蛋白质组学分析显示,拓扑异构酶2a与缺陷的精子头形态相关*

  • 雅各布荷兰
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    澳大利亚新南威尔士大学环境与生命科学,环境与生命科学学院的优先研究中心,新南威尔士州新南威尔士州
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  • Rachel A. Ogle
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    澳大利亚新南威尔士大学环境与生命科学,环境与生命科学学院的优先研究中心,新南威尔士州新南威尔士州
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  • Louise Hetherington.
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    澳大利亚新南威尔士大学环境与生命科学,环境与生命科学学院的优先研究中心,新南威尔士州新南威尔士州
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  • Ana Izabel Silva Balbin Villaverde
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    独立研究员,圣保罗,巴西
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  • Hubert Hondermarck.
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    纽卡斯尔大学纽卡斯尔大学纽卡斯尔大学卫生和医学系生物医学科学学院,澳大利亚,纽卡斯尔大学,新兰顿,新南威尔士州,澳大利亚
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  • Mark A. Baker.
    一致
    应解决对应的通信:纽卡斯尔大学环境与生命科学学院的生殖科学优先研究中心,澳大利亚新南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士州南威尔士公告电话:+61 2 4921 6143;传真:+61 2 4921 6308
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    澳大利亚新南威尔士大学环境与生命科学,环境与生命科学学院的优先研究中心,新南威尔士州新南威尔士州
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  • 作者脚注
    *提交人声明他们对本文内容没有利益冲突。
    本文包含补充数据和表格。
      男性不孕普遍普遍,估计影响20人。虽然在某些情况下,条件的病因良好理解,但至少50%的男性,潜在的原因尚未被分类。男性不孕症或体育率通常通过观察细胞的总精子,细胞的运动和整体形态而诊断。虽然计数精子及其相关的动力是常规的,但形态学评估是高度主观的,主要是因为该程序是基于显微镜检查的过程。未经诊断雄性不孕症或子生育率导致了经常不必要地使用辅助概念的情况。因此,需要男性不育症的生物标志物来帮助建立更一致的诊断。在本研究中,通过基于LC-MS / MS的蛋白质组学分析,将核提取物与高质量和低质量的精子进行比较。我们的数据表明,特定蛋白质的核保留是低质量精子细胞中的常见方面。我们证明,精子头中的拓扑异构酶2a的存在与差的头部形态高度相关。因此,拓扑异构酶2a是潜在的新生物标志物,用于确认临床实践中的男性不孕症。

