通过强阳离子交换色谱分离的胰酸盐消化肽分离乙酰化和未改性蛋白N-末端肽的分离

  • Chih-Hsiang Chang
    隶属关系
    京都大学制药科学研究生院,日本京都
    搜索本作者的文章
  • Hsin-yi chang
    隶属关系
    京都大学制药科学研究生院,日本京都

    台北医科大学代谢与肥胖科学研究院,台北,台湾
    搜索本作者的文章
  • juri rappsilber
    隶属关系
    京都大学制药科学研究生院,日本京都

    Bioanalytics,生物技术研究所,TechnischeUniversität柏林,柏林,德国

    英国爱丁堡大学生物科学学院的细胞生物学系科学中心
    搜索本作者的文章
  • Yasushi Ishihama.
    一致
    对于通信:Yasushi Ishihama
    隶属关系
    京都大学制药科学研究生院,日本京都

    国家生物医学创新研究所临床与分析化学实验室,健康与营养,茨城,大阪,大阪,日本
    搜索本作者的文章
开放访问发布:11月23日,2020年11月23日DOI://doi.org/10.1074/mcp.TIR120.002148

      强调

      • 蛋白质N-末端肽的分离而没有化学反应
      • 可以分离N-乙酰化和未改性的蛋白N末端
      • 两步隔离,由Trypn消化和强阳离子交换分离组成
      • 用内肽污染不到3%
      我们开发了一种简单且快速的方法来丰富蛋白质N-末端肽,其中首先使用蛋白酶Trypn,以产生没有液体或arg和arg和内肽的蛋白质N-末端肽,并在它们的n末端具有两个正电荷,然后,通过基于肽的电荷/取向,通过强阳离子交换色谱法与内肽分离有或不具有N-乙酰化的N-末端肽。将该方法应用于20μg人HEK293T细胞裂解物蛋白以分析N-末端蛋白质组。平均而言,在单个LC / MS / MS中成功地鉴定了1550个乙酰化和200个未改性的蛋白质N-末端肽,其中含有含有内肽的污染少于3%,即使我们只接受在瑞士 - PROM中注册的典型蛋白质N Termini数据库。因为这种方法仅涉及两步,蛋白质消化和色谱分离,而无需繁琐的化学反应,所以它应该有助于综合素材N Termini的综合分析,包括具有Neo-N Termini的蛋白质Oform。

      图形概要

      关键词

      缩写:

      ACN. (乙腈), CAA (2-氯乙酰胺), Chafradic. (基于电荷的分数对角线色谱), cofradic. (组合分数对角线色谱), 睫毛 (疏水标记辅助N-Termini Encroce), 小姐 (质谱), PTS. (相转移表面活性剂), SCX. (强阳离子交换色谱), SDC. (脱氧核酸钠), SLS. (N-月桂酸钠), st (停止并去提取提示), 尾巴 (末端胺同位素标记的基材), TCEP. (Tris(2-羧乙基)膦), TFA. (三氟乙酸), TRIS-HCL (Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸甲烷)
      表征蛋白质N Termini对于了解通过生物过程(如翻译启动)产生的全部蛋白质组(
      • Nakahigashi K.
      • 塔凯y.
      • Kimura M.
      • ab
      • Nakayashiki T.
      • Shiwa Y.
      • Yoshikawa H.
      • Wanner B.L.
      • Ishihama Y.
      • 森林。
      通过四环素抑制核糖体分析的翻译开始综合识别。
      ,
      • Ingolia N.T.
      核糖体谱分析:翻译的新视图,从单个密码子到基因组规模。
      ,
      • van damme p.
      • Gawron D.
      • van criekinge w。
      • Menschaert G.
      N-末端蛋白质组学和核糖体分析提供了小鼠和男性替代翻译启动景观的综合图。
      ),后期修改(
      • Hwang C.S.
      • 迷人A.
      • varshavsky A.
      细胞蛋白的N-末端乙酰化产生特异性降解信号。
      ,
      • Starheim K.K.
      • Gevaert K.
      • Arnesen T.
      蛋白质N-末端乙酰转移酶:当开始很重要时。
      )和蛋白水解裂解(
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 巴克D.T.
      • 萨利A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      蛋白质N末端特异性标记对凋亡中蛋白水解裂解位点的全局测序。
      ,
      • 麦当劳L.
      • 罗伯逊D.H.L.
      • 赫斯特J.L.
      • Beynon R.J.
      位置蛋白质组学:N-末端蛋白质溶胶的选择性恢复和分析。
      )。为了使用MS进行N术语,必须选择性富集蛋白质N末端的肽,并且为此目的开发了许多方法(
      • 莱特纳A.
      化学改性方法在现代质谱型蛋白质组学研究中的作用综述。
      • Klein T.
      • Eckhard U.
      • Dufour A.
      • solis n.
      • 总体上行
      近无处不在的后期改性的蛋白水解裂解机制,功能和“OMIC”方法。
      )。其中一些使用“阳性选择”方法,其中化学标记的蛋白质N-末端肽通过亲和纯化来富集(
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 巴克D.T.
      • 萨利A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      蛋白质N末端特异性标记对凋亡中蛋白水解裂解位点的全局测序。
      ,
      • 徐G.
      • Shin S.B.
      • jaffrey s.r.
      蛋白质N-Termini的化学选择标记蛋白酶切割位点的全局分析。
      )。但是,这些方法不适用于蛋白质 在体内 n末端修改。相反,通过耗尽内肽分离蛋白质N-末端肽的“阴性选择”方法已经用于全面鉴定蛋白质N-末端肽,包括N-末端修饰,例如甲基化,乙酰化和脂质(
      • 凡尔兰斯。
      • 奥贝格C.
      • Arnesen T.
      细胞蛋白质的N-末端修饰:涉及的酶,它们的底物特异性和生物学效应。
      ,
      • 赖Z.W.
      • Petrera A.
      • 席克宁o.
      蛋白质氨基末端修饰和N末端分析的蛋白质组学方法。
      )。 Gevaert. 等等。 开创性的分数对角线色谱(
      • Gevaert K.
      • 潮气米
      • 玛特L.
      • van damme J.
      • Staes A.
      • 托马斯G.R.
      • vandekerckhove J.
      探索蛋白质谱和分析蛋白质处理的质谱法鉴定分选N-末端肽。
      ),然后是其他负选择方法,如亚胺同位素标记的基材(
      • Kleifeld O.
      • Doucet A.
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • 席克宁o.
      • Kaidhan R.K.
      • 斯塔尔A.E.
      • 福斯特L.J.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • 总体上行
      复合样品中末端胺的同位素标记鉴定蛋白质N-末端和蛋白酶切割产物。
      ),组合分数对角线色谱的变体称为电荷基分数对角线色谱法(
      • venne A.S.
      • Solari F.a.
      • FADEN F.
      • paretti t.
      • 陷入困难的n。
      • Zahedi R.P.
      用于定量N-末端电荷基分数对角线色谱(Chafradic)的改进的工作流程,以研究拟南芥植物蛋白水解事件。
      )和疏水性标记辅助N-末端富集(
      • Chen L.F.
      • 山Y.C.
      • 翁y.j.
      • sui z.g.
      • 张X.D.
      • 梁Z.
      • 张L.H.
      • 张Y.K.
      疏水标记辅助N-Termini富集用于深入的N-末端分析。
      )。所有这些都需要通过基于化学标记的分离阻断蛋白质水平和消化的内肽的消耗耗尽。因此,通常需要相对大量的样品(〜5-10mg)以增加蛋白质N-末端肽的鉴定次数。这限制了在难以获得的生物样品的情况下这些方法的有用性(
      • na c.h.
      • Barbhuiya M.A.
      • 金马
      • verbruggen s.
      • EACKER S.M.
      • Pletnikova O.
      • Troncoso J.C.
      • Halushka M.K.
      • Menschaert G.
      • 总体上行
      • Pandey A.
      蛋白质N末端质谱分析发现非甘露透明翻译起始位点。
      ,
      • yeom J.
      • 崔Y.
      • PAEK E.
      • lee c.
      人蛋白N-Termini的综合分析能够评估各种蛋白质形式。
      )。此外,化学衍生化效率和特异性的限制损害了肽鉴定的置信度。因此,仍然需要一种简单敏感的蛋白质N-末端肽的方法,用于基于MS的蛋白质组学。
      强阳离子交换(SCX)色谱,基于其在酸性pH下的电荷采用Coulombic相互作用,已广泛应用于深蛋白质组学分析(
      • adachi J.
      • Hashiguchi K.
      • 长野米
      • 佐藤M.
      • 佐藤A.
      • Fukamizu K.
      • Ishihama Y.
      • 汤汤汤
      通过组合酸和盐梯度改善阳离子交换剂上的蛋白质组和磷脂蛋白酶分析。
      ,
      • Essader A.S.
      • Cargile B.J.
      • Bundy J.L.
      • Stephenson Jr.,J.L.
      固定性pH梯度等电聚焦和强阳离子交换色谱作为霰弹枪蛋白质组学中的第一维度的比较。
      )。 alpert. 等等。 (
      • Alpert A.J.
      • 肉炎K.
      • Kangas L.
      • 史密斯r.d.
      • Mechtler K.
      • 有丝提的G.
      • 穆罕默德S.
      • heck a.j.r.
      肽取向影响离子交换色谱中的选择性。
      )报道,SCX中的肽保留受充电和取向的影响。在胰蛋白酶肽的SCX分离中,首先洗脱乙酰化蛋白N-末端肽和蛋白质C-末端肽。然后洗脱具有+1电荷的单磷酸化肽,然后用+ 2或更多电荷的肽,例如未修饰的蛋白质N-末端肽,内肽和含有错过的切割的肽(
      • Helbig A.O.
      • Gauci S.
      • raijmakers r.
      • van Breukelen B.
      • Slijper M.
      • 穆罕默德S.
      • heck a.j.r.
      N-乙酰化蛋白末端的分析提供了对蛋白质组的N末端性质的深入洞察。
      ,
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      )。因此,不可能通过SCX色谱法从胰蛋白酶肽中分离蛋白质N-末端肽。当Lys-N与SCX色谱一起使用时,这也是如此,基于充电/取向保留模型(
      • Alpert A.J.
      • 肉炎K.
      • Kangas L.
      • 史密斯r.d.
      • Mechtler K.
      • 有丝提的G.
      • 穆罕默德S.
      • heck a.j.r.
      肽取向影响离子交换色谱中的选择性。
      )。为了克服这个问题,我们专注于Trypn,也称为裂谷酶,一种金属蛋白酶,即使在Pro-Lys和Pro-Arg键的情况下,也可以在Lys / Arg的N-末端侧切割肽链,产生肽 - 不含不含Lys / Arg的蛋白质N-末端肽(
      • 威尔逊J.P.
      • ipsaro J.J.
      • del giudice s.n.
      • 转变N.S.
      • 高斯下午
      • Dusenbury K.H.
      • 马奎特K.
      • Rivera K.D.
      • Pappin D.J.
      Tryp-N:用于生产N-末端氨基乙烯基和溶尿苷肽的热稳定蛋白酶。
      )。与其他种类的液体酶(如Ulilysin)不同(
      • 略高的C.
      • Garcia-Castellanos R.
      • Seco J.
      • Baumann U.
      • gomis-ruth f.x.
      乌利柳素素的分子分析,新甲磺酸金属蛋白酶族的结构原型。
      ,
      • HUESGEN P.F.
      • lange p.f.
      • 罗杰斯L.D.
      • solis n.
      • Eckhard U.
      • Kleifeld O.
      • 炖牛肉T.
      • gomis-ruth f.x.
      • 总体上行
      Lysarginease镜子胰蛋白酶用于蛋白质C末端和甲基化 - 位点鉴定。
      )和mirolysin(
      • koneru l.
      • ksiazek m.
      • Waligorska I.
      • Straczek A.
      • Lukasik M.
      • madej m.
      • Thogersen I.B.
      • Enghild J.J.
      • Potempa J.
      Mirolysin,来自Tannerella连翘的裂谷酶,蛋白水解灭活人类植物疗法,LL-37。
      ),其优先切割任何Lys或Arg的N-末端侧,Trypn切割Lys的N-末端侧并在pH6〜8处拍摄。此外,N-末端Lys / Arg肽的肽鉴定性能与胰蛋白酶肽的肽鉴定性能相当(
      • Tsiatsiani L.
      • Giansanti P.
      • 施泰米r.a.
      • van denorn h.
      • 总体上行
      • Altelaar A.F.M.
      • heck a.j.r.
      相反的电子传递解离和蛋白质组和(X)(n)(n)k / R肽的蛋白质组学和磷蛋白质中的肽测序的益处的蛋白质分离k / R(x)(n)和(x)(n)(n)的较高能量碰撞碎片特征。
      )。
      在这项研究中,我们开发了一种富含蛋白质N-末端肽的新方法,而无需化学衍生化或复杂的程序,可以利用蛋白酶Trypn介导的蛋白质切割和基于延伸的N-末端肽的SCX分离的组合充电/取向保留模型。我们表明,这种快速和简单的富蛋白N-末端肽的方法能够实现人和细菌N-末端蛋白质蛋白质的全面,高通量分析。

