取出的肽 - 光谱匹配信息包括聚糖单糖组合物,肽序列(加上修饰的质量),保留时间和蛋白质名称。从肽序列中除去肽修饰以产生汽提序列。然后检查库以重复转换,然后导出为与导入到PeakView兼容的标签分隔的.txt文件。
      表格1糖肽的离子类型的分配糖尿病患者
      Glyco / peptide片段类型描述DIA图书馆的分配
      by (labile)by 包括丢失不稳定单糖的离子by ions
      Y0 (O - 链接)和Y1和Y2( N - 链接)糖肽片段离子(根据)(
      • Domon B.
      • Costello C.E.
      糖缀合物Fab-MS / MS光谱中的碳水化合物片段分段的系统术语。
      )对应于 m / z. 肽或肽+六十一段1–2
      A1,A2和A3分别
      b 和 y (+HexNAc1; N - 链接)by 离子含有额外的六氯1>a3
      by (+ Glycan; O- 和 N - 链接)by 无损失单糖的离子c ions
      DIA,数据无关的收购;条件,顺序窗口获取所有理论。
      来自蛋白单滴搜索的鉴定的肽与从良态搜索鉴定的糖肽与糖肽组合以形成一个离子文库。使用SWATH获取MicroApp使用该库用于测量PeakView 2.2.0.11391(SCIEX)中的肽丰富。设置包括每种蛋白质,无限制的肽数;每肽过渡,6;肽置信阈值,99%; FDR,1%;共享肽,允许;保留时间提取离子色谱图(XIC)窗口,6分钟;和XIC宽度,75ppm。手动检查所有糖肽的MS2片段离子的XIC。
      对于以蛋白质为中心的分析,确定样品之间的总蛋白质丰度的变化,用标准化的蛋白质强度确定参考蛋白胰蛋白酶,如前所述(
      • Kerr E.D.
      • Caboche C.H.
      • Schulz B.L.
      翻译后修饰驱动蛋白质稳定性来控制动态啤酒酿造蛋白质组。
      );如前所述,r的MSSTATS(
      • Kerr E.D.
      • Phung T.K.
      • Caboche C.H.
      • 福克斯G.P.
      • Platz G.J.
      • Schulz B.L.
      响应真菌感染的大麦种子的内在和调节蛋白质组。
      );或主要成分分析(PCA)和群集与CLUSTVIS的热量(
      • Metsalu T.
      • vilo J.
      CLUSTVIS:使用主成分分析和Heatmap可视化多变量数据的群集的Web工具。
      )使用对所有酵母和葡萄蛋白质丰富的蛋白质丰富(
      • Kerr E.D.
      • Phung T.K.
      • Caboche C.H.
      • 福克斯G.P.
      • Platz G.J.
      • Schulz B.L.
      响应真菌感染的大麦种子的内在和调节蛋白质组。
      )。对于以糖肽为中心的分析,糖族丰度被标准化为所有检测到的相同肽形式的总和(
      • Kerr E.D.
      • Caboche C.H.
      • Schulz B.L.
      翻译后修饰驱动蛋白质稳定性来控制动态啤酒酿造蛋白质组。
      )。对于以蛋白质和糖肽为中心的分析,施加1%的肽FDR截止值。使用PRISM制作HeatMaps,版本7.00,用于Mac OS X(GraphPad软件),使用SCIDAVIS,1.25版绘制了手动注释的Spectra。

