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第7节:糖蛋白质

        7.1. 使用凝集素的血浆糖蛋白酶分析

        Y. H. Cho. 1,J. E. Kim1,J. G. Kang1和J. W. Cho1,2
        1韩国首尔延世大学生物与BPRC系;和 2Proteometch Inc.,韩国首尔
        人血浆蛋白质组可以代表生理状态。因此,血浆蛋白质组的映射可以提供用于寻找疾病标志物蛋白的有价值的基本信息。特别是几乎血浆蛋白质是糖蛋白,因为糖基化模式也依赖于生理状态,因此需要血浆蛋白质组的映射和分析糖基化图案。在该研究中,凝集素用于将血糖组血管组映射从正常人获得的等离子体。这是第一次尝试使用凝集素和未来映射人糖蛋白酶的尝试,该地图将作为参考从患者获得患者检测疾病标志蛋白的血浆。

        7.2. 质谱促进糖蛋白酶的发育

        C. E. Costello, M. E. McComb,P. B. O'Connor和J. Zaia
        群众光谱资源和心血管蛋白质组学中心,波士顿大学。医学院,波士顿,马,美国
        糖血管学具有特殊挑战,因为密切相关的结构的复杂混合物和糖族分布中的糖族分布的时间,发育或退行性变化,其在套装中的每个器官/组织/液体中发生,并且在不同的物种中。可能存在分支和/或不稳定取代基,以及生物活性变化的可能性来自次要或瞬态组件的源自分析的难度。然而,我们快速扩大的解开这些复杂性的能力现在允许我们确定重要的结构细节,这些结构细节是阐明碳水化合物和碳水化合物和蛋白质之间的结构/功能关系的关键。相关的质谱相关方法越来越多的阵列现在为该任务提供了强大的工具;聪明才智应该在未来几年维持增长。我们的实验室专注于增强糖蛋白质的几个方面:(1)改善微观分离,纯化和衍生化的方法,(2)轻度离子化条件,保持不稳定取代基,(3)高性能质量分析和串联质谱法,重点是新颖FTMS方法,(4)库和搜索策略的数据处理和设计,优化了Glycan分析。我们的整体方法将进行讨论,插图来自正在进行的糖类研究。

        7.3. 一种新试剂,用于选择性检测2D凝胶上的糖蛋白

        M. Kajjout,S.Le Gac,C. Rolando,以及 C. Cren-Olivé
        有机和大分子化学,法国里尔的科学大学和技术
        糖基化是最常见和复杂的翻译后修改之一。这种改性导致数千种独特的生物活性糖蛋白,其可以是循环,膜结合或限制在细胞质上。糖蛋白检测目前通过改性的周期性酸Schiff(PAS)方法进行。在SDS-PAGE蛋白质之后固定在凝胶中。蛋白质上的碳水化合物通过核酸氧化成醛。彩色染料随后反应醛函数,导致洋红色带,浅粉红色或无色背景。这些用于凝胶碳水化合物检测的经典方法非常有选择性,但缺乏敏感性(检测限为25-100ng碳水化合物)。为了提高敏感性,可以使用荧光染料。虽然该染色程序对于糖蛋白是非常有选择的,但是发生一些非特异性蛋白质染色,其在一些凝胶制剂中更加明显。我们开发了一种新试剂,用于选择性检测聚丙烯酰胺凝胶中的糖蛋白。该策略基于糖邻离二醇和硼酸之间的众所周知的反应,导致环状硼酸盐的形成。更确切地说,我们已经合成了由苯基硼酸构成的分子,用于与糖蛋白选择性反应,通过连接物与荧光染料基于钌络合物偶联。这允许直接在凝胶中的糖蛋白的特异性敏感性检测。将该新试剂首先在SDS页面上用糖蛋白标准和/或分子量标记进行测试。这种新的荧光在这些蛋白质上表现良好,因为观察到的检测极限比用周期酸 - 席夫碱试剂观察到的检测限度为5-10倍。目前正在研究实验室的下一步是在从2D​​凝胶电泳上分离的HCT 116细胞的更复杂的蛋白质样品上应用这种新的荧光检测。