      图形概要

      精子是一种独特的细胞,其主要用于其主要目的;将父系DNA递送到卵母细胞(
      • Salicioni上午
      • Platt M.D.
      • Wertheimer E.v.
      • arcelaye。
      • Allaire A.
      • Sosnik J.
      • Visconti P.E.
      涉及精子电容的信号通路。
      ,
      • 舒尔茨德
      • 哈姆拉福克。
      • 加勒斯德。
      仅在减数分裂或后生物生成细胞中表达的多种基因具有多种避孕靶标。
      )。精子发生,一种涉及强烈细胞分裂和形态变化的过程,远非是一个完美的过程(
      • 荣啊
      • Eberl M.
      • 席勒W.
      夜间阴囊冷却的改善和中度行为变化,以减少寡核苷酸的男性生殖器热应激。
      ,
      • 选择我。
      • Basha M.
      • Maraee A.
      • El-Naby S.
      • nazeef n。
      • El-Mehrath R.
      • 莫斯加法斯
      精子DNA和RNA异常在肥沃和寡核苷酸异孢菌菌吸烟者。
      )。事实上,如此贫穷是人体精子,所有人,甚至是肥沃的男性,都会产生缺陷的精子(
      • mclachlan r.i.
      • de克雷斯德下午。
      男性不育症:持续研究的情况。
      )。然而,当有缺陷的细胞数量达到临界水平时,一个人可以成为底部或不育(
      • mclachlan r.i.
      • de克雷斯德下午。
      男性不育症:持续研究的情况。
      )。
      男性因子不孕症的主要问题之一是实际诊断。通常,在观察它们产生的精子量后,男性被归类为不孕症或次肥大,精子的动力和细胞的形态。尽管全球总精子计数和精子运动的测量是一致的(如今通常通过计算机测量),但是精子形态的分析被证明是有问题的(
      • Cooper t.g.
      • 中午e.
      • von enkardstein s.
      • 埃格尔J.
      • 贝克H.
      • Haugen T.B.
      • 克鲁格T.
      • 王C.
      • MBizvo M.T.
      世界卫生组织人类精液特征的参考价值。
      )。根据世界卫生组织手册(1992),精子可以具有几种形态异常,包括头部,尾部和/或中间件内的缺陷,或细胞可能具有多余的残留细胞质。详细分析了应评估精子形态如何(
      • Menkveld R.
      临床意义较低的正常精子形态价值,提出的人类精液检验处理WHO实验室手册。
      )。然而,尽管精子形态由特定标准指导,但实验室间差异普遍存在(
      • 弗兰肯D.R.
      • Menkveld R.
      • 克鲁格T.F.
      • Sekadde-Kigondu C.
      • 伦巴第C.
      在精子形态质量控制计划中监测技术人员阅读技巧。
      )有一个报告,显示用户变化超过12%(
      • Cooper t.g.
      • NeuWinger J.
      • Bahrs S.
      • Nieschlag E.
      精液分析的内部质量控制。
      )。为了说明精子形态的分析如何,从1980年至1994年的时间内初步检查,从一年到1994年随着时间的推移显示,精子形态有显着下降(
      • 霍尔特A.
      • Vierula M.
      • 最佳pari J.
      • Suominen J.
      从1980 - 1994年期间重新评估档案精液涂片的精子形态。
      );然而,对相同样品的独立重新评估显示没有显着的形态下降。相反,先前观察到的下降是因为在这个时间段内对精子形态不一致(
      • 霍尔特A.
      • Vierula M.
      • 最佳pari J.
      • Suominen J.
      从1980 - 1994年期间重新评估档案精液涂片的精子形态。
      )。无法评估精子形态,了解其对生育能力的影响导致许多夫妻的治疗和相关成本。事实上,1391次提到辅助概念,包括男性和女性不孕症,最终自发地构思了45.6%(
      • 品牌M.
      • 汉密尔顿C.
      • 德布林J.
      • Nelen W.
      • 克雷梅勒J.
      IVF.对底部队列中持续妊娠率的相对贡献。
      )。这表明许多夫妇是误诊和更好的肥力标志性,特别是关于男性生育潜力,迫切需要避免患者的过度治疗(
      • 德克雷斯德D.
      男性不孕症。
      ,
      • Krausz C.
      男性不孕症:发病机制和临床诊断。
      )。
      报告的最常见的形态异常是与精子头的形状有关。关注,对头形态的变化可以反映DNA的质量和/或包装(
      • 埃格尔J.
      • Jouannet P.
      • eustache F.
      另一种看人体精子形态。
      )。在从圆形精子的过渡到伸长精子的精子后,发生核的大小的显着降低(
      • 克莱蒙y.
      男人的疗法上皮的循环。
      ),使得精子核体积约为1/7TH. 任何体细胞的大小(
      • Champroux A.
      • Torres-Carreira J.
      • gharagozloop.
      • 德夫特J.
      • Kocer A.
      哺乳动物精子核组织:居住和漏洞。
      )。这是完成的,因为组蛋白家族被称为protamines(PRM1,PRM2)所示的两个较小和带电荷的蛋白质。估计表明,90%的基因组DNA与PRM1或PRM2结合,而剩余的10%保持规范组蛋白-DNA相互作用(
      • 病房W.S.
      精子染色质结构元素在施肥与发育中的作用。
      )。在组蛋白 - 预蛋白替代物后,DNA压实在PRM1和PRM2之间形成间分子间二硫化物结合时几乎结晶水平(
      • Balhorn R.
      • Corzett M.