      结果

      鉴于调查起泡葡萄酒的蛋白质数量有限的研究(
      • Cilindre C.
      • Fasoli E.
      • D'Amato A.
      • Liger-Belair G.
      • righetti p.g.
      是时候在香槟的蛋白质组上弹出一个软木塞了!
      )和蛋白质在确定葡萄酒质量方面的可能重要性,我们旨在进行在不同条件下产生的闪亮葡萄酒蛋白质的综合和定量分析。出乎意料的是,初步LC-MS / MS蛋白质组学调查闪亮葡萄酒的胰蛋白酶摘要揭示了这些样品中的主要成分是糖肽(Fig. 2),前体质量用162Da(六六角)和132Da(PET)和含有对应于己糖离子的离子的MS / MS光谱,用于己糖和戊糖。糖肽的存在并不意外,因为在葡萄葡萄葡萄糖期间释放并在初级和二次发酵期间从酵母中分泌(Fig. 1)。然而,鉴于糖肽分析通常需要在样品制备期间富集富集血管肽肽的丰富令人惊讶
      • 徐Y.
      • 贝利U.M.
      • punyadeera c.
      • Schulz B.L.
      鉴定唾液 N甘油酸甘油蛋白富集素富集和液相色谱/电喷雾电离串联质谱法的糖蛋白和糖基化位点的测量。
      ,
      • alagesan K.
      • Khilji S.K.
      • Kolarich D.
      它全部关于溶剂:关于流动相对于Zic-Hilic糖肽富集的重要性。
      ,
      • 托丁三
      • Feasley C.L.
      • 伯梅兹A.
      • Pitteri S.J.
      N-连接的糖肽富集技术的平行比较揭示了SAX-ERLIC使能血浆的大量糖蛋白酶分析。
      )。糖蛋白对控制所有葡萄酒的清晰度很重要(
      • 水e.j.
      • Pellerin P.
      • 布里穆特星期日。
      葡萄酒阿拉伯酰胺蛋白,可减少热诱导的葡萄酒蛋白雾霾。
      ,
      • 水e.j.
      • Pellerin P.
      • Brillouet J.-M.
      酿酒酵母 甘养丁保护来自蛋白质雾麦的葡萄酒。
      ,
      • 杜普I.v.
      • 麦金纽芬
      • Ryan C.
      • Boulay M.
      • 标记A.J.
      • 琼斯G.P.
      • 威廉姆斯P.J.
      • 水e.j.
      酿酒酵母酿酒酵母 甘露黄蛋白保护来自蛋白质的雾霾:在发酵和LEES联系期间的释放以及其行动机制的提案。
      )在泡沫生产中特别重要,特别是在闪亮的葡萄酒中(审查(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
      • Marchal R.
      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
      )),但很少有关于葡萄酒和葡糖蛋白含量的蛋白质特异性糖基化和变化在葡萄酒和起泡葡萄酒生产过程中。这促使我们将我们的分析集中在汽油葡萄酒糖蛋白质上。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2LC-MS / MS蛋白质组学表明,糖肽在起泡酒中丰富。 8个月的Cuvée的胰蛋白酶碱基峰色谱图描绘了在整个LC-MS / MS实验中洗脱的最强烈肽和糖肽的保留时间曲线。 Pau,Seripauperin。肽和糖肽鉴定的细节显示在 , , 和 .