        7.4. 单纯疱疹病毒型-2在昆虫细胞中的表达

        F。 Fotouhi. ,M.Roustaee H. Soleimanjahi和G. R. Haqshenas
        Tarbiat Modares大学,医学科学学院,病毒学系,德黑兰,伊朗
        疱疹病毒类型2(HSV2)是生殖器疱疹的主要原因。它在全世界人口中普遍存在。由于大多数HSV感染是亚临床,因此有效疫苗的发展将提供强大的控制工具。在本研究中,HSV2的重组糖蛋白D在昆虫细胞中表达。 HSV2的伊朗分离物在HeLa细胞系中繁殖。萃取病毒DNA并用作使用特异性引物的聚合酶链式反应的模板。将扩增的GD2 DNA克隆到 埃森 我和 XHO. 我的PffastBachtc(Invitrogen)质粒的遗体并转化为DH5A细胞。将GD2重组质粒纯化并转化为 大肠杆菌 DH10BAC细胞(Invitrogen)从PffastBachtC到Bacmid DNA的GD2 DNA的临床分子转子,杆状病毒梭载体,其包含在宿主细胞中。通过PCR使用M13 / PUC引物和GD2基因特异性引物来证实重组的Bacmid。使用Cellfectin(Invitrogen)将GD2重组Bacmid转染到SF21细胞中,在27℃下在无血清Grace的培养基中培养并每天筛查观察细胞病变。 48小时后,从细胞培养基中收获重组杆状病毒并离心以除去细胞杂物并命名为GD2-重组杆状病毒。为了鉴定蛋白质表达,使用针对GD2(生物阶段)的单克隆抗体检测通过IFA测试检查GD2-重组杆状病毒。通过72h.pi,在杆状病毒感染细胞的核和细胞质中检测到蛋白质。重组GD2可用作亚基疫苗以及素升压免疫策略。

        7.5. 使用人聚糖的观察MSN数据库快速鉴定糖蛋白寡糖的系统

        A. Kameyama.1,N. Kikuchi.2,南约亚1,3 ,H. Ito. 1,佐藤1,T. Shikanai.1,2,Y. Takahashi.2,和h. narimatsu1
        1日本全国先进产业科技学院糖科学研究中心,筑波,筑波,筑波,筑户省,筑珠省; 2日本东京三井知识实业有限公司;和 3Shimadzu Corporation,京都,日本
        糖基化是真核生物中最广泛的翻译后修饰(PTM),但是寡糖的作用已经缺乏缺乏对寡糖结构的敏感和容易的分析方法来研究。最近串联质谱技术揭示了寡糖可能具有特征信号强度谱。这些事实促使我们开发一种实用和系统化的技术,旨在含有人体组织和血清的聚糖结构分析,这是基于MSN数据和计算机技术的组合。这里,这里描述了仅使用质谱法使用甘氨酸对糖蛋白的寡糖结构的策略。基于在观察数据库中的分析物和文库之间的MSN光谱的信号强度分布的比较,该观察数据库通过获取大量结构定义的低聚糖的MSN光谱而构成。我们在过去几年中克隆并表征了许多人类糖原。与他人以前的试验不同,我们的策略利用了各种结构定义的低聚糖,其不仅可以从天然来源获得,而且可以使用由已经积累在我们的糖基因的糖基转移酶的文库的糖基转移酶文库的难以捉保的酶促制剂。实验室。使用该策略,我们能够识别转铁蛋白和免疫球蛋白G中N-连接的寡糖的结构作为实例。这项工作得到了新能源和工业技术发展组织(NEDO)的支持。

