定量蛋白质组学显示神经元投影发展基因的关联 ARF4, KIF5B , 和 RAB8A 随着Hirschsprung疾病

开放访问发布:12月7日,2020年 DOI: //doi.org/10.1074/mcp.RA120.002325

      强调

      • Hirschsprung疾病患者的人结肠组织大规模,定量蛋白质组学。
      • 平行反应监测,蛋白质印迹和免疫组织化学染色进行验证。
      • 与差异表达蛋白质相关的四种途径:核糖体,内吞作用,抗血糖组和轴突引导。
      • ARF4,KIF5B和RAB8A在Aganglionic(狭窄)结肠段中的下调。

      抽象的

      Hirschsprung疾病(HSCR)是一种异质的神经病病变,其特征在于沿着肠道的可变长度没有肠道神经节。遗传缺陷在HSCR的发病机制中发挥着重要作用,而所有已知基因(基因座)的致病变体的家庭研究仅展示了不完全的渗透率和可变的表达,而原因是未知的原因。在这里,我们从21例患者应用了大规模的人性结肠组织,使用同学标签用于相对和绝对量化。方法后面进行生物信息学分析。通过并行反应监测验证确认了所选结果。最后,通过Western印迹确认有趣的差异表达蛋白质。鉴定了人结肠组织中总共5341个蛋白质。其中,664个蛋白质>在六组中鉴定了1.2倍差异:来自雄性神经节和Aganglionic结肠的组A1和A2汇集蛋白,长段HSCR患者(n = 7); B1和B2群来自神经节和aganglionic结肠的B1和B2蛋白质,短段HSCR患者(n = 7);来自女性的神经节和aganglionic结肠的C1和C2汇集蛋白,短段HSCR患者(n = 7)。基于这些分析,选择来自五种途径的49个蛋白,用于平行反应监测验证,包括核糖体,内吞作用,抗血糖组,氧化磷酸化和细胞粘附。三个神经元投影发展基因的下调 ARF4, KIF5B , 和 RAB8A 在使用Western印迹的15个成对的结肠样品中验证了结肠的Aganglionic部分。本研究的结果将在HSCR发病机制上揭示新的光线,并促进治疗目标的发展。

      图形概要

      关键词

      缩写:

      奴隶 (肠道神经系统 ), (基因本体论 ), HSCR. (Hirschsprung病 ), itraq. (用于相对和绝对量化的等离标签 ), ke (Kyoto基因和基因组的百科全书 ), PRM. (并行反应监测 ), WB. (Western Blot.)
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      罕见,编码和非划分的差异贡献,对多因素Hirschsprung疾病责任。
      )。参与肠柱神经系统(ENS)的其他分子,例如GDNF(RET受体配体),EDN3 / EDNRB信号传导途径,转录因子(SOX10,PHOX2B,ZEB2),SEMAS(轴突引导分子),L1CAM(细胞粘附分子)和PROKR1 / 2(协调用GDNF)被验证通过HSCR的易感基因进行编码(
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      )。此外,许多研究还记录了平滑肌蛋白质,细胞外基质分子,离子通道和HSCR结肠中的各种其他重要分子的缺陷。尽管如此,对所有这些致病变异的家庭研究表明了不完全的渗透和可变性表达,其原因在很大程度上是不明原因的(
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      用ITRAQ和串联质谱法测量肺腺癌和正常肺组织线粒体蛋白的定量蛋白质组学分析。
      )。已施加质谱(MS)基于二维凝胶电泳,以研究与HSCR发育相关的蛋白质。然而,以前的研究全部受到该技术本身的相对较低的分辨率(
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      患有Hirschsprung疾病患者的狭窄和正常结肠段组织之间差异表达蛋白质的蛋白质组学分析。
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      人类Hirschsprung疾病中正常和Aganglionic后肠的比较蛋白质组学谱。
      )。这里,我们对串联质量标签进行了基于MS的蛋白质组学分析(用于相对和绝对量化[ITRAQ]的阻碍标签)标记。分层聚类,基因本体(GO)注释,以及基因和基因组(KEGG)的京都百科全书(KEGG)分析并分类蛋白质组学数据。通过来自HSCR患者的狭窄(Aganglionic)和正常(神经节)结肠分段组织的平行反应监测(PRM)进一步验证有趣的差异蛋白。 ARF4,KIF5B和RAB8A的下调通过Western印迹确认。通过免疫组织化学染色在正常结肠组织的粘膜和神经元丛中观察到所有三种蛋白质的强烈表达。我们的研究探讨了HSCR患者的狭窄结肠分段组织的第一次蛋白质组学变化,并提出了对疾病的病因和发病机制的理解。

      实验步骤

       人类主题

      总共21例诊断出孤立的HSCR(7雄S-HSCR:2-10岁的男性S-HSCR,平均值= 5.6个月; 7男性L-HSCR:2-6岁,平均值= 3.0个月; 7雌性S-HSCR:招募并研究了2-11个月,平均= 4.7个月)。在手术期间收集所有肠组织,在冰上运输,并在-80℃下储存以供以后使用。 Honglionic和Aganglionic Segments都用免疫组化染色和病理学家的检查证实。查看详细信息 补充表S1S2.