       构建糖肽离子文库

      为了允许通过体内鲁棒定量有效地测量现场特异性糖基化,我们开发了通过伴随γ与血管肽的糖肽鉴定的工作流程,与血管/直径糖肽量化。要创建一个SWATH / DIA库以允许通过SWATH / DIA测量糖肽,我们写了一个Python脚本来检索来自致电调试模式的前体和片段离子数据(参见 实验步骤 详细信息部分)。用DDA LC-MS / MS测量汽化葡萄酒样品的胰蛋白酶摘要,用γ型搜索,鉴定了手动验证的糖肽,以及用管道处理的数据。得到的血管/ DIA库含有142 Q1值(前体)和2849型转变(片段离子),用于16蛋白的糖肽(补充表S3)。 142 Q1值表示具有不同单糖组合物,肽序列和电荷状态的糖肽前体(104个独特的单糖组合物和肽序列)(补充表S4 和注释光谱 补充图。S1)。在鉴定的104个独特的糖肽的中,93个是 O - 与酵母相连,六个是 O - 链接和五 N - 与葡萄相连。不出意外地,来自酵母和葡萄的聚糖具有不同的单糖组合物。来自酵母的糖蛋白具有高甘露糖 N-Glycans和oligomannose. O-glycans(
      • Lesage G.
      • Bussey H.
      细胞壁组件 酿酒酵母酿酒酵母.
      ),而来自葡萄的糖蛋白具有高甘露糖或幼苗 N-glycans(
      • 霍瓦斯A.
      • Alayi T.D.
      • 范杜塞尔A.
      • Marchal R.
      • jegou s.
      • Schaeffer-Reiss C.
      使用质谱法的组合的葡萄浆果真空转化酶的深入糖蛋白表征。
      )和浮葡萄酒羟脯氨酸连接的阿拉伯糖和/或半乳糖 O-glycans(
      • Doco T.
      • 威廉姆斯P.
      香槟酒葡萄酒II型阿拉伯酰亚胺蛋白的纯化与结构表征。
      ,
      • Martinez-lapuente L.
      • 瓜达卢佩Z.
      • Ayestaran B.
      • Ortega-Heras M.
      • Perez-Magarino S.
      发光葡萄酒制作期间多糖组合物的变化。
      )。酵母 O - 我们鉴定的糖肽肽含有一至九个十六进制残基,最有可能曼诺斯(代表性光谱 Fig. 3, AB),而葡萄 O - 链接的糖肽含有一至六个肺活量,最可能是阿拉伯糖(代表性谱 Fig. 3C)。检测到的葡萄 N - 链接的糖肽含有单一的六氯残基或单糖组合物甲虫2十六进制3Dhex.1p1 或者 HexNAc3十六进制3Dhex.1p1 (补充图。S1 幻灯片132-136)。我们检测到的许多肽和糖肽是半晶体,表明在起泡葡萄酒生产或储存期间,其他酵母或葡萄蛋白酶活跃。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3酵母和葡萄的代表性数据相关的MS / MS光谱 O - 在闪亮的酒中肽肽。 每个面板含有糖肽的碎片模式的示意图;并非所有离子都已在光谱中标记,以便于解释。每个面板还包括用于通过直径定量的MS 2片段离子的代表性提取的离子色谱图。 A,VitgvpWyssr来自川5(Uniprot ID P43575),附有六个六角洲 m / z. 746.3205(3+)具有-17.15ppm前体质量误差。 B,来自Seripauperins 1至24的肽Vnlvelgvyvsdir,附着两个epexose m / z. 950.4798(3+)具有-14.42ppm前体质量误差。光谱的光谱 O - 链接肽 AB 来自分析8个月的火花Cuvée。 C,来自调用的脯氨酸富含细胞壁蛋白(国家生物技术信息参考NP_001268136.1)的肽VVRPPPTPPT在赛伐顿BLANC中发现,酵母DV10为16个月的酵母DV10。观察到六戊糖附着的糖肽 m / z. 714.6610(3+),具有-12.74ppm前体质量误差。小写脯氨酸代表羟脯氨酸的可能存在。