        7.6. 碳水化合物序列标记语言(Cabosmm):碳水化合物结构的XML描述

        诺里希罗基金奇2,akihiko kameyama.1,舒吉尼纳卡耶1,3,Hiromi Ito.1,Takashi Sato.1 Toshihide Shikanai1,2,yoriko takahashi.2,和hisashi narimatsu1
        1甘甙函数团队,糖科学研究中心,国家先进的工业科学与技术研究所(AICT),Tsukuba,茨城,日本; 2Mitsui知识实业有限公司,日本东京纳纳诺 - 库;和 3Shimadzu Corporation,Nakagyo-Ku,京都,日本
        基因组学和蛋白质组学的生物信息资源广泛用于分子生物学家,但这种情况尚未实现糖生物学家。碳水化合物序列的复杂性使得难以定义一种常规语言来代表碳水化合物序列并开发用于糖类的生物信息学工具。在这项研究中,我们开发了一种碳水化合物序列标记语言(CABOSML),XML(可扩展标记语言)碳水化合物结构的描述,并利用XML格式实现了碳水化合物的结构数据库。我们还开发了用于编辑和搜索碳水化石结构的图形用户界面,所以所描绘的结构可以自动转换为XML格式。这里描述的碳水化合物的XML描述将极大地有助于信息学工具的算法。

        7.7. 单页分离的糖蛋白的N-连接寡糖的测序:凝胶脱糖基化,然后用MALDI-TOF / TOF进行3-APH衍生的寡核苷酸片段化

        Y. H. Kim, K. I. Kim和S. Kim
        韩国基础科学研究所蛋白质组分析团队,南朝鲜跆拳道
        描述了使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间/飞行时间串联质谱仪的天然和3-氨基苯二甲酸丁酯(3-APH) - 超强的寡糖的碎片特征。 3-APH衍生的Maltoheptaose显示出50倍的敏感性敏感性改善,并且可以在10个Fmol的水平下检测。示出了包括糖苷裂解和横环裂解的广泛碎片,以促进从标准糖蛋白释放的N-连接的低聚糖的详细结构表征。此外,证明了该技术可用于表征通过糖蛋白在一维十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上的糖蛋白中的凝胶突刺酶F治疗的糖粉部分的表征。

        7.8. 纤维素柱色谱法的糖肽分析方法的研制

        Akihiro Kondo.1,4,5,Takatoshi Nakagawa.1,5,Miyako Nakano2,4,Nobuto Koyama.3,5,eiji miyoshi2,5,和naoyuki taniguchi2,4
        1糖类化学部和 2大阪大学生物化学系,大阪大学医学院; 3Takara Bio Inc. 4The 21 英石 世纪COE计划; 5冠,日本
        为了改善MALDI-TOF MS的糖蛋白分析,需要分离糖肽和来自蛋白酶消化的非糖肽。那是因为在MALDI-TOF MS中的甘肽和非糖肽的电离效率是完全不同的。通过反相HPLC分离氟氟肽:蛋白酶消化的胎霉素纯化蛋白酶消化的胎素。收集三长年肽级分并用唾液酸酶消化。蛋白质的胰蛋白酶消化:转铁蛋白(TF)和亚硫醚(ASF)与DTT和碘乙酰胺均可烷基化,然后胰蛋白酶化。糖肽和非糖肽的分离:蛋白酶消化的糖蛋白经受纤维素盒,用60%丁醇进行平衡。逐步洗脱结合级分,用含有不同浓度的乙醇的洗脱缓冲液洗脱。 1.胎素衍生的甘丙酮(GP3)约为。与相应的裸肽(P3)相比,电离10倍。糖肽和非糖肽通过纤维素柱有效地与TF和ASF的胰蛋白酶消化分离。 3.纤维素柱可以成功地应用于小鼠组织的蛋白质组分析。已经提出纤维素柱分离是对蛋白质组学/糖蛋白质中的MARDI-TOF MS分析的样品制备的强大工具。

