呼吸机相关肺炎先天免疫应答机制的分子分析

      呼吸机相关的肺炎(VAP)是一种常见的医院收养感染,导致发病率高,死亡率高。目前,Bronchoalveolar灌洗(BAL)用于医院,用于VAP诊断和指导治疗方案。虽然BAL收集程序是侵入性的,但替代品如气管术吸气(ETA)可能具有诊断价值,但是,它们的使用尚未彻底探索。纵向ETA和BAL被从16例预热患者收集,最多15天,其中11个发达的VAP。我们进行了综合的LC-MS / MS MS蛋白质组和代谢物表征纵向ETA和BAL,以检测宿主和病原体对VAP感染的反应。我们发现了一种富含富有的宿主微生物界面的上呼吸道的多样性ETA蛋白质组。在通过BAL的微生物培养物的VAP诊断之前,患者ETA呈现反应性氧物质和中性粒细胞脱粒的特征特征,指示中性粒细胞介导的病原体处理作为对VAP感染的关键宿主响应。随着氨基酸的增加,这表明嗜中性粒细胞蛋白酶的蛋白水解活性引起的细胞外膜降解。 MetaproTome方法成功地允许同时检测患者ETA中的病原体肽,其可能潜在用于诊断。我们的研究结果表明,ETA可以促进与VAP感染相关的宿主病原体相互作用的早期机械洞察力,因此提供其诊断和治疗。

      图形概要

      呼吸机相关的肺炎(VAP)是第二个最常见的医院收购的医院收购(ICU)(ICU),有关美国所有与海海相关死亡的60%(
      • Niederman M.S.
      医院患有肺炎,医疗保健肺炎,呼吸机相关的肺炎和呼吸机相关的气管咽喉炎:试验设计中的定义和挑战。
      )。它在机械通风后至少发生48小时,在美国每年占300,000多种。 (
      • Niederman M.S.
      医院患有肺炎,医疗保健肺炎,呼吸机相关的肺炎和呼吸机相关的气管咽喉炎:试验设计中的定义和挑战。
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      • Koenig S.M.
      • Truwit J.D.
      呼吸机相关的肺炎:诊断,治疗和预防。
      )。机械通风可以损伤气管上皮,促进环境微生物定植和从鞋面到下航向的迁移(
      • mangram a.j.
      • Sohn J.
      • 周恩。
      • HOLLINGWORTH A.K.
      • Ali-Osman F.R.
      • Sucher J.f.
      • Moyer M.
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      创伤相关的肺炎:在创伤患者中重新定义呼吸机相关肺炎的时间。
      )。所有患有长期住院的ICU患者都有高风险,越来越高的风险,增加了住院费用40,000至每位患者50,000美元(
      • mangram a.j.
      • Sohn J.
      • 周恩。
      • HOLLINGWORTH A.K.
      • Ali-Osman F.R.
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      创伤相关的肺炎:在创伤患者中重新定义呼吸机相关肺炎的时间。
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      )。 VAP诊断主要是基于临床标准,如发烧,胸部射线照相浸润,白细胞计数以及来自支气管肺泡灌洗(BAL)的阳性培养物(BAL)(
      • Koenig S.M.
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      住院肺炎和呼吸机相关肺炎的临床实践指南。
      )。患有创伤患者,这些症状通常是非特异性,导致真正的VAP发作的高估导致广谱抗生素不足的处方(
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      创伤患者临床肺部感染评分的无用。
      )。涉及300名美国医院的研究表明,与非临界护理相比,重症监护单位(ICU)的抗生素消费率增加了52%(
      • 袋子J.
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      )。此外,VAP占ICU中使用的一半超过一半的抗生素,这可能导致多毒性(
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      在ICU的呼吸机相关的肺炎。
      )。基于培养的测试可以降低抗生素滥用,但它是耗时的,并且可以延迟诊断和治疗。因此,需要仔细研究VAP发病机制,以更好地了解宿主对微生物脱泻病的响应,并对感染进展的分子机制提供见解。
      以前的研究提出了几种候选生物标志物(白细胞介素-1β,白细胞介素-8,在骨髓细胞类型1,C反应蛋白(CRP),ProCalcitonin和Pro-adrenomedullin的中区域片段中表达的可溶性触发受体)以帮助VAP血清,等离子体或BAL的诊断(
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      生物标志物动力学在预测VAP诊断:BIOVAP研究的结果。
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      对呼吸机相关肺炎诊断的ProCalcitonin的有用性。
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      肺白细胞介素-1beta和白细胞介素-8在呼吸机相关肺炎中的诊断重要性。
      )。其中,白细胞介素-1β和白细胞介素-8已在VAP诊断中成功验证(
      • Conway Morris A.
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      肺白细胞介素-1beta和白细胞介素-8在呼吸机相关肺炎中的诊断重要性。
      )。此外,大多数这些蛋白质是炎症标志物,并且显示出可变的敏感性和对VAP检测的特异性(
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      肺泡和血清ProCalcitonin:呼吸机相关肺炎的诊断和预后价值。
      )。这提高了潜在的误诊问题,并强调需要进一步研究特定的VAP生物标志物。
      bal是一种广泛接受的基质,用于研究肺部感染(
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      支气管肺泡灌洗液蛋白质组学分析在呼吸机相关肺炎患者危重患者中。
      )。许多研究已经证明了使用BAL进行微生物培养,16S rDNA分析和确定宿主反应免于VAP感染(
      • nguyen e.v.
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      16S Pan-Bacterial PCR可以准确地识别呼吸机相关肺炎的患者。
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      多发性呼吸机相关肺炎的发病率和结果。
      )。气管膜吸气(ETA)被视为非侵入性呼吸抽样的来源,最近已经推荐用于VAP诊断中的半定量培养物(
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      执行摘要:有医院收购和呼吸机相关肺炎的成人管理:2016年传染病社会和美国胸部社会的临床实践指南。
      )。然而,ETA的分子组成尚未被宣传为BAL以了解宿主对感染的反应。我们假设涉及ETA采样的减少的侵袭性是在早期感染期间允许更频繁频繁的纵向分子快照和对微生物菌群的变化。我们预计这种增强的粒度可以为VAP发病机制提供有价值的机械洞察力。我们使用了一种多学科方法,整合蛋白质组学和定量代谢组织对纵向ETA和来自插管患者的匹配BAL进行本研究。

      实验步骤

       化学品

      除非另有说明,否则化学品和溶剂是从Sigma-Aldrich(St.Louis,Mo)或Fisher Scientific(San Jose,CA)采购的。本研究中使用的化学物质是Ar级,甲酸(Fa)和溶剂是LC-MS等级。