       蛋白质和糖蛋白丰富的变化

      为了探讨闪亮葡萄酒的糖蛋白质如何受到生产风格的影响,我们利用了我们的分析工作流程来调查三对商业规模的实验起泡葡萄酒:在LEES,Sauvignon Blanc上持续了8或24个月的Cuvée经历了DV10或ZymaFlore酵母的第二次发酵,以及用DV10或SiHa4酵母进行第二发酵的雷曲。为了评估蛋白质和糖蛋白丰富的差异,我们将我们的致癌衍生的糖肽文库与蛋白质组文库组合来自蛋白质论的搜索(补充表S5补充图S2)。我们在所有六种实验条件下鉴定了35个蛋白质。在35个蛋白质中,17次来自 V. Vinifera 18来自 S. Cerevisiae.,通过仅通过糖肽(其中11个属于酵母)来鉴定12种蛋白质。使用组合的文库,130个糖肽Q1值和219肽Q1值在峰景中可靠地测量,并用于计算34酵母和葡萄蛋白的丰度。
      我们使用34酵e和葡萄蛋白的丰富数据来研究每个样品中的总蛋白质丰度(Fig. 4A)葡萄酒之间的蛋白质丰富的统计学上显着的逻辑变化(Fig. 4B)。 Seripauperins是所有样品中最丰富的酵母蛋白。观察到的五种SeriPauperin(Pau)蛋白质均用至少一种独特的肽鉴定。然而,几种肽对于所有Seri​​Pauperins是常见的,因此不能获得个体基因产物的明确丰富信息。我们首先在8或24个月的Cuvée酒中调查蛋白质组学差异。该分析表明,与LEE仅有8个月相比,24个月的蛋白质丰度急剧下降( Fig. 4A),与所有蛋白质在这种延长的老化过程中的溶解度一般丧失一致。 PCA分析揭示了技术复制的聚类,并在LEE上的8和24个月内清除样品的分离(Fig. 4C)。我们接下来比较索维尼顿Blanc贱金葡萄酒,与DV10或ZymaFlore酵母进行第二次发酵。这种比较表明,总蛋白质含量几乎没有变化(Fig. 4A)根据用于二次发酵的酵母,相对较少的蛋白质差异丰富(Fig. 4B)。 PCA分析(Fig. 4C)证实了蛋白质组的紧密缔合。最后,我们比较了与DV10或SiHa4酵母一起进行第二次发酵的雷曲碱葡萄酒。该分析表明,与SIHA4相比,在发酵后,酵母蛋白通常相对于葡萄蛋白在发酵后的葡萄蛋白质较低(Fig. 4, AB)。 PCA(Fig. 4C)证实,用DV10发酵的RIESLING的蛋白质组不同于与SIHA4发酵的雷峰,并且实际上与24个月的Cuvée的蛋白质组有关。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4汽酒蛋白质水平分析。 A,对胰蛋白酶标准化的蛋白质的丰富的热线。值是技术三倍体的平均值的日志。 B,差异丰富的蛋白质的热爱(p < 10−5)实验组之间。值显示日志2 相对于8个月,24个月的Cuvée的折叠差异,16个月的Sauvignon Blanc相对于DV10和Riesling,17个月的Riesly与Siha4相对于DV10发酵。蛋白质名称列于(A)。酵母蛋白显示在下面的虚线和葡萄上方。用(o)或(n)标记的蛋白质用 O - 链接和 N - 链接的聚糖。 C汽油蛋白质组学和糖蛋白谱的主要成分分析。每个点代表技术复制(n = 3)来自实验组。该图显示了两个主组件(PC1和PC2),其方差与括号中的每个组件相关联。