      实验步骤

       材料

      铵碳酸氢铵,Tris(羟甲基)盐酸氨基甲烷,SDC,N-月桂酸钠,碳酸氢铵,三(2-羧乙基)膦,2-氯乙酰胺,氯化钙,乙酸乙酯,乙腈(ACN),乙酸,TFA等化学品购自Fujifilm Wako。 Rapigest是从水域公司购买的。修饰的胰蛋白酶来自Promega。 Trypn来自protifi。苯乙烯二乙烯基苯(SDB-XC)媒体磁盘购自GL科学。通过Millipore Milli-Q系统纯化水。

       细胞培养和蛋白质提取

      HEK293T.(人胚胎肾脏)细胞培养至10cm直径的粉末中的80%汇合。 大肠杆菌 K-12 BW25113细胞在LB肉汤中生长至中间对立相,在37℃下剧烈摇动。通过离心收集这些细胞并重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂(Sigma),12mM SDC,12mM N-LaUloylarcosate,10mM Tris(2-羧基乙基)膦,40mm 2-氯酰胺中的蛋白酶抑制剂(Sigma),10mM 2-氯酰胺中的蛋白质缓冲液(pH 8.5)(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      ,
      • Humphrey S.J.
      • azimifar s.b.
      高通量磷蛋白酶揭示 在体内 胰岛素信号动态。
      )。裂解物在冰上涡旋并超声处理20分钟。蛋白质粗提取物的浓度通过双式胆酸蛋白质测定(Thermof Serior Scientific)测定。

       蛋白质消化

      为了优化Trypn消化条件,如前所述,通过甲醇/氯仿沉淀制备蛋白质颗粒(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质中蛋白质的定量回收的方法。
      )溶解在由25mM三甲基铵,2mM CaCl和0.1mM MnCl组成的缓冲液中溶解在0.1%赖化的缓冲液中2 在pH 7.4,根据制造商的协议,在55°C下进行Trypn消化过夜。 PTS缓冲区(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      )或由1M尿素,25mM三甲基铵,2mM CaCl和0.1mm MnCl组成的尿素缓冲液 2 在pH7.4,代替迅速的缓冲液也用于Trypn消化。
      对于优化后的Trypn消化,PTS缓冲液中的细胞裂解物用10mM CaCl稀释10倍2 并在37℃下用Trypn(1:50w / w)消化过夜。请注意,Trypn可以用Lysarginase(Merck Millipore)替换。在胰蛋白酶消化的情况下,用Lys-C(1:50W / W)在37℃下将蛋白质溶液在3小时内消化,然后用50mM碳酸氢铵和胰蛋白酶消化稀释(1:50) w / w)在37°C下过夜。在酶消化后,向每个样品溶液中加入等体积的乙酸乙酯,并根据先前报告的PTS协议,用0.5%TFA(最终浓度)酸化混合物(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      )。将所得混合物摇动1分钟并在15,700处离心g 2分钟分离乙酸乙酯层。通过使用具有SDB-XC盘膜(SDB-STAGETIP)(SDB-STAGETIP)(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )。使用牛血清白蛋白消化剂在214nm处通过LC-UV定量蛋白水解肽作为标准,并在-20℃下保持80%ACN和0.5%TFA直至使用。

       SCX. HPLC的肽分馏

      使用突出的HPLC系统(Shimadzu)进行SCX色谱法,其中具有Bioiex SCX柱(250mm×4.6mm内径,由聚[苯乙烯 - 二乙烯基苯]用磺酸盐基团修饰)(Agilent)。
      为了检查SCX分离特性,将75μg混合,每种胰蛋白酶和胰蛋白酶消化的HEK293T肽混合并直接在0.8ml / min的SCX塔上。使用5mM磷酸钾(pH3.0)和ACN(7:3)的混合物用作SCX缓冲液A,并使用500mM磷酸钾(pH3.0)和ACN(7:3)的混合物作为SCX缓冲b 。如下进行梯度洗脱,如下进行:0%B,5分钟,20分钟,0至10%,10分钟,10%至5​​0%,5分钟,50%至100%,100%B持续4分钟。在1分钟间隔下手动收集级分45分钟。在SpeedVac SPD121P(Thermofisher Scientific)中蒸发溶剂后,通过使用SDB-STAGETIPS将分级肽重悬于50μl0.1%TFA和脱盐中。如下所述,通过三重份子/ MS / MS通过纳米/ MS / MS分析每个级分中的四分之一。
      对于Trypn消化的HEK293T肽的梯度SCX分馏,使用上述SCX HPLC系统分析了80μg的消化肽。使用7.5mm磷酸钾(pH2.6)和ACN(7:3)的混合物作为SCX缓冲液A,向缓冲液A中加入350mM KCl,用于SCX缓冲液B.如下进行梯度洗脱:0.5%B 15分钟,10分钟,10分钟,10分钟,1至4%B,在3分钟内,4至10%B,在3分钟内为10至100%B,100%B为5分钟。在1分钟间隔下手动收集级分50分钟。如上所述,通过使用SDB-STAGETIPS脱盐的分级肽。使用如下所述的嵌合融合钻孔质谱仪(Thermof Serior Scientific)通过纳米/ MS / MS分析FR.1至43的每馏分的四分之一和FR.44至50的每馏分的第一个。

       通过SCX HPLC富集蛋白质N-末端肽,具有等离心洗脱

      富集蛋白质n-末端肽从30μg的胰蛋白胨消化 大肠杆菌 使用SCX HPLC系统在以下等离心条件下进行肽:SCX缓冲液A是含有10,12.5或15mM KCl和ACN(7:3)的7.5mM磷酸钾溶液(pH2.2)的混合物,缓冲液B是含有500mM KCl和ACN(7:3)的7.5mM磷酸钾溶液(pH2.2)的混合物。用100%A持续30分钟进行等型洗脱,然后用100%B洗涤该系统。将收集的级分冻干,重悬于50μl0.1%TFA,使用SDB-STAGETIPS脱盐。使用嵌合融合LUMOS通过纳米/ MS / MS分析三分之二的富集肽。
      为了从Trypn消化的HEK293T肽中分离蛋白质N-末端肽,通过SCX HPLC系统在等离心条件下分析消化的肽(80μg),用含有10mM KCl的7.5mM磷酸钾溶液(pH2.2)的混合物洗脱和AcN(7:3)30分钟以使用如上所述的SDB-STAGETIPS收集所需的分数和脱盐。我们使用嵌合融合探测器通过纳米/ MS / MS分析了四分之一的富集肽。