       标本系列

      在Monemealth Osborne Medical Centre,斯科茨代尔,AZ的ICU Trauma中心机械通风患者注册了这项研究。从患者或法律相对获得书面知情同意书。样品收集的临床议定书由医院的机构审查委员会和西方制度审查委员会批准,Puyallup,WA。所有实验程序符合赫尔辛基宣言和卫生和人类服务贝尔蒙特报告所载的原则。患有阳性临床症状的患者(≥48小时插管,发烧>38.4°C),胸部Xco.3的脓性分泌物,新的或渐进性肺浸润的增加),以及使用BAL用于致病微生物的阳性培养试验(大肠杆菌, 假单胞菌铜绿假单胞菌, 金黄色葡萄球菌, Serratia marcescens., 链球菌 C组, 肠杆菌肝脏, 肠杆菌空气原味, Proteus mirabilis., 或者 念珠菌白葡萄酒)被诊断为VAP。通过BAL微生物培养测试支持VAP的临床诊断。使用两次截止物来确定测试积极性。截止10,000至100,000 CFU(菌落形成单位)被解释为存在优势单病原体,而>100,000个CFU被解释为存在多种潜在病原体。胸部X射线是对入学患者进行的所有患者进行的。没有临床症状迹象的患者被称为控制。 ETA每隔一天收集,从Intubation的第一天开始,直到拔管。临床症状后,将BAL被收集,作为护理标准程序(Fig. 1)并用于微生物培养以帮助临床诊断。通过将50cc的无菌生理盐水引入支气管内腔来完成BAL收集,以除去粘液塞,分泌物和碎片。概述了研究队列和纵向收集的详细描述 表I.。 ETA和BAL Biopececens都收集在无菌管中,并立即冷冻并在收集地点储存在-80°C。将样品解冻,过滤用0.45μ灭菌m UltraFree-Cl HV离心过滤器(Millipore,Billerica,MA),并储存在-80°C直至进一步加工。在这项研究中, 基线 被定义为控制和VAP患者的插管的第一天,和 v积极 作为VAP诊断的日子。在VAP诊断之前2天收集ETA被定义为 预vap.后VAP., 分别。对照组中的其他时间点被定义为 控制。该分类用于蛋白质组学和代谢组学数据分析。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1A,患者队列,样品收集和抗生素治疗。 16例插管患者注册了该研究,并根据临床诊断的呼吸机相关的肺炎(VAP)分类在控制和病例组中。插管的持续时间由每位患者的黑色概要箱的长度表示,而抗生素处理的持续时间由彩色线的长度表示,并且在图例中提供抗生素处理的类型。在整个插管期间每隔一天收集气管插管(ETA)样品。按照所示收集支气管肺泡灌洗(BAL)样品。 B,在临床诊断患者中检测到BAL培养中检测到的VAP病原体的百分比。 MSSA =甲氧西林敏感 金黄色葡萄球菌,MRSA + =耐甲氧丙胺 S.金黄色葡萄球菌.
      表I.队列特点
      患者ID团体年龄性别天管天eta.
      a ,b为每位患者进行ETA或BAL系列的数量;
      bal
      a ,b为每位患者进行ETA或BAL系列的数量;
      文化测试
      c 括号中的值表明对应于阳性培养测试的插管日;
      临床VAP.
      d 插管后诊断患有肺炎的患者被分类为“延迟”。
      1控制25M11N
      2控制73M32N
      3控制44F33N
      4控制33F51N
      5控制91F11N
      6案件50M95+(
      • Povoa P.
      • Martin-Loeches I.
      • Ramirez P.
      • Bos L.D.
      • esperatti m.
      • Silvestre J.
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      • Artigas A.
      生物标志物动力学在预测VAP诊断:BIOVAP研究的结果。
      )
      延迟
      7案件26M95+(
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      )
      Y
      8案件65F1372+(
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      )
      Y
      9案件32F1372+(
      • Povoa P.
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      • Artigas A.
      生物标志物动力学在预测VAP诊断:BIOVAP研究的结果。
      )
      Y
      10案件80F741+(
      • Kalanuria A.A.
      • Ziai W.
      • Zai W.
      • mirski m.
      在ICU的呼吸机相关的肺炎。
      )
      延迟
      11案件70M1161+(
      • Cocanour C.S.
      • Ostrosky-zeichner L.
      • 潘格林米
      • 加拉德D.
      • Tidemann T.
      • Domonoske B.D.
      • 李T.
      • 艾伦S.J.
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      呼吸创伤密集护理单元中呼吸机相关肺炎的成本。
      )
      Y
      12案件71M74+(
      • Rotstein C.
      • 埃文斯G.
      • 出生A.
      • 格罗斯曼r.
      • 灯r.b.
      • 玛格斯。
      • MCTAGGART B.
      • Weiss K.
      • Zhanel G.G.
      住院肺炎和呼吸机相关肺炎的临床实践指南。
      )
      Y
      13案件77M1372+(
      • mangram a.j.
      • Sohn J.
      • 周恩。
      • HOLLINGWORTH A.K.
      • Ali-Osman F.R.
      • Sucher J.f.
      • Moyer M.
      • Dzandu J.K.
      创伤相关的肺炎:在创伤患者中重新定义呼吸机相关肺炎的时间。
      )
      Y
      14案件75M137+(
      • mangram a.j.
      • Sohn J.
      • 周恩。
      • HOLLINGWORTH A.K.
      • Ali-Osman F.R.
      • Sucher J.f.
      • Moyer M.
      • Dzandu J.K.
      创伤相关的肺炎:在创伤患者中重新定义呼吸机相关肺炎的时间。
      )
      Y
      15案件79M1371+(
      • mangram a.j.
      • Sohn J.
      • 周恩。
      • HOLLINGWORTH A.K.
      • Ali-Osman F.R.
      • Sucher J.f.
      • Moyer M.
      • Dzandu J.K.
      创伤相关的肺炎:在创伤患者中重新定义呼吸机相关肺炎的时间。
      )
      Y
      16案件56M1574+(
      • mangram a.j.
      • Sohn J.
      • 周恩。
      • HOLLINGWORTH A.K.
      • Ali-Osman F.R.
      • Sucher J.f.
      • Moyer M.
      • Dzandu J.K.
      创伤相关的肺炎:在创伤患者中重新定义呼吸机相关肺炎的时间。
      )
      Y
      eta =气管插管,bal =支气管肺泡灌洗,
      a ,b为每位患者进行ETA或BAL系列的数量;
      c 括号中的值表明对应于阳性培养测试的插管日;
      d 插管后诊断患有肺炎的患者被分类为“延迟”。

       蛋白质组学分析

      使用AMICON Ultra-3KDA离心过滤器(Sigma-Aldrich)浓缩ETA和BAL,使用供应商的协议。使用Pierce BCA测定套件(Thermofisher Scientific,San Jose,CA)测量蛋白质浓度。评估了用于制备BAL和ETA样品的各种方法,并进行了总结在射击蛋白质组学分析中 补充方法S1。由于BAL和ETA的免疫拼接产生优异的蛋白质鉴定(〜708个独特的蛋白质,至少-2.5倍),而来自ETA和BAL的其他方法(凝胶消化,溶液消化和纳米粒子捕获/洗脱)(补充图。S1),选择这种方法进行生物流体的样品制备。从ETA和BAL回收的蛋白质的总量在160μg和406μg之间。使用刺穿前12个丰富的蛋白质耗尽旋转柱(Thermof Serian)免疫蛋白质量(160μg)的每种BAL或ETA样品的蛋白质量(160μg)。对流过蛋白质溶液进行改性过滤剂辅助样品制剂(
      • wiśniewskij.r.
      • Zielinska d.f.
      滤液辅助样品制备方法对蛋白质组学和N-糖蛋白分析超滤单元的比较。
      )。
      简而言之,将样品进行缓冲液交换到50米m 使用8M尿素(1小时)变性碳酸氢铵缓冲液,pH7.8和蛋白质,使用1米减少m DTT(1小时,37℃),并用40米烷基化m 碘乙酰胺(1小时,37℃)。免疫缩水后的蛋白质回收率为5μg和35μg。该可变蛋白质回收可以通过ETA和BAL蛋白质的动态浓度范围,不同量的高丰度蛋白如IGS,大葡萄糖蛋白和不同阶段的传递素,以及由于盐水洗涤而产生的基质稀释效应在BAL系列期间。在37℃(Promega,Madison,Wi),用胰蛋白酶金消化蛋白质过夜。使用C18 SPE盒(水,Milford,MA)脱盐并用70%乙腈(ACN)用0.1%三氟乙酸洗脱(v / V.)(水)。将洗脱的肽真空干燥并在-20℃下冷冻直至LC-MS / MS分析。在分析日,在0.1%甲酸中重构肽样品并使用BCA测定定量。胰蛋白酶消化后肽的回收率范围为2μg至20μg。来自ETA和BAL的免疫蛋白质恢复的差异限制了我们进行技术复制的能力。样品制备和数据采集分别随机化以最小化偏差。使用纳米型超高性能液相色谱系统(水)与耦合到侧面的融合Lumos Tribriat质谱仪(Thermo Fisher)进行LC-MS / MS分析。将来自每个样品的一μg肽在A BE1中分离C18,1.7μm,0.1×100mm柱(水)使用83.5分钟梯度,从3至90%溶剂B(ACN,0.1%Fa)和97-10%溶剂A(水,0.1%Fa),流速为0.5μL/分钟。将下列梯度条件用于1分钟,7至25%B的1至72分钟,25至45%B,10分钟,45至90%B 0.5分钟,90%B为0.5 min和柱平衡为3%b持续10分钟。在扫描范围内获得MS光谱 M /Z 380至2000使用120,000分辨率的orbitrap,然后使用前体离子的四极性隔离(宽度1.6),用于数据依赖的高能量碰撞解离MS / MS以顶速,目标自动增益控制值为50,000,最大60毫秒注射时间和60秒的动态排除。具有电荷状态的+ 2至+7的前体在离子阱中的标准化碰撞能量下分离为35%。 大肠杆菌 在每个批次和5个样品的批次和支架之前和之后注射胰蛋白酶摘要(柱)(柱上的250 ng)以评估运行间变异性。利用以下参数将含有42,150个蛋白条目的近期人类数据库(2015)的人类数据库(2015)进行搜索原始数据,该数据库(2015)含有以下参数:胰蛋白酶规则,最多2错过了切割,固定半胱氨酸氨基甲酰化(+ 57.021Da)和可变甲硫氨酸氧化(+15.995Da)。前体和产物离子容差分别设定为10ppm和0.5 da。目标假发现率设定为1%。使用基于曲线(AUC)下的前体离子区域的无标记定量进行肽定量。蛋白质组发现者的渗滤器用于计算肽和PSM的严格阈值的假发现率,并且对于0.05的松弛阈值。
      对于微生物蛋白质组学,我们策划了由革兰氏阳性,革兰氏阴性细菌和酵母组成的常见VAP病原体列表(补充表S1)来自文学。列出的病原体的蛋白质组Fasta文件(革兰氏阳性细菌和酵母病原体:397,142蛋白条目,革兰氏阴性细菌病原体:4,760,935个蛋白条目)被用作微生物组数据库,并使用上面提到的吉祥物搜查了本研究中产生的蛋白质组学原始数据参数。将PSM扫描数与匹配的人肽进行比较,以检查可能是由于PTMS的重叠。任何人和VAP病原体之间常见的肽仅被分配给人肽。保持对细菌和酵母的肽进行下游分析。使用unipept v4.0进一步验证了来自元标题数据的肽序列(
      • Gurdeep Singh R.
      • Tanca A.
      • Palomba A.
      • van der jeugt f.
      • vershaffelt p。
      • Uzzau S.
      • 玛特L.
      • Dawyndt P.
      • Mesuere B.
      Unipept 4.0:MetaproTome数据的功能分析。
      )对于他们对微生物病原体的特异性并进行分类学表征。
      为了验证MS观察,MPO(AB119605)和ELANE(AB11955)水平通过ELISA(ABCAM,剑桥,MA)根据制造商的说明进行VAP和控制ETA样品。