       蛋白质提取

      用于提取人结肠组织蛋白的一步动物组织活性蛋白提取试剂盒(C500006,盛公,中国)。对于每个样品,使用50mg人结肠组织提取蛋白质。在每次样品中加入1ml预冷却试剂(用1μl蛋白酶抑制剂,5μl蛋白酶抑制剂,1μlDTT和10μLPMSF),将组织用均化器和超声波破碎,30每次,8到10次,间隔为1分钟。离心15分钟后,将上清液转移到新的预冷却Eppendorf管中,用于过滤辅助样品制备实验的下一步骤。

       过滤辅助样品制备

      如图所示 补充表S1,实验样品包括六组,每个患者的混合样品是相同的诊断。简而言之,每组将7例与诊断相同诊断(每个患者14.3μg)的蛋白质混合为每组100μg。通过3KD过滤器(UFC500396,Millipore,Thermo Fisher Scientific)浓缩来自每组的总蛋白质。将每100μg样品加入到300μL尿素溶液中并以14,000离心g 30分钟。然后,加入30μL10mMDTT(297μLUA+3μL1MDTT)并在37℃下孵育1小时。然后,加入15μL1mM碘乙酰胺,在室温(RT)下将溶液在黑暗中保持20分钟,然后以14,000离心g 45分钟。接下来,加入300μL尿素溶液以洗涤三次,然后用300μLNH洗涤三次4 HCO 3。将总蛋白质溶于100μL25mM碳酸氢铵缓冲液中并在-80℃下储存在下一个实验。

       蛋白质消化和ITRAQ标签

      在ITRAQ标记实验之前,如上所述提取的50μg蛋白质,胰蛋白酶化。过夜消化后,根据制造商的协议,使用4-Plex Itraq标签套件(AB SCIEX,目录:4466096)进行ITRAQ标签。如图所示执行ITRAQ标签 表格1 :用ITRAQ试剂114标记用作含有来自所有基团样品的对照的混合物,用Itraq试剂115标记A1和B2; A2和C1用Itraq试剂116标记;用Itraq试剂标记C2和B1。接下来将来自六组的浓缩的ITRAQ试剂标记的消化样品在250μL加载缓冲液A(20mM甲酸铵,pH10)中溶解并在分馏之前将其组合成一个管。
      表格1 ITRAQ标记详细信息
      类型 L-HSCR男性神经节L-HSCR男性AganglionicS-HSCR男性神经节混合物(用A1,A2,B1,B2,C1,C2合并)S-HSCR男性AganglionicS-HSCR女神经节S-HSCR女性Aganglionic
      亚组A-1A-2B-1 混合 B-2C-1C-2
      ITRAQ标签115116117114∗2115116117
      HSCR. ,Hirschsprung病; L-HSCR,长段HSCR; S-HSCR,短段HSCR。

       高pH单D反相色谱分级

      在配备有最终3000 RS泵的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统上进行肽混合物的分馏,终极3000 RS柱隔室和最终3000 RS自动进样器(Dionex)。如上所述在样品注射之前,将柱在缓冲液A(20mM铵甲酸铵,pH10)中以70分钟平衡。使用线性梯度以1%B /分钟的速率从2±45%流动相B(pH值在pH下,使用直线梯度增加(Gemini-nx 3u c18 110a; 1502.00 mm)上注射到现象柱(Gemini-nx 3u c18 110a; 1502.00mm)上。 10; B:20mM HcoonH4,80%在pH10中,在200μl/ min的流速下,同时监测214nm / 280nm的UV吸光度。在运行过程中每分钟收集级分。随后,将所有48个收集的级分混入14个组分,冻干,并在纳米LC-MS / MS分析之前保持在-80℃。

        HPLC / MS.