       Nanolc / MS / MS分析

      在TripletOf 5600质谱仪或侧侧熔化钻孔质谱仪上进行Nanolc / MS / MS分析,连接到热终极3000泵和HTC-PAL自动进样器(CTC分析)。用ReprosiL-PUR 120 C18-AQ3μm反相材料(Maisch博士),在自拉针柱(150mm长度×100μmid,6μm开口)上分离肽(150mm长度×100μmid,6μm开口)。注射体积为5μL,流速为500nl / min。移动相是(a)0.5%乙酸和(b)0.5%乙酸和80%ACN。对于TripletOf 5600分析,如下进行梯度洗脱,如下:12至40%B在20分钟内,在1分钟内为45至100%B,100%B 5分钟。对于赤膜分析,如下进行分级样品的梯度洗脱,如下:15分钟,40-10%B,在1分钟内,100%B,5分钟。对于蛋白质N-末端肽富集的样品,如下进行梯度洗脱,如下:10至40%B在100分钟内,10分钟,10分钟,100%B,10分钟。施加了2300 V中的喷雾电压5600系统和2400V在侧面系统中的2400V。 Tripletof 5600系统的质量扫描范围是 m / z. 对于随后的MS / MS扫描,在每个MS扫描中选择300至1500,并且在每个MS扫描中选择前十个前体离子。 orbitrap系统的质量扫描范围是 m / z. 300至1500,具有1.00E + 06的自动增益控制值,最大喷射时间为50毫秒,并且质量分辨率为60,000 m / z. 200中的orbitrap分析仪。在每个MS扫描中选择具有+2,+3或+4电荷的前十个前体离子,用于随后的MS / MS扫描,自动增益控制值为5.00E + 04,最大喷射时间为300ms。用10ppm门设置动态排除25秒。将归一化更高的能量碰撞解离被设定为30,在大规模分辨率下检测为15,000 m / z. 200中的orbitrap分析仪。锁定质量(445.1200025)功能用于在梯度期间获得恒定的质量精度。

       蛋白质组学数据处理

      “.mgf”和“.pl”格式中的两个峰列表是由MAXQUANT 1.5.8.0(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )。肽和蛋白质通过吉祥物V2.6.1(基质科学)对瑞士-PLAT数据库(2017_4版,20,199序列)或 大肠杆菌 K-12 Mg1665蛋白质序列数据库(
      • 莱利M.
      • ab
      • Arnaud M.B.
      • Berlyn M.K.B.
      • blattern f.r.
      • chaudhuri r.r.
      • Glasner J.D.
      • Horiuchi T.
      • keseler i.M.
      • Kosuge T.
      • 森林。
      • perna n.t.
      • Plunkett G.
      • rudd K.E.
      • Serres M.H.
      • 等等。
      大肠杆菌K-12:一个合作开发的注释快照 - 2005。
      )具有20ppm的前体质量容差(三重份子键5600)或10ppm(orbitrap),0.1da(三重岩5600)或20ppm(orbitrap),Trypn /胰蛋白酶特异性的片段离子质量耐受,允许最多四种错过的切割对于胰蛋白酶/胰蛋白酶混合的蛋白水解肽,并且严格的胰蛋白蛋白特异性允许最多两种错过的胰蛋白酶消化肽切割。将半胱氨酸的氨基甲酰甲基化被设定为固定改性,并且允许甲硫氨酸氧化和蛋白质N-末端乙酰化作为可变的修饰。肽水平小于1%的假发现速率用于基于目标 - 诱饵方法施用肽鉴定。

      结果与讨论

       SCX.色谱法中胰蛋白酶消化肽的保留行为

      用Trypn的蛋白水解产生肽,其在酸性pH下肽N末端的Lys或Arg和α-氨基的肽和α-氨基。通过逆向,衍生自蛋白质N末端的肽既没有灯泡也不均在蛋白质n末端乙酰化,使得它们中的大多数具有0或+1电荷,并且仅具有未修饰的蛋白N末端的含有含有肽的肽+2收费(补充图。S1)。在这项研究中,我们专注于酸性条件下的SCX色谱法可能能够将肽分离基于正电荷的数量以及根据电荷/取向保留模型的电荷的定位(
      • Alpert A.J.
      • 肉炎K.
      • Kangas L.
      • 史密斯r.d.
      • Mechtler K.
      • 有丝提的G.
      • 穆罕默德S.
      • heck a.j.r.
      肽取向影响离子交换色谱中的选择性。
      ),并且我们试图将蛋白质N-末端肽与蛋白质消化肽之间的内肽分离。
      我们首先检查了Trypn消化中错过的裂缝的数量。根据制造商的方案在0.1%Rapigest中进行消化,错过的切割率(具有两个或更多个错过的裂解位点的肽含量)为14%,几乎等于条件下的价值,而不添加rapigest(16% )。然而,当加入1%脱氧胆酸钠(SDC)而不是Rapigest时,错过的切割率显着降至5.8%。因此,根据相转移表面活性剂(PTS)方案进行Trypn消化(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      ) 在这个研究中。
      接下来,请注意,从TRPAPN消化的内肽中,与他的残基和未改性的N末端分离蛋白质N-末端衍生的肽,我们研究了肽是否可以根据正电荷的位置分离,另外通过SCX色谱法向正电荷的数量。用蛋白酶切割Lys-C和Lys-N或胰蛋白酶和Trypn的蛋白酶的研究表明,正电荷的位置影响霰弹枪蛋白质组学的结果(
      • HUESGEN P.F.
      • lange p.f.
      • 罗杰斯L.D.
      • solis n.
      • Eckhard U.
      • Kleifeld O.
      • 炖牛肉T.
      • gomis-ruth f.x.
      • 总体上行
      Lysarginease镜子胰蛋白酶用于蛋白质C末端和甲基化 - 位点鉴定。
      ,
      • raijmakers r.
      • Neerincx P.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      兄弟和姐妹蛋白酶Lys-C和Lys-N的切割特异性。
      )。例如,据报道,肽与N-末端Lys或Lys / arg的肽比在反相LC中的C-末端Lys或Lys / Arg的肽更强烈地保留(
      • Tsiatsiani L.
      • Giansanti P.
      • 施泰米r.a.
      • van denorn h.
      • 总体上行
      • Altelaar A.F.M.
      • heck a.j.r.
      相反的电子传递解离和蛋白质组和(X)(n)(n)k / R肽的蛋白质组学和磷蛋白质中的肽测序的益处的蛋白质分离k / R(x)(n)和(x)(n)(n)的较高能量碰撞碎片特征。
      )。为了确定肽的Lys / Arg位置如何影响Scx色谱法在酸性pH的SCX色谱中,我们使用SCX HPLC系统检查了轨迹和胰蛋白酶消化肽的混合物,然后是纳米/ MS / MS。 19,853个独特的胰蛋白肽通常表现出比具有相同电荷状态的11,334个独特的Trypn肽较弱的保留(Fig. 1A, 补充表S1)。为了更详细地表征SCX洗脱曲线,我们将SCX HPLC中的保留时间与大约4000个肽对进行了比较,其具有仅在终端Lys / Arg的位置不同的序列(Fig. 1B)。正如预期的那样,基于胰蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶肽的毒素消化肽具有更强的SCX潴留。这将是因为胰蛋白肽在n末端携带两个带正电荷的基团,因为N-末端Lys / Arg和侧链ε-氨基或胍基团的α-氨基,而阳性电荷胰蛋白酶肽的C-末端Lys / Arg被α-羧基部分中和(补充图。S1)。 alpert. 等等。 (
      • Alpert A.J.
      • 肉炎K.
      • Kangas L.
      • 史密斯r.d.
      • Mechtler K.
      • 有丝提的G.
      • 穆罕默德S.
      • heck a.j.r.
      肽取向影响离子交换色谱中的选择性。
      )和Gauci. 等等。 (
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      [)报道,具有近距离近距离接近的两个碱性部分的Lys-N-消化的磷酸肽倾向于比胰蛋白酶磷酸肽更强烈地保留在SCX柱上。 Gussakovsky. 等等。 (
      • Gussakovsky D.
      • Neustaeter H.
      • Spicer V.
      • krokhin o.v.
      强阳离子交换色谱中肽保留时间预测的序列特异性模型。
      )报道了用于预测胰蛋白酶肽SCX色谱中的保留时间的保留模型,其中碱性氨基酸的位置依赖性系数较高,靠近N末端。我们还发现,在比胰蛋白肽的较窄的SCX分数范围内洗脱胰蛋白胨消化的肽(Fig. 1A)。这可能是因为胰蛋白酶肽中N-末端正电荷之间的距离根据肽的长度而不同,而胰蛋白酶消化的肽具有N-末端Lys / arg,其最小化两个阳性之间的距离收费。据我们所知,本作的工作是使用数千个相同的序列对验证SCX中的肽电荷/方向保留模型。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1胰蛋白酶消化和胰蛋白酶消化肽的SCX分离. A,SCX分离消化HEK293T细胞裂解物中不同类型的肽。通过将Trypn和胰蛋白酶消化的HEK293T肽混合1:1来制备肽样品。这 黑色的, 浅灰, 和 深灰色曲线 分别代表独特的肽,胰蛋白酶消化的肽和Trypn消化的肽。酸性pH的电荷数标记。 B,对胰蛋白酶和胰蛋白酶消化肽的SCX洗脱谱的比较。选择除末端之外的相同序列的肽(K / R-XXXXXX和XXXXXX-K / R,分别用于胰蛋白酶和胰蛋白酶消化肽)。圆形颜色的阴影表示肽的数量。 SCX,强阳离子交换。

