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打开数据库彩易福彩能够鉴定和比较细菌糖蛋白,而无需在彩易福彩之前定义聚糖组合物

      质谱层已成为在生物系统上表征糖基化的不可或缺的工具。我们在过去十年中,我们产生富含糖肽的丰富片段的能力大大提高,但我们的信息方法仍然落后于此。虽然使用Glycan数据库的糖蛋白信息学方法引起了相当大的关注,但数据库独立的方法没有。这具有显着限制了对诸如在细菌中观察到的异常或非典型糖基化事件的高通量研究。因此,迫切需要计算细菌糖基化和鉴定化学多样化聚糖的计算方法。在这里,我们描述了广泛公差(最多2000A)的开放彩易福彩作为快速检查细菌糖蛋白的手段。我们使用的方法基准测试N - 链接的糖肽Campylobacter胎儿亚空间。胎儿O - 链接的糖肽Acinetobacter Baumannii.伯克德利亚 Cenocepacia.揭示用一系列聚糖改性的糖肽可以容易地识别,而无需在数据库彩易福彩之前定义甘油群。使用这种方法,我们证明了通过检查八个伯克德列利亚物种的糖蛋白酶来比较宽容的公差彩易福彩来比较细菌种类(B. Pseudomallei; B. Multivorans; B. Dolosa; B. HumptydoOnsis; B. ubonensis,B. Anthina; B. diffusa; B. Pseudomulivorans.)。最后,我们展示了开放彩易福彩如何能够基于共享修饰的肽序列鉴定低频糖族。结合,这些结果表明,开放彩易福彩是一种稳健的计算方法,用于测定细菌蛋白质组中的甘油多样性。