      将胰蛋白酶摘要注入最终的3000 rslcnano系统(Dionex),并通过Q辐射HF质谱仪(Thermo Scientific)分析。将胰蛋白酶消化物悬浮在缓冲液A(0.1%甲酸)中,并直接装载到适度的Pepmap100 C1875μm×20mm陷阱柱(Thermo Fisher Scientific)以进行预浓缩和在线脱盐。然后使用易于喷雾肽C1875μm×150mm柱(Thermo Fisher Scientific)进行分离,采用4至90%乙腈在300nl / min超过150分钟的线性梯度。 Q-Factive HF MS系统(Thermo Fisher Scientific)在全MS /数据相关的采集MS / MS模式(数据相关的采集)中运行。斜拉瓣质量分析仪以60,000的分辨率使用,以获得350至2000的M / z范围的全MS,其中包含3E6的目标自动增益控制值和20ms的最大填充时间。使用5E5的自动增益控制目标和60ms的最大填充时间,以30,000的横向分辨率测量MS / MS片段。在壁图中获得了350至2000的M / Z范围内的全扫描MS光谱。 MS / MS分析分离出20个最强烈的离子。使用蛋白质组发现(2.1.0.81,Thermo Fisher Scientific)进行处理原始数据,搜索人类组蛋白的数据库(www.uniprot.org.,访问2016年2月,91,974次序列)。肽是由多达四个错过的裂解,半胱氨酸的氨基甲酰化作为固定改性的肽,以及蛋氨酸的氧化作为可变改性。前体质量耐受性为20ppm,并以0.05Da耐受搜索产物离子。使用基于Q值的Q值以1%的假发现速率验证肽光谱匹配。此处分析的数据集已存入Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org) 通过 IPROX合作伙伴存储库(
      • 马杰。
      • 陈T.
      • 吴S.
      • 杨C.
      • 白云
      • 舒克。
      • 李克。
      • 张G.
      • 金Z.
      • Hermjakob H.
      • 朱y
      IPROX:综合蛋白质组资源。
      )使用PXD021292的数据集标识符。

       开发和分析验证有针对性的MS测定/测量

      通过虚假发现率的肽被出口到文本文件并由PRM处理。大规模包容列表涉及质量,充电和极性。提供了PRM分析中靶向的所有肽的清单 补充表S3。 PRM方法是根据第3层水平分析开发的。使用Skyline进行PRM方法设计和数据分析(Ver。20.2.0.286)。通过在线连接的Dionex终极3000纳米HPLC上通过LC-MS / MS分析样品,该LC-MS / MS在线连接到配备有易于喷射离子源(Thermo Sciencific)的Q辐射HF混合四极轨道 - 轨道质谱仪。通过在300 nl / min的易喷涂肽C18柱(2μm; 15cm×75μm,Thermo fisher Scientific)上直接注射肽,在300nl / min,从4至90%的溶剂b,静脉/分钟以300 nl / min的溶剂梯度直接喷射150分钟(B:80%ACN / 0.1%甲酸/ 20%水,A:2%ACN / 0.05%甲酸/ 98%水)。质谱仪被配置用于PRM采集。选择每组的六个样品进行PRM。使用蛋白质组发现(2.1.0.81,Thermo Fisher Scientific)进行处理原始数据,搜索人类组蛋白的数据库(www.uniprot.org.,访问2016年2月,91,974次序列)。这里分析的蛋白质组发现结果已被沉积到Proteomexchange联盟中(http://proteomecentral.proteomexchange.org) 通过 具有PXD021292的数据集标识符的IPROX伙伴存储库。

        PRM. 数据分析

      使用Skyline(版本20.2.0.286; ab sciex)处理得到的MS数据。肽设置:酶被设定为胰蛋白酶[KR / p],最大遗漏的裂解设定为0,将肽长度设定为7至25,并将固定改性设定为Cys的氨基甲酰基。过渡设置:将前体电荷设定为2,3,将离子电荷设定为1,离子类型设置为B,Y。将产物离子从离子3设置为最后的离子,并将离子匹配耐受设定为0.02da。通过提取精确的片段离子的峰面积来定量肽,然后整合在肽的洗脱型材上。对于每种肽,通过在延伸的所有肽的过渡峰面积的平均值标准化过渡峰区域。所有检测到的肽的强度的总和用于比较差异。如果在样品中未检测到肽,或者光谱不良好,则除去一个样品,并留下至少五个样品进行统计分析。

       实验设计与统计理由

      将21例患者的结肠组织蛋白分为六组,每个患者的混合样品是七名患者的诊断(雄性S-HSCR,雄性L-HSCR和雌性S-HSCR)。消化了来自每组的总蛋白质,使用ITRAQ标记来进行定量蛋白质组学。使用来自所有基团的样品的混合物用作对照,以将蛋白质水平标准化两批。在定量分析的结果中,我们使用至少两个独特的肽来鉴定蛋白质,并且使用每个通道的丰度来计算鉴定的蛋白质的平均值。然后我们设置比率阈值>1.2用于蛋白质上调和<0.83(1 / 1.2)用于蛋白质下调。
      折叠变化大于1.2和a的蛋白质 p value <0.05定义为显着差异表达。通过学生检测的火山曲线分析筛选出显着改变的蛋白质 t-测试。蛋白质组织蛋白质折叠变化的直方图用于证明正常数据分布。来自A1,A2,B1,B2,C1和C2组的六个个体的样品被随机选择用于PRM验证。使用GraphPad Prism进行PRM的统计分析6. PRM数据通过未配对,双尾进行分析 t-测试。统计显着性被认为是 p value <0.05。所有数据都表示为平均值±标准错误。