       SCX. HPLC分离Trypn消化HEK293T肽

      本研究中使用的HPLC系统配备了具有与典型反相色谱柱(半高度的峰值宽度为12.4±4.2 s的分离效率的无孔亲水SCX柱,并且峰值容量为122;见 补充无花果S2)。如图所示 图1A,该SCX HPLC系统能够将Trypn消化的肽与彼此的+1和+2电荷分离。通过在pH2.6的KCl盐梯度洗脱中进行衍生自HEK293T细胞的衍生自HEK293T细胞的综合SCX分馏,每馏分的肽鉴定由Nanolc / MS / MS进行(补充表S2)。如图所示 图2A,几乎所有蛋白质N-末端衍生的肽都与内肽清楚地分离出来,无论它们是否乙酰化或未改性。从2-11分钟的级分主要含有0和+1肽,包括2207乙酰化蛋白质N-末端肽,345个含乙酰化N-末端肽,262个未改性的N-末端肽。 12至18分钟的级分含有+2肽, IE。,未经修改的蛋白质N-末端肽,其含有含有两种碱性氨基酸的他的含有他的,溶液或阿氨基和乙酰化蛋白质N-末端肽。从19至30分钟的下一个级分也含有+2肽,但大多数是基于定向效果的内肽, IE。, 由于肽的N末端的正电荷密度高(Fig. 1B)。因此,可以容易地分离蛋白质N-末端肽。在31分钟后,在级分中依次洗脱具有大于2+的肽。这些包括含有错过的切割位点的蛋白质N-末端肽,但由于PTS方法的胰蛋白胨消化的高效率,它们的数量小。通过该方法可以在馏分中以级分回收至18分钟的90%的非还原蛋白N-末端肽(补充图S3 ),证明与SCX HPLC的Trypn消化的组合能够实现简单快速的蛋白质N-末端肽富集。此外,与不能切割Lys-Pro和Arg-Pro键的胰蛋白酶不同,Trypn可以切割Pro-Lys和Pro-Arg键,在C Termini处使用Pro产生蛋白质N-末端肽,从而改善覆盖范围n初学者。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2SCX.洗脱曲线的Trypn消化肽。 Z是酸性pH值的电荷数,其基于每种肽的基本残留物的数量,例如未修饰的n末端,Lys,Arg和他。 A,使用KCl盐梯度洗脱的Trypn消化HEK293T细胞裂解物中不同类型肽的SCX HPLC分馏。在级分2至6中,观察蛋白质N-末端肽,观察到Z = 0和1,例如乙酰化蛋白质N-末端肽,或没有碱性氨基酸,没有碱性氨基酸的碱性氨基酸和未改性的蛋白质N-末端肽。 B,SCX HPLC分离Trypn消化 大肠杆菌 肽在等于不同KCl浓度的等级条件下。示出了富集蛋白质N-末端肽的特异性和具有不同Z值的肽的数量。 C,蛋白质N-末端肽中含含肽的含量。实验结果是用10mm Kcl等物体洗脱获得的实验结果,以及 在硅片里 结果是计算的 大肠杆菌 K-12 Mg1665蛋白质序列数据库。的细节 在硅片里 消化在补充方法中描述。 SCX,强阳离子交换。
      因为酸性pH下蛋白质N-末端肽的电荷数量通常小于内肽的肽,所以我们检查了蛋白质N-末端肽的鉴定效率是否受到低阳性电荷数的影响。因为肽鉴定受几个步骤的影响,包括离子化,从MS1至MS2的离子传递,以及碎片化,SCX中214nm处的四个参数,诸如UV吸光度,MS和MS / MS扫描中的总离子电流,以及吉祥物测量SCX 1至18分钟的肽评分分布分别(富含蛋白质N-末端肽),分别为19-至50分钟(富集)(内部肽)(补充表S3)。考虑到1-至18分钟的uV吸光度比为19-至50分钟的级分小于每个MS扫描的平均总离子电流的比例,蛋白质N-末端肽的电离效率更好而不是内肽,因为1-至18分钟的样品复杂性较低。对于来自MS1至MS2的离子传输效率,我们没有看到蛋白质N-末端肽和内肽之间的任何差异。对于碎片化,酸性pH值的电荷数分布的谱在蛋白质N-末端和内肽之间显着差异,但是得分分布的所得曲线几乎相同。这可能是因为前体离子的充电状态的类似分布谱。这些结果表明使用Trypn鉴定蛋白质N-末端肽的鉴定没有明显的缺点。