       有针对性的代谢组科分析

      AbsoluteIDQ®P180套件(BICOCRATE LEFE SCIENCES AG,Innsbruck Austria)用于量化185个代谢物。使用供应商的说明进行提取和数据分析。简而言之,使用苯二硫氰酸酯对来自10μlBAL或ETA的代谢物进行衍生化。使用5米提取衍生化代谢物m 乙酸铵在甲醇中,然后是溶剂萃取。制备ETA和BAL系列的样品池并用作样品质量控制(QC)。三份QCS通过运行序列同样地分布。数据采集​​在与XEVO TQ-S质谱仪(Waters)耦合的Acquity UPLC上进行。对于所有ETA和BAL,同时定量进行以下:21个氨基酸,21个生物胺,40个酰基氨基碱,89个甘油磷脂。使用MetIDQ™分析数据。在微摩尔单元中测量所有浓度。在整个手稿中使用甘油磷脂磷脂(Lysopc X:Y),甘油磷脂(PC AA X:Y和PC AE X:Y)和鞘磷脂(SM X:Y,SM [OH] X:Y),甘油磷脂酰磷脂(PC AA X:Y和PC AE X:Y)。 X表示侧链中的许多碳,Y表示不饱和脂肪链的数量。对于脂肪酸,“AA”和“AE”分别用甘油部分和脂肪酸与脂肪醇和甘油的脂肪酸代表脂肪酸。

       实验设计与统计理由

      实验设计包括来自16名插管患者的纵向ETA和BAL系列(11名VAP患者,以及5种控制 表I.)。对于VAP组,每位患者收集3至8个纵向ETA样品,而在对照组中,每位患者收集最多3个ETA样品(总共74个ETA和13个BAL样品)。由于先前描述的样本限制,未执行技术复制。由于患者接受了护理标准,因此在收集期间未进行随机化。所有样品都随机进行处理和数据采集。相对蛋白质丰度为LOG2转化。在VAP患者中,只有80%的蛋白质只有80% 基线 或者 v积极 选择用于下游蛋白质组学分析。还比较了这些蛋白质的丰富 基线 从对照患者。对于定量代谢组学,只有代谢物<将QC样品测量中的20%变异系数(CV)用于下游分析。代谢产物>从分析中取出50%缺失值,并且通过链式方程(小鼠)对剩余的缺失值进行多变量归档(
      • Azur M.J.
      • stuart e.a.
      • Frangakis C.
      • 叶P.J.
      链接方程的多重归责:它是什么以及它如何工作?
      )。使用中值蛋白质丰度或代谢物中值浓度进行时间聚类。使用Shapiro-Wilk测试测试蛋白质组学和代谢组学数据的分布。两个数据集都没有正常分布(p >0.05)因此使用Wilcoxon Rank-Sum测试进行非参数分析。使用Benjamini-Hochberg调整p值 后HOC. 测试。比较以下样品组: v积极基线, 预vap.基线后VAP.基线。蛋白质或代谢物与 p < 0.05或adj。 P. < 0.05 被认为是显着的。基因本体(GO)注释使用TOPPFUN进行(
      • 陈杰。
      • 吟呦诗人
      • aronow b.j.
      • Jegga A.G.
      TOPPGENE套件用于基因列表浓缩分析和候选基因优先级。
      )。途径分析是使用反应和智能途径分析(IPA,QIAGENNIC.)进行的(
      • Fabregat A.
      • Sidiropoulos K.
      • Garapati P.
      • Gillespie M.
      • Hausmann K.
      • haw
      • 亚马尔B.
      • 茱满
      • Korninger F.
      • McKay S.
      • 马修斯L.
      • 可能。
      • 米拉尼亚米
      • rothfels k。
      • Shamovsky V.
      • 韦伯M.
      • Weiser J.
      • 威廉姆斯米
      • 吴G.
      • Stein L.
      • Hermjakob H.
      • d'eustachio p.
      反应途径知识库。
      ,
      • 克拉默A.
      • 绿色J.
      • Pollard Jr.,J.
      • Tugendreich S.
      思想途径分析中的因果分析方法。
      )。这 P-eta.蛋白的值和折叠变化被输入到IPA中,并映射到人类的革命性知识库,默认值越突出的VAP患者中的富集途径。激活Z分数由IPA软件计算,以确定途径,疾病和生物学功能的正面或负面富集。分数分别预测正或负Z分数的形式增加或减少。使用Bland-Altman分析进一步评估ETA和BAL矩阵之间的相似性的蛋白质组学和代谢组合数据(
      • Giavarina D.
      了解Bland Altman分析。
      )。

      结果

       研究队列

      我们的研究队列由16名创伤患者组成,长达15天。这些患者11种表现出肺炎(VAP患者)的症状,五个未呈现任何肺部感染迹象(对照患者)。临床注释和抗生素方案描述于 表I.Fig. 1A。插管的持续时间比对照患者(≤5天)更长的vap(≥7天)。在插管时,共有8名患者,包括3名对照患者和5名VAP患者,均为抗生素,而剩余的2个对照和6名VAP患者没有抗生素。在VAP患者中,与没有抗生素相比,插管时的抗生素预防并未显示出任何更好的保护;此外,抗生素预防对机械通气长度没有明显的效果。进一步的抗生素治疗按照BAL培养和临床诊断排列。基于BAL文化, 金黄色葡萄球菌 是最常见的VAP病原体:7例患者甲氧西林敏感 S.金黄色葡萄球菌 (MSSA)和2例患者抗甲氧西林 S.金黄色葡萄球菌 (MRSA) (Fig. 1B)。随着我们研究群体的所有患者进行抗生素的标准治疗方案,不会评估它们对患者蛋白质组和代谢物的影响。