       Western Blot(WB)分析

      使用Sangon Kit(Sangon Biotech,中国)从人结肠组织中提取总蛋白质。用10%SDS-PAGE(Sangon Biotech)分离等量的变性蛋白质,然后转移到硝酸纤维素(NC)膜(Millipore Corporation)中。在室温下用10%脱脂牛奶封闭NC膜,并与一抗原发抗体(抗ARF4,1:1000稀释,AB171746,ABCAM;抗KIF5B,1:1000稀释,AB167429,ABCAM;抗RAB8A;抗RAB8A ,1:3000稀释,AB188574,ABCAM;和抗β-肌动蛋白,1:1000稀释,#3700,CST)过夜。冲洗后,将NC膜进一步与适当的二抗在室温下孵育2小时。应用ECL试剂(GE Healthcare)以可视化带信号。带的灰度值被标准化为相应的β-肌动蛋白条带的值以确定蛋白质的表达水平。

       免疫组织化学

      使用生物素 - 链霉抗生物素蛋白复合方法对从石蜡包埋嵌段获得的3μm部分进行免疫组化研究。将组织切片在二甲苯(四次,20分钟)中的脱碱化,用分级乙醇(100%,90%,80%和70%)再水化,并在蒸馏水(5分钟)中漂洗。在pH9.0和140℃下用Tris / EDTA进行抗原检索2分钟。用3%h治疗后2O2 (北京Yili)在37℃下甲醇含15分钟以阻断内源性过氧化物酶,用PBS中的5%牛血清白蛋白封闭部分,并与抗ARF4(1:500稀释,AB171746,ABCAM)孵育。在4℃下,抗KIF5b(1:100稀释,AB167429,ABCAM)和抗RAB8A(1:700稀释,AB188574,ABCAM)过夜。用0.1米PBST洗涤后; pH 7.4; (5分钟,3次),根据制造商的说明,使用Polink-2加上聚合物辣根过氧化物酶检测系统检测抗体。用PBS洗涤后,用3,3'-二氨基苯并二甲基四氯化物试剂盒(DAKO)来观察反应。所有样品均用哈里斯苏木精染色,在乙醇中使用盐酸分化,并使用氨水的浓度。最后,将载玻片脱水在分级醇中,用二甲基苯结合,并安装中性胶。使用当量的PBS代替一抗原抗体进行阴性对照。来自人肾,脑和胃的组织切片作为初级抗ARF4抗体,抗KIF5B抗体和抗RAB8A抗体的阳性对照。通过两个独立的病理研究人员评估染色的组织样品。使用尼康E800数字显微镜捕获图像。

      结果

       用于发现和验证HSCR相关蛋白的工作流程的概述

      我们的实验策略如图所示 图1。对于发现步骤,从雄性,L-HSCR(n = 7),雄性,S-HSCR(n = 7)和雌性,S-HSCR(n = 7)组中的神经节和aganglionic部分产生的蛋白质通过ITRAQ量化分析。蛋白质>鉴定了六组的1.2倍差异。对于验证步骤,基于事先研究中发现的信息来建立一个目标PRM研究,以验证ITRAQ发现研究的定量发现。最后,使用Western印迹在15个成对的结肠样品中验证了三种神经元投影显影分子,ARF4,KIF5b和Rab8a的下调。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1实验程序的工作流程。用于鉴定患有综合性HSCR的六组儿童中差异表达蛋白质的工作流程的概述。 (A1:雄性L-HSCR患者的合并神经节部分(n = 7); A2:阳性L-HSCR患者的Aganglionic部分(n = 7),B1:雄性S-HSCR的合并神经节部分(n = 7) ,B1:雄性S-HSCR(n = 7),C1:C1:颈部S-HSCR(n = 7),C2:C2的汇集神经节部分,C2:汇集雌性S-HSCR(n = 7)。结肠收集六组的组织。通过胰蛋白酶萃取蛋白质和消化。来自每个样品和汇集的内部参考样品的肽被随机分布并在两个ITRAQ实验中标记。通过串联质谱进行粘合并分析样品并分析。该使用蛋白质组发现者鉴定数据。基于定量结果施加生物信息学分析,使用PRM实验验证了所选择的感兴趣的蛋白质。此外,WB用于证实HSCR相关蛋白质。HSCR,HIRSCHSprung病; L-HSCR ,长段HSCR; PRM,并联反应培养蛋白G; S-HSCR,短段HSCR; WB,Western Blot。