       糖族丰富的变化

      我们接下来利用我们富含糖蛋白酶的数据集来探讨葡萄酒之间的占用血糖血管族的占用或组成的任何差异。我们计算了高置信度(Glyco)肽水平数据(FDR截止值1%)的糖蛋白丰度,并通过在含有该部位的所有电荷状态中的所有形式的肽或糖肽的总和的总和的综合强度的分数计算了糖族的相对丰度(s)糖基化。类似于蛋白质级型材,聚集的热线图(Fig. 5A)和PCA(Fig. 5B)证实了24个月的Cuvée的糖族分开与8个月的Cuvée分开聚集。这种全球糖蛋白分析鉴定了九种糖族,其在24个月相对于8个月的Cuvée中的丰富性显着不同,葡萄葡萄球菌的糖族糖族的含量最大的差异(Fig. 5C)。密切检查这些数据证实了在老年人的Cuvée(proM)中该肽的更高糖基化糖族的富集(Fig. 6A)。相比之下,在所有24 seripauperins共享的糖肽ER / VN / Lvelgvyvsdir的糖肽的丰度中观察到很少的差异(Fig. 6D)。用热图和PCA用DV10或ZymaFlore酵母发酵的Sauvignon Blanc糖蛋白酶的比较显示,两种条件的糖族密切相关(Fig. 5, AB),任何单个糖蛋白的丰度都没有显着差异(Fig. 5CFig. 6, BE)。与蛋白质水平分析一致,聚集热线图(Fig. 5A)和PCA(Fig. 5B)证实,用DV10发酵的雷曲的糖族不同于Siha4的发酵,并与24个月老人的Cuvée更紧密地聚集。九颗甘油膜在与DV10发酵的RIESLING中有显着差异(Fig. 5C)。我们观察到更高度高糖基化的糖肽Vitgvpwyssr / L(Hex2–9)用DV10发酵的RIESLY(Fig. 6C),在糖肽ER / VN / Lvelgvyvsdir的丰富糖族中观察到差异很小差异(Fig. 6F)。我们还观察到不同葡萄品种的汽油葡萄酒之间的特异性糖基化的差异。葡萄糖肽VVRPPPTPKPPT的糖族在Sauvignon Blanc样品中更为异质,与Cuvée和雷司令(Fig. 6G)。总之,这种糖蛋白丰富分析显示较大 O一些酵母蛋白质的糖蛋白富含Cuvée富含酵母,Sauvignon Blanc的糖蛋白酶差异有限,用DV10或ZymaFlore酵母发酵,用DV10或Shia4酵母发酵​​引发不同的酵母 O糖基化曲线和葡萄蛋白的糖基化与苏维尼顿Blanc不同于Cuvée和雷司令的糖蛋白。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5闪闪发光的葡萄酒显示不同的糖蛋白。 A,所有复制中的相对丰度的聚集热含量。使用相关距离和平均链接来聚集两行和列。具有标记的行(糖肽糖甘油膜)的完整聚类热映射可以在 . B,闪亮葡萄酒糖族丰度的主要成分分析。每个点代表技术复制(n = 3)来自实验组。该图显示了两个主组件(PC1和PC2),其方差与括号中的每个组件相关联。 C,差异丰富的糖蛋白的热敷(双尾 t 测试, p <0.05)。值显示日志2 相对于8个月,24个月的Cuvée的折叠变化,患有ZymaFlore的16个月相对于DV10发酵的16个月,以及相对于DV10发酵的Riesling 17个月。酵母SeriPauperin糖素显示在第一虚线上方,剩余的酵母糖型在虚线之间,葡萄甘油膜均低于下虚线。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6特定于特定的糖基化型材在实验起泡葡萄酒之间不同。 十六进制的相对丰富2–9 VitgvpWyssr / L肽的糖蛋白来自酵母Pau5(Uniprot ID P43575)。 A,在LEE上8岁或24个月的Cuvée。 B,Sauvignon Blanc用DV10或ZymaFlore发酵。 C,用DV10或SIHA4发酵的雷曲。未修饰和十六进制的相对丰富1–4 来自酵母SeriPauperins 1至24的ER / VN / Lvelgvyvsdir肽的糖蛋白。 D,在LEE上8岁或24个月的Cuvée。 E,Sauvignon Blanc用DV10或ZymaFlore发酵。 F,用DV10或SIHA4发酵的雷曲。 G,相对丰富的龙头1–6 Vvrppptpkppt肽的糖族富含葡萄脯氨酸的细胞壁蛋白质样前体(国家生物技术信息中心NP_001268136.1)。小写脯氨酸代表羟脯氨酸的可能遗址(如图所示的典型光谱) C)。在含有糖基化的位点的所有电荷状态中,丰度被表示为所有形式的肽或糖肽的总和的一部分。值表示技术三倍体的平均值。误差条显示标准偏差,并且*(双尾 t 测试, p < 0.05).