       Eta蛋白质组揭示了中性粒细胞介导的反应在VAP中

      在所有患者和时间点,我们在ETA系列中识别出3067个独特的蛋白质。我们将患者匹配的ETA和Bal与同一天收集的患者匹配,并在同一天收集的ETA和BAL中鉴定了1811年和1097个独特的蛋白质。其中,975个蛋白质代表了该队列的88.9%的BAL蛋白质组,并映射到187例明显的反应途径。前10名映射的途径是 中性粒细胞脱粒,先天免疫系统,免疫系统,补体级联,补体级联的调节,血小板活化,信号传导和聚集,血小板脱粒,调节胰岛素样生长因子转运,翻译后蛋白质磷酸化和止血 (补充表S2)。这些建议富集与ETA和BAL中的宿主免疫相关的蛋白质。此外,这些共享蛋白的平坦altman比较表明,ETA和BAL之间没有显着的偏差,因为大多数数据坐在95%置信区间上限4.1之间,下限-4.4。 (Fig. 2B)。与先天和体液免疫有关的生物过程的GO术语同样富含液体(Fig. 2C)。这表明BAL和ETA之间的蛋白质组组成中的相似性。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2eta.和BAL蛋白质在VAP患者中的比较。 A,Venn图显示了ETA和BAL蛋白之间共享的蛋白质的数量。 B,Bland-Altman对ETA协议的95%限制 相对 BAL蛋白。 C,ETA和BAL蛋白的基因本体(GO)分析(生物过程)。甜甜圈图显示了BAL(内核)和ETA(外核心)蛋白的前10个富集的生物过程。
      由于相对易用性和增加的采样可用性,我们将我们的研究重点研究了ETA。因为插管在VAP患者和对照中是可变的,所以我们比较了插管的第一天(基线)针对VAP患者的后续时间点并进行比较 基线 eta蛋白质组在VAP和Control患者中。
      注册我们研究的患者在不同的日子里插管了可变的时间和发育感染。我们将纵向收集分类为兴趣的主要临床事件,如 基线, v积极, 预vap.后VAP.。对每个事件的分尼蛋白质丰富,无监督的时间聚类显示伴随的聚类 基线 对照(控制 基线)和VAP患者(VAP 基线),建议在插管时,对照和VAP患者的ETA蛋白质蛋白质保持不变(Fig. 3A)。 VAP患者的ETA蛋白质组遵循VAP感染的进展模式 预vap,VAP积极后VAP. (Fig. 3A)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3eta.蛋白质组分析。 A,使用中值蛋白质丰富的临床时间点的时间聚类。 B,比较 基线v积极 vap患者的eta蛋白质组。 C,VAP患者中显着上调的蛋白质; 代表ETA蛋白质组的火山曲线,(1)在蓝色,重要的蛋白质(p <0.05,Wilcoxon Rank和试验),(2)在橙色,蛋白质中的蛋白质(FC))的丰度(v积极 和....相比 基线) > 1 or <-1,(3)绿色,显着的蛋白质(p <0.05)带LOG2(FC)> 1 or <-1 fc =折叠变化。 D, E,基因本体(GO)基础的功能性富集分析显着差异丰富的蛋白质 v积极 和....相比 基线 (生物过程)。上调(剩下)和下调()GO类别(括号)。 基线 =控制和VAP插管的第1天, v积极 = VAP诊断日, 预vap. =在VAP之前的一天, 后VAP. = VAP后的一天, 控制 =对照患者的其他插管时间点(第3天和第5天)。
      在VAP患者中,共鉴定了总共1823和1603个蛋白质 基线v积极 ETA分别有1269个蛋白质在时间点之间共享(Fig. 3B)。在这些中,在所有ETA中鉴定了10至19%的独特蛋白质,反映了纵向样品中的蛋白质组变异性。
      1269年共享的ETA蛋白用于比较 基线v积极 在VAP患者中。更改进一步比较 预vap.后VAP. 团体。在所有蛋白质中的巧精力途径分析(IPA) v积极基线 揭示了133个富集的途径。 补充系统, 急性相位响应信号, 肌动蛋白细胞骨架信号传导, 葡糖生成I., 整合素信令, 糖酵解I., rho的基于肌动蛋白的运动的调节 , 和 戊糖磷酸途径 积极丰富,但 LXR / RXR激活上皮粘附结的重塑 是负面丰富的(补充表S3)。上述术语通过来自IPA的生物学功能和疾病进行了进一步验证,其中报道 中性粒细胞,粒细胞的脱粒,吞噬细胞, 白细胞迁移, , 凋亡, 和 坏死 as most enriched (补充表S4)。也观察到这些途径和过程富集 预vap. 样品比较 基线 并提示早期激活白细胞介导的免疫力响应VAP病原体。
      进一步的统计比较鉴定了96个差异丰富的蛋白质(p <0.05,中位数折叠变化>2) between 基线v积极 (Fig. 3C)(表二)。 20个上调的蛋白质促进了以下GO术语(生物过程, p < 0.05): 中性粒细胞聚集, 对细菌和真菌的防御反应, 白细胞迁移, 和 补充激活 (Fig. 3D); 76下调蛋白质与 活性氧物种代谢过程, 氧化应激, 细胞氧化解毒, 和 组织稳态 (Fig. 3E)。这表明中性粒细胞介导的先天免疫应答和伤口愈合过程 v积极.
      表二基线与临床诊断日之间ETA蛋白的差异表达(VAP阳性)
      Uniprot加入蛋白质名称(基因ID)log2(FC)
      a log2(fc)的 v积极基线,fc =折叠变化。
      p Value
      P02741C-反应蛋白(CRP)28.110.0366
      P15531-2核苷二磷酸激酶A(NME1)的同种型226.560.0293
      P27918适用于(CFP)3.680.0323
      P06702蛋白质S100-A9(S100A9)3.450.0068
      O00602Ficolin-1(FCN1)3.390.0092
      O14950肌球蛋白调节轻链12B(MyL12B)3.210.0323
      P05109蛋白质S100-A8(S1​​00A8)3.140.0068
      Q6UX06嗅素-4(OLFM4)2.870.0420
      P35579myosin-9(Myh9)2.710.0420
      Q9HD89抵抗素(Retn)1.870.0020
      P14780基质金属蛋白酶-9(MMP9)1.720.0322
      Q13451馅脂l-Prolyl CIS-Trans异构酶FKBP5(FKBP5)1.710.0323
      Q9HB71钙环结合蛋白(Cacybp)1.620.0420
      Q96C19含EF手域蛋白D2(EFHD2)1.530.0420
      Q13231际千核苷酸酶-1(CHIT1)1.430.0098
      Q92820γ-戊二基水解酶(GGH)1.250.0137
      P05164-3myeloperoxidase.的同种型H7(MPO)1.210.0186
      P00491嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)1.160.0420
      P54819腺苷酸激酶2,线粒体(AK2)1.140.0322
      P18206Vinculin(VCL)1.080.0420
      P07339Compeopsin D(CTSD)−1.030.0186
      P6310414-3-3蛋白Zeta / delta(Ywhaz)−1.110.0144
      P13987CD59糖蛋白(CD59)−1.130.0244
      O00299氯化物细胞内通道蛋白1(CLIC1)−1.140.0244
      P17931Galectin-3(LGALS3)−1.190.0244
      P00746补充因子D(CFD)−1.230.0129
      P11413-2同种型长葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(G6PD)−1.290.0322
      P07355-2Annexin A2的同种型2(ANXA2)−1.490.0068
      P01834IG Kappa Chain C地区(IGKC)−1.620.0098
      P09668Pro-Cathepsin H(CTSH)−1.640.0186
      P80723脑酸可溶蛋白1(Basp1)−1.670.0244
      O43490PROMININ-1(PROM1)−1.700.0420
      P00558磷酸性激酶1(PGK1)−1.710.0323
      Q08380Galectin-3结合蛋白(LGALS3BP)−1.820.0186
      P00915碳酸酐酶1(CA1)−1.850.0244
      P12273催乳素诱导蛋白(PIP)−1.920.0186
      P43652Afamin(AFM)−1.930.0068
      Q32MZ4-3富含亮氨酸的重复飞行 - 相互作用蛋白1(LRRFIP1)的同种型3 −1.980.0323
      P69905血红蛋白亚基α(HBA1)−1.990.0420
      P00918碳酸酐酶2(CA2)−2.030.0420
      P02766Transthyretin(TTR)−2.090.0049
      P01591免疫球蛋白J链(IGJ)−2.190.0137
      Q9BW30管蛋白聚合促进蛋白质成员3(TPPP3)−2.350.0010
      P02765α-2-HS-糖蛋白(AHSG)−2.390.0186
      Q06830过氧杂志毒素-1(PRDX1)−2.430.0029
      P32119过氧杂志毒素-2(PRDX2)−2.480.0059