      图形概要

      蛋白质糖基化,向蛋白质加入碳水化合物,是一种广泛和异质类别的蛋白质改性(
      • struwe w.b.
      • 罗宾逊C.V.
      将糖蛋白结构异质性与天然质谱中的功能相识。
      ,
      • Brockhausen I.
      • 斯坦利P.
      • 等等。
      o-galnac glycans。
      ,
      • 斯坦利P.
      • Taniguchi N.
      • Aebi M.
      • 等等。
      n-聚糖。
      )。在真核内,已识别多种糖基化系统(
      • struwe w.b.
      • 罗宾逊C.V.
      将糖蛋白结构异质性与天然质谱中的功能相识。
      ,
      • Brockhausen I.
      • 斯坦利P.
      • 等等。
      o-galnac glycans。
      ,
      • 斯坦利P.
      • Taniguchi N.
      • Aebi M.
      • 等等。
      n-聚糖。
      )最多20%的蛋白质组被认为受到这类修改(
      • khoury g.a.
      • 巴利亚尔r.c..
      • floudas c.a.
      蛋白线翻译后修改统计:Swiss-Prot数据库的频率分析和策序。
      )。在真核内,两者 N - 链接和 O - 已知 - 克隆的糖基化系统产生高度异质的甘油结构(
      • Brockhausen I.
      • 斯坦利P.
      • 等等。
      o-galnac glycans。
      ,
      • 斯坦利P.
      • Taniguchi N.
      • Aebi M.
      • 等等。
      n-聚糖。
      )这种甘油的异质性对于糖蛋白的功能很重要(
      • Moremen K.W.
      • Tiemeyer M.
      • Nairn A.v.
      脊椎动物糖基化:多样性,合成和功能。
      ,
      • 徐C.
      • ng d.t.
      糖基化导向的蛋白质折叠质量控制。
      )。虽然在真核系统中使用的聚糖曲目被认为是大的,但是任何给定的生物样品中的多样性受到真核生物系统中使用的有限数量的单糖(
      • 冻结H.H.
      • 哈特G.W.
      • Schnaar R.L.
      • 等等。
      糖基化前体。
      ),以及表达蛋白质所需的蛋白质,例如糖基转移酶如糖基转移酶(
      • 卡瓦南斯。
      • Hashimoto K.
      • Miyama T.
      • goto s.
      • Kanehisa M.
      基于糖基转移酶反应的基因表达数据预测聚糖结构。
      )。在实验上,这些约束仅导致在真核样本中产生有限数量的聚糖(
      • 坎贝尔M.P.
      • 罗伊尔L.
      • radcliffe c.m.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      Glycobase和Autogu:基于HPLC的Glycan分析工具。
      ,
      • BöhmM.
      • Bohne-lang A.
      • 弗兰克米
      • 损失A.
      • rojas-macias m.a.
      • LüttekeT.
      glycosciences.db:链接算术和蛋白质组学数据的注释数据收集(2018更新)。
      )尽管有大量的含有糖类结构(
      • 麦当劳A.G.
      • Tipton K.F.
      • Davey G.P.
      一种基于知识的系统,用于响应酶敲除o-糖基化网络行为的显示和预测。
      ,
      • Akune Y.
      • 林C.-h.
      • 亚伯拉罕J.L.
      • 张继夫
      • 包装机N.H.
      • Aoki-Kinoshita K.F.
      • 坎贝尔M.P.
      使用生物信息学生成独角兽的N-聚糖生物合成途径的综合分析:理论n-聚糖结构数据库。
      )。这种有限的真核内的多样性 N - 链接和 O-Linded Glycans已经启用了糖粉数据库的发展,该数据库促进了高通量糖蛋白研究(
      • 胡H.
      • Khatri K.
      • Klein J.
      • Leymarie N.
      • Zaia J.
      糖肽串联质谱数据解释方法述评。
      )使用诸如cyonic(
      • 伯尔尼姆。
      • kil y.j.
      • Becker C.
      否决:晚期肽和蛋白质识别软件。
      )和pglyco(
      • 刘M.Q.
      • 曾W.-f.
      • 方P.
      • cao w.-q.
      • 刘C.
      • 燕G.-q.
      • 张Y.
      • 彭C.
      • 吴j.-q.
      • 张X.-j.
      • tu h.-j.
      • Chi H.
      • 太阳r.-x.
      • Cao Y.
      • 董M.Q.
      • 江湾。
      • 黄j.-m.
      • 沉h.-l.
      • Wong C.C.L.
      • 他是-M。
      • 杨p.y.
      Pglyco 2.0使精密N-糖蛋白酶具有综合质量控制和一步质谱法,用于完整糖肽鉴定。
      )。遗憾的是,这些数据库不适用于所有糖基化系统,并且未能鉴定用新型或非典型聚糖如细菌糖基化系统中发现的糖肽改性的糖肽。
      在细菌系统中,糖基化越来越被认为是常见的修改(
      • NOTHAFT H.
      • szymanski c.m.
      细菌N-糖基化的新发现膨胀合成生物工具箱。
      ,
      • szymanski c.m.
      • Wren B.W.
      细菌粘膜病原体中的蛋白质糖基化。
      ,
      • Koomey M.
      o-链接蛋白质糖基化在细菌中:快照和当前的观点。
      ,
      • Joshi H.J.
      • Narimatsu Y.
      • Schjoldager K.T.
      • Tytgat H.L.P.
      • Aebi M.
      • 克劳森H.
      • 哈利姆A.
      快照:跨国公司的O-糖基化途径。
      )。虽然在20世纪70年代首先首先发现细菌中的糖基化(
      • Schaffer C.
      • Messner P.
      原发性糖基化的新出现的刻面。
      ),它只是在过去的二十年之内,显然这类修饰遍布细菌属(
      • NOTHAFT H.
      • szymanski c.m.
      细菌N-糖基化的新发现膨胀合成生物工具箱。
      ,
      • Koomey M.
      o-链接蛋白质糖基化在细菌中:快照和当前的观点。
      ,
      • MACEK B.
      • 福尔赫酸
      • Hardouin J.
      • Weber-Ban E.
      • Grangease C.
      • Mijakovic I.
      蛋白质在细菌中翻译后修饰。
      )。与使用相对较少的单糖的真核系统不同,细菌糖蛋白装饰有多种单糖(
      • 帝国B.
      细菌碳水化合物多样性 - 勇敢的新世界。
      )导致惊人的甘草结构阵列(
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      ,
      • 辛苦辛苦
      • NASR M.A.
      • Kinsella R.L.
      • 斯科特N.E.
      • 福斯特L.J.
      • 韦伯B.S.
      • Fiester S.E.
      • actis l.a.
      • Tracy e.n.
      • Munson R.S.
      • 费尔德曼M.F.
      传导杆菌菌株携带两种功能性寡核酸杆菌剂,一个专门致力于IV型pilin,以及专用于多种蛋白质的O-糖基化的另一个。
      ,
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • NOTHAFT H.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Labbate M.
      • djordjevic s.p.
      • Larsen M.R.
      • szymanski c.m.
      • Cordwell S.J.
      通过EPTC蛋白介导的磷乙醇胺的蛋白蛋白介导的Campylobacter N-Lated Glycan进行修饰。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
      • djordjevic s.p.
      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      ,
      • hadjineophytou c.
      • Anonsen J.H.
      • 王恩。
      • 马克。
      • viburiene R.
      • vikÅ。
      • 哈里森O.B.
      • Maiden M.C.J.
      • 毕业于Y.H.
      • Koomey M.
      细菌蛋白糖基化体系中属型甘油多样性的遗传决定因素。
      ,
      • Ulasi G.N.
      • Creese A.J.
      • 慧S.X.
      • Penn C.W.
      • Cooper H.J.
      从Campylobacter 11168的旗杆蛋白蛋白酸蛋白酶综合映射:偏酶差分离子迁移率质谱法。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 木头A.G.
      • Cain J.A.
      • 巴特勒J.A.
      • 霜H.
      • 尤尔阁下
      • 兰登R.
      • Cordwell S.J.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      幽门螺杆菌N-连接蛋白质糖基化体系的功能分析。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 巴特勒J.A.
      • 劳森A.J.
      • 兰登R.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      弯曲杆菌物种结构各种N键聚糖的表征。
      )。这种聚糖多样性对该领域表示重大挑战,因为它使新细菌糖蛋白的鉴定成为非竞争分析承诺。然而,通过质谱(MS)的进步(
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
      • djordjevic s.p.
      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      ,
      • Ulasi G.N.
      • Creese A.J.
      • 慧S.X.
      • Penn C.W.
      • Cooper H.J.
      从Campylobacter 11168的旗杆蛋白蛋白酸蛋白酶综合映射:偏酶差分离子迁移率质谱法。
      ,
      • Madsen J.A.
      • ko b.j.
      • 徐H.
      • iwashkiw J.A.
      • Robotham S.A.
      • Shaw J.B.
      • 费尔德曼M.F.
      • Brodbelt J.s.
      通过紫外光沉积质谱法同时自动测序O-连接糖肽阴离子的甘油和肽部分。
      ,
      • Zampronio C.G.
      • Blackwell G.
      • Penn C.W.
      • Cooper H.J.
      通过液相色谱电子捕获解离串联质谱法局部施用Jejuni Flagellin FLAA鉴定的新型糖基化位点。
      ),曾经模糊的修改越来越识别,现在已知对细菌健身是必不可少的(
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • Cain J.A.
      • 戴尔A.L.
      • Niewold P.
      • Klare W.P.
      • 男人L.
      • 白色m.y.
      • 斯科特N.E.
      • Cordwell S.J.
      蛋白质组学揭示了在Campyloblacter Jejuni中与N-连接的糖基化相关的多种表型。
      ,
      • Elhenawy W.
      • 斯科特N.E.
      • Tondo M.L.
      • Orellano e.g.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      植物病原菌菌蛋白钴蛋白钴糖基化。
      ,
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      ,
      • abouelhadid s。
      • 北部S.J.
      • Hitchen P.
      • vohra p.
      • Chintoan-Uta C.
      • 史蒂文斯M.
      • 戴尔A.
      • Cuccui J.
      • Wren B.W.
      定量分析揭示了主要肠道细菌病原体中N-糖基化的新作用。
      )。尽管我们产生了富含细菌糖肽的能力,但该领域仍然很大程度上使用手动询问来识别和表征新型糖基化系统(
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      ,
      • 辛苦辛苦
      • NASR M.A.
      • Kinsella R.L.
      • 斯科特N.E.
      • 福斯特L.J.
      • 韦伯B.S.
      • Fiester S.E.
      • actis l.a.
      • Tracy e.n.
      • Munson R.S.
      • 费尔德曼M.F.
      传导杆菌菌株携带两种功能性寡核酸杆菌剂,一个专门致力于IV型pilin,以及专用于多种蛋白质的O-糖基化的另一个。
      ,
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • NOTHAFT H.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Labbate M.
      • djordjevic s.p.
      • Larsen M.R.
      • szymanski c.m.
      • Cordwell S.J.
      通过EPTC蛋白介导的磷乙醇胺的蛋白蛋白介导的Campylobacter N-Lated Glycan进行修饰。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
      • djordjevic s.p.
      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      ,
      • hadjineophytou c.
      • Anonsen J.H.
      • 王恩。
      • 马克。
      • viburiene R.
      • vikÅ。
      • 哈里森O.B.
      • Maiden M.C.J.
      • 毕业于Y.H.
      • Koomey M.
      细菌蛋白糖基化体系中属型甘油多样性的遗传决定因素。
      ,
      • Ulasi G.N.
      • Creese A.J.
      • 慧S.X.
      • Penn C.W.
      • Cooper H.J.
      从Campylobacter 11168的旗杆蛋白蛋白酸蛋白酶综合映射:偏酶差分离子迁移率质谱法。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 木头A.G.
      • Cain J.A.
      • 巴特勒J.A.
      • 霜H.
      • 尤尔阁下
      • 兰登R.
      • Cordwell S.J.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      幽门螺杆菌N-连接蛋白质糖基化体系的功能分析。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 巴特勒J.A.
      • 劳森A.J.
      • 兰登R.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      弯曲杆菌物种结构各种N键聚糖的表征。
      )。这种对手动询问的依赖性是不可缩​​放,耗时和容易出现人的误差,尤其是在检测糖族异质性。这是我们自己的表征糖基化的经验 Acinetobacter Baumannii. 在我们的初步分析忽视替代甲基化和脱乙酰化形式的葡糖醛酸(
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      )。因此,需要新方法以确保细菌糖基化学化研究可以以稳健和高吞吐量的方式进行。
      宽前体大众公差数据库彩易福彩,也称为“打开”或通配符彩易福彩,是蛋白质组学数据集中检测蛋白质修改的越来越流行的方法(
      • 鸡爪。
      • Kolippakkam D.
      • Nusinow D.P.
      • 翟德
      • RAD R.
      • Huttlin E.L.
      • Gygi S.P.
      容许数据库彩易福彩识别霰弹枪蛋白质组学中的大部分未分配的光谱作为改性肽。
      ,
      • na s.
      • Bandeira N.
      • PAEK E.
      快速多盲修改通过串联质谱进行彩易福彩。
      ,
      • devabhaktuni A.
      • 林S.
      • 张L.
      • Swaminathan K.
      • gonzalez c.g.
      • olsson n。
      • 珍珠夫人
      • rawson k。
      • eliasj.e.
      Taggraph揭示了大型串联质谱数据集的巨大蛋白质修改景观。
      ,
      • solntsev s.k.
      • 短red m.r.
      • Frey B.L.
      • 史密斯l.m.
      通过Metamorpheus增强全球翻译后修改发现。
      ,
      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      )。这种方法的潜在前提是通过允许宽的前体大众耐受性,可以通过观察到的质量与预期质量的差异来检测修饰的肽。重要的是,这使得识别无关的修改,无论是需要在初始彩易福彩参数中定义修改。这种方法已被用于检查甲型化的化学修饰(
      • Lenco J.
      • Khalikova M.A.
      • SVEC F.
      溶解0.1%甲酸中的肽带来人工甲型化的风险。
      )和错误烷基化(
      • Muller T.
      • 冬天D.
      对蛋白质还原和烷基化的系统评价显示含碘试剂的巨大非特异性副作用。
      )以及大规模的修饰,例如DNA肽交联(
      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      )和真核糖基化(
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      ,
      • Medzihradszky K.F.
      • Kaasik K.
      • Chalkley R.J.
      糖肽水平的组织特异性糖基化。
      )。虽然这种方法是有效的,但没有没有权衡的权衡比传统彩易福彩更昂贵,导致彩易福彩时间更长(
      • 李问:
      • 短red m.r.
      • 温格C.D.
      • Frey B.L.
      • Schaffer L.v.
      • Scalf M.
      • 史密斯l.m.
      全球翻译后修改发现。
      )。迄今为止,通常使用这些彩易福彩 ±500大公差(
      • 鸡爪。
      • Kolippakkam D.
      • Nusinow D.P.
      • 翟德
      • RAD R.
      • Huttlin E.L.
      • Gygi S.P.
      容许数据库彩易福彩识别霰弹枪蛋白质组学中的大部分未分配的光谱作为改性肽。
      ,
      • na s.
      • Bandeira N.
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      快速多盲修改通过串联质谱进行彩易福彩。
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      • devabhaktuni A.
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      • 珍珠夫人
      • rawson k。
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      Taggraph揭示了大型串联质谱数据集的巨大蛋白质修改景观。
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      • solntsev s.k.
      • 短red m.r.
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      通过Metamorpheus增强全球翻译后修改发现。
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      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      )±1000da的大三角形窗户(
      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      ,
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      甚至+ 3000da(
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      ,
      • Medzihradszky K.F.
      • Kaasik K.
      • Chalkley R.J.
      糖肽水平的组织特异性糖基化。
      ) 已经报道。尽管在真核蛋白质组学中寻找开放数据库的应用越来越多,但很少有细菌研究已经使用了这种技术。这所说,替代肽彩易福彩等替代策略已被用于细菌以跟踪氨基酸的MISlincorations(
      • Cvetesic N.
      • Semanjski M.
      • Soufi B.
      • 克鲁格克。
      • gruic-sovulj i.
      • MACEK B.
      通过蛋白质修饰的定量质谱法测定非规范细菌误差的蛋白质组测量。
      )并鉴定新颖的糖基化形式,例如精氨酸 - rhammnosylation(
      • Lassak J.
      • 吉尔霍尔e.c.
      • FürstM.
      • Wuichet K.
      • GödekeJ.
      • starosta a.l.
      • 陈J.-M.
      • Søgaard-Andersen L.
      • rohr J.
      • 威尔逊D.N.
      • HÄUSSLES.
      • jung k.
      精氨酸 - rhamnosylation作为激活翻译伸长因子P的新策略。
      )。
      在这项研究中,我们证明了广泛的质量(最多2000AD)开放数据库彩易福彩能够快速鉴定细菌糖肽,而无需在数据库彩易福彩之前分配甘草群。使用Byonic™,这使得糖肽和开放数据库彩易福彩(
      • 伯尔尼姆。
      • kil y.j.
      • Becker C.
      否决:晚期肽和蛋白质识别软件。
      ,
      • 伯尔尼姆。
      • Cai Y.
      • 戈德伯格D.
      查找峰值:通过串联质谱法进行Nevo测序和数据库彩易福彩蛋白质鉴定的混合。
      ),我们在三个以前表征的细菌糖基化系统上基准测试广泛寻找彩易福彩: N - 链接的糖基化系统 Campylobacter胎儿亚空间。胎儿 NCTC10842 (
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      );这 O - 链接的糖基化系统 Acinetobacter Baumannii. ATCC17978 (
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
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      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
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      • SCILD S.
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      鉴别 of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter Baumannii. and its role in virulence and biofilm formation.
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      • 费尔德曼M.F.
      A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter Baumannii..
      );和 O - 链接的糖基化系统 伯克德利亚 Cenocepacia. J2315 (
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      ,
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      )。这些细菌中的每一个具有越来越复杂的蛋白质素(从1600到近7000个蛋白),使我们能够评估在一系列蛋白质组大小的开放数据库彩易福彩的性能。我们发现开放数据库彩易福彩随心所欲地启用以前特征的糖食和微型物质性,以识别所有样本。将这种方法应用于代表性物种 伯克德利亚岛属 (
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      ,
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      ),我们在该属中提供糖基化的第一个快照。符合对伯克德利亚的生物合成途径的保护 O-Linded Glycans(
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      )所有Burkowneria物种均主要用两种类似组合物的糖粉结构修饰它们的糖蛋白。令人兴奋的是,我们证明开放式彩易福彩还可以检测到低频糖型,突出显示特异性的甘草结构在伯克德利亚中存在。因此,开放数据库彩易福彩能够以高吞吐量的方式识别各种细菌聚糖结构。