      讨论

      闪闪发光的葡萄酒生产商正在不断调查生产和分析方法,以提高最终产品的质量和稳健性。改善了对闪亮葡萄酒的产生变化影响其分子组合物的变化可以鉴定关键蛋白质及其改性,促进所需质量,例如清晰度,香气和可发泡性。在这里,我们描述了一种基于较强的MS基方法,其能够从少量起泡葡萄酒中定量蛋白质,糖蛋白和它们的糖基化型材。我们开发了一种自动化工作流程,它创建了来自致谐波搜索中鉴定的糖肽的过渡文库,用于SWATH / DIA分析。为了举例说明这种方法的使用,我们将其应用于三种实验葡萄酒,研究了老化对LES的影响以及如何不同的酵母菌株 利口酒De Tirrage. 改变成熟闪亮葡萄酒的糖蛋白质和蛋白质组学谱。我们调查了一个Cuvée,在Le恤上为24个月,与8个月的一个月相比。 Sauvignon Blanc经历了DV10或ZymaFlore酵母的二次发酵,并突然接受了DV10或SiHA4酵母的二次发酵。
      在这项研究中,我们确定了35个蛋白质(17来自 V. Vinifera 18岁.. S. Cerevisiae.)每次复制使用250μl闪亮的葡萄酒。虽然所识别的蛋白质的数量低,但重要的是要注意,在闪亮的葡萄酒中仅发现少量蛋白质(4-20 mg / L)(
      • Dambrouck T.
      • Marchal R.
      • Cilindre C.
      • 帕丁米
      • JeanDet P.
      在各种澄清处理之后,葡萄转化酶含量(使用PTA-ELISA)与葡萄酒总蛋白质含量的变化相反。与葡萄酒发泡性的关系。
      )。其他定性蛋白质组学研究调查基础葡萄酒和起泡葡萄酒实施的蛋白质浓度方法尚仅鉴定了有限数量的蛋白质(
      • KEMP B.
      • Conde B.
      • jegou s.
      • 豪威尔K.
      • vasserot y.
      • Marchal R.
      闪亮葡萄酒中泡沫形成和稳定的化学化合物和机制。
      ,
      • Cilindre C.
      • Fasoli E.
      • D'Amato A.
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      是时候在香槟的蛋白质组上弹出一个软木塞了!
      )。例如,未经处理的香槟碱(200ml)或霞多丽葡萄酒(15ml)的研究确定了9至13个葡萄蛋白,最多15酵e蛋白(
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      )。使用组合肽配体文库的未经处理的伏特葡萄酒的另一个研究,具有4个pH条件的每个pH条件使用750ml原料(
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      Mehercules,Adhuc Bacchus!关于葡萄酒蛋白质组学的辩论仍在继续。
      )。本研究确定了106 V. Vinifera 和其他viridiplantae蛋白和11个酵母蛋白。使用具有750ml起始原料的组合肽配体文库的闪亮葡萄酒的单独深入研究鉴定了12个葡萄蛋白和7酵母蛋白(
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      是时候在香槟的蛋白质组上弹出一个软木塞了!
      )。因此,我们的结果与闪亮葡萄酒蛋白质组的低浓度和复杂性一致,并表明使用小的250μl样品体积,可以对葡萄酒糖蛋白的深入分析进行。
      随着糖肽在汽酒中丰富(Fig. 2),我们在蛋白质分析中包括肽和糖肽的测量。这是对葡萄酒和起泡葡萄酒研究的重大改进,这忽略了甘肽对整个蛋白质组的大量贡献。该蛋白质水平分析显示,与8个月的老年人相比,24个月的Cuvée总蛋白质丰度降低(Fig. 4A)。在起泡葡萄酒生产中第二个发酵后,酵母细胞活力和蛋白质分泌减少(
      • Nunez Y.P.
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      酵母加速自分解对香菇法阐述闪亮葡萄酒组成及发泡性能的影响。
      ),衰老9个月后,通常不留下可行的酵母细胞(
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      )。我们在24个月观察到的蛋白质含量的进一步减少可能是因为正在进行的蛋白质聚集(
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      蛋白质组学方法揭示的酵母蛋白酶通过酵母蛋白酶酶活性水解。
      )。令人惊讶的是,即使在LEE上延长老化后,我们才确定 善意 分泌的酵母蛋白,而不是细胞内蛋白质,表明酵母自分解对老化的荧光葡萄酒蛋白质组的影响并不像以前认为那样广泛。我们以蛋白质为中心的分析还揭示了Sauvignon Blanc蛋白质丰富的蛋白质丰度变化,不同的酵母菌菌株DV10和ZymaFlore在与SiHa4发酵的发酵相比,在RIESling发酵中检测到酵母蛋白的降低。在二次发酵期间,不同的酵母菌株在生长动力学,活力和自溶性性质中变化,这可以改变蛋白质和游戏葡萄酒中的单次糖含量(
      • Nunez Y.P.
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      酵母加速自分解对香菇法阐述闪亮葡萄酒组成及发泡性能的影响。
      )。酵母性能和活性的这种差异可能考虑我们在用DV10发酵的RIESLING中观察到的较低的酵母蛋白质含量。