      Q16270胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)−2.520.0323
      Q13228-4同种型4硒结合蛋白1(SelenBP1)−2.540.0059
      P01620Ig Kappa链V-III地区SIE(IGKV3-20)−2.550.0440
      Q6P5S2UPF0762蛋白C6ORF58(C6ORF58)−2.590.0059
      P15311ezrin(ezr)−2.640.0029
      O14745NA(+)/ H(+)交换监管辅助因子NHE-RF1(SLC9A3R1)−2.670.0420
      P61769β-2-微胶囊(B2M)−2.670.0137
      P68871血红蛋白亚基Beta(HBB)−2.790.0420
      Q8N4F0BPI FOL.d - 统一家庭B会员2(BPIFB2)−2.800.0244
      P19823间α-胰蛋白酶抑制剂重链H2(ITIH2)−2.920.0420
      P23528Cofilin-1(CFL1)−2.960.0144
      P30838醛脱氢酶,二聚体NADP偏好(ALDH3A1)−3.180.0059
      P07711Compacepsin L1(CTSL)−3.200.0323
      P10909-2Clusterin的同种型2(CLU)−3.270.0068
      Q14103异质核核糖核蛋白D0(HNRNPD)−3.360.0244
      P13667蛋白二硫化物 - 异构酶A4(PDIA4)−4.040.0129
      P02042血红蛋白亚单位三角洲(HBD)−4.320.0420
      O75347细胞素特异性伴侣A(TBCA)−4.630.0080
      P02545prelamin-a / c(lmna)−4.920.0080
      P23141-2肝羧基酯酶1的同种型2(CES1−5.070.0059
      Q13938钙盐(帽)−6.110.0010
      P13010X射线修复交叉互补蛋白5(XRCC5)−24.520.0248
      P08294细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn](SOD3)−24.870.0091
      Q5RHP9富含谷氨酸的蛋白质3(Erich3)−24.970.0092
      P27105红细胞带7整体膜蛋白(stom)−25.250.0323
      P09758肿瘤相关钙信号换能器2(TACSTD2)−25.300.0091
      P67936Tropomyosin alpha-4链(TPM4)−25.460.0191
      Q15185前列腺素E合成酶3(PTGES3)−25.600.0244
      P34932热休克70 KDA蛋白4(HSPA4)−25.930.0020
      P50502HSC70相互作用蛋白质(ST13)−25.990.0029
      Q96NY7氯化物细胞内通道蛋白6(CLIC6)−26.080.0080
      P30043黄素还原酶(NADPH)(BLVRB)−26.140.0092
      P06727载脂蛋白A-IV(apoA4)−26.160.0129
      P43353醛脱氢酶系列3成员B1(ALDH3B1)−26.220.0010
      P30041过氧杂志毒素-6(PRDX6)−26.310.0092
      P07988肺表面活性剂相关蛋白B(SFTPB)−26.460.0330
      Q13740CD166抗原(Alcam)−26.520.0059
      P19338核仁(NCL)−26.600.0244
      P05452四菌菌素(CLEC3B)−27.060.0092
      P51884Lumican.(LUM)−27.130.0244
      P15328叶酸受体α(folr1)−27.160.0440
      P13647角蛋白,II型细胞骨骼5(KRT5)−27.250.0080
      Q0491714-3-3蛋白质ETA(YWHAH)−27.340.0323
      P02753Retino.l - 粘合蛋白4(RBP4)−27.420.0137
      P15090脂肪痤疮d - 粘合蛋白,脂肪细胞(Fabp4)−27.700.0092
      P08727角蛋白,I型细胞骨骼19(KRT19)−27.950.0010
      P3194614-3-3蛋白β/α(YWHAB)−28.610.0029
      P00352视网膜脱氢酶1(ALDH1A1)−28.680.0059
      P06396戈尔洛林(GSN)−28.680.0080
      P05787-2角蛋白的同种型2,II型细胞骨骼8(KRT8)−29.580.0092
      a log2(fc)的 v积极基线,fc =折叠变化。
      为了确定对感染的反应特异性,我们比较 基线 VAP和控制患者之间的ETA。在纵向分析中发现的96个差异丰富的蛋白质中,Ywhah显着更高(p <0.05,2.4倍)在VAP中 基线 与控制相比 基线。进一步比较VAP 基线 随着其他插管时间点,控制的显着增加了PGK1(p <0.05,2倍)和Ncl(p <在VAP中0.05,2.2倍) 基线。然而,没有检测到26种蛋白质,包括Ywhah和Ncl v积极 但是出现在所有 基线 (Fig. 3B, 表III)。功能注释揭示了它们在多个绑定活动中的作用(p < 0.05) (激素装订, 维生素绑定, 铜离子结合, 支架蛋白质结合)(Fig. 3A, 补充表S5)。没有这些蛋白质 v积极 可能暗示病原体结合和间隙。核苷二磷酸激酶A(NME-1)和CRP的两种同种型2仅在VAP ETA中检测到(表III)。为了进一步洞察力,将显着的差异丰富的蛋白质映射到反应途径(表IV.)。两种途径低 P-值(p < 6.6E-14), 中性粒细胞脱粒 (11个蛋白质)和 天生免疫系统 (13个蛋白质)代表所有上调蛋白质的55至65%,表明VAP患者中宿主免疫蛋白的分泌增加。 76个下调蛋白质(Fig. 3C),将48个蛋白质映射到前10个显着性(p < 0.05) pathways (表IV.)。大多数上调的蛋白质映射到与病原体识别和先天免疫有关的多种途径,而大多数下调的血液蛋白质,碳酸酐酶1(CA1),碳酸酐酶2(CA2),血红蛋白亚基β(HBB),血红蛋白亚基α(
      • Nachbagauer R.
      • Choi A.
      • Hirsh A.
      • 边缘I.
      • Iida S.
      • Barra A.
      • Ferres M.
      • Albrecht R.A.
      • Garcia-Sastre A.
      • 贝弗维尔N.M.
      • 没关系。
      • 麦地那r.a.
      • Palese P.
      • Krammer F.
      定义针对流感病毒表面糖蛋白的抗体交叉反应。
      表二, IV.)。
      表III基线之间Eta蛋白的比较(来自对照和VAP患者)和VAP阳性
      蛋白质名称基因ID.log2(FC)
      a log2(fc)的 v 积极的 与基线 在VAP患者中; p值 使用Wilcoxon等级和测试确定。
      p Value曲线下的中位数(AUC)
      控制 基线v患者
      基线v积极
      视网膜脱氢酶1ALDH1A1−28.680.00626.9628.680.00
      Retino.l - 绕线蛋白4.RBP4−27.420.01428.4427.420.00
      四菌菌素CLEC3B−27.060.00925.2327.060.00
      角蛋白的同种型2,II型细胞骨架8KRT8−29.580.00927.5929.580.00
      戈尔洛林GSN.−28.680.00830.2628.680.00
      载脂蛋白A-IVAPOA4−26.160.01325.0726.160.00
      肺表面活性剂相关蛋白B.SFTPB.−26.460.03325.9926.460.00
      细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]SOD3−24.880.00924.5324.880.00
      角蛋白,I型细胞骨骼19KRT19−27.950.00127.8127.950.00
      肿瘤相关钙信号传感器2Tacstd2.−25.300.00920.1325.300.00
      X射线修复交叉补充蛋白5XRCC5−24.520.02521.2424.520.00
      角蛋白,II型细胞骨骼5KRT5−27.250.00825.7727.250.00
      脂肪痤疮d - 粘合蛋白,脂肪细胞FABP4−27.700.00928.3427.700.00
      叶酸受体α.FOLR1−27.160.04426.5827.160.00
      核仁NCL.−26.600.02424.8026.600.00
      过氧杂志毒素-6PRDX6−26.310.00925.3426.310.00
      黄素还原酶(NADPH)BLVRB.−26.140.00925.2126.140.00
      14-3-3蛋白β/αYWHAB.−28.610.00327.9828.610.00