       使用ITRAQ标记和LC-MS / MS鉴定差异表达蛋白质

      通过ITRAQ偶联的2DLC-MS / MS分析,共鉴定了总共5341个蛋白质在人结肠组织中。其中,在批量1中检测到4907个蛋白质;分批2检测4792蛋白;两批检测到4358(补充图。S1)。显示包括这些已识别的蛋白质的蛋白质量化日期和平均ITRAQ比的详细信息 补充表S4-S6。蛋白质>分析了雄性L-HSCR,雄性S-HSCR和雌性S-HSCR患者的1.2倍差异。在雄性L-HSCR组中,与神经节部分相比,上调1169个蛋白质,下调了846个蛋白质。在雄性S-HSCR组中,在与神经节部分相比的Aganglionic部分中,上调了816个蛋白质,下调了1073个蛋白质。在雌性S-HSCR组中,在与神经节部分相比的Aganglionic部分中,上调了834个蛋白质,下调了1160个蛋白质( Fig. 2A)。共有664例常见蛋白质显示出显着改变的水平,A1和A2,B1和B2和C1和C2之间的折叠截止值≥1.2,Fig. 2B补充表S7 )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2基于测序结果的生物信息学分析. A,上调和下调的蛋白质>雄性L-HSCR,雄性S-HSCR和雌性S-HSCR患者差异为1.2倍。 B,显示在三组神经节和Aganglionic部分中所有差异表达蛋白质的重叠(A1和A2:雄性L-HSCR; B1和B2:雄性S-HSCR;和C1和C2:雌性S-HSCR)重叠。 C,108个常见差异表达蛋白的分层聚类。条形表示从-1.5到1.5的对数刻度。 D,细胞组分,生物过程和分子函数的基因本体富集结果。这 p 每个术语的值(-log10)显示在水平轴上,纵轴表示术语名称。 E,通过泡沫图表显示反应性富集结果。水平轴显示每个途径的富因子。每个途径所涉及的基因数由气泡的尺寸反射,而颜色代表每个 p 价值。 BP,生物过程; CC,细胞组分; HSCR,Hirschsprung病; Kegg,Kyoto基因组百科全书; L-HSCR,长段HSCR; MF,分子函数; S-HSCR,短段HSCR。

       生物信息学分析

      在所有六组中显着改变的一百八个蛋白质进行聚类分析(Fig. 2C)。结果表明,A1,B1和C1聚集在一组,A2,B2和C2聚集到另一组。这些结果表明,HCSCR患者的神经节和Aganglionic部分之间存在一些常见差异。六百六十四次常见蛋白质>选择1.2倍的差异,用于基于David数据库的进一步生物信息学分析(//david.ncifcrf.gov)。 GO分析包括生物过程,分子功能和细胞组分。选择前10个项目绘制 图2.D。途径分析用于根据Kegg数据库中的途径对蛋白质进行分类;选择前13个途径绘制 图2.E。基于串数据库(以下)分析蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)(//string-db.org),并显示所有664蛋白的PPI结果 补充图S2。通过在0.9处设定置信度值获得304蛋白的PPI网络,然后使用Cytoscape 3.7.1来调节PPI图。最后,通过选择程度≥5获得117个键蛋白的PPI网络(Fig. 3 )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)网络分析差异表达蛋白质。使用String软件进行117个关键差异表达蛋白的网络分析(//string-db.org/)。置信度值设定为0.9,度≥5。如图所示,用六条彩色线绘制边缘(参见图例中的详细信息)。