        7.9. 使用两步蛋白水解消化与序贯微柱和质谱法不同血浆糖蛋白的表征

        马丁r. larsen.,peter hojrup,和彼得罗普斯托夫
        丹麦州立大学南丹麦大学生物化学与分子生物学系
        蛋白质糖基化参与构象稳定性,免受劣化,分子和细胞识别等的保护,因为糖基化蛋白可以具有所附的糖粉结构的各种各样的糖粉结构并且不同的位点可以仅部分糖基化,糖基化蛋白难以表征。因此,需要互补技术的组合来充分表征糖蛋白,降低整体敏感性。在这里,我们描述了一种方法,其允许表征少量(低pmol水平)的n键合糖蛋白,包括附着的聚糖的鉴定,糖基化位点测绘和部分结构分析。将凝胶分离的糖蛋白用胰蛋白酶提交至凝胶消化,然后用蛋白酶K消化所得肽。通过用孔隙R2 RP材料包装的微柱除去剩余的肽。糖肽通过R2微柱,可以在石墨微柱上纯化,并由MALDI MS和MSM分析以提供肽和聚糖序列的分子量。
        通过对污染商业可用卵烧蛋白(Ovomucoid和Oveglotcoprotein)的糖蛋白卵黄白和糖蛋白的分析来说明该策略。给出了凝集素亲和力富集的人血浆中糖蛋白表征的初步结果。

        7.10. 使用MALDI-TOF / TOF质谱法的蛋白质衍生碳水化合物的质谱测序

        urs Lewandrowski.1,Anja Reatemann.2,Detlev Suckau.2,Lars Vorwerg.2,赫伯特·蒂埃尔2和Albert Sickmann1
        1Rudolf-Virchow实验生物医学中的中心,德国武师;和 2Bruker Daltonics,德国不来梅
        在最丰富的翻译后修饰中,糖基化包括对蛋白质的多肽骨干的高度复杂的碳水化合物修饰。两种最常见的形式,N-和O-糖基化,其特征在于分支的三维结构,其形式和尺寸高度多样化。在蛋白质组学界的各种质谱技术外面,糖果分析利润来自近期仪器设计。在这里,我们描述了关于各种基质和系统参数的蛋白质衍生的碳水化合物的MALDI-TOF / TOF测序。从各种来源获得寡糖;部分模型化合物(Sigma)并通过糖蛋白处理从糖蛋白处理中部分获得。使用标准干燥液滴制剂在不锈钢MALDI靶标,DHB是典型的基质,但还评估了其他基质如SDHB和THAP。 MS和升力-TOF / TOF / TOF MS / MS光谱在Ultroflex TOF / TOF(Bruker Daltonics)上获得,在单分子分解(盖子)或高能量CID(Hecid)的条件下,主要是AR作为碰撞气体[1]。新软件工具支持MS / MS Spectra分析。除了常见的肾间切割(带Y-离子)之外,Hecid还导致分析有价值的横环碎片(A-和X离子系列)的发生增强。这提供了碳水化合物结构的快速初始测序的机会,以区分结构连锁异构体。在实验方法期间,我们研究了各种系统参数的影响,包括不同矩阵,盖子与Hecid和样品纯度。结果表明,与高度纯化的寡糖相比,复合碳水化合物样品导致MS / MS光谱显着不同,可能是由于激光量大升高的显着增加。这项工作中的另一个重要方面是开发分析策略,包括样品制备,碎片制度和光谱解释以及结构可视化。

        7.11. 构建人糖基因库。使用该糖烯库的系统合成聚糖,并提供使用观察MS的快速鉴定聚糖的快速鉴定聚糖结构n Database

        H. Narimatsu.,A. Togayachi,T. Sato,A. Kameyama和H. Ito
        甘甙函数团队,糖科学研究中心(RCG),国家先进工业科学与技术研究所(AICT),OSL C-2,Tsukuba,茨城,日本
        在克隆第一个哺乳动物糖基转移酶后,已经通过了18岁。在2001年4月初,已经克隆并分析了110个用于人糖基转移酶的110个基因,包括用于碳水化合物链如磺酸盐链的改性酶,如磺基转移酶。我们在2001年4月开始了甘筋项目(GG项目),借助生物信息技术综合研究人糖原。术语烯丙烯包括糖基转移酶的基因,将硫酸酯添加到碳水化合物和糖 - 核苷酸转运蛋白等中,首先是使用数据库中的生物信息技术在数据库中搜索尽可能多的新基因。然后将它们克隆并在各种表达系统中表达以检测碳水化合物合成的活性。使用各种受体确定它们的底物特异性。
        其次,使用重组酶库的文库,可以制备寡糖和糖肽文库。为了合成O-聚糖肽,化学合成基本结构。通过在单管中顺序添加每个酶来实现O-聚糖的延伸。对于N-聚糖的合成,基本结构是商业上获得的。使用多种酶实现N-聚糖的进一步延伸。
        第三,这些糖粉库被提供给MSn 分析为结构定义的聚糖。通过获取MS的观察数据库n 建立了各种结构定义的低聚糖的光谱,并仅用于仅使用质谱法快速鉴定聚糖结构。通过这种策略,我们能够识别的结构 N - 作为实施例的转铁蛋白和免疫球蛋白G中的链寡糖。
        这项工作得到了日本政府新能源和工业技术发展组织(NEDO)的支持。