      热休克70 kda蛋白4 HSPA4−25.930.00225.9325.930.00
      HSC70 - 相互作用蛋白质ST13−25.990.00325.8125.990.00
      Lumican.l−27.130.02425.5327.130.00
      Tropomyosin alpha-4链TPM4−25.460.01926.4325.460.00
      14-3-3蛋白质ETAYwhah.−27.340.03226.1027.340.00
      CD166抗原阿尔卡姆−26.520.00626.3726.520.00
      富含谷氨酸的蛋白质3ERICH3−24.970.00922.1324.970.00
      氯化物细胞内通道蛋白6CLIC6−26.080.00825.2226.080.00
      馅脂l-Prolyl CIS-Trans异构酶FKBP5FKBP51.710.0320.0023.3925.10
      IG kappa链V-III地区SIEIGKV3-SIV−2.560.0440.0028.1225.57
      Ficolin-1FCN13.390.0090.0022.5625.95
      核苷二磷酸三磷酸激酶A的同种型2NME126.560.0290.000.0026.56
      C-反应蛋白CRP.28.110.0370.000.0028.11
      a log2(fc)的 v 积极的 与基线 在VAP患者中; p值 使用Wilcoxon等级和测试确定。
      表IV.基线与VAP之间差异表达蛋白质的反应途径分析阳性
      途径显着的蛋白质(p < 0.05)p Value
      监管
          中性粒细胞脱粒FCN1; GGH; RETN; CFP; OLFM4; MPO; MMP9; NME1; CHIT1PNP; S100A9; S100A8; VCL6.59E-14.
          Innate immune systemFCN1; CRP; GGH; RETN; CFP; OLFM4; MPO; MMP9; NME1CHIT1; PNP; MYH9; S100A9; S100A8; VCL6.24E-10
          初始触发补充FCN1; CRP; CFP9.27E-05.
          平滑肌收缩VCL; MYL12B.6.68E-05.
          EPH-Ephrin signalingmyh9; mmp9; myl12b5.55E-05.
          rho gtpases激活岩石,cit,paksmyh9; myl12b.9.89E-04.
          核苷酸二 - 和三磷酸酯的相互互连AK2; NME16.07E-04.
          抗微生物蛋白的金属封存S100A9; S100A83.20E-04.
          Ficolins与靶细胞表面上的重复碳水化合物结构结合FCN12.73E-04.
          核苷酸的代谢pnp; ak2; nme11.60E-03.
      下调
          红细胞占用氧气和释放二氧化碳CA1; CA2; HBA1; HBA2; HBB4.33E-07.
          中性粒细胞脱粒CD59; PRDX6; LGALS3; XRCC5; CFD; TTR; HSG; GSN; B2M; ALDH2B1; HBB; stom; ctsd; ctsd; ctsh9.58E-06.
          CHK1 / CHK2(CDS1)介导的细胞周期蛋白B的失活:CDK1复合物YWHAB.; YWHAH; YWAZ1.02E-04.
          反应性氧气物种的解毒PRDX1; PRDX2; PRDX6; SOD32.06E-04.
          TP53调节代谢基因prdx1; prdx2; ywhab; ywhaz; ywhah4.92E-04.
          神经退行性疾病prdx1; prdx2; lmna6.77E-04.
          从等离子体中清除血红素HBA.1; HBA2; jchain; kappachainvii-sie,kappachainc8.32E-04.
          淀粉样纤维纤维形成TTR; GSN; B2M; APOA41.80E-03.
          血小板脱粒LGALS3BP; CFL1; CFD; AHSG; CLEC3B2.55E-03.
      为了确定早期的VAP响应机制,我们在临床诊断前2天收集ETA(预vap.)。我们鉴定了21种显着差异差异丰富的蛋白质(p <0.05)折叠变化>2 compared with 基线 (Fig. 3C, 表V.)。与我们的前提分析一致,19个下调蛋白中的每一个与暗示清除和封存的结合功能相关,作为早期宿主对感染的反应(Fig. 4AC)。我们观察到髓过氧化物酶(MPO)和腺苷酸激酶2(AK2)的同种型H7的结合机制和上调的复发 预vap. eta. (Fig. 4C)。虽然MPO已参与中性粒细胞介导的先天免疫力(
      • 遇见zler K.D.
      • Fuchs T.A.
      • nauseef w.m.
      • Reumaux D.
      • Roesler J.
      • Schulze I.
      • Wahn V.
      • Papayannopoulos V.
      • Zychlinsky A.
      髓过氧化物酶是嗜中性粒细胞细胞外捕集性的形成:对先天免疫的影响。
      ),AK2已被报告为细胞裂解的无处不在的标志物(
      • 迪克隆L.
      • Scrimale T.
      • Baxter B.K.
      • Krysan D.J.
      酵母菌裂解药物发现和遗传分析的高通量测定。
      )。这表明他们在早期防御免受VAP感染的潜在作用,促使我们探索中性粒细胞介导的病原体处理。通过ELISA证实了通过ELISA的两个关键组分的LC-MS / MS测量的纵向趋势,MPO和ELANE确认(Fig. 4D)。两种蛋白质都显着高得多 预vap. (4.8-至5倍 基线,adj。 p < 0.044) and v积极 (比较3.4至4倍 基线,adj。 p <0.038),突出嗜中性粒细胞脱粒的快速启动,可以作为早期检测标志物。
      表V.基线中ETA蛋白质组的比较,VAP阳性(诊断日)和 预vap. (诊断前2天)
      蛋白质名称基因ID.v积极预vap.
      log2(FC)
      a ,b表示log2(fc) v积极基线预vap.基线, 分别。
      p valuelog2(FC)
      a ,b表示log2(fc) v积极基线预vap.基线, 分别。
      p value
      视网膜脱氢酶1ALDH1A1-28.6800.006−2.1780.036
      碳酸酐酶1CA1−1.8540.024−1.3750.022
      血红蛋白亚单位三角洲HBD.−4.3220.042−3.3640.022
      prelamin-a / clmna.−4.9220.008−1.7030.036
      α-2-HS-糖蛋白Ahsg.−2.3890.019−1.0220.022
      myeloperoxidase.的同种型h7MPO1.2060.0191.7590.022
      角蛋白,I型细胞骨骼19KRT19-27.9540.001−2.9350.022
      pro-compepsin hCTSH.−1.6440.019−1.5390.035
      肿瘤相关钙信号传感器2Tacstd2.-25.3010.009-25.3010.036
      角蛋白,II型细胞骨骼5KRT5-27.2530.008−2.2610.036
      肝羧基酯酶1的同种型2CES1−5.0670.006−1.7940.036
      过氧杂志毒素-6PRDX6-26.3070.009-26.3070.036
      过氧杂志毒素-2PRDX2−2.4810.006−2.4020.022
      醛脱氢酶家庭3成员B1ALDH3B1-26.2170.001−1.3790.022
      HSC70 - 相互作用蛋白质ST13-25.9900.003-25.9900.022
      腺苷酸激酶2,线粒体AK21.1380.0321.5850.022
      血红蛋白亚单位βHBB.−2.7900.042−2.6570.022
      血红蛋白亚基αHBA.1−1.9920.042−1.7920.022
      同种型4硒结合蛋白1Selenbp1.−2.5440.006−1.9720.036
      钙盐披肩−6.1120.001−1.7900.022
      异紫外线3的富含亮氨酸的重复飞行相互作用蛋白1LRRFIP1.−1.9800.032−1.1500.036
      a ,b表示log2(fc) v积极基线预vap.基线, 分别。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4差异丰富的蛋白质功能性富集和蛋白质水平分析。 A,仅出现蛋白质的分子函数分析 基线 (在插管日)。 B,去分子函数分析下调蛋白质 预vap.v积极 关系到 基线. C,21例显着蛋白质的蛋白质丰富的中值log2(fc) 预vap. (黑暗的 红色的), v积极 (红色的), 和 后VAP. (蓝色) 和....相比 基线. D,使用MS辅助相对丰度,LOG2(AUC)测量VAP患者中MPO和ELANE水平的测量(剩下)和ELISA(NG / ml ETA)()。