      实验步骤

       细菌菌株和生长条件

      C.胎儿亚数据。胎儿NCTC 10842. 在微血管条件下用5%偏压的马血液(Hemostat,Dixon,Ca)血液 - 心脏输注培养基(Hardy Diagnostics)上生长(10%CO2, 5% O2,85%n2)如前所述37°C(
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      )。 伯克德利亚 pseudomallei K96243以前报道的(
      • 伯爵n.m.
      • 斯科特N.E.
      • 诺维尔I.H.
      • 斯科特A.E.
      • 阿特金斯T.
      • 庞S.
      • Sarovich D.S.
      • Coombs G.
      • Inglis t.j.j.
      • 卡勒下午
      • Sarkar-Tyson M.
      肽基 - 脯氨酰异构酶PPIB对于Burkhowderia pseudomallei的蛋白质组稳态和毒力是必不可少的。
      )在Luria Bertani(LB)肉汤中。如前所述(
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      )。关于该研究中使用的菌株,它们的起源,参考和蛋白质组数据库的细节 表I..
      表I.应变列表
      菌株来源(描述,国家,年)参考蛋蛋白质组数据库
      Campylobacter胎儿亚空间。胎儿 NCTC 10842绵羊胎儿,法国的脑子,1952年(
      • VéronMCr.
      Sebald和Véron属的分类学研究,以及物种,振动杆菌(史密斯和泰勒)Sebald和Véro的新型菌株的指定。
      )
      UNIPROT数据库:UP000001035
      Acinetobacter Baumannii. ATCC179781951年,一个4个月大的婴儿的致命脑膜炎(
      • Baumann P.
      • Doudoroff M.
      • Stanier R.Y.
      莫拉克拉群体研究。 II。氧化剂阴性物种(acinetobacter)。
      )
      Genbank装配加入: gca_001593425.2
      伯克德利亚 pseudomallei K96243人类临床标本,泰国,1996年(
      • holden m.t.g.
      • Titball R.W.
      • 孔雀s.j.
      • Cerdeño-tárraga上午
      • 阿特金斯T.
      • Crossman L.C.
      • 皮特T.
      • 教堂C.
      • Mungall K.
      • 宾利S.D.
      • Sebaihia M.
      • 汤姆森N.R.
      • Bason N.
      • Beacham i.r.
      • 布鲁克斯克。
      • 棕色K.A.
      • 棕色N.F.
      • Challis G.L.
      • Cherevach I.
      • Chillingworth T.
      • Cronin A.
      • 十字路口B.
      • 戴维斯P.
      • Deshazer D.
      • Feltwell T.
      • 弗雷泽A.
      • Hance Z.
      • Hauser H.
      • Holroyd S.
      • 杰格尔斯K.
      • Keith K.E.
      • Maddison M.
      • Moule S.
      • 价格C.
      • 鹌鹑M.A.
      • rabbinowitsch E.
      • rutherford K.
      • 桑德斯米
      • Simmonds M.
      • 松西岛S.
      • 史蒂文斯K.
      • tumapa s.
      • vesaratchavest m.
      • 怀特黑头S.
      • 叶片C.
      • Barrell B.G.
      • oyston p.c.f.
      • Parkhill J.
      伯克德列德菌杂交蛋白均衡致病剂的基因组可塑性。
      )
      UNIPROT数据库:UP000000605
      伯克德利亚 Cenocepacia. (LMG 16656/J2315)人类临床标本,英国,1989年(
      • Vandamme P.
      • 福尔摩斯B.
      • Vancanneyt M.
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      • Hoste B.
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      • 振兴H.
      • Lauwers S.
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      • 凯斯特K.
      • GOVAN J.R.
      伯克德利亚 Cepacia在囊性纤维化患者中发生多种基因洛维亚的发生及Burkholderia Multivorans SP的提案。 11月。
      )
      UNIPROT数据库:UP000001035
      伯克德利亚 Multivorans MSMB2008土壤孤立,澳大利亚,2012年(
      • Sahl J.W.
      • Vazquez A.J.
      • 霍尔下午厅。
      • BUSCH J.D.
      • Tuanyok A.
      • 梅奥米
      • Schupp J.M.
      • Lummis M.
      • Pearson T.
      • 奶昔K.
      • Colman R.E.
      • allder c.j.
      • Theobald V.
      • Sarovich D.S.
      • 价格e.p.
      • Hutcheson A.
      • Korlach J.
      • Lipuma J.J.
      • 梯子J.
      • Lovett S.
      • KoroLeva G.
      • Palacios G.
      • Limmathurotsakul D.
      • Wuthiekanun V.
      • Wongsuwan G.
      • Currie B.J.
      • keim p.
      • 瓦格纳下午
      信号侵蚀和核心基因组对诊断标志物鉴定的影响。
      )
      伯克德利亚 Genome数据库(
      • Winsor G.L.
      • Khaira B.
      • van rossum t.
      • LO R.
      • Whiteside M.D.
      • Brinkman F.S.
      伯克德利亚 Genome数据库:促进灵活的查询和比较分析。
      ),应变编号:3016
      伯克德利亚 Dolosa Au0158人类临床标本,美国未知(
      • 约翰逊S.L.
      • Bishop-lilly K.A.
      • 梯子J.T.
      • DaLigault H.E.
      • 达文波特K.W.
      • 泽西州
      • 弗雷K.G.
      • KoroLeva G.I.
      • Bruce D.C.
      • Coyne S.R.
      • 乔布尔三个
      • 李p. -e.
      • Teshima H.
      • 长臂H.S.
      • Palacios G.F.
      • Rosenzweig C.N.
      • redden c.l.
      • 徐Y.
      • minogue t.d.
      • 链P.S.
      完全基因组序列为59个伯克德列风分离物,致病和邻居。
      )
      UNIPROT数据库:UP000032886
      伯克德利亚 humptydooensis MSMB43水孤立,澳大利亚,未知(
      • Sahl J.W.
      • Vazquez A.J.
      • 霍尔下午厅。
      • BUSCH J.D.
      • Tuanyok A.
      • 梅奥米
      • Schupp J.M.
      • Lummis M.
      • Pearson T.
      • 奶昔K.
      • Colman R.E.
      • allder c.j.
      • Theobald V.
      • Sarovich D.S.
      • 价格e.p.
      • Hutcheson A.
      • Korlach J.
      • Lipuma J.J.
      • 梯子J.
      • Lovett S.
      • KoroLeva G.
      • Palacios G.
      • Limmathurotsakul D.
      • Wuthiekanun V.
      • Wongsuwan G.
      • Currie B.J.
      • keim p.
      • 瓦格纳下午
      信号侵蚀和核心基因组对诊断标志物鉴定的影响。
      ,
      • Ginter J.L.
      • 梅奥米
      • 沃灵顿S.D.
      • Kaestli M.
      • Mullins T.
      • 瓦格纳下午
      • Currie B.J.
      • Tuanyok A.
      • keim p.
      澳大利亚北境内缅因近邻物种的缅因力近邻近。
      )
      伯克德利亚 Genome数据库(
      • Winsor G.L.
      • Khaira B.
      • van rossum t.
      • LO R.
      • Whiteside M.D.
      • Brinkman F.S.
      伯克德利亚 Genome数据库:促进灵活的查询和比较分析。
      ),应变编号:4072
      伯克德利亚 Ubonensis MSMB22土壤孤立,澳大利亚,2001年(
      • 约翰逊S.L.
      • Bishop-lilly K.A.
      • 梯子J.T.
      • DaLigault H.E.
      • 达文波特K.W.
      • 泽西州
      • 弗雷K.G.
      • KoroLeva G.I.
      • Bruce D.C.
      • Coyne S.R.
      • 乔布尔三个
      • 李p. -e.
      • Teshima H.
      • 长臂H.S.
      • Palacios G.F.
      • Rosenzweig C.N.
      • redden c.l.
      • 徐Y.
      • minogue t.d.
      • 链P.S.
      完全基因组序列为59个伯克德列风分离物,致病和邻居。
      )
      伯克德利亚 Genome数据库(
      • Winsor G.L.
      • Khaira B.
      • van rossum t.
      • LO R.
      • Whiteside M.D.
      • Brinkman F.S.
      伯克德利亚 Genome数据库:促进灵活的查询和比较分析。
      ),应变编号:3404
      伯克德利亚 Anthina MSMB649土壤孤立,澳大利亚,2010(
      • Sahl J.W.
      • Vazquez A.J.
      • 霍尔下午厅。
      • BUSCH J.D.
      • Tuanyok A.
      • 梅奥米
      • Schupp J.M.
      • Lummis M.
      • Pearson T.
      • 奶昔K.
      • Colman R.E.
      • allder c.j.
      • Theobald V.
      • Sarovich D.S.
      • 价格e.p.
      • Hutcheson A.
      • Korlach J.
      • Lipuma J.J.
      • 梯子J.
      • Lovett S.
      • KoroLeva G.
      • Palacios G.
      • Limmathurotsakul D.
      • Wuthiekanun V.
      • Wongsuwan G.
      • Currie B.J.
      • keim p.
      • 瓦格纳下午
      信号侵蚀和核心基因组对诊断标志物鉴定的影响。
      )
      伯克德利亚 Genome数据库(
      • Winsor G.L.
      • Khaira B.
      • van rossum t.
      • LO R.
      • Whiteside M.D.
      • Brinkman F.S.
      伯克德利亚 Genome数据库:促进灵活的查询和比较分析。
      ),应变编号:2849
      伯克德利亚 diffusa MSMB375水孤立,澳大利亚,2008年(
      • Sahl J.W.
      • Vazquez A.J.
      • 霍尔下午厅。
      • BUSCH J.D.
      • Tuanyok A.
      • 梅奥米
      • Schupp J.M.
      • Lummis M.
      • Pearson T.
      • 奶昔K.
      • Colman R.E.
      • allder c.j.
      • Theobald V.
      • Sarovich D.S.
      • 价格e.p.
      • Hutcheson A.
      • Korlach J.
      • Lipuma J.J.
      • 梯子J.
      • Lovett S.
      • KoroLeva G.
      • Palacios G.
      • Limmathurotsakul D.
      • Wuthiekanun V.
      • Wongsuwan G.
      • Currie B.J.
      • keim p.
      • 瓦格纳下午
      信号侵蚀和核心基因组对诊断标志物鉴定的影响。
      )
      伯克德利亚 Genome数据库(
      • Winsor G.L.
      • Khaira B.
      • van rossum t.
      • LO R.
      • Whiteside M.D.
      • Brinkman F.S.
      伯克德利亚 Genome数据库:促进灵活的查询和比较分析。
      ),应变编号:2966
      伯克德利亚 pseudomulivorans MSMB2199土壤孤立,澳大利亚,2011年(
      • Sahl J.W.
      • Vazquez A.J.
      • 霍尔下午厅。
      • BUSCH J.D.
      • Tuanyok A.
      • 梅奥米
      • Schupp J.M.
      • Lummis M.
      • Pearson T.
      • 奶昔K.
      • Colman R.E.
      • allder c.j.
      • Theobald V.
      • Sarovich D.S.
      • 价格e.p.
      • Hutcheson A.
      • Korlach J.
      • Lipuma J.J.
      • 梯子J.
      • Lovett S.
      • KoroLeva G.
      • Palacios G.
      • Limmathurotsakul D.
      • Wuthiekanun V.
      • Wongsuwan G.
      • Currie B.J.
      • keim p.
      • 瓦格纳下午
      信号侵蚀和核心基因组对诊断标志物鉴定的影响。
      )
      伯克德利亚 Genome数据库(
      • Winsor G.L.
      • Khaira B.
      • van rossum t.
      • LO R.
      • Whiteside M.D.
      • Brinkman F.S.
      伯克德利亚 Genome数据库:促进灵活的查询和比较分析。
      ),应变编号:3251