      • Mazrimas J.
      • 沃特金斯B.
      鉴定公牛protamine二硫化物。
      ,
      • Shalgi R.
      • Seligman J.
      • kosower n.s.
      大鼠精子硫醇状态在成熟过程中的动态:用荧光标记剂Monobromobimane的分析。
      ,
      • Saogaros W.
      • 帕尼姆S.
      在精子成熟期间人蛋白质中的二硫键形成。
      )。这种致密包装从环境因素中提供了基因组DNA的临界保护,并提供了用于运动的流体动力学形状。然而,有时,很明显,染色质压实不会正确发生。实际上,在不育男性的群组中观察到较差的染色质压实(
      • Foresta C.
      • Zorzi M.
      • Rossato M.
      • varotto a。
      精子核不稳定和脂肪染色蓝蓝色:无育人中精子的特征异常持久性。
      ,
      • de iuliis g.n.
      • Thomson L.K.
      • 米切尔L.A.
      • 芬尼吉。
      • Koppers A.J.
      • 篱笆A.
      • 尼克松B.
      • Aitken R.J.
      人体精子的DNA损伤与染色质重塑的效率高度相关,并形成8-羟基-2'-脱氧核苷酸,氧化应激1的标志物。
      ,
      • Zandemami M.
      • Qujeq D.
      • Akhondi m.m.
      • Kamali K.
      • raygani m.
      • lakpour n。
      • Shiraz E.S.
      • Sadeghi M.R.
      CMA3染色与精子质量和protamine缺乏的相关性。
      )并且也与较低有关 体外 施肥 (IVF)
      使用的缩写是:
      IVF.
      体外 fertilization
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      多发性硬化症
      质谱
      m
      分子量
      ICSI.
      细胞内精子注射
      PMSF.
      氟甲基磺酰氟乙烯
      CTAB.
      1%(w / v)十六烷基三乙基溴化物
      DAPI.
      4',6-二氨基-2-苯基吲哚
      BWW.
      大老牌人们& Whittingham
      达达
      数据相关的采集
      顺序窗口获取所有理论群众。
      1使用的缩写是: IVF.
      体外 fertilization
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      多发性硬化症
      质谱
      m
      分子量
      ICSI.
      细胞内精子注射
      PMSF.
      氟甲基磺酰氟乙烯
      CTAB.
      1%(w / v)十六烷基三乙基溴化物
      DAPI.
      4',6-二氨基-2-苯基吲哚
      BWW.
      大老牌人们& Whittingham
      达达
      数据相关的采集
      顺序窗口获取所有理论群众。
      outcomes (
      • 弗兰肯D.R.
      • 弗兰肯C.J.
      • de la guerre h.
      • de Villiers A.
      正常精子形态和染色质包装:苯胺蓝和色霉素A3染色之间的比较。
      )。
      通过这种背景知识,IVF行业通过通过密度梯度传递精子射精来增加成功率。在该过程中,较高的致密细胞通常通过管底部的梯度和沉淀,而在梯度内较低的致密细胞(包括核体积增加)颗粒(
      • Jayaraman V.
      • Upadhya D.
      • Narayan P.K.
      • Adiga S.K.
      通过扫描和密度梯度的精子处理可有效地消除具有DNA损伤的精子。
      )。一般而言,较高的致密细胞具有更好的运动,形态和染色质压实水平(
      • 汉德S.
      • 刘L.
      • Carrell D.T.
      选育密度梯度制剂中的精子中的预蛋白比例和组蛋白保留水平。
      )因此,将是对自然生育的负责相同的。
      在以前的研究中,我们已经比较了高致密的精子的蛋白质组学组成,并且在这两个细胞群之间发生了显示的蛋白质变化(
      • 荷内·克
      • Hethington L.
      • ogle R.
      • Velkov T.
      • 贝克M.
      良好和差的人体精子的蛋白质组学分析表明了几种蛋白质经常调节了几种蛋白质。
      )。感兴趣的是,发现许多蛋白质在劣质细胞内较高或更低的丰度在不同的供体中是“常见”。虽然通常建议具有非常异质的病因,但是我们的数据集似乎建议相反,并且可能导致精子形成有缺陷的机制可能比我们预先理解的更常见(
      • 荷内·克
      • Hethington L.
      • ogle R.
      • Velkov T.
      • 贝克M.
      良好和差的人体精子的蛋白质组学分析表明了几种蛋白质经常调节了几种蛋白质。
      )。在该分析中,在完整的精子上进行,我们注意到鉴定了很少核蛋白质。因此,要了解劣质精子的核含量是否在精子发生过程中也受到影响,我们决定对精子进行亚细胞分馏。这种方法使我们能够比较高质量和低质量的精子之间的核蛋白质组成,并调查它们与精子形态的关联(
      • 卡斯蒂略J.
      • Amaral A.
      • Oliva R.
      精子核蛋白质组及其表观遗传潜力。
      )。在我们寻求鉴定蛋白质生物标志物中,这些生物标志物将更好地预测人的生育状态,我们发现蛋白质的核蛋白质保留,包括拓扑异构酶2a(Top2a),可以是低质量精子细胞的标志。这些标记可以添加到蛋白质面板中,以便在未来更好地诊断男性的生育状态,而不是依赖于精子形态的主观测量。