       v患者涉及氧化应激的代谢特征

      与蛋白质组学分析类似,Bland-Altman分析显示ETA和BAL矩阵中的代谢物没有显着偏差,因为大多数数据都在达到95%置信区间的协议范围内(平均差异为0,上限为4.7和下限。 -4.8)(Fig. 5A)。使用中位数代谢物浓度的无监督的时间聚类显示出两个不同的簇 基线 和 post-基线 样品。与ETA蛋白质组的时间聚类不同, 控制 聚集得更紧密 后VAP.。这表明,在插管时,对照和VAP患者的ETA代谢物相似并随着感染的进展而变化 预vap,VAP积极后VAP.。群集 控制后VAP. 可能突出由于插管而不是感染的残留炎症的效果(Fig. 5B)。我们在两者中看到了几种代谢物的浓度增加 预vap. 或者 v积极, 或两者。这些代谢物都在减少 控制后VAP.。这些变化可能反映患者对感染的反应。进一步比较 v积极基线 ETA在VAP感染时鉴定了53个代谢物的增加和一种甘油磷脂(PC AA C30:0)的降低(p < 0.05, fold change >±2) (表VI.)。高浓度的氨基酸和T4-OH Pro v积极 ETA可能是嗜中性粒细胞蛋白酶的活性,基质金属蛋白酶-9(MMP9)和ELANE,而达到浓度(p <0.05)及其氧化产品(遇见, p = 0.977)可以指示在中性粒细胞脱粒期间MPO,NADH氧化酶或PNP形成的活性氧物质(ROS)(Fig. 7C)。在 v积极 ETA,我们还观察到5倍的五聚胺增加了作为精氨酸分解代谢的产物, IE。 Adma,鸟氨酸,精子和亚精亚胺(p <0.05)及其前体多胺(瓜氨酸, p = 0.067)。升高的ADMA指向ROS诱导的甲基化蛋白质蛋白水解(Fig. 7C)。其对一氧化氮合酶(NOS)的抑制作用为硝基-TYR(p = 0.371) to Tyr (p < 0.05), (Fig. 7C)此前还报道了社区获得的肺炎(
      • Vogeli A.
      • Ottiger M.
      • Meier M.A.
      • 符号C.
      • Bernasconi L.
      • Kulkarni P.
      • Huber A.
      • 基督队伍。
      • Henenen C.
      • 赫斯C.
      • 汤兰罗
      • Zimmerli W.
      • 穆勒B.
      • Schuetz P.
      进入不对称和对称二甲基碱的入学水平预测社区肺炎患者的长期结果。
      )。在VAP感染期间,我们检测到显着增加的酰基甘油碱,甘油磷脂和鞘脂脂。 VAP患者报告了类似血浆脂质代谢的类似趋势(
      • Schmerler D.
      • Neugebauer S.
      • Ludewig K.
      • Bremer-Streck S.
      • Brunkhorst F.M.
      • Kiehntopf M.
      针对患有危重患者的全身炎症障碍歧视的目标代谢组。
      )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5差分代谢分析。 A,Bland-Altman对代谢物浓度的分析(μm)来自Eta和Bal在同一天收集。 B,在ETA中使用中值浓度的临床时间点的时间聚类。 C,Volcano图通过比较了ETA中的185个代谢物的差异浓度 v积极基线。 (1)在蓝色,显着的代谢物,(2)橙,代谢物,代谢物浓度的log2(Fc)( v积极 和....相比 基线) > 1 or <-1; (3)以绿色,具有LOG2(比率)的显着代谢物> 1 or < −1.
      表VI.基线之间的差异丰富的代谢物和临床诊断日(VAP阳性)
      类型代谢物log2(FC)
      a log2(fc)的 v 积极的 与基线 在VAP患者中; p值 使用Wilcoxon等级和测试确定, p <0.05被认为是显着的。
      p Value
      酰基甘油苷.C21.420.032
      酰基甘油苷.C31.100.032
      酰基甘油苷.C41.610.001
      酰基甘油苷.C6(C4:1-DC)1.020.024
      氨基酸2.170.007
      氨基酸GLN.1.390.014
      氨基酸glu.2.220.032
      氨基酸g2.160.005
      氨基酸他的2.240.007
      氨基酸遇见2.790.010
      氨基酸Orn.2.720.019
      氨基酸TRP.1.970.007
      氨基酸TYR.2.920.005
      氨基酸2.900.007
      生物胺ADMA.2.120.014
      生物胺硫胺因1.070.014
      生物胺sp2.320.010
      生物胺T4-OH-PRO1.170.009
      生物胺遇见1.490.977
      生物胺瓜粉丁2.190.067
      生物胺鸟氨酸2.720.018
      甘油磷脂PC AA C30:0−1.230.019
      甘油磷脂PC AA C32:31.250.025
      甘油磷脂PC AA C36:11.080.042
      甘油磷脂PC AA C36:21.740.032
      甘油磷脂PC AA C36:31.760.042
      甘油磷脂PC AA C38:01.150.024
      甘油磷脂PC AA C38:32.190.024
      甘油磷脂PC AA C38:42.330.024
      甘油磷脂PC AA C38:51.580.032
      甘油磷脂PC AA C40:21.070.014
      甘油磷脂PC AA C40:31.250.037
      甘油磷脂PC AA C40:51.540.032
      甘油磷脂PC AA C40:61.260.014
      甘油磷脂PC AA C42:11.430.005
      甘油磷脂PC AE C34:11.230.007
      甘油磷脂PC AE C34:21.590.014
      甘油磷脂PC AE C34:31.230.032
      甘油磷脂PC AE C36:11.190.019
      甘油磷脂PC AE C36:21.370.014
      甘油磷脂PC AE C36:31.860.005
      甘油磷脂PC AE C36:41.490.019
      甘油磷脂PC AE C38:11.780.032
      甘油磷脂PC AE C38:21.980.010
      甘油磷脂PC AE C38:31.880.019
      甘油磷脂PC AE C38:42.020.019
      甘油磷脂PC AE C38:51.780.032
      甘油磷脂PC AE C40:11.730.014
      甘油磷脂PC AE C40:21.330.042
      甘油磷脂PC AE C40:31.700.016
      甘油磷脂PC AE C40:41.120.008
      甘油磷脂PC AE C40:52.390.019
      甘油磷脂PC AE C40:62.320.010
      甘油磷脂PC AE C42:22.410.033
      甘油磷脂PC AE C42:43.460.013
      甘油磷脂PC AE C44:61.200.042
      H11.690.003
      a log2(fc)的 v 积极的 与基线 在VAP患者中; p值 使用Wilcoxon等级和测试确定, p <0.05被认为是显着的。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7呼吸道中呼吸道中的中性粒细胞介导的先天免疫应答的提出机制。 A,中性粒细胞颗粒及其在ETA和BAL中检测到的蛋白质。 B,征聘中性粒细胞在发炎的气管和肺泡的位点,响应于病原体刺激。通过VCL,Actn1,Myyh9和MyH12促进了中性粒细胞轧制,粘附和迁移至发炎的肺泡和气管组织。中性粒细胞的活化可以诱导脱粒和释放颗粒蛋白酶,氧化酶,过氧化物酶和其他抗微生物蛋白用于病原体处理(
      • wikoff w.r.
      • nagle m.a.
      • kouznetsova v.l.
      • Tsigelny i.f.
      • nigam s.k.
      未确定的代谢组科将肠道组代谢物和推定的尿毒剂毒素鉴定为有机阴离子转运蛋白1(OAT1)的基材。
      )。 C,在VAP感染期间,将中性粒细胞脱粒和反应性氧(ROS)诱导呼吸道中的氧化应激的代谢命运。

       v病原体特异性肽签名在ETA中找到

      我们鉴定了66个独特的微生物肽(补充表S6)对应于59个蛋白质,特异于VAP病原体(列入) 补充表S1)(在15名患者的ETA和BAL(5例和10例)中。其中,24种肽与革兰氏阳性,38〜革兰氏阴性细菌相关,4粒染色酵母4。在ETA,62个肽中在VAP患者中检测到66个,与对照组中的8个肽(共用)进行比较。在BAL中仅鉴定出10个肽,其中3个在BAL中唯一观察到补充表S6)。虽然ETA和BAL中的微生物肽的低发病率和丰富的微生物肽排除了任何定量,但我们评估了它们与VAP状态的关联。从两个VAP和对照组中发现与革兰氏阳性和阴性细菌相关的肽,然而,与对照(14个肽)相比,肽计数基本上在VAP(144肽)中升高。在大多数插管天中,在VAP患者中更主程地观察到革兰阴性病原体,如其肽分布(革兰氏阴性,82;克阳性,37;酵母,25个肽计数)所示。在大多数患者中VAP诊断之前至少1天检测到这些肽( 补充图S2)。
      使用unipept,我们证实了在家庭,属和/或物种水平的微生物肽的特异性,并进行了基于肽的分类分类(Fig. 6)。 12个肽属于革兰氏阳性细菌,其中8个代表 Bacilli. 1与actinobacteria有关(补充表S7, 表VII.)。三个被分类为葡萄球菌,链球菌和皮杆菌属,2种肽表现出物质水平特异性,1 金黄色葡萄球菌 和1 CutInibacterium Acnes. (Fig. 6A, 补充表S7)。四种肽与4酵母蛋白质有关,其中一个是念珠菌特异性的。我们还确定了与革兰氏阴性植物有关的29个肽(补充表S7)。这些肽中的大多数与之相关 肠杆菌,假单胞菌痤疮neisseriaceae. VAP病原体的家庭,其中7个与假单胞菌有关,1至 大肠杆菌 和1到 Klebsiella Areogenes. (Fig. 6B, 表VII.)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6基于MetaproTome方法的分类致病菌特征。 革兰氏阳性VAP病原体的DENDOOM(A)和革兰氏阴性VAP病原体(B)。在括号中,每个级别鉴定的肽数。特定于最低共同祖先的肽序列以红色表示。
      表VII.物种特异性肽,导致ETA中的细菌蛋白质鉴定
      肽序列Uniprot加入基因ID.v病原体的特异性克本质
      langgensiegtanlnelsnsnkpinsdsvk.A0A0H2×JB4.耳朵金黄色葡萄球菌积极的
      lrdefgydipnek.a0a0t8bki5.GMUF.链球菌积极的
      mqgavwgidsfdqwgelgk.W4TV09JCM18916Cifbacterium Acnes.积极的
      reyfhaglgsiydivgnilgvttgtplqk.B9WKF6CD36_72570念珠菌积极的
      mkilaameiadcdfehmdmdvlvgallk.a0a1m0krg1.BK251_25065.大肠杆菌消极的
      tlvddtvaqaqtsgeaak.A0A094ZQ80.ASV18Klebsiella Areogenes.消极的
      DRPEHADSADGDDSDNSDASDNADE.Q4KJ62RPSF.假单胞菌消极的
      LTSTISNLQNINENASAALGR.A0A0K1QPN3. B723_13770假单胞菌消极的
      qvlvnqygvganr.A0A1U9LQW5.OPRF.假单胞菌消极的
      vAPVAPAPAPEPAPAPAPVAEVVR.A0A1U9LQW5.OPRF.假单胞菌消极的
      VQSVGYGESRPVADNATEAGR.A0A1U9LQW5.OPRF.假单胞菌消极的
      miyaqpgtpgavvsfkpr.A0A0T8Kut8.Acod.假单胞菌消极的
      spniffedimqaepk.a0a1u9lrj1.Pedi.假单胞菌消极的