       用于糖蛋白酶体分析的细菌裂解物

      在用5ml预冷的无菌PBS(PBS)淹没之前,将细菌菌株生长至琼脂平板上的汇合,并通过刮擦收集的细菌细胞。将细胞在PBS中洗涤3次以除去培养基污染物,然后通过以10,000×离心收集 g 在4˚C下​​10分钟,然后快速冷冻。将冷冻细胞样品重新悬浮在4%SDS中,100米m 特里斯 pH 8.0, 20 mm Dithiothreitol(DTT)并在95˚C下煮沸,摇动为2000rpm 10分钟。通过以17,000×离心澄清样品 g 持续10分钟,然后收集上清液,并通过双子胆酸测定法测定蛋白质浓度(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)。通过将一体积的样品与4体积的4体积的冰冷丙酮混合,将来自每个样品的1mg蛋白质沉淀出丙酮。将样品在-20℃下沉淀过夜,然后以16,000×旋转下来 g 在0˚C时10分钟。将沉淀的蛋白质颗粒重悬于80%冰冷的丙酮中,并在-20℃下沉淀额外的4小时。将样品以17,000×离心 g 在0℃下10分钟,弃去的上清液和过量的丙酮在65℃下驱动5分钟的每种细菌菌株的三个生物重复。

       消化蛋白质样品

      如前所述,通过轻微改变进行蛋白质消化(
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
      • djordjevic s.p.
      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      )。简而言之,将干燥的蛋白质颗粒重悬于6米的尿素中,在40米中2米硫脲m NH4HCO3 然后用20米减少1小时m DTT随后用40米烷基化m 氯乙酰胺在黑暗中为1小时。然后用Lys-C(1/200w / w)消化样品3小时,然后用5体积的40米稀释m NH4HCO3和digested overnight with trypsin (1/50 w/w). Digested samples were acidified to a final concentration of 0.5% formic acid and desalted with 50 mg tC18 Sep-Pak columns (Waters corporation, Milford, MA) according to the manufacturer's instructions. tC18 Sep-Pak columns were conditioned with 10 bed volumes of Buffer B (0.1% formic acid, 80% acetonitrile), then equilibrated with 10 bed volumes of Buffer A* (0.1% TFA, 2% acetonitrile) before use. Samples were loaded on to equilibrated columns then columns washed with at least 10 bed volumes of Buffer A* before bound peptides were eluted with Buffer B. Eluted peptides were dried by vacuum centrifugation and stored at −20˚C.

       Zic-Hilic富集细菌糖肽

      如前所述进行ZIC-HILIC富集,如前所述(
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
      • djordjevic s.p.
      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      )。 ZIC-HILIC Stage-TIPS(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      使用缘物的蛋白质组学的微纯化,富集,分馏和储存的微纯化,富集,分馏和储存的方案。
      )通过包装0.5cm为10μm而产生的m Zic-Hilic树脂(Millipore,Burlington,MA)进入P200提示,其中包含C8 Empore™(Sigma,St.Louis,Mo)材料的玻璃料。在使用前,用超纯水洗涤柱,然后用95%乙腈洗涤,然后用80%乙腈和5%甲酸平衡。将消化的蛋白质组样品重悬于80%乙腈和5%甲酸中。将样品调节至3μg/μl的浓度(共300μg用于每个富集的肽),然后加载到平衡的ZiC-Hilic柱上。用20%乙腈,5%甲酸的20%晶体积洗涤ZIC-HILIC柱,以除去用10张床体积的超纯水洗脱的核心化肽和结合肽。通过真空离心干燥洗脱的肽并储存在-20℃。

       反向阶段LC-MS

      在缓冲液A *中重新悬浮ZIC-HILIC富集的样品,并使用双柱色谱设定由PEPMAP100 C18 20mm×75μm捕集器和PEPMAP C18 500mm×75μm分析柱(Thermo Fisher Scientific)组成。 。用缓冲液A(0.1%甲酸,2%DMS​​O)将样品浓缩到5μL/ min上5分钟,然后在300 nL下注入orbitrap Fusion™Lumos™Tribrid™质谱仪(Thermo Fisher Scientific)使用Dionex Ultimate 3000 UPLC(Thermo Fisher Scientific)通过分析柱。通过将缓冲剂组合物从2%缓冲液B(0.1%甲酸,77.9%乙腈,2%DMS​​O)以超过150分钟的28%B来改变缓冲液组合物进行185分钟的分析运行,然后从28%B至40%B超过10分钟,从40%b到100%b超过2分钟,组合物在100%b以100%b保持3分钟,然后在5分钟内滴加至2%b,然后再在2%b中另外15分钟的lumos™质谱仪在数据依赖模式下操作,自动在采集单个绕组MS扫描(120,000分辨率)之间切换,每3秒和Orbitrap MS / MS HCD扫描的前体(NCE 30%,最大喷射时间为80 ms,AGC 1 * 10.5 分辨率为15,000)。己酰胺Oxonium离子(204.087 m/z)产品依赖性MS / MS分析(
      • SABA J.
      • DUTTA S.
      • Hemenway E.
      • Viner R.
      通过使用更高能量的碰撞解离式精确的质量 - 产物依赖性电子转移解离,提高糖肽分析的生产率。
      )用于引发潜在糖肽的三种额外扫描;侧面型血液扫描(NCE 15%,最大喷射时间为250毫秒,AGC 2 * 105 分辨率为30,000);离子陷阱CID扫描(NCE 35%,最大喷射时间为40 ms,AGC 5 * 104)步进碰撞能量HCD扫描(使用NCE 32%,40%,48% N - 链接糖肽样品和NCE 28%,38%,48% O-Lindeded糖肽样品,最大喷射时间为250ms,AGC 2 * 105 分辨率为30,000)。为了 B. Pseudomallei. K96243糖肽富集,如上所述,通过修改延伸质量范围设定(200 m/z 到3000. m/z)改善高质量糖肽片段离子的检测(
      • oliveira l.m.
      • resende d.m.
      • Dorneles e.m.s.
      • Horácioe.c.a.
      • alves f.l.
      • Gonçalvesl.o.
      • 塔瓦斯G.S.
      • Stynen A.P.R.
      • le.page a.p.
      • Ruiz J.C.
      Complete genome sequence of type strain Campylobacter胎儿亚空间。胎儿 ATCC 27374.
      )。

       数据分析

      使用Byonic V3.5.3(蛋白质Metrics Inc(Protectrics Inc)处理原始数据文件
      • 伯尔尼姆。
      • kil y.j.
      • Becker C.
      否决:晚期肽和蛋白质识别软件。
      ))蛋白质组数据库表示 表I.。使用两个3.00 GHz Intel Xeon Gold 6148处理器,2TB SDD和128 GB的RAM在桌面上彩易福彩数据,使用最多16个核心用于给定彩易福彩。对于所有彩易福彩,设定了半胰蛋白的N-ragged特异性,最多允许两个错过的解理事件。氨基甲酰基被设定为胱氨酸的固定改性,而甲硫氨酸的氧化被称为可变改性。允许最大的质量前体耐受5ppm,而对于HCD片段和20ppm的醚片段设定高达10ppm的质量耐受性。开放彩易福彩 C.胎儿胎儿 samples (N - 链接的糖基化),使能允许在天冬酰胺残基上允许200Da和1600Da之间的δ质量。开放彩易福彩 O - 链接的糖基化样品,使能允许存在的通配符参数,从而使200DA和2000Da在丝氨酸和苏氨酸残基上的δ质量。对于聚焦彩易福彩,除了从包含从包括可变修改的开放彩易福彩标识的公共卡彩易福彩之外,上面列出的上面列出的所有参数仍然是常量的。为了确保高数据质量,使用来自相同的生物样品的单独数据组使用R和仅具有γcept的糖肽>300用于进一步分析。该分数截止符合先前的报告,突出显示较强的糖肽分配需要大于至少150的得分阈值(
      • Lenco J.
      • Khalikova M.A.
      • SVEC F.
      溶解0.1%甲酸中的肽带来人工甲型化的风险。
      ,
      • Lee L.Y.
      • Moh E.S.
      • Parker B.L.
      • 伯尔尼姆。
      • 包装机N.H.
      • Thaysen-Andersen M.
      在糖蛋白质中的自动化N-糖肽鉴定。
      )。应当注意,对于所有组合数据集,300的得分阈值导致误报率小于1%。使用Perseus进行Delta大规模概况的Pearson相关分析(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Sinitcyn P.
      • 卡尔森A.
      • 嘿m.y.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      Perseus综合分析(Prote)OMICS数据的计算平台。
      )。数据可视化在r中使用ggplot2进行,其中所有脚本包含在vide上传的数据集中。

       实验设计与统计理由

      对于每种细菌菌株检查,制备了三种生物学重复并用于导致每种细菌菌株的三种LC-MS的糖肽富集。制备三种单独的富集并运行,以确保可观察到的糖蛋白酶的准确表示。 B. Pseudomallei. K96243生物重复用两次不同的仪器方法运行两次,以改善990Da Glycan的表征。为了 C.胎儿胎儿NCTC 10842 未成分的肽样品以相同的方法运行,作为用于糖肽分析的那些,以评估富集在富集之前含有含有聚乙烯化聚糖的存在。