        PRM. 验证差异表达的蛋白质

      接下来,为了验证差异表达的蛋白质,选择六组的胰蛋白酶消化蛋白质用于PRM。根据Kegg和David的分析结果,选择了与差异表达蛋白质相关的四种途径:核糖体,内吞作用,抗血糖组和氧化磷酸化。此外,我们还选择了细胞粘附分子,其先前已知与HSCR相关,并且总计到49个蛋白质。通过天际线分析的靶肽的轮廓显示在 补充表S8。 25个蛋白质的PRM结果与ITRAQ一致。其中,确认在三个患者组的所有Aganglionic区段中确认九个核苷类 - 三磷酸酶活性蛋白,DDX5,ATP2A2,TUBB6,EIF4A1,NSF,RAB8A,ARF4,RAC2和KIF5B。部分结果显示在 图4.:在三组的Aganglionic部分中,数量肽“QDLPNAMAISEMTDK”的表达水平降低(ARF4的所有检测到的肽)和总和(Fig. 4, AB);所有检测到的RAB8A,KIF5B,ATP2A2和RAC2的总和几乎都显着降低(Fig. 4, CF)。这些结果与ITRAQ结果一致,表明在HCSCR患者的结肠的Aganglionic部分中核苷类 - 三磷酸酶的活性降低。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4使用PRM测量的五种核苷三磷酸酶活性蛋白质的相对蛋白质水平。 A1:男性L-HSCR的神经节部分; A2:男性L-HSCR的Aganglionic部分。 B1:男性S-HSCR的神经节部分; B2:雄性S-HSCR的Aganglionic部分。 C1:女性S-HSCR的神经节部分; C2:雌性S-HSCR的Aganglionic部分。数据代表平均值±SEM。 *p ≤ 0.05; ∗∗p ≤ 0.01; ∗∗∗p ≤ 0.001; ∗∗∗∗p ≤0.0001。 aganglionic部分与神经节部分进行比较;这 p 使用未配对计算值 t 测试。 A在A组中,A1和A2的ARF4肽QDLPNAMAISEMTDK强度为6.427E8±3.431E7(n = 6)和3.328E8±1.403E7(n = 6), p <0.0001;在B组中,B1和B2的ARF4肽QDLPNAMAISEMTDK强度为7.235E8±5.877E7(n = 6)和4.832E8±4.310E7(n = 6), p = 0.0080;在C组中,C1和C2的ARF4肽QDLPNAISEMTDK强度为7.435E8±4.452E7(n = 6)和3.784E8±7.738e7(n = 6), p = 0.0022. B,在A组中,A1和A2 ARF4中的所有检测到的肽强度的总和为1.215E10±4.241e8(n = 6)和7.602e9±1.678e8(n = 6), p <0.0001;在B组中,B1和B2的ARF4中的所有检测到的肽强度的总和为1.288E10±7.956E8(n = 6)和1.068E10±2.301E8(n = 6), p = 0.0243;在C组中,C1和C2的ARF4中的所有检测到的肽强度的总和为1.442E10±2.400E8(n = 6)和1.160E10±1.0008(n = 5), p = 0.0086. C,在A组中,A1和A2的Rab8a中的所有检测到的肽强度的总和为1.607e7±1.070e6(n = 6)和6.333e6±589071(n = 6), p <0.0001;在B组中,B1和B2的Rab8a中所有检测到的肽强度的总和为2.086E7±3.409E6(n = 6)和1.199E7±1.029E6(n = 6), p = 0.0319;在C组中,C1和C2的Rab8a中的所有检测到的肽强度的总和为1.200e7±682642(n = 6)和8.135e6±1.878e6(n = 6), p = 0.0818. D,在A组中,A1和A2的KIF5B中的所有检测到的肽强度的总和为7.795E9±6.902E8(n = 6)和4.763E9±3.846E8(n = 6), p = 0.0033;在B组中,B1和B2的KIF5B中的所有检测到的肽强度的总和为4.693E9±3.017E8(n = 6)和3.513E9±1.534E8(n = 6), p = 0.0059;在C组中,C1和C2的KIF5B中的所有检测到的肽强度的总和为1.693E8±1.735E7(n = 6)和5.742E7±1.075e7(n = 5), p = 0.0006. E,在A组中,A1和A2的ATP2A2中所有检测到的肽强度的总和为6.842E9±1.913E8(n = 6)和3.972E9±9.854E7(n = 6), p <0.0001;在B组中,B1和B2的ATP2A2中的所有检测到的肽强度的总和为4.810E9±5.061e8(n = 6)和3.565e9±1.181e8(n = 6), p = 0.0376;在C组中,C1和C2的ATP2A2中的所有检测到的肽强度的总和为7.778E9±3.011e8(n = 6)和6.642E9±1.639E8(n = 5), p = 0.0123. F,在A组中,A1和A2的RAC2中的所有检测到的肽强度的总和为2.707E9±1.072E8(n = 6)和1.840E9±9.096E7(n = 6), p = 0.0001;在B组中,B1和B2的RAC 2中的所有检测到的肽强度的总和为4.610E9±4.172E8(n = 6)和3.498E9±2.521E8(n = 6), p = 0.0458;在C组中,C1和C2的RAC2中的所有检测到的肽强度的总和为2.443E9±1.642E8(n = 6)和1.710E9±2.632E8(n = 6), p = 0.0397。 HSCR,Hirschsprung病; L-HSCR,长段HSCR; S-HSCR,短段HSCR。