       使用Trypn消化的SCX分离优化 大肠杆菌 Peptides

      我们采用优化蛋白质N-末端肽的分离的洗脱条件 大肠杆菌 胰蛋白胨消化的肽。由于细菌蛋白质的N-末端改性较少而不是哺乳动物蛋白质,所以认为细菌样品优选优化与+ 2电荷(肽用未修饰的N末端和他残留物的肽分离蛋白质N-末端肽的条件内肽(补充图。S1)。具有不同KCl浓度的三种SCX缓冲液用于等离心洗脱30分钟,并比较蛋白质N-末端肽的富集效率(补充表S4)。用10mM KCl获得超过97%的富集特异性(表格1)。当使用具有更高KCl浓度的缓冲液时,鉴定了更多的内部肽(Fig. 2B)。在10mM KCi缓冲液的情况下,我们鉴定了270个非重新蛋白N-末端肽的53个含他含有的蛋白质N-末端肽,而不会错过20μg的裂解 大肠杆菌 裂解物(19.6%, Fig. 2C)。之中 在Silico. 来自胰蛋白胨消化的肽 大肠杆菌 蛋白质组,20%的蛋白质N-末端肽含有他的蛋白质,表明我们的富集条件在鉴定其含蛋白质N-末端肽没有偏差。换句话说,该SCX色谱法能够将蛋白质N-末端肽与TRYPN消化分离 大肠杆菌 肽甚至在最困难的情况下,其中未修饰的蛋白质N-末端肽含有另外的碱性氨基酸,例如他,液体或在n末端附近(补充图S4)。尽管该SCX分离可以通过电荷/方向模型解释,但是第一个将保留模型应用于N-未改性蛋白质N-末端肽的报告。
      表格1富集 大肠杆菌 蛋白质N-末端肽通过SCX HPLC具有三种不同KCl浓度的等物质洗脱
      盐浓度10 mM12.5毫米15 mM
      独特的肽43216693416
      未修饰的蛋白质N-末端肽326444387
      乙酰化蛋白质N-末端肽312522
      基于肽计数的蛋白质N-末端肽(%)82.628.112
      基于峰面积的蛋白质N-末端肽(%)98.249.218.5
      通过计算所有鉴定的肽中的蛋白质N-末端肽的数量和LC / MS峰面积获得蛋白质N-末端肽的富集特异性。
      SCX.,强阳离子交换。

       HEK293T.蛋白质N-末端肽富集通过TRYPN-SCX方法

      在优化的洗脱条件下,SCX HPLC可以成功地与人和细菌样品的内肽与人和细菌样品的内肽分离出来的N-末端肽。为了验证该方法的适用性在大规模的N-末端蛋白质组学中,我们使用HEK293T细胞进行三份分析,该细胞已广泛用于N-末端蛋白质组学(
      • na c.h.
      • Barbhuiya M.A.
      • 金马
      • verbruggen s.
      • EACKER S.M.
      • Pletnikova O.
      • Troncoso J.C.
      • Halushka M.K.
      • Menschaert G.
      • 总体上行
      • Pandey A.
      蛋白质N末端质谱分析发现非甘露透明翻译起始位点。
      ,
      • yeom J.
      • 崔Y.
      • PAEK E.
      • lee c.
      人蛋白N-Termini的综合分析能够评估各种蛋白质形式。
      )。使用10mm KCl等物体洗脱的三份SCX HPLC分级用于Trypn消化的HEK293T肽(每次80μg),并且我们将分离的肽的四分之一受到三次纳米/ MS / MS的三份(总共九次)。默认参数,如瑞士人的人蛋白序列数据库,特定的胰蛋白酶切割和七个氨基酸的最小肽长度,用于通过数据库搜索肽鉴定(Fig. 3A)。结果显示在 图3.B, 表2., 和 补充表S5。对盘中和白天制备样品观察到鉴定肽的峰面积的高相关(R.2 = 0.96 and R2 分别= 0.75,0.80)。平均而言,在单个LC / MS / MS / MS分析中,我们鉴定了来自20μg的Trypn消化的HEK293T肽的1550个独特的乙酰化和200个未修饰的蛋白质N-末端肽。肽峰面积和肽数分别污染内肽仅为3%和9%(Fig. 3C, 表2.)。蛋白质N-末端肽具有错过裂解的蛋白质也富含相同的洗脱,并且平均鉴定了850(〜50%)切错切割的独特N-末端肽,从而改善了N末端的覆盖率。我们鉴定了1640个乙酰化,106个部分乙酰化,167个未改性的非还原蛋白N末端。注意,当在数据处理中允许在数据处理中允许半特异性切割时,鉴定了1600个额外的新末端肽,尽管我们在本研究中的目的不是寻找新的蛋白质血换,而是建立新的N术语方法。此外,将我们的结果与两个公开的N-Terminome数据集进行比较,用于HEK293T人体细胞(
      • na c.h.
      • Barbhuiya M.A.
      • 金马
      • verbruggen s.
      • EACKER S.M.
      • Pletnikova O.
      • Troncoso J.C.
      • Halushka M.K.
      • Menschaert G.
      • 总体上行
      • Pandey A.
      蛋白质N末端质谱分析发现非甘露透明翻译起始位点。
      ,
      • yeom J.
      • 崔Y.
      • PAEK E.
      • lee c.
      人蛋白N-Termini的综合分析能够评估各种蛋白质形式。
      ),我们在不使用其原始定制数据库或非特异性切割的情况下重新分析这些数据集。就乙酰化和未改性蛋白质N-末端肽的含量而言,所有三个数据集都提供了相同的结果,而内肽的含量以及根据方法和样品量而变化的独特肽的数量(补充图S5)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3N-末端蛋白质组学使用SCX色谱法。 A,基于TRYPN / SCX的N末端蛋白质组学的工作流程。有关详细信息,请参阅 。在第1天(REC 1)和第2天(REP 2和REP 3)进行三次技术复制,以评估内部和盘间可重现性。 B,在三种技术复制之间定量肽峰面积的再现性。 Rep 1-rep 2和Rep1-rep 3相关性代表白天的再现性,而Rep 2-rep 3相关性显示有关资源的相关性。 C,三种技术复制中蛋白质N-末端肽的富集特异性。 SCX,强阳离子交换。
      表2.从Trypn消化的HEK293T细胞鉴定蛋白质N-末端肽
      肽和蛋白质组复制1复制2.复制3.全部的
      未修饰的蛋白质N-末端肽199(±3)187(±5)197(±3)352
      乙酰化蛋白质N-末端肽1854(±13)1301(±18)1509(±15)2666
      内部肽160(±8)147(±3)232(±6)433
      n术语比(%,肽计数)92.8(±0.3)91.0(±0.2) 88.0(±0.3)
      n术语比(%,肽区域)97.4(±0.3)98.0(±0.5)97.4(±0.5)
      未修改的蛋白质组115(±3)100(±4)116(±3)167
      部分乙酰化蛋白质基团36(±2)60(±3)50(±2)106
      乙酰化蛋白质组1223(±7)1000(±9)1187(±16)1640
      用三份(重复1-3)制备样品,并一式三份进行每个样品的纳米/ MS / MS。表中的每个数字是一式三份测量的平均值,并且在合并所有结果(n = 9)并删除冗余后计算总数。通过计算所有鉴定的肽中的蛋白质N-末端肽的数量和峰面积来获得蛋白质N-末端肽的富集特异性。
      总之,我们成功地开发了一种不需要化学反应的新的N-术语方法。这种简单且快速的方法适用于具有最小样品的高通量筛选。我们的TRYPN-SCX N术语可以丰富蛋白质N-末端肽而没有偏压,包括含有碱性氨基酸的肽,有或没有N-末端改性。我们相信我们的Trypn-SCX方法具有扩展N初学者的潜力。潜在的发展包括更深入的分析,额外分馏,使用含有预测蛋白N末端的定制数据库,用SCX分离的酸液相同更换HPLC,并通过同位素标记进行定量。