      结果

       开放数据库彩易福彩允许识别细菌N-连接的糖肽

      虽然开放数据库彩易福彩可以检测多种修饰,包括真核糖基化(
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      ,
      • Medzihradszky K.F.
      • Kaasik K.
      • Chalkley R.J.
      糖肽水平的组织特异性糖基化。
      [以我们的了解,它尚未应用于细菌系统或对非典型形式的糖基化的研究。为了能够鉴定与复合聚糖的糖肽,需要大的δ质量窗是甚至适度的聚糖(>三种单糖)将大于通常用于开放彩易福彩的500个窗口(
      • 鸡爪。
      • Kolippakkam D.
      • Nusinow D.P.
      • 翟德
      • RAD R.
      • Huttlin E.L.
      • Gygi S.P.
      容许数据库彩易福彩识别霰弹枪蛋白质组学中的大部分未分配的光谱作为改性肽。
      ,
      • na s.
      • Bandeira N.
      • PAEK E.
      快速多盲修改通过串联质谱进行彩易福彩。
      ,
      • devabhaktuni A.
      • 林S.
      • 张L.
      • Swaminathan K.
      • gonzalez c.g.
      • olsson n。
      • 珍珠夫人
      • rawson k。
      • eliasj.e.
      Taggraph揭示了大型串联质谱数据集的巨大蛋白质修改景观。
      ,
      • solntsev s.k.
      • 短red m.r.
      • Frey B.L.
      • 史密斯l.m.
      通过Metamorpheus增强全球翻译后修改发现。
      ,
      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      )。为了实现我们使用的广播彩易福彩,我们使用的是使用峰值查找方法来识别PSM(
      • 伯尔尼姆。
      • kil y.j.
      • Becker C.
      否决:晚期肽和蛋白质识别软件。
      ,
      • 伯尔尼姆。
      • Cai Y.
      • 戈德伯格D.
      查找峰值:通过串联质谱法进行Nevo测序和数据库彩易福彩蛋白质鉴定的混合。
      )。这种方法既快速又克服了组合爆炸,这导致了与数据库开放彩易福彩的长彩易福彩时间(
      • 李问:
      • 短red m.r.
      • 温格C.D.
      • Frey B.L.
      • Schaffer L.v.
      • Scalf M.
      • 史密斯l.m.
      全球翻译后修改发现。
      ,
      • 伯尔尼姆。
      • Cai Y.
      • 戈德伯格D.
      查找峰值:通过串联质谱法进行Nevo测序和数据库彩易福彩蛋白质鉴定的混合。
      )。为了评估基于官期的开放彩易福彩鉴定细菌糖肽的能力,我们首先检查了糖肽的富集 C.胎儿胎儿NCTC 10842.C.胎儿胎儿 拥有一个小蛋白质组(~1600蛋白(
      • oliveira l.m.
      • resende d.m.
      • Dorneles e.m.s.
      • Horácioe.c.a.
      • alves f.l.
      • Gonçalvesl.o.
      • 塔瓦斯G.S.
      • Stynen A.P.R.
      • le.page a.p.
      • Ruiz J.C.
      Complete genome sequence of type strain Campylobacter胎儿亚空间。胎儿 ATCC 27374.
      ))已知产生两个 N - 链接的聚糖组成,由β-glcnac-α1,3-[glcnac1,6-] glcnac-α1,4-加仑-α1,4-Galnac-α1,3-DinacBac(1243.507Da)和β-glcnac-α1,3组成 - [glc1,6-] GlcNAC-α1,4-Galnac-α1,4-Galnac-α1,4-纳克布(1202.481Da),DinacBac是细菌特异性糖2,4-二乙酰氨基-2,4,6三氧基葡萄氨酸(
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      )。
      我们彩易福彩了Zic-Hilic糖肽的富集 C.胎儿胎儿 允许在天冬酰胺上的200 da到1600 da的通配符,从而通过不到2小时的开放彩易福彩运行3 h lc-ms的处理(补充图S1A)。在0.001 da中通过分箱检测到的修改,增量的观察到的Δ质量呈现出明确的群众的清晰修改集群>1000Da (Fig. 1A)。在这些群众中,1242.501 DA和1201.475Da是观察到最多的δ群众(Fig. 1A, 补充表S1)然而,这些是预期的糖族的一个da C.胎儿胎儿 (
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      )。仔细检查观察到的三角洲群众通过卫星峰的出现显示单同位素群体的错误分配证据(
      • solntsev s.k.
      • 短red m.r.
      • Frey B.L.
      • 史密斯l.m.
      通过Metamorpheus增强全球翻译后修改发现。
      ,
      • 李问:
      • 短red m.r.
      • 温格C.D.
      • Frey B.L.
      • Schaffer L.v.
      • Scalf M.
      • 史密斯l.m.
      全球翻译后修改发现。
      )通过恰好一个da(补充图。S2A)。先前已经注意到大糖肽的单同位素峰的误操作(
      • 胫骨
      • Jung H.-J.
      • hyung s. -w。
      • 金H.
      • 李德。
      • lee c.
      • yu m.-h.
      • 李S. -W.
      串联质谱数据的PostimentPistopic质量过滤和细化(PE-MMR)增加了LC / MS / MS中肽鉴定的准确性。
      )通过允许表示为“OFF-X”参数的同位素重新分配来组合通过允许的同位素。 “Off-By-X”群众支持1243/1202 DA Glycans对观察到的1242/1201三角洲群众(补充图。S2B)。这些结果支持1243/1202Da Glycans在易于检测到 C.胎儿胎儿 使用Open Database彩易福彩的示例尽管在Mono-IsoTope分配中存在跨越多个群体的Delta大众观测,但由于Mono-IsoTope分配错误,因此可以分裂。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1开放彩易福彩分析 C.胎儿胎儿 NCTC 10842糖肽。 A, C.胎儿胎儿 糖肽δ质量曲线为0.001Da的增量,显示用超过1000DA的质量进行改性的PSM的检测。 B,缩放视图 C.胎儿胎儿 糖肽δ质量曲线突出显示最多观察到的δ质量;红色质量对应于非环氧化的聚糖,而黑质量对应于甲型化聚糖。 C,密度和缩放的delta质量图 C.胎儿胎儿 Glycan群众1243.507 da和1202.481 da。 D,在开放和聚焦的彩易福彩之间观察到独特的糖肽序列和糖蛋白的比较 C.胎儿胎儿 data sets.
      令人惊讶的是,我们的开放式彩易福彩还揭示了对应于甲型聚糖(+27.99Da)的另外的糖族,以及与来自1243Da或1202da聚糖的六氯(-203.079Da)或六克(-162.053Da)的损失相对应的修饰分别 (Fig. 1B)。 MS / MS分析支持这些增量群体作为意外但BONA FIDE Glycoforms(补充图。s3a到s3j)。先前已经观察过甲酰基化聚糖(
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
      • djordjevic s.p.
      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      )在Zic-Hilic富集期间,由于高浓度的甲酸(
      • Lenco J.
      • Khalikova M.A.
      • SVEC F.
      溶解0.1%甲酸中的肽带来人工甲型化的风险。
      )在富集期间使用。这些甲酰基化的聚糖代表了所有潜在的糖肽PSM的显着比例(Fig. 1B, 补充表S1)。与甘草甲型化的一致性是伪造的,在C上未观察到它。 胎儿胎儿 未成分样品中的糖肽(补充图S4)。为了评估使用开放彩易福彩获得的聚糖质量的精度,我们使用基于密度的配合方法提取了1243和1202Da Glycans的平均δ质量(
      • avtonomov d.m.
      • 孔子A.
      • nesvizhskii a.i.
      DELTAMASS:蛋白质组学开放彩易福彩结果中的自动检测和可视化。
      )(Fig. 1C1D)。我们发现1243Da,1202达聚糖的开放彩易福彩定义质量均在已知质量的5 ppm范围内(
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      )支持这种方法可以高精度地确定大修改。最后,我们评估了使用七个鉴定的糖综合体的开放数据库方法对传统彩易福彩的蛋白质组覆盖(1040.423DA,1068.419DA,1202.475Da,1230.469Da,1243.501Da,1271.497Da,1299.492Da, Fig. 1B)作为专注的彩易福彩(
      • Khatri K.
      • Klein J.A.
      • Zaia J.
      使用明智的彩易福彩空间最大限度地提高了糖蛋白糖基化的特异性特异性分配的信心。
      )。与以前的研究符合关注的彩易福彩优先于开放的开放数据库彩易福彩(
      • 鸡爪。
      • Kolippakkam D.
      • Nusinow D.P.
      • 翟德
      • RAD R.
      • Huttlin E.L.
      • Gygi S.P.
      容许数据库彩易福彩识别霰弹枪蛋白质组学中的大部分未分配的光谱作为改性肽。
      ,
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      ,
      • Medzihradszky K.F.
      • Kaasik K.
      • Chalkley R.J.
      糖肽水平的组织特异性糖基化。
      )通过35%和糖蛋白通过28%提高独特糖肽的鉴定(Fig. 1D, 补充表S2)。这种改进也与来自456至491的平均糖精PSM的平均复调评分的增加有关,其具有相同的MS / MS扫描,接受了聚焦和开放的彩易福彩分配之间的平均114对频率得分(补充图S5)。这些聚焦的彩易福彩还证明了甲型聚糖的聚糖占所有糖肽的近1/3分配的PSM(>1246甲酰化甘油PSM中的总量为3824颗糖肽PSM, 补充表S2)。结合,这些结果表明开放式彩易福彩允许检测异质细菌 N - 在彩易福彩之前,不需要定义聚糖的糖肽。