      实验步骤

      所有化学品都是从Sigma-Aldrich购买的最高研究成绩,除白蛋白和铵脱硫(研究有机物,克利夫兰,哦),Percoll(GE Healthcare,Castle Hill,Australia),Hepes(Gibco,Invitrogen澳大利亚,墨尔本,澳大利亚)和10×Ham的F-10(MP生物医学,七山,NSW,澳大利亚)。 d - 葡萄糖,碳酸氢钠,氯化钠,氯化钾,氯化钾,正磷酸钾和亚硫酸镁都是肛门级等级。氯仿,甲醇和甲醛购自Fronine(Riverstone,澳大利亚)以最高纯度可用。来自Fluka(Castle Hill,Australia),微核核酸酶(MNA酶)和10×MNA键缓冲液来自NEB Biolabs(Arundel,Australia),来自ICN生物化学(Castle Hill,Australia)的TRIS,来自BioRad的预制SDS凝胶( Gladsville,NSW,澳大利亚)和罗氏(曼海姆曼海姆)的完整迷你蛋白酶抑制剂。

       人类精子和伦理的制备

      为在本研究计划中使用人体精液样本,确保了机构和国家政府的道德批准。这项工作是根据世界医学协会的伦理法(赫尔辛基宣言)进行的工作进行,涉及人类的实验。研究人口由捐助者组成(n = 8)从25至70岁或没有任何可检测的有机疾病。没有人报告过任何明显的不孕症 - 毒素缺陷,如瓦里奇焦。在至少3天的禁欲后,通过手淫产生精液样品。将样品在37℃下静置至少30分钟,以便在加工之前发生液化。根据世卫组织的生育标准,评估了精子数,形态和总动力,
      )。然后在三层梭菌密度梯度上处理精液样品。工作解决方案是通过用更大的大鼓来稀释percoll&Whittingham(BBW)溶液在9:1的比例中。将2ml等份的工作溶液(将100%Percoll)置于15ml缩斗管中,并覆盖2ml 60%的Percoll,然后是2mL 30%的Percoll。通过用BWW稀释工作溶液来获得60和30%的Percoll溶液。精液样品在梯度上轻轻分层。然后以500×离心样品 g 30分钟,并且100%Percoll溶液(高质量细胞)底部的精子和100和60%层(低质量细胞)的界面中的底部被收集到单独的管中。然后用5ml BBW洗涤细胞并以500×离心 g 15分钟。颗粒重悬于1mL BWW中,并进行细胞计数。将10μl抗CD45涂覆的DynaBeads(Thermof Serian,11153d)在BWW中洗涤3次,并加入样品以确保没有存在污染的白细胞并在室温下放置在旋转器上30分钟(1000× g30°C)。使用磁铁去除DynaBeads,细胞以500×造粒 g 3分钟并用BWW洗涤两次。

       精子肿胀和dapi染色

      大约0.5×106 将精子重悬于150μl缓冲液3(50米m 硼酸钠,1%(w / v)sds和10 mm EDTA; pH 9.0)50分钟。通过加入等体积的4%多聚甲醛淬灭反应。将细胞在玻璃滑移到玻璃载玻片上并通过覆盖〜50μl10μl染色m DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)。使用荧光显微镜对细胞进行成像。

       图像J分析

      荧光图像被转换为​​8位,并且阈值集合以创建二进制图像。插件“分析粒子”用于测量荧光面积,不包括区域<选择“排除边缘”50像素和设置。成像至少100个细胞,并使用学生比较组之间的比较 t test (p < 0.05).

       精子核孤立

      共30×106 精子(使用血细胞计测定)重新悬浮在750μl缓冲液1(1米m 苯基甲基磺酰氟(PMSF),1%(W / V)十六烷基 - 三乙基溴化溴化铵(CTAB),10米m DTT and 50 mm TRIS,pH 8.0)在冰上持续15分钟。之后,加入750μl缓冲液2(不含DTT的缓冲液1),然后在4℃下温和旋转温育45分钟。然后将细胞以3000×离心 g 在室温下5分钟,并且由核组成的细胞沉淀,在500μl缓冲液2中轻轻重悬,并孵育30分钟。然后将分离的核轻轻洗涤两次在500μl中,并在300μl洗涤缓冲液中一次(10米m Tris and 1 mm PMSF; pH 8.0)使用3000×以5分钟的离心 g and 4 °C.