        7.12. 专用于糖肽特异性分离的整体柱

        K. Tobal. ,S.Le Gac,C. Rolando和C. Cren-Olivé
        有机和大分子化学,法国里尔的科学大学和技术
        蛋白质中翻译后修饰的分析是了解许多蛋白质在这种修饰时改变的功能性质的重要一步。因此,需要专用于这些研究的新型分析工具。我们在这里描述了用于在MS分析之前的糖肽的特异性分离的新型色谱装置。该柱依赖于在聚合物整体载体上制备的酸性硼化性固定相。在孔隙率和功能方面选择单片载体,并兼容其与装置的次数相容,以例如在微流体系统中的集成。以毛细管形式(I.D.75μm)成功制备专用于糖肽分离的聚合物整体阶段。首先在模型,芦丁上测试所得到的相,该曲线是众所周知的糖基化的多酚。表现得非常好:芦丁被相选择性捕获,然后通过略微碱性溶剂洗脱。我们正在研究鸡卵磷蛋白的模型消化的柱性能:糖肽的保留在相中,其相互作用强度,洗脱条件的强度。在相似条件下,目前在通过微电子技术通过微电子技术制成的30×10μm微纤维通道中的相同相。

        7.13. 亲水性亲和力分离和MALDI MS的糖肽用于阐明糖蛋白的特异性甘油结构

        Y. Wada.
        大阪医疗中心及妇幼保健研究所,伊佐姆,大阪,大阪,日本
        在糖蛋白质中,应在大量糖蛋白中评估糖蛋白质,蛋白质鉴定,糖基化位点的评价,以及甘草异质性的评价,而质谱(MS)提供有关个体纯化的糖蛋白的实质性信息。考虑到这些结构问题通过研究糖肽来阐明,并且单个胰蛋白肽的串联MS通常足以用于蛋白质鉴定,施工胰蛋白酶糖肽的基于MS的方法的构建将对研究中有巨大的益处。为此,利用碳水化合物基质如琼脂糖为寡糖的碳水化合物基质的亲水性结合,成功地应用于胰蛋白酶糖肽的分离。通过MN的存在改善了恢复或特异性2+ 或分别在结合溶液中乙酸盐。可以回收N-和O-糖基化糖肽。通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)产生的离子的线性飞行时间(TOF)测量,概述了包括每个收集的糖肽的唾液酸化的聚糖结构。通过来自马尔迪的离子的多阶段串联MS,如下,阐明肽和寡糖结构。胰蛋白酶糖肽混合物的MALDI离子阱质谱由[M + H]组成+ 组分糖肽的离子。凝结诱导的糖肽的解离(CID)[M + H]+ 离子产生与MS / MS光谱中的肽和肽+ N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)物种对应的糖间隔开的峰值及其片段离子。糖间隔开的梯子用于概述寡糖结构,然后选择作为前后的前体,如果需要进一步表征,则在随后的多阶段CID测量。对MS / MS光谱中的肽或肽+ GlcNAc离子或MS光谱中丰富的相应离子进行CID以确定肽序列,以鉴定蛋白质和它们的糖基化位点。该策略,分离糖肽,其次是MALDI线性TOF MS和多串联MS分析,有效地表征了等离子体和细胞纤维凝集素之间的位点特异性N-聚糖结构的差异。