       打开数据库彩易福彩允许鉴定细菌O型糖肽

      为了评估开放彩易福彩与细菌O型糖肽的兼容性,我们检查了糖肽的富集 A. Baumannii ATCC17978。这 A. Baumannii. 蛋白质组是两倍的大小 C.胎儿胎儿 (∼3600 proteins (
      • 史密斯M.G.
      • Gianoulis T.A.
      • Pukatzki S.
      • Mekalanos J.J.
      • 或者nston l.n.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      New insights into Acinetobacter Baumannii. pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis.
      ))迄今为止报告的丝氨酸和苏氨酸残留物的糖基化(
      • iwashkiw J.A.
      • Seper A.
      • 韦伯B.S.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • Stratilo C.
      • reiz b.
      • Cordwell S.J.
      • 漂亮的R.
      • SCILD S.
      • 费尔德曼M.F.
      鉴别 of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter Baumannii. and its role in virulence and biofilm formation.
      )。在该系统内,糖蛋白主要与聚糖GlcNAC3NACA4OAC-4-(β-GlcNAC-6 - ) - α-Gal-6-β-Glc-3-β-加仑蛋白质修饰,其中GlcNac3Naca4OAc对应于细菌糖2,3-二乙酰氨基-2,3-二赤氧基 - α-d-Glucuronic酸(甘油质量1030.368Da(
      • iwashkiw J.A.
      • Seper A.
      • 韦伯B.S.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • Stratilo C.
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      • Cordwell S.J.
      • 漂亮的R.
      • SCILD S.
      • 费尔德曼M.F.
      鉴别 of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter Baumannii. and its role in virulence and biofilm formation.
      )))。重要的是,该末端胰葡糖醛酸也可以在甲基化以及未乙酰化状态(对应于聚糖质量1044.383Da和988.357Da(
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • iwashkiw J.A.
      • Seper A.
      • 韦伯B.S.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • Stratilo C.
      • reiz b.
      • Cordwell S.J.
      • 漂亮的R.
      • SCILD S.
      • 费尔德曼M.F.
      鉴别 of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter Baumannii. and its role in virulence and biofilm formation.
      )))。 A. Baumannii. 彩易福彩糖肽富集允许在丝氨酸和苏氨酸残留物上的200da至2000Da的通配符质量。这种彩易福彩的复杂性增加,两者都是潜在地修改的氨基酸的数量以及蛋白质组的大小,导致每个数据文件的彩易福彩时间标记增加到〜10小时(补充图S1B)。在这些样本中,开放彩易福彩容易使得能够识别到预期的聚糖的多个相似大小的多个Δα A. Baumannii ATCC17978也the unexpected glycoforms of 827.281 and 1058.358 Da (Fig. 2A, 补充表S3)。这些新的聚糖质量与甲酰化(+27.99Da)一致,以及来自1030Da Glycan的六烷基克(-203.079Da),MS / MS分析支持这些作业(补充图S6)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2开放彩易福彩分析 A. Baumannii ATCC17978 glycopeptides. A, A. Baumannii. 糖肽δ质量图为0.001Da的增量,显示用800Da超过800 da的质量调节PSM的检测。 B,缩放的视图 A. Baumannii. 糖肽Delta质量曲线突出显示最多观察到的修饰。 C,在开放和聚焦的彩易福彩之间观察到的独特糖肽序列和糖蛋白的比较 A. Baumannii. 数据集 D,显示在聚焦彩易福彩内的糖肽PSM上观察到的聚糖(in)的糖粉质量曲线。 E,显示基于在这些肽上观察到的聚糖数量分组的独特糖肽序列的数量。
      对这些群众的检查显示最多的达达群众(1029.362Da,987.355Da和1043.378Da)比预期的一致 A. Baumannii. glycan masses (Fig. 2B (
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
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      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • iwashkiw J.A.
      • Seper A.
      • 韦伯B.S.
      • 斯科特N.E.
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      • Cordwell S.J.
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      • 费尔德曼M.F.
      鉴别 of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter Baumannii. and its role in virulence and biofilm formation.
      )))。和人一样 C.胎儿胎儿, 检查这些作业显示“OFF-BY-X”参数的应用程序不正确,导致跨多个质量分配分隔的多群群体的拆分(补充图S7)。使用群众1030.368DA,988.357DA,1044.383DA,827.281DA和1058.358DA,我们研究了这些 A. Baumannii. 数据集以评估开放性的良好彩易福彩的性能。与在开放和聚焦的彩易福彩之间观察到的独特糖肽的〜35%〜35% C.胎儿胎儿 we noted a dramatic >在内部确定的独特糖肽的改善240% A. Baumannii. 使用聚焦彩易福彩(Fig. 2C)。要了解这种戏剧性改善,我们检查了针对聚焦彩易福彩所特有的67种糖肽。在这些糖肽内,我们注意到与用多种聚糖改性的糖肽(Fig. 2D, 补充表S4)。实际上,>20%(共2282颗糖肽PSM中的494个)对应于附着大于一个聚糖的糖肽。在这些PSM中,仅观察到31种独特的肽序列>1 glycan attached (Fig. 2E)。在聚焦彩易福彩中识别的独特糖肽数量增加也与平均成分分数的增加以及相同的MS / MS扫描接收到平均149个权力分数之间的聚焦和开放彩易福彩分配(补充图S8)。如同 C.胎儿胎儿,用甲酰化聚糖鉴定大部分糖肽PSM( >309分中总共2282颗糖肽PSM, 补充表S4)。重要的是要注意,倍增糖基化肽的δ质量落在2000DA窗口之外,用于开放彩易福彩,这是无法检测这些糖肽的预期彩易福彩参数的限制。因此,虽然开放彩易福彩能够快速鉴定糖肽,但是可以忽略大的聚糖/倍增糖基化肽,其支持两步(开放后的开放)彩易福彩方法的值。

       开放数据库彩易福彩可以在大蛋白质组内鉴定糖基化

      由于开放彩易福彩使得能够鉴定N和O-Linked糖肽,我们试图利用使用来自细菌的富集的样品的较大蛋白质蛋白质与较大的蛋白质蛋白酶探讨这种方法的兼容性 B. Cenocepacia. J2315作为模型。这 B. Cenocepacia. 蛋白质组编码〜7000个蛋白质(
      • holden m.t.g.
      • Seth-Smith H.M.B.
      • Crossman L.C.
      • Sebaihia M.
      • 宾利S.D.
      • Cerdeño-tárraga上午
      • 汤姆森N.R.
      • Bason N.
      • 鹌鹑M.A.
      • 夏普S.
      • Cherevach I.
      • 教堂C.
      • Goodhead I.
      • Hauser H.
      • Holroyd N.
      • Mungall K.
      • 斯科特P.
      • 沃克D.
      • 白b。
      • 玫瑰H.
      • Iversen P.
      • 米兰母屋D.
      • Rocha E.P.C.
      • 菲利奥上午
      • Baldwin A.
      • Dowson C.
      • Barrell B.G.
      • GOVAN J.R.
      • Vandamme P.
      • 哈特C.A.
      • Mahenthiralingam E.
      • Parkhill J.
      The genome of Burkholderia Cenocepacia. J2315, an epidemic pathogen of cystic fibrosis patients.
      )并拥有一个 O - 密切的糖基化体系负责修饰至少23个蛋白质(
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      )。以前,我们表明,该糖基化系统转移由β-加仑(1,3)-α-加仑蛋白(1,3)-β-Galnac和Suc-β-gal-(1,3)-α组成的两种聚糖-Galnac-(1,3)-β-加纳酸,其中Suc是琥珀酰基分别对应于质量568.211Da和668.228Da的这些聚糖(
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      ,
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      )。和人一样 A. Baumannii, 增加该蛋白质组的复杂性导致彩易福彩时间的增加,各个数据文件都需要〜20小时进程(补充图S1C)。这些开放式彩易福彩显示出存在预期的糖族 B. Cenocepacia. (568.207 DA和668.223 DA)以及额外的含甲酰基化变体(596.202DA,624.197和696.218DA),导致鉴定五种独特的糖蛋白(Fig. 3A, 补充表S5)。与大型聚糖不同 C.胎儿胎儿和A. Baumannii, 值得注意的是,已知的单同位素质量 B. Cenocepacia. glycans (
      • Lithgow K.v.
      • 斯科特N.E.
      • iwashkiw J.A.
      • Thomson E.L.S.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      )被正确分配(Fig. 3A)。因此,这支持用于较小的聚糖在开放彩易福彩期间单位同位素群体的误操作不会出现问题。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3开放彩易福彩分析 B. Cenocepacia. J2315 glycopeptides. A, B. Cenocepacia. 糖肽δ质量曲线为0.001Da的增量,显示用超过500da的质量改性PSM的检测。缩放面板中显示的突出显示区域。 B,在开放和聚焦的彩易福彩之间观察到独特的糖肽序列和糖蛋白的比较 B. Cenocepacia. 数据集 C,显示在聚焦彩易福彩内的糖肽PSM上观察到的聚糖(in)的糖粉质量曲线。近40%的所有糖肽PSM用两种或更多种聚糖装饰。
      将这些糖素掺入聚焦的彩易福彩再次导致糖肽数量的显着〜4倍,与开放彩易福彩相比鉴定的总数糖蛋白的〜2倍增加(Fig. 3B, 补充表S6)。虽然识别总数的改善与平均成分(从728到700到700)的减少有关,但是相同的MS / MS扫描的指定得分揭示了聚焦彩易福彩的平均反肠评分的增加与175相比开放彩易福彩的分配(补充图S9)。作为糖蛋白覆盖率的显着改善 A. Baumannii. 通过检测乘法糖基化肽的检测部分驱动,我们检查了糖肽PSM中的糖基化的量 B. Cenocepacia.。作为 B. Cenocepacia. 用多种聚糖改性的糖肽小于2000Da,我们对我们开放彩易福彩中确定的有限数量的繁殖糖基化肽感到惊讶(<所有鉴定的糖肽的10%, 补充图S10)。相比之下,聚焦彩易福彩识别所有PSM的〜40%(Fig. 3C,3937个鉴定的糖肽PSM中的1508个)对应于乘法改性肽。和人一样 C.胎儿胎儿A. Baumannii. 甲酰基化聚糖组成近50%的糖肽PSM(Fig. 3C, 补充表S6)。这些数据支持,尽管开放彩易福彩对于单独修饰的肽表现良好,但是即使糖粉的组合质量在开放彩易福彩范围内,这种方法也是不足的常见糖基化肽。

       开放数据库彩易福彩允许筛选含有生物样本的聚糖

      已经确定开放彩易福彩可以识别一系列聚糖,我们试图探索这一点,如果这还可以促进细菌样本的聚糖多样性的比较。最近,我们报告说,单个基因座负责生成O型综合聚糖 B. Cenocepacia.和that this loci is conserved across the 伯克德利亚 (
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      )。虽然这些结果支持伯克德列达群岛物种使用类似的聚糖,但已经注意到,在其他细菌属中存在广泛的甘草异质性(
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
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      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
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      • viburiene R.
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      • 毕业于Y.H.
      • Koomey M.
      细菌蛋白糖基化体系中属型甘油多样性的遗传决定因素。
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      • 林顿D.
      弯曲杆菌物种结构各种N键聚糖的表征。
      )。随着聚糖的异质性可能具有挑战性,我们推理开放彩易福彩将提供评估横跨伯克德列利群种使用的聚糖的相似性的方法。我们检查了八种伯克德列利亚(八种)的糖肽富集(B. Pseudomallei K96243; B. Multivorans MSMB2008; B. Dolosa AU0158; B. Humptydooensis MSMB43; B. ubonensis MSMB22,B. Anthina MSMB649; B. diffusa MSMB375;和B. Pseudomultivorans MSMB2199)。在这八种物种上观察到的δ肿块表明,所有菌株中存在568Da和668Da甘油膜以及其含甲酰基化变体( Fig. 4A补充图。S11, 补充表S7至S14)。为每个物种产生“Delta Mass FingerPrints”,我们评估了这些配置文件是否可以使用Pearson相关性和分层聚类来进行聚集使用的比较(Fig. 4B补充图。S12)。与Delta Mass FingerPrints Pearson相关性和分层聚类的相似性一致地导致所有Burkholderia物种的分组与Delta Mass指纹相比 C.胎儿胎儿A. Baumannii. (Fig. 4B)。这些结果支持,符合伯克德列卡内糖基化基因座的培养,基于群体的伯克德列薇物种中观察到的主要糖族是相同的。应该注意的是,与上述糖肽数据集一样,聚焦彩易福彩显着改善了所有伯克德列风(补充图。S13, 补充表S15至S22)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4伯克德大甲糖蛋白使用开放彩易福彩的比较。 A八个伯克德列利菌菌株中的四种ΔUmate句子的代表性Δ质量句在展示568Da和668da聚糖中经常鉴定伯克德犬糖肽富集的δ群众。甲酰基化的聚糖用黑色表示,而Burkowneria O-连接的聚糖是红色的。 B,Pearson相关性和Delta Mass Plot的聚类分析能够比较和分组样品。