       ARF4,KIF5B和RAB8A在正常结肠标本中的免疫组织化学染色

      在PPI分析中,在PRM,三个关键蛋白,ARF4,KIF5B和RAB8A中验证的25个蛋白质,在PPI分析中被归类为串数据库中的神经元投影蛋白。为了进一步了解疾病中可能的病理作用,然后我们使用免疫组织化学染色来定位ARF4,KIF5B和RAB8A在结肠组织中。在正常结肠组织的粘膜和神经元族宫内观察到所有三个神经元投影显影蛋白的强烈表达。省略一抗作为阴性对照。在阴性对照组中没有检测免疫染色(Fig. 5 )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5ARF4,KIF5B和RAB8A在正常结肠切片中的免疫组织化学染色。在粘膜中观察到ARF4,KIF5B和RAB8A的强烈表达(B, CD)和近期(F, GH)正常结肠组织中的丛。在阴性对照组中没有检测免疫染色(AE)。示出了代表性的结肠部分。条:200μm。 NC,负面控制。

       ARF4,KIF5B和RAB8A的蛋白表达水平

      最后,为了在蛋白质水平处确认ARF4,KIF5B和RAB8A中的改变,我们进行了WB分析。总共检查了15个配对样品,来自A,B和C组的5个。我们的研究结果表明,与神经节段的蛋白段中,蛋白表达水平显着降低(p < 0.05) (Fig. 6)。通过剥离膜的β-肌动蛋白染色证实了等量的装载量。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6 WB. 确认了HSCR患者Aganglionic段中ARF4,KIF5B和RAB8A的下调表达。 显示了代表性染色带(A ,ARF4; B,kif5b, C,rab8a)。通过β-肌动蛋白染色证实了等量的装载量。值作为平均值±SD(D)。 g,神经节细分; A,Aganglionic段。 HSCR,Hirschsprung病; WB,Western Blot。

      讨论

      我们在这里提出了人类HSCR最普遍的亚型的定量蛋白质组织景观,通过免疫组化染色,综合PRM验证,WB验证和随后的形态学检查。使用来自L-和S-HSCR影响的男性患者的结肠组织,以及诊断出S-HSCR的女性患者,利用强大的蛋白质组学和生物信息学工具探索不同性别和表型存在的共享和亚型特异性改变的蛋白质组 - 分配的HSCR,提供对这种复杂人类疾病的生物学的见解,具有可变的富有效力。在六组中,664名常见蛋白质>鉴定了1.2倍差异并选择进一步调查。 GO分析表明,差异表达的蛋白质主要在抗剪蛋白酶(mRNA剪接),轴突引导,细胞外外出组,细胞溶胶和蛋白质结合中的作用。在使用KEGG的同时,识别13种途径以显着富有富集的关联信号 p <0.05级,包括抗乳糖组,碳代谢,轴突引导,内吞作用和粘附结。这些信号传导途径受到不同蛋白质的显着影响,这些发现可以为未来的人类潜在的分子机制的研究提供有价值的信息。
      中,检测到108个蛋白质,具有所有亚组之间的一致变化趋势,并进行分层聚类分析。观察到正常(Ganglionic-A1,B1和C1)和所有狭窄(Aganglionic-A2,B2和C2)结肠段组织之间的清晰区别。雄性,S-HSCR患者(B1)中正常结肠组织的蛋白表达模式与男性,L-HSCR患者(A1)中的蛋白表达模式比在雌性,S-HSCR患者(C1)中更类似于雄性,L-HSCR患者(A1)。类似地,雄性,L-HSCR患者(A2)中狭窄结肠组织的蛋白质表达模式意外与雌性,S-HSCR患者(C2)的蛋白质表达模式比男性,S-HSCR患者(B2)的患者更相似,建议(1)蛋白质丰度和正常肠道组织中的表达模式似乎在不同的性别之间存在差异,与女性相比,它们与女性更相似,反之亦然; (2)在女性中表现出的HSCR的阈值可能显着高于男性,因此定义了异常蛋白表达的类似模式(和程度)将存在于L-HSCR(A2)中的类似模式(和程度)与S-HSCR(C2)的雌性一样。对于更大的样品大小和深入分析的研究将有助于更好地搜索HSCR标志性的性别差异的潜在病因。
      在25例与ITRAQ结果一致的验证蛋白质中,其中三种(ARF4,KIF5B和RAB8A)被串数据库归类为Neuron投影显影相关蛋白,作为参与发展缺陷的良好候选者奴隶。随后的WB实验证实了它们在患者结肠狭窄区段内的下调,并且观察到正常结肠组织中的宽,强烈的表达,包括粘膜和神经元丛。 ARF4是20-KDA细胞蛋白,最初被鉴定为人ADP-核糖基化因子基因家族的成员。作为人AADP-核糖基化因子的最分歧的成员,ARF4参与控制众多细胞功能,包括微管和肌动蛋白细胞骨骼的组装和动力学,内膜运输,脂质代谢,线粒体结构和细胞中的其他途径生物学(
      • 费舍尔斯。
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      ARF家庭GTP酶与纤毛的链接。
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      用于人ADP-核糖基化因子的mRNA和相关假基因的选择性扩增,霍乱毒素的鸟嘌呤核苷酸依赖性蛋白激活物。
      )。全球淘汰赛 Arf4 在小鼠中被证明是胚胎致命的,突变动物显示睫状体组件的严重缺陷。珍珠 等等。 (
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      ARF4的丧失导致外分泌胰腺的严重变性,但不是囊性肾病或视网膜变性。
      )发现敲门声 Arf4 在产后第2天(P2)导致P10导致死亡率提高。 P10的幸存者比它们的凋落物小,尸检显示出较小的胰腺,较低的肠道呈黄色粪便,并且内脏内胚层中的微血管异常。据报道,KIF5B,迄今为止迄今鉴定的〜40 kinesin超家族蛋白质中鉴定的蛋白质中的一种,作为神经系统中含RNA颗粒的分子电机(
      • Kanai Y.
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      Kinesin传输RNA:分离和表征RNA输送颗粒。
      )。 RNA运输是局部蛋白质合成的重要且基本的事件,特别是在神经元中。发现树突蛋白合成的过程通常伴随着可塑性并参与突触强度的长期变化(
      • 雷蒙德C.R.
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      • 亚伯拉罕瓦氏。
      代谢谷氨酸受体引发纯度蛋白合成延长长期增强。
      );这种变化是建立ENS的关键。 Rab8a属于小GTP / GDP结合蛋白的RAS超家族,平均尺寸为200氨基酸。该蛋白质分别与狗rab8和小鼠MEL蛋白共享97%和96%的相似性,并含有四种全部Ras蛋白的GTP / GDP结合位点,在内质网的蛋白质中起重要作用到高尔基和血浆膜(
      • Cromm下午
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      通过涉及隧道纳米管的接触,RAB8依赖性机理进行转铁蛋白受体的细胞间转移。
      )。作为LRRK2的磷酸化底物,证明Rab8A参与巨噬细胞损坏的末端膜的修复(
      • 草本S.
      • 坎贝尔P.
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      LRRK2激活控制巨噬细胞损坏的损伤的修复。
      ),介导内糖瘤贩运改变并导致家族帕金森病(
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      • Romo-lozano M.
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      RAB10和RAB29在致病性LRRK2介导的底糖组织贩运改变中的不同作用。
      )通过控制偏振膜贩运事件来协调内皮细胞小管发生(
      • Norden P.R.
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      用RAB和RAL GTP酶控制内皮细胞生成,以及Caveolin-1标记的真空吸附的顶端靶向。
      )。总的来说,这些分子的功能障碍是否破坏神经元投影发育并导致较高的HSCR风险仍有待阐明的风险。
      蛋白质是一组多样化和复杂的分子,有助于生物系统的巨大复杂性。除了巨大的功能性不同的蛋白质外,生物多样性和人类特征的扩展谱也来自后术中的修饰,这不能从核酸序列预测。因此,定量蛋白质组学分析可以提供在缺陷细胞或组织中发生的功能畸变的更现实的图像,并导致发现可能参与疾病所涉及的器官的发展的新型模块或途径。