      我们发现Seripauperins是闪亮葡萄酒中最丰富的酵母糖蛋白(Fig. 4A)。 PAU5 表达在低温下诱导,低氧气,类似于酿酒过程中使用的条件(
      • 罗Z.
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      强调诱导的Seripauperin蛋白,Pau5p的生产,加工和稳定性 酿酒酵母酿酒酵母.
      )。 Pau5也被鉴定为糖蛋白,可能会降低自发溢出的汽酒(
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      由葡萄酒进行比较蛋白质剖面分析 Botrytis cinerea 感染和健康的葡萄揭示了一种新的生物标志物,用于涌出闪亮的葡萄酒。
      ),一种称为涌出的现象,其被消费者视为负面。讨厌的缺陷或未检测水平与涌出的高可能性有关(
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      由葡萄酒进行比较蛋白质剖面分析 Botrytis cinerea 感染和健康的葡萄揭示了一种新的生物标志物,用于涌出闪亮的葡萄酒。
      ),而添加来自农神经的纯化的天然斗5稳定泡沫形成(
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      酵母蛋白Pau5的泡沫稳定性能和对必须和葡萄酒中浓度影响的因素的评估。
      )。
      除了以蛋白质为中心的丰富,我们还通过测量甘肽的强度来量化糖族的相对丰度(图。 5.6)。为此,我们通过使用致答复软件搜索DDA文件,在鉴定糖肽后,在凝结糖肽之后创建了一种糖肽的转型库。据我们所知,我们的研究是葡萄酒或汽酒中蛋白质糖基化谱的最深入调查(
      • kupfer v.m.
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      糖蛋白概况在葡萄酒中:“甜蜜”的分子文艺复兴。
      )。除了在非特帕尔灵甘露甘露甘露尼甘露甘露糖蛋白中除去聚糖后,其他基团已经研究了蛋白质糖基化,识别44 N - 链接的网站(
      • Palmisano G.
      • Antonacci D.
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      糖蛋白概况在葡萄酒中:“甜蜜”的分子文艺复兴。
      )。我们在我们的工作中识别出这些网站(位点N184,蛋白质P21,或XP_0022829888.1)中附着两种交替糖族。另一组研究了白色闪亮葡萄酒(
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      由葡萄酒进行比较蛋白质剖面分析 Botrytis cinerea 感染和健康的葡萄揭示了一种新的生物标志物,用于涌出闪亮的葡萄酒。
      )。与我们在糖肽水平的结果类似,作者注意到在完整分析后对蛋白质的改性(己糖)给蛋白质(
      • kupfer v.m.
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      • Niessen L.
      由葡萄酒进行比较蛋白质剖面分析 Botrytis cinerea 感染和健康的葡萄揭示了一种新的生物标志物,用于涌出闪亮的葡萄酒。
      )。最后, N - 已经研究了从葡萄中分离的纯化葡萄芳棒逆变酶的链接糖基化必须(在按下葡萄后产生)(
      • 霍瓦斯A.
      • Alayi T.D.
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      • Schaeffer-Reiss C.
      使用质谱法的组合的葡萄浆果真空转化酶的深入糖蛋白表征。
      )。该研究确定了脱糖基化后的10位点,其中一项也在我们的工作中鉴定在与附着的一种糖果(位点N101,Beta-FructofuraniDaIsidase,XP_002265534.1)中的合作中鉴定。
      我们鉴定了酵母来源的更多糖肽,而不是从葡萄,93与11相比,这表明在起泡酒中存在的主要糖蛋白来自酵母。这突出了二次发酵在为闪亮葡萄酒提供碳酸化和风味化合物时的重要性,以及如何衰老如何促进可能影响其复杂感官特征的更复杂的生物分子。这一发现与研究鉴定甘露糖作为发光葡萄酒中存在的主要自由单糖(
      • Nunez Y.P.
      • Carrascosa A.v.
      • Gonzalez R.
      • polo m.c.
      • Martinez-Rodriguez A.J.
      酵母加速自分解对香菇法阐述闪亮葡萄酒组成及发泡性能的影响。
      )。我们的糖肽的数据显示,具有较大的聚糖的一些糖肽在老年人的Cuvée中富集。这种效果可能是由于通过较大的聚糖提供的溶解度增加,从而降低蛋白质的倾向或免受低水平的蛋白酶活性(Fig. 6, AC)。然而,老化后的所有位点未富集大型聚糖,表明蛋白质中的糖基化的精确位点对于确定其在葡萄酒老龄化期间影响其在影响稳定性时的功能至关重要(Fig. 6, DF)。
      总之,我们开发了一种敏感方法,可用于识别和测量糖蛋白及其特异性修饰,以研究其对闪亮葡萄酒的感官特性的重要性。来自小体积汽油的蛋白质和糖族特异性定量方法的发展将非常有用,并互补其他工具,这些工具测量闪亮葡萄酒的感觉特性,以确定与所需结果相关的特异性蛋白质。我们开发的小规模的定量工作流程也可以应用于静止或基础葡萄酒,以研究其蛋白质组和糖蛋白的特征,这有助于葡萄酒品质。更广泛地,我们为SWATH / DIA糖蛋白组织开发的工作流程将适用于对其他不同复合糖蛋白的研究。