       开放数据库彩易福彩允许在基于已知的糖基可达肽的低频下检测鉴定的糖族

      除了允许跨种类的聚糖多样性的比较外,我们还推理开放彩易福彩还允许基于糖基可达肽序列的共同用途鉴定新型聚糖。在细菌糖基化研究中,与不同的糖基化机器相容的蛋白质通常用于“鱼”除了不同细菌物种中用于蛋白质糖基化的聚糖(
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 巴特勒J.A.
      • 劳森A.J.
      • 兰登R.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      弯曲杆菌物种结构各种N键聚糖的表征。
      )。类似地,通过专注于用568/668Da聚糖进行修饰的肽,我们假设这将提供检测伯克德列利群物种内用于糖基化的替代聚糖的方法。为了评估这一点,我们检查了糖肽的富集 B. Pseudomallei. K96243在肽序列上仅观察到的δ质量的过滤也用568/668Da聚糖(Fig. 5A)。对这些δ质量的检查很容易揭示匹配单一(203.077DA)或双(406.158Da)六氯残基的肽改性的PSMS的存在,两种568Da聚糖(1136.422Da)和990.390 da(Fig. 5A)。分配给该990 daδ质量的PSM的检查显示,由六氯庚糖-Heptose-188-215组成的直链甘油,其中188Da和215Da是未知组合物的部分(Fig. 5B)。将这种意外的甘草质量纳入与已知的Burkholderia聚糖的聚焦彩易福彩,证明了990.390Da Glycan在多个肽底物上观察到,但小于所有糖肽PSM的6%对应于这种新的聚糖(Fig. 5C)。因此,这表明开放彩易福彩提供了检测意外的糖食的有效手段,这是由于其在糖蛋白数据集中出现的低频率而被忽略。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5鉴定内部糖蛋白 B. Pseudomallei. K96243. A,达到0.001Da的δ质子图,显示出于用568或668D聚糖改性的肽序列观察到的δ质量。 B,MS / MS分析(FTMS-HCD,ITMS-CID和FTMS-ETHCD)支持在肽KAATAADASQ附着于肽KAATAASQ附着的六氯庚糖-Heptose-188-215的直链甘油。 C,糖粉质量图显示在聚焦彩易福彩内的糖肽PSM上观察到的聚糖(in da)的量。观察到所有PSM的〜6%的〜6%的用990Da Glycan改性。