       核沉淀和肽产生

      将核重新悬浮在450μl的Tris缓冲盐水中,补充10米m DTT,并在37℃下孵育30分钟。加入50μL10×MNA键缓冲液和0.5μl(1,000 u)的MNA酶等份,并在37℃下将样品进一步30分钟。在MNA酶消化后,将一体体积的氯仿和两体积体积的甲醇加入到两体积的样品中,并剧烈涡旋混合物。将该样品离心(10,000× g,2分钟)并且在相分离后,除去上相。向剩余的较低相中加入三体积的甲醇,并将混合物轻轻倒置两次。然后离心溶液(10,000× g15分钟)颗粒沉淀沉淀的蛋白质。弃去上清液,使颗粒允许空气干燥。将胰蛋白酶加入颗粒中并在37℃下消化过夜。将样品以17,000×离心 g 20分钟,转移到样品瓶和酸化。

       数据相关的采集(DDA)和库生成

      为了产生光谱库,将11个样本被随机选择,并且如前所述(
      • 汉德S.
      • 刘L.
      • Carrell D.T.
      选育密度梯度制剂中的精子中的预蛋白比例和组蛋白保留水平。
      )。每个文件都被加载到蛋白导频V5.0.1(AB SCIEX)中,并在“彻底ID”模式下,胰蛋白酶作为消化酶的胰蛋白酶,没有CYS烷基化,乙酰化重点是一种特殊的,以搜索(5.0.1.0,4895)搜索。因素,ID专注于生物修改。这些文件是针对人类Swissprot数据库(2017年1月)的搜索,其中包含42,324个蛋白质。还包括在搜索数据库中是从冰川识别的蛋白质(
      • Mellacheruvu D.
      • 赖特Z.
      • Couzens A.L.
      • 兰伯特J.-P.
      • st-denis n.a.
      • 李T.
      • Miteva Y.v.
      • 哈利斯。
      • Sardiu M.E.
      • 低T.Y.
      • Halim V.A.
      • Bagshaw R.D.
      • 哈伯纳N.C.
      • Al-Hakim A.
      • Bouchard A.
      • Faubert D.
      • 费尔明D.
      • 邓汉W.H.
      • Goudreault M.
      • 林Z.-Y.
      • Badillo B.G.
      • Pawson T.
      • DUROCHER D.
      • 库仑B.
      • Aeberberold R.
      • Superti-Furga G.
      • 大歌j.
      • heck a.j.r.
      • Choi H.
      • Gstaiger M.
      • 穆罕默德S.
      • 克里斯特芹。
      • Bennett K.L.
      • Washburn M.P.
      • 骑B.
      • e
      • Gingras A.-​​C.
      • nesvizhskii a.i.
      克拉佩:一种用于亲和纯化质谱数据的污染物库。
      )。最终光谱文库包括389个蛋白质,包含1331个肽和8797个光谱,具有1%的全局假发现率(FDR)。对FDR如何通过Paragon算法计算的深入解释,用于肽ID的多个光谱和可变修改的分配的处理的处理和可变修改的分配
      • Shilov I.v.
      • Seymour S.L.
      • Patel A.A.
      • Loboda A.
      • 唐W.H.
      • Keating S.P.
      • 猎人C.L.
      • Nuwaysir L.M.
      • Schaeffer D.A.
      Paragon算法,使用序列温度值的下一代搜索引擎和特征概率来识别来自串联质谱的肽。
      )。

       顺序窗口获取所有理论群众(SWATH)分析

      为了获得肽定量数据,在上面制备的16个样品(8个高和8个低质量的精子)再次通过液相色谱法,偶联至6600三倍的质谱仪,运行SWATH采集方法。对于收购SWATH数据,设置如下:执行MS1扫描,然后进行100 m/z 孤立窗户1m/z 交叠。使用SCIEX可变窗口计算器1.0使用上面生成的DDA文件确定窗口尺寸。总循环时间为2.8s。为了量化肽,将上面产生的光谱库进口到PeakView(2.2)中。使用swath-ms获取的文件使用swath-ms / msall micro app(1.0)导入。导入生成的库,不包括修改和非唯一肽。通过手动选择来自已知高丰度的蛋白质的所有样品中存在的肽来对准保留时间。肽从洗脱时间的均匀分布中取出。手动检查所有样品以确保在洗脱时间重新校准之前通过SWATH算法检测并选择肽并选择肽。重新校准后,确保样品之间的线性是均匀的。在保留时间对准之后,将样本被处理以在5mal的RT窗口内匹配。最高六个最丰富的离子(不包括前体离子)用于鉴定,具有10ppm的质量耐受,用于在文库之间匹配并获取SWATH数据。鉴定的片段离子曲线下的区域由SWATH算法自动计算,并求和匹配肽(99%的置信度)。