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过IPROX合作伙伴存储库(
      • 马杰。
      • 陈T.
      • 吴S.
      • 杨C.
      • 白云
      • 舒克。
      • 李克。
      • 张G.
      • 金Z.
      • Hermjakob H.
      • 朱y
      IPROX:综合蛋白质组资源。
      )使用DataSet标识符PXD021292。

      利益冲突

      提交人声明他们没有利益冲突。

      伦理批准

      本研究经受资本儿科研究所的医学伦理委员会(Sherll 2013039)的批准,并根据赫尔辛基议定书宣言进行。

      致谢

      我们感谢许多受影响的个人及其家庭,其合作使这项研究成为可能。

      资金和其他信息

      中国国家自然科学基金(81971397),北京医学研究所(BMR2019-11)的公共服务发展和改革试点项目以及资本儿科研究所的研究基金( PY-2018-02)对QZBB的支持得到了中国国家自然科学基金(81901167)。 Z.Z. Z.是中国国家自然科学基金(81700451)的支持。 Q. L.得到北京市托管孵化计划(PX2020054)的支持。 Q. J.得到了中国医学科学院授予的创新医学(CAMS-I2M)和中国国家自然科学基金(81771620,82070532)的支持。

      作者捐款

      Q. Z.和L.-h. W.准备了稿件。 Q.,Z.,H.W.和L. L. L. L. L. L.S.进行样品征集和收集的临床信息。问:Z.,B.-L. B.和D.1.提取蛋白质,进行蛋白质消化,Itraq标记,色谱分级,HPLC / MS,数据分析和PRM验证。 L.-h. W.进行了WB实验。 L.-h. W.和P. X.进行免疫组织化学染色。问:Z.和Q. J.监督研究并编辑了手稿。

      支持信息

      参考

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