      数据可用性

      小姐 蛋白质组学数据已被沉积在Proteomexchange联盟中 通过 蛋白质组学识别(
      • Perez-Riverol Y.
      • Csordas A.
      • 白j.
      • Bernal-Llinares M.
      • 赫瓦帕·纳拉纳S.
      • kundu d.j.
      • Inuganti A.
      • 怜悯J.
      • Mayer G.
      • 艾森凯母线
      • 佩雷斯E.
      • Uszkoreit J.
      • Pfreuffer J.
      • Sachsenberg T.
      • 伊利马萨斯。
      • 等等。
      2019年的自豪数据库和相关工具和资源:提高对量化数据的支持。
      )与DataSet标识符PXD019572的合作伙伴存储库。

      利益冲突

      Christopher H. Caboche.由葡萄酒澳大利亚研究奖学金PH1903支持。其他提交人声明没有竞争利益。

      致谢

      作者感谢Amanda Nouwens博士,昆士兰大学,化学和分子生物科学大众化设施学院,提供援助和专业知识。他们真诚地感谢Schloss Vaux Winery提供实验葡萄酒,并鼓励出版这些结果和教授Mark Strobl博士和Shraddha更多来自Hochschule Geisenheim University,他能够获得葡萄酒。

      作者捐款

      K. H.和B. L. S.构思了这项研究; C.L.P.,C.H.C.C.和S. N.进行实验; C.L.P.,T.K.P.,M.B.和B.L.L.S。发达了新的分析工作流程; C.L.P.,T.K.P.和B. L.S.分析数据; C.L.P.,T.K.P.和B. L.S.写了稿件。所有作者都编辑了稿件。

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