      数据可用性

      支持本研究结果的所有LC / MS / MS数据已通过JPOST Partner Repository与DataSet标识符(JPST000422 / PXD010551)一起存放了Proteomexchange联盟(
      • okuda s.
      • Watanabe Y.
      • 莫里亚y.
      • 卡瓦南斯。
      • Yamamoto T.
      • Matsumoto M.
      • Takami T.
      • Kobayashi D.
      • Araaki N.
      • yoshizawa a.c.
      • Tabata T.
      • Sugiyama N.
      • goto s.
      • Ishihama Y.
      JPOSTREPO:蛋白质的国际标准数据存储库。
      )。

      利益冲突

      作者声明没有竞争利益。

      致谢

      我们要感谢分子部的成员&富有成效的讨论的细胞生物分析。

      作者捐款

      C.-h. C.,H.-Y. C.,J. R.和Y. I.设计研究; C.-h. C.进行研究; C.-h. C.和Y. I.分析数据; C.-h. C.,H.-Y. C.,J. R和Y. I.写了论文。

      资金和其他信息

      这项工作得到了JST战略基础研究计划Crest(18070870年)的支持(1806.699年)的高级研发计划(18068699),以及JSPS助剂的科学研究17H05667(对Yi) Wellcome Trust No.103139(JR)和JSPS邀请奖学金在日本No.L16568(J. R.和Yi)。来自惠康信托的核心资金支持的细胞生物学惠康中心(第203149号)支持。