       佩戴斯

      在PeakView中处理后,原始数据将导出到Markerview(版本1.3.0.1版本)中。从这里,数据再次导出为原始文本文件,这允许使用免费软件Perseus软件(1.5.2.6版)进行分析(www.perseus-framework.org.)。在PERSEUS中,数据被记录转换,然后标准化为每个样本的中位数。使用配对的螺纹进行比较样品组 t 测试。折叠变化的蛋白质大于2.0和 p 价值 >0.05被认为是显着的。

       免疫荧光

      如别处所述进行免疫荧光,使用所有原发性抗体的稀释度为1/50(
      • Hethington L.
      • 施耐德e.k.
      • Dekretser D.
      • Muller C.H.
      • Hondermarck H.
      • Velkov T.
      • 面包师M.A.
      外致密纤维1的不足是特发性男性不孕症的标记和潜在驱动器。
      )。使用标准指导方针得分细胞形态。使用的荧光二抗是:山羊抗兔488(ABCAM,A1108),驴抗羊(Sigma,F7634)。

       免疫印迹

      如上所述制备全细胞,或如上所述制备的细胞核(在胰蛋白酶消化之前的所有步骤)。在SDS萃取缓冲液中溶解蛋白质(2%(w / v)sds,10%(w / v)蔗糖,114米m TRIS和1片剂完整的迷你蛋白酶抑制剂:pH7.5)。免疫印迹如其他地方所述进行(
      • 荷内·克
      • Hethington L.
      • ogle R.
      • Velkov T.
      • 贝克M.
      良好和差的人体精子的蛋白质组学分析表明了几种蛋白质经常调节了几种蛋白质。
      )。对于在整个细胞上进行的印迹,使用〜5μg蛋白质进行分析,并且用作负载控制的α管蛋白。用于核,10×10的蛋白质提取物6 核被用于蛋白质萃取,并且载有相同的蛋白质,用于免疫印迹作为负载控制。使用的抗体和它们的稀释剂如下:小鼠单克隆抗体抵抗TOP2A(ABCAM,AB52934)稀释1/1000,针对PDIA3(生物技术,AF8219)的绵羊多克隆抗体稀释1/1000,小鼠单克隆对抗α管蛋白(Sigma,T5168 )稀释1/2000,兔多克隆反对组蛋白H3(Sigma,H0164)稀释1/3000。用于检测的二级抗体:山羊抗兔HRP(Sigma,DC03L),山羊抗小鼠HRP(Invitrogen,A16072),兔抗羊HRP(Sigma,402100)。

       实验设计与统计理由

      对于精子核的质谱分析,通过Percoll梯度加工射精以分离高质量和低质量的精子群。用洗涤剂处理分离的细胞以分离核,并用MNA酶在胰蛋白酶消化的整个核的消化之前用MNA酶处理,以产生用于分析的肽。 11个样品用于库生成(5种高质量/ 6个低质量,随机选择)和16个样品,用于SWATH数据生成(来自8个捐赠者的高/低质量)。选择8个供体作为适当的样品尺寸,因为我们达到6个供体检测的阈值功率,在7且在8中增加了8.用于精子染色质溶胀,免疫印迹和免疫细胞化学实验,高质量和低质量的精子/使用来自3个独立供体的核。对于使用Perseus软件的SWATH数据的统计分析,数据是日志 2 转化,中位数标准化和韦尔奇的 t 测试执行(Welch's t 使用测试作为数据被认为是通常分布的,并且作为韦尔皮 t 测试表现也在学生们 t 在平等方差的情况下测试,并且在不平等方差的情况下表现出(
      • Deracre M.
      • Lakens D.
      • Leys C.
      为什么默认情况下,心理学家应该使用Welch的T-Test而不是学生的T-Test。
      )))。一个 p 价值 >0.05 and >2倍的变化用于阈值变化。对于染色质肿胀,肿胀的2尾纹纹 t 使用试验,用于免疫细胞化学计数成对的2个被宣传的学生 