      讨论

      糖蛋白样品的MS分析通常需要了解蛋白质组和可能的聚糖组合物,以促进基于软件的鉴定(
      • 胡H.
      • Khatri K.
      • Klein J.
      • Leymarie N.
      • Zaia J.
      糖肽串联质谱数据解释方法述评。
      )。由于细菌糖基化系统不使用在真核甘油数据库中发现的聚糖(
      • 不幸的穆罕默德y.
      • 斯科特N.E.
      • Molinaro A.
      • Creuzenet C.
      • 或者tega x.
      • Lertmemongkolchai G.
      • 唐尼米米。
      • 绿色H.
      • 琼斯上午
      • Deshazer D.
      • Currie B.J.
      • 福斯特L.J.
      • Ingram R.
      • de Castro C.
      • Valvano M.A.
      在伯克德列利亚洲物种中保守的一般蛋白质O-糖基化机械改善了人类的细菌健身,并引发了聚糖免疫原性。
      ,
      • 辛苦辛苦
      • NASR M.A.
      • Kinsella R.L.
      • 斯科特N.E.
      • 福斯特L.J.
      • 韦伯B.S.
      • Fiester S.E.
      • actis l.a.
      • Tracy e.n.
      • Munson R.S.
      • 费尔德曼M.F.
      传导杆菌菌株携带两种功能性寡核酸杆菌剂,一个专门致力于IV型pilin,以及专用于多种蛋白质的O-糖基化的另一个。
      ,
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
      • Cordwell S.J.
      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Kinsella R.L.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Larsen M.R.
      • DUTTA S.
      • SABA J.
      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • NOTHAFT H.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • Labbate M.
      • djordjevic s.p.
      • Larsen M.R.
      • szymanski c.m.
      • Cordwell S.J.
      通过EPTC蛋白介导的磷乙醇胺的蛋白蛋白介导的Campylobacter N-Lated Glycan进行修饰。
      ,
      • 斯科特N.E.
      • Parker B.L.
      • 康诺利地
      • Paulech J.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 十字路口B.
      • Falconer L.
      • Kolarich D.
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      • Højrupp.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
      ,
      • hadjineophytou c.
      • Anonsen J.H.
      • 王恩。
      • 马克。
      • viburiene R.
      • vikÅ。
      • 哈里森O.B.
      • Maiden M.C.J.
      • 毕业于Y.H.
      • Koomey M.
      细菌蛋白糖基化体系中属型甘油多样性的遗传决定因素。
      ,
      • Ulasi G.N.
      • Creese A.J.
      • 慧S.X.
      • Penn C.W.
      • Cooper H.J.
      从Campylobacter 11168的旗杆蛋白蛋白酸蛋白酶综合映射:偏酶差分离子迁移率质谱法。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 木头A.G.
      • Cain J.A.
      • 巴特勒J.A.
      • 霜H.
      • 尤尔阁下
      • 兰登R.
      • Cordwell S.J.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      幽门螺杆菌N-连接蛋白质糖基化体系的功能分析。
      ,
      • Jervis A.J.
      • 巴特勒J.A.
      • 劳森A.J.
      • 兰登R.
      • Wren B.W.
      • 林顿D.
      弯曲杆菌物种结构各种N键聚糖的表征。
      ),我们试图建立一种替代方法,用于对细菌糖蛋白的高通量分析。在这项工作中,我们证明了广泛的质量开放数据库彩易福彩能够鉴定细菌糖基化,而无需在彩易福彩之前确定聚糖块。这种方法克服了新型细菌糖基化系统的鉴定和表征中的显着瓶颈。我们证明了一系列不同的聚糖结构,据报道(
      • NOTHAFT H.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • 刘X.
      • 胡R.
      • Beadle B.
      • FODOR C.
      • 米勒W.G.
      • 李杰。
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      • szymanski c.m.
      弯曲杆菌内蛋白质N-糖基化途径的多样性。
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      • Kinsella R.L.
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      • DUTTA S.
      • SABA J.
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      o-连接蛋白质糖基化体系中的异膜杆菌物种的多样性。
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      • 福斯特L.J.
      • 费尔德曼M.F.
      • 丹尼斯J.J.
      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      ,
      • iwashkiw J.A.
      • Seper A.
      • 韦伯B.S.
      • 斯科特N.E.
      • vinogradov E.
      • Stratilo C.
      • reiz b.
      • Cordwell S.J.
      • 漂亮的R.
      • SCILD S.
      • 费尔德曼M.F.
      鉴别 of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter Baumannii. and its role in virulence and biofilm formation.
      )和未报告,例如观察到的990 da glycan B. Pseudomallei. K96243以及诸如甲型含有甲型聚糖的聚糖伪像可以使用这种方法鉴定。此外,我们还证明了开放的数据库彩易福彩可用于提供一种简单的方法来比较生物样本跨生物样本的Delta质量谱。这使得能够进行比较和对比细菌糖蛋白的直接方法,从而能够从非非法甘露甘油概况中分组伯克德利亚曲线,例如所看到的那些 C.胎儿胎儿 或者 A. Baumannii..
      在这项工作中,我们在糖蛋白群落中使用了广泛的糖蛋白群落中的开放彩易福彩,用于分析糖基化(
      • Lee L.Y.
      • Moh E.S.
      • Parker B.L.
      • 伯尔尼姆。
      • 包装机N.H.
      • Thaysen-Andersen M.
      在糖蛋白质中的自动化N-糖肽鉴定。
      ,
      • Parker B.L.
      • Thaysen-Andersen M.
      • solis n.
      • 斯科特N.E.
      • Larsen M.R.
      • 格雷厄姆M.E.
      • 包装机N.H.
      • Cordwell S.J.
      特异性聚糖肽分析,用于测定N-糖蛋白酶组非均质性。
      ,
      • 莱利n.m.
      • Hebert A.S.
      • Westphall M.S.
      • Coon J.J.
      用大规模的N-糖蛋白酶体分析捕获特异性特异性异质性。
      )。这使我们能够直接比较开放彩易福彩对聚焦的糖肽彩易福彩在同一平台内的表现。我们观察到聚焦彩易福彩中的糖肽和糖蛋白鉴定的显着改善,特别是对于用多种聚糖改性的糖肽。随着最佳糖肽鉴定所需的若干唯一考虑,例如核糖碎片的核算(
      • 胡H.
      • Khatri K.
      • Klein J.
      • Leymarie N.
      • Zaia J.
      糖肽串联质谱数据解释方法述评。
      ,
      • Darula Z.
      • Medzihradszky K.F.
      哺乳动物O-Glycopeptides分析 - 我们已经取得了良好的开端,但有很长的路要走。
      ),这种性能的改善是不熟产的。与此符合这一致,我们观察到与大多数数据集的开放彩易福彩相比,关注彩易福彩内的对个体分数的增加(补充图S5, S8, 和 S9)。这种改善转化为〜240%鉴定的独特糖肽和糖蛋白的数量增加。这与以前的研究一致(
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      ,
      • Medzihradszky K.F.
      • Kaasik K.
      • Chalkley R.J.
      糖肽水平的组织特异性糖基化。
      )观察结果,非优化的糖肽分析可以导致糖蛋白覆盖率的降低(
      • Khatri K.
      • Klein J.A.
      • Zaia J.
      使用明智的彩易福彩空间最大限度地提高了糖蛋白糖基化的特异性特异性分配的信心。
      )。虽然在本研究中使用了通过官文,但应该注意替代非商业平台,如Msfragger(
      • 孔A.T.
      • Leprevost F.v.
      • avtonomov d.m.
      • Mellacheruvu D.
      • nesvizhskii a.i.
      小姐FRAGRE:基于质谱的蛋白质组学中的超快和综合肽鉴定。
      )也允许开放彩易福彩。在我们的手中,MSFRAGREGS与通过OPEN彩易福彩鉴定糖综合症进行鉴定(补充图S14a到S14F.)。然而,与我们的开放性彩易福彩一样,Msfragger并未识别出许多独特的糖肽/糖蛋白作为聚焦的致力调查(补充图s15a到s15f.)。这些结果表明,开放彩易福彩可用于鉴定糖肽,然而由于与糖肽相关的独特挑战,鉴定开放彩易福彩可能比聚焦彩易福彩更敏感。
      虽然我们使用了群众的开放彩易福彩,最高可达200​​0年的大量质量范围,并且已被用于鉴定糖肽。事实上,对于真核糖基化分析,已经证明了+ 3000Da的开放彩易福彩,使得能够鉴定尺寸高达约20000a的聚糖(
      • 特立尼达J.C.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      • Medzihradszky K.F.
      鼠突触体中的N-和O-糖基化。
      ,
      • Medzihradszky K.F.
      • Kaasik K.
      • Chalkley R.J.
      糖肽水平的组织特异性糖基化。
      )。虽然多个开放式彩易福彩工具允许最大的Δ质量范围扩大,但这可能是以彩易福彩时间为代价的(
      • 李问:
      • 短red m.r.
      • 温格C.D.
      • Frey B.L.
      • Schaffer L.v.
      • Scalf M.
      • 史密斯l.m.
      全球翻译后修改发现。
      )。应该注意的是,在没有额外的高置信分配之前,可以使用最大Δ质量的最大Δ质量上限。该最大限制不仅由检查的分析物决定,而且仅确定MS / MS采集参数。例如,对于糖肽作为甘草的量,装饰肽的量增加了最佳的碰撞能量和ETD反应时间开始从标准参数偏离(
      • Hinneburg H.
      • Stavenhagen K.
      • Schweiger-Hufnagel U.
      • 彭莱利S.
      • jabs w.
      • Seeberger P.H.
      • Silva D.v.
      • Wuhrer M.
      • Kolarich D.
      销毁艺术:优化基于糖肽的糖蛋白酶糖蛋白酶(Q-TOF)仪器中的四极型 - 时间中的碰撞能量。
      ,
      • alagesan K.
      • Hinneburg H.
      • Seeberger P.H.
      • Silva D.v.
      • Kolarich D.
      糖粉尺寸和附着点位置影响电子转移解离(ETD)碎片和自动化糖肽鉴定。
      )。因此,即使使用开放彩易福彩肽的一些特定子集可能仍然是无法识别的,而不是仔细裁缝数据采集方法。
      在其核心,这种分析方法使用基于“数量的强度”,用于检测聚糖的策略。这种方法的一个关键优点在于它不需要鉴定肽的肽的未修改版本,以根据依赖性肽的方法所需鉴定(
      • Cvetesic N.
      • Semanjski M.
      • Soufi B.
      • 克鲁格克。
      • gruic-sovulj i.
      • MACEK B.
      通过蛋白质修饰的定量质谱法测定非规范细菌误差的蛋白质组测量。
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      • Lassak J.
      • 吉尔霍尔e.c.
      • FürstM.
      • Wuichet K.
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      • starosta a.l.
      • 陈J.-M.
      • Søgaard-Andersen L.
      • rohr J.
      • 威尔逊D.N.
      • HÄUSSLES.
      • jung k.
      精氨酸 - rhamnosylation作为激活翻译伸长因子P的新策略。
      )。这种独立性是对未修饰的肽的必要性使得这种方法与Zic-Hilic糖肽富集等富集策略相容。这对于最佳性能很重要,这种方法需要大量具有相同的增量群众的PSM。应该注意的是,在Zic-hilic富集中,细菌糖肽仍然只是观察到的肽的较小比例<鉴定的PSM的10%(补充图S16)。在这项工作中,我们专注于已知靶向多种蛋白质基质的细菌糖基化系统(
      • NOTHAFT H.
      • szymanski c.m.
      细菌N-糖基化的新发现膨胀合成生物工具箱。
      ,
      • Koomey M.
      o-链接蛋白质糖基化在细菌中:快照和当前的观点。
      ),确保识别大量独特的PSM /肽序列。我们发现,在糖肽富集内,已知的糖族 C.胎儿胎儿, A. Baumannii.B. Cenocepacia. 很容易检测到,而不经常观察到的聚糖,例如在内部观察到的990Da Glycan B. Pseudomallei.,需要额外的过滤以将其与背景信号区分开来。这支持虽然开放彩易福彩能够检测糖食,但它对数据集中观察到修改事件的频率敏感。虽然我们使用基于糖化肽序列的过滤来识别低频事件,但最近的基于核心密度估计的拟合方法被证明以更一般的方式有效地解决了这个问题(
      • avtonomov d.m.
      • 孔子A.
      • nesvizhskii a.i.
      DELTAMASS:蛋白质组学开放彩易福彩结果中的自动检测和可视化。
      )。因此,开放数据库彩易福彩提供了多种方法来识别甚至那些从背景中解析得差的修改。
      在我们的开放彩易福彩中的令人惊讶的观察是富含甘肽样品中的聚糖甲型甲型甲醛事件的共性。最近,结果表明,低至0.1%的甲酸浓度可能导致肽甲酰化(
      • Lenco J.
      • Khalikova M.A.
      • SVEC F.
      溶解0.1%甲酸中的肽带来人工甲型化的风险。
      )。为了富集细菌糖肽ZIC-HILIC富集用5%甲酸/ 80%乙腈进行了广泛使用(
      • 辛苦辛苦
      • NASR M.A.
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      使用CID的亲水相互作用色谱和平行碎裂的同时甘草肽表征,较高能量碰撞解离,以及应用于Jejuni弯曲杆菌N-连接糖蛋白的电子转移解离MS。
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      植物病原菌菌蛋白钴蛋白钴糖基化。
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      • iwashkiw J.A.
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      )然而,在大量糖肽PSM上观察甲酰化伪影(补充表S2, S4, S6, S15到S22)提出了关于本协议的担忧。多种试剂,包括TRIS(
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      )可以导致甘草结构内的改变,必然能在聚糖/糖肽样品制备方案中进行明智地使用这些化学品。虽然5%的甲酸改善了Zic-Hilic富集内糖肽的选择性(
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      利用离子配对亲水性相互作用色谱分离固相萃取,以高效糖肽富集在糖蛋白质中的富集。
      ),而丁 等等。 注意到盐酸是用于正常相富集的细菌糖肽的有效离子配对剂(
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      使用离子配对正正相液相色谱法和质谱法鉴定和定量糖蛋白。
      )。因此,丁基化突出的观察结果将考虑替代缓冲液用于未来的糖肽研究,并且在分析在糖肽富集期间使用的糖肽数据集时需要考虑含有含有的聚糖。
      虽然开放彩易福彩使所有细菌样本中的糖基化能够鉴定,但分析 C.胎儿胎儿A. Baumannii. 数据集突出了与大型聚糖的单同位素蛋白质的通共性(>1000 dA)被配置。此问题先前突出显示(
      • 胫骨
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      串联质谱数据的PostimentPistopic质量过滤和细化(PE-MMR)增加了LC / MS / MS中肽鉴定的准确性。
      )与糖肽与其他大型生物分子的单同位素质量(如交联肽)的单同位素质量不同,如图50至75%的PSM(
      • 伦茨。
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      单位异位峰的彩易福彩分配改善了交联肽的鉴定。
      )。这种单同位素质量的这种误操作导致观察PSM的数量与多个质量通道的特定甘油质量分裂。虽然我们证明可以通过检查“OFF-X”参数可以容易地鉴定这些MIS分配的糖肽,但是应该注意,该分裂在特定物质下稀释可观察的糖肽,使糖蛋白的分析从开放的彩易福彩中复杂化。与上面讨论的聚焦彩易福彩相比,与开放彩易福彩相比,糖肽鉴定的较低灵敏度耦合,与上面讨论的聚焦彩易福彩相比,开放彩易福彩是一种有用的发现工具,但通常在数据集中报告独特的糖肽和糖蛋白。对此问题的最简单解决方案是使用开放彩易福彩作为识别可以在聚焦彩易福彩中作为变量修改而被包括在内的Glycan的方法。如上所述,这显着改善了糖蛋白组覆盖范围,并且在我们手中提供了能够检测新的聚糖的灵活性,尚未确保糖肽的最佳鉴定。已经演示了使用多步骤彩易福彩的自动化管道(
      • solntsev s.k.
      • 短red m.r.
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      通过Metamorpheus增强全球翻译后修改发现。
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      全球翻译后修改发现。
      )然而,我们的知识尚未针对糖肽鉴定进行优化或实施。因此,我们建议使用多步分析以使得能够使用开放彩易福彩来定义包含聚集在聚焦彩易福彩中的聚糖的凝固糖基化。
      最后,应该注意的是,虽然不是该稿件的主题,但在该工作中鉴定的糖蛋白/糖肽本身是细菌糖基化群落的有用资源。以前的研究 C.胎儿胎儿, A. Baumannii.B. Cenocepacia. 共鉴定共26,26和23个独特的糖蛋白(
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      伯克德利亚 Cepacia复合物内的一般蛋白质O-糖基化系统参与了运动和毒力。
      )然而,这些研究中的大部分是对先前几代MS仪器进行的。在这项工作中,我们在现代发电仪器上进行,我们观察到鉴定在其中鉴定的61(2.3倍),53(2.0倍)和125(5.4倍)糖蛋白鉴定的糖蛋白数量的显着改善 C.胎儿胎儿, A. Baumannii.B. Cenocepacia. 分别。同样,我们对8个伯克德列利菌种物种的糖蛋白酶分析凸显了至少70种蛋白质在每个Burkowneria物种内糖基化。在一起,这项工作凸显了大多数细菌物种的糖蛋白可能远远大于利用开放彩易福彩所建议的早期研究,提供可访问的起点来探测这些系统。

      数据可用性

      所有MS蛋白质组学数据(原始数据文件,对代理彩易福彩输出,R脚本和输出表)已被存放到骄傲的Proteomexchange Consortium存储库中(
      • Perez-Riverol Y.
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      • Inuganti A.
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      • Del-Toro N.
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      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
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      致谢

      我们感谢Bio21分子科学和生物技术研究所的墨尔本质谱和蛋白质组学设施,可进入MS仪器和致癌物质。我们要感谢Christine Szymanski和Justin Duma为C.胎儿胎儿NCTC 10842裂解物;用于提供B.Pseudomallei K96243裂解物的Mitali Sarkar-Tyson和Nicole Bzdyl; Deborah Yoder-Hemes,Mark Mayo,Bart Currie和Amy Cain,为该分析提供Burkholderia菌株以及Chris McDevitt和Saleh Alquethamy提供A. Baumannii ATCC17978。我们感谢Ben Parker和Nick Williamson为他们的批判性反馈意见。

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