      补充数据

      参考

        • Nakahigashi K.
        • 塔凯y.
        • Kimura M.
        • ab
        • Nakayashiki T.
        • Shiwa Y.
        • Yoshikawa H.
        • Wanner B.L.
        • Ishihama Y.
        • 森林。
        通过四环素抑制核糖体分析的翻译开始综合识别。
        DNA Res。 2016; 23: 193-201
        • Ingolia N.T.
        核糖体谱分析:翻译的新视图,从单个密码子到基因组规模。
        NAT。 Rev. Genet。 2014; 15: 205-213
        • van damme p.
        • Gawron D.
        • van criekinge w。
        • Menschaert G.
        N-末端蛋白质组学和核糖体分析提供了小鼠和男性替代翻译启动景观的综合图。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2014; 13: 1245-1261
        • Hwang C.S.
        • 迷人A.
        • varshavsky A.
        细胞蛋白的N-末端乙酰化产生特异性降解信号。
        科学。 2010; 327: 973-977
        • Starheim K.K.
        • Gevaert K.
        • Arnesen T.
        蛋白质N-末端乙酰转移酶:当开始很重要时。
        趋势生物化学。 SCI。 2012; 37: 152-161
        • 马尔斯斯。
        • 特立尼达J.C.
        • 巴克D.T.
        • 萨利A.
        • 伯灵名A.L.
        • 井J.A.
        蛋白质N末端特异性标记对凋亡中蛋白水解裂解位点的全局测序。
        细胞。 2008; 134: 866-876
        • 麦当劳L.
        • 罗伯逊D.H.L.
        • 赫斯特J.L.
        • Beynon R.J.
        位置蛋白质组学:N-末端蛋白质溶胶的选择性恢复和分析。
        NAT。方法。 2005; 2: 955-957
        • 莱特纳A.
        化学改性方法在现代质谱型蛋白质组学研究中的作用综述。
        肛门。 ch acta。 2018; 1000: 2-19
        • Klein T.
        • Eckhard U.
        • Dufour A.
        • solis n.
        • 总体上行
        近无处不在的后期改性的蛋白水解裂解机制,功能和“OMIC”方法。
        化学。录 2018; 118: 1137-1168
        • 徐G.
        • Shin S.B.
        • jaffrey s.r.
        蛋白质N-Termini的化学选择标记蛋白酶切割位点的全局分析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2009; 106: 19310-19315
        • 凡尔兰斯。
        • 奥贝格C.
        • Arnesen T.
        细胞蛋白质的N-末端修饰:涉及的酶,它们的底物特异性和生物学效应。
        蛋白质组学。 2015; 15: 2385-2401
        • 赖Z.W.
        • Petrera A.
        • 席克宁o.
        蛋白质氨基末端修饰和N末端分析的蛋白质组学方法。
        Curr。拍摄。化学。 BIOL。 2015; 24: 71-79
        • Gevaert K.
        • 潮气米
        • 玛特L.
        • van damme J.
        • Staes A.
        • 托马斯G.R.
        • vandekerckhove J.
        探索蛋白质谱和分析蛋白质处理的质谱法鉴定分选N-末端肽。
        NAT。 Biotechnol。 2003; 21: 566-569
        • Kleifeld O.
        • Doucet A.
        • auf dem keller u.
        • Prudova A.
        • 席克宁o.
        • Kaidhan R.K.
        • 斯塔尔A.E.
        • 福斯特L.J.
        • Kizhakkedathu J.n.
        • 总体上行
        复合样品中末端胺的同位素标记鉴定蛋白质N-末端和蛋白酶切割产物。
        NAT。 Biotechnol。 2010; 28: 281-288
        • venne A.S.
        • Solari F.a.
        • FADEN F.
        • paretti t.
        • 陷入困难的n。
        • Zahedi R.P.
        用于定量N-末端电荷基分数对角线色谱(Chafradic)的改进的工作流程,以研究拟南芥植物蛋白水解事件。
        蛋白质组学。 2015; 15: 2458-2469
        • Chen L.F.
        • 山Y.C.
        • 翁y.j.
        • sui z.g.
        • 张X.D.
        • 梁Z.
        • 张L.H.
        • 张Y.K.
        疏水标记辅助N-Termini富集用于深入的N-末端分析。
        肛门。化学。 2016; 88: 8390-8395
        • na c.h.
        • Barbhuiya M.A.
        • 金马
        • verbruggen s.
        • EACKER S.M.
        • Pletnikova O.
        • Troncoso J.C.
        • Halushka M.K.
        • Menschaert G.
        • 总体上行
        • Pandey A.
        蛋白质N末端质谱分析发现非甘露透明翻译起始位点。
        Genome Res。 2018; 28: 25-36
        • yeom J.
        • 崔Y.
        • PAEK E.
        • lee c.
        人蛋白N-Termini的综合分析能够评估各种蛋白质形式。
        SCI。代表。 2017; 7: 6599
        • adachi J.
        • Hashiguchi K.
        • 长野米
        • 佐藤M.
        • 佐藤A.
        • Fukamizu K.
        • Ishihama Y.
        • 汤汤汤
        通过组合酸和盐梯度改善阳离子交换剂上的蛋白质组和磷脂蛋白酶分析。
        肛门。化学。 2016; 88: 7899-7903
        • Essader A.S.
        • Cargile B.J.
        • Bundy J.L.
        • Stephenson Jr.,J.L.
        固定性pH梯度等电聚焦和强阳离子交换色谱作为霰弹枪蛋白质组学中的第一维度的比较。
        蛋白质组学。 2005; 5: 24-34
        • Alpert A.J.
        • 肉炎K.
        • Kangas L.
        • 史密斯r.d.
        • Mechtler K.
        • 有丝提的G.
        • 穆罕默德S.
        • heck a.j.r.
        肽取向影响离子交换色谱中的选择性。
        肛门。化学。 2010; 82: 5253-5259
        • Helbig A.O.
        • Gauci S.
        • raijmakers r.
        • van Breukelen B.
        • Slijper M.
        • 穆罕默德S.
        • heck a.j.r.
        N-乙酰化蛋白末端的分析提供了对蛋白质组的N末端性质的深入洞察。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2010; 9: 928-939
        • Gauci S.
        • Helbig A.O.
        • Slijper M.
        • Krijgsveld J.
        • Heck A.J.
        • 穆罕默德S.
        Lys-N和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
        肛门。化学。 2009; 81: 4493-4501
        • 威尔逊J.P.
        • ipsaro J.J.
        • del giudice s.n.
        • 转变N.S.
        • 高斯下午
        • Dusenbury K.H.
        • 马奎特K.
        • Rivera K.D.
        • Pappin D.J.
        Tryp-N:用于生产N-末端氨基乙烯基和溶尿苷肽的热稳定蛋白酶。
        J.蛋白质组。 2020; 19: 1459-1469
        • 略高的C.
        • Garcia-Castellanos R.
        • Seco J.
        • Baumann U.
        • gomis-ruth f.x.
        乌利柳素素的分子分析,新甲磺酸金属蛋白酶族的结构原型。
        J. Biol。化学。 2006; 281: 17920-17928
        • HUESGEN P.F.
        • lange p.f.
        • 罗杰斯L.D.
        • solis n.
        • Eckhard U.
        • Kleifeld O.
        • 炖牛肉T.
        • gomis-ruth f.x.
        • 总体上行
        Lysarginease镜子胰蛋白酶用于蛋白质C末端和甲基化 - 位点鉴定。
        NAT。方法。 2015; 12: 55-58
        • koneru l.
        • ksiazek m.
        • Waligorska I.
        • Straczek A.
        • Lukasik M.
        • madej m.
        • Thogersen I.B.
        • Enghild J.J.
        • Potempa J.
        Mirolysin,来自Tannerella连翘的裂谷酶,蛋白水解灭活人类植物疗法,LL-37。
        BIOL。化学。 2016; 398: 395-409
        • Tsiatsiani L.
        • Giansanti P.
        • 施泰米r.a.
        • van denorn h.
        • 总体上行
        • Altelaar A.F.M.
        • heck a.j.r.
        相反的电子传递解离和蛋白质组和(X)(n)(n)k / R肽的蛋白质组学和磷蛋白质中的肽测序的益处的蛋白质分离k / R(x)(n)和(x)(n)(n)的较高能量碰撞碎片特征。
        J.蛋白质组。 2017; 16: 852-861
        • Masuda T.
        • Tomita M.
        • Ishihama Y.
        相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 731-740
        • Humphrey S.J.
        • azimifar s.b.
        高通量磷蛋白酶揭示 在体内 胰岛素信号动态。
        NAT。 Biotechnol。 2015; 33: 990-995
        • Wessel D.
        • flugge u.i.
        洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质中蛋白质的定量回收的方法。
        肛门。生物学习。 1984; 138: 141-143
        • Rappsilber J.
        • Ishihama Y.
        蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
        肛门。化学。 2003; 75: 663-670
        • Tyanova S.
        • Temu T.
        • Cox J.
        基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
        NAT。 protoc。 2016; 11: 2301-2319
        • 莱利M.
        • ab
        • Arnaud M.B.
        • Berlyn M.K.B.
        • blattern f.r.
        • chaudhuri r.r.
        • Glasner J.D.
        • Horiuchi T.
        • keseler i.M.
        • Kosuge T.
        • 森林。
        • perna n.t.
        • Plunkett G.
        • rudd K.E.
        • Serres M.H.
        • 等等。
        大肠杆菌K-12:一个合作开发的注释快照 - 2005。
        核酸RES。 2006; 34: 1-9
        • raijmakers r.
        • Neerincx P.
        • 穆罕默德S.
        • Heck A.J.
        兄弟和姐妹蛋白酶Lys-C和Lys-N的切割特异性。
        化学。安排。 (CAMB)。 2010; 46: 8827-8829
        • Gussakovsky D.
        • Neustaeter H.
        • Spicer V.
        • krokhin o.v.
        强阳离子交换色谱中肽保留时间预测的序列特异性模型。
        肛门。化学。 2017; 89: 11795-11802
        • okuda s.
        • Watanabe Y.
        • 莫里亚y.
        • 卡瓦南斯。
        • Yamamoto T.
        • Matsumoto M.
        • Takami T.
        • Kobayashi D.
        • Araaki N.
        • yoshizawa a.c.
        • Tabata T.
        • Sugiyama N.
        • goto s.
        • Ishihama Y.
        JPOSTREPO:蛋白质的国际标准数据存储库。
        核酸RES。 2017; 45: D1107-D1111