      讨论

      本研究描述了VAP介导的宿主重新扫描eta和16例插管患者的BAL。这也是ETA蛋白质组和代谢物的第一次详细表征。我们在纵向上检测到eta的3067个独特的蛋白质,与1139个蛋白质在Bal中相比。我们也观察了一个>与以前的研究相比,独特的BAL蛋白增加了10%(
      • nguyen e.v.
      • gharib s.a.
      • Palazzo S.J.
      • 咸肉Y.H.
      • Goodlett D.R.
      • 施娜普黎各。
      支气管肺泡灌洗液蛋白质组学分析在呼吸机相关肺炎患者危重患者中。
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      • 陈杰。
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      • gharib s.a.
      • Goodlett D.R.
      • 施娜普黎各。
      探索正常人支气管肺泡灌洗液蛋白质蛋白质。
      )。尽管我们观察了3倍的蛋白质组多样性,但虽然侵入性较少,但ETA已经历史上忽略了支持BAL(
      • 学者J.B.
      • van dessel H.A.
      • linssen c.f.
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      • roekaerts下午
      • van mook w.n.
      气管插管和支气管肺泡灌洗液流体分析:可疑似呼吸机相关肺炎的可互换诊断方式?
      )。我们的研究表明,ETA在涉及先天和适应症的蛋白质中功能多样化和高度富集,这表明它是研究肺感染的有吸引力的来源。在VAP患者中,在VAP感染期间观察到呼吸道中呼吸道中的炎症,ROS形成和中性粒细胞介导的先天免疫的上调,导致病原体处理(Fig. 7)。 Fig. 7A 代表在ETA中检测到的中性粒细胞颗粒蛋白。 vinculin和肌球蛋白的升高可能暗示细胞外基质(ECM)粘附和中性粒细胞的迁移(Fig. 7B)(
      • Langereis J.D.
      中性粒细胞整合在粘附,迁移和细菌间隙中的亲和力调节。
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      • vicente-manzanares m.
      • 最大限度。
      • 阿德斯坦R.S.
      • Horwitz A.R.
      非肌肉肌苷II在细胞粘附和迁移中占据中心阶段。
      )。增加丰富的病原体识别分子Ficolin-1和ETA的适合素可以通过与细菌多糖的相互作用来连接到补体系统活化(
      • 刘Y.
      • endo Y.
      • Iwaki D.
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      人体M-Ficolin是激活凝集素补体途径的分泌蛋白。
      )。为了支持这一点,抗微生物中性粒细胞蛋白S100A8和S100A9,具有促炎和趋化活性(
      • raquil m.a.
      • Acceriz N.
      • 罗努勒P.
      • TESSIER P.A.
      阻断抗菌蛋白S100A8和S100A9抑制吞噬细胞迁移到链球菌肺炎的肺泡。
      ),在VAP感染期间高度升高。此外,颗粒蛋白的VAP相关增加,例如际千核苷酸酶-1,γ-谷氨酸水解酶,抗蛋白,嗅觉蛋白-4和MMP9(
      • 威尔
      • Amirbeagi F.
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      由OLFM4的存在或不存在定义的人嗜中性粒细胞亚群将在体内翻转到组织中,并在体外产生不同的蚊帐。
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      • Rorvig S.
      • Ostergaard O.
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      • Borregaard N.
      人中性粒细胞颗粒子集,分泌囊泡和细胞膜的蛋白质组谱分析:与中性粒细胞前体的转录组分析相关。
      )所有对炎症和中性粒细胞脱滴的点以促进病原体间隙(Fig. 7B)。李和同事预先通过VAP感染的严重性和进展增加了血浆MMP9的增加(
      • 李伊..
      • 王玉..
      • Lee H.L.
      • Lu M.C.
      • 杨S.F.
      升高的血浆基质金属蛋白酶-9及其与呼吸机相关肺炎患者疾病严重程度的相关性。
      )。在感染期间,这些水解颗粒蛋白在中性粒细胞脱粒上的释放可能对气道上皮的ECM具有不利影响。在ETA的高浓度的游离氨基酸(T4-OH Pro)(Fig. 7C)建议通过胶原蛋白劣化改变ECM完整性。中嗜中性粒细胞金属蛋白酶对ECM调制的影响已经研究过(
      • Fedorova N.v.
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      中性粒细胞在胰岛素存在下粘附期间释放金属蛋白酶,但在胰高血糖素的存在下组织蛋白酶。
      )。中性粒细胞是肺部感染中病理炎症的关键球员,如VAP(
      • Papayannopoulos V.
      中性粒细胞细胞外陷阱免疫和疾病。
      )。在我们的研究中,我们在VAP感染期间观察到增加的肺炎和中性粒细胞脱粒,这可能促进中性粒细胞细胞外疏水阀(网)的形成和释放。最近在100名危重病患者的血统中研究了蚊帐在VAP发病机制中的作用(
      • Mikacenic C.
      • 摩尔R.
      • Dmyterko V.
      • West T.E.
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      中性粒细胞细胞外疏水阀(网)在呼吸机相关肺炎患者的肺泡空间中增加。
      )。
      虽然,Netisis为病原体感染提供了防御网络,但研究表明,夸张的蚊帐可能对肺活量有害(
      • 程O.Z.
      • Palaniyar N.
      净平衡:炎症性肺病中的问题。
      )。考虑到多胺的组织保护作用(
      • Pegg A.E.
      多胺在哺乳动物中的功能。
      ),在VAP感染时的高水平可能在组织保护中具有作用,作为抗中性粒细胞脱落对肺上皮脱髓液的不利影响的平衡机制。
      总体而言,ETA调查表明,从中性粒细胞招生,粘附和迁移到感染部位开始的中性粒细胞脱粒事件的级联。氧化应激的诱导使脱滴和染色质解透张解作为对VAP的宿主反应。 ELISA验证升高的ELANE和MPO证实了中性粒细胞脱粒在早期宿主对VAP中的作用。研究表明,在诊断肺炎(
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      血清C反应蛋白诊断价值急性呼吸道症状患者患者鉴定肺炎。
      )。 CRP和NME1-2的存在和作用仅在 v积极 尚不清楚并保证进一步调查。我们还寻找其他炎症标志物,如白细胞介素-1β,白细胞介素-8,在骨髓细胞中表达的Inter Seinin-1β,白细胞介素-8,可溶性触发受体,ProCalcitonin和ETA中的Pro-adrenomedullin的中区域片段,来自VAP和对照患者。我们在VAP和控制患者的ETA中检测到白细胞介素(补充表S9)。但是,这些制造商之间都没有显着差异 基线v.
      我们观察到VAP ETA中蛋白质分解代谢,ROS合成,多胺和脂质代谢的调节(Fig. 7C)。使用蛋白诱导剂(MPO和嘌呤核苷磷酸化酶)测量ROS的形成,并通过代谢指示剂确认(Met-So,T4-OH-PRO和ADMA)(
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      )。梅特勒 等等。 进一步示出了ROS-触发ELANE与核的易位和随后的染色质裂缝诱导。氧化应激是中性粒细胞脱粒的特征,并在其他肺部疾病中报道(
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      中性粒细胞细胞外陷阱在肺部疾病中:太多的好事?
      )。我们的假设通过调查纵向ETA采样进行了证实,其已经确定了病原体处理的主体先天免疫机制,并提供了增强的VAP进展粒度。
      在我们的研究中,我们雇用了定量和定性的BAL文化,是VAP诊断的临床标准,以鉴定VAP病原体。我们的Metaprootomic策略确定了VAP病原体的家庭,属和物种水平特异性的候选肽。随着临床症状,病原体检测在VAP诊断和抗生素治疗方面具有至关重要的作用。大多数患者在整个(护理标准)和超出通风期结束时都在广谱抗生素。我们的研究主要集中在使用ETA和BAL来解剖VAP,所有样品的通风后的收集对于确定抗生素治疗结果是不可行的。虽然,我们没有与病原体肽的消失不相关的抗生素治疗,但我们确实研究了肽与VAP感染相关的关联。在VAP诊断前至少1天,在大多数患者的ETA中检测到革兰氏阴性细菌肽。
      因为与宿主蛋白质组相比微生物肽丰度低,因此定量超出了本研究的范围。未来的研究需要评估这些微生物肽的蛋白质和算术性质及其在VAP诊断中的用途。
      插管是关键护理中最常见的干预措施之一,并与肺部感染和死亡率的易感性相关联。插管程序,留下长度和不恰当的抗生素治疗,以及预先存在的条件,如损害或弱化的免疫力可能有助于肺炎的微生物消化和发育。最终,对宿主环境的这些改变可以反映在肺界面处。我们的研究专注于ETA,在VAP开发和进展期间对上航道进行分子调查。我们已经表明ETA反映了丰富多彩的气道蛋白质组。在VAP中,我们确定了与早期宿主对感染相关的免疫调节蛋白的早期上调。我们还寻找ETA中的VAP病原体肽,并检测到与培养物相关的独特物种特异性肽。在大多数VAP患者中,这些独特的病原体签名至少比BAL培养基诊断至少1至2天。虽然呈现来自BAL,ETA的独特特征,但对于预热患者的早期和经济高效的肺炎临床诊断,尤其是具有有吸引力的替代品。

      数据可用性

      MS蛋白质组学数据已通过具有数据集标识符的自豪伙伴存储库提交给Proteomexchange联盟 PXD010715。标准化数据的标准化数据(补充表S6-S7),定量代谢组学(补充表S8)和宿主蛋白质组学(补充表S9)也可以在补充Excel文件中提供。

      致谢

      我们感谢患者,他们的亲属和医务人员在荣誉健康的贡献和支持下对该项目。我们感谢Nancy Linford,Phd(Linford Biomedical Communications,LLC,WA),用于审查此手稿。

      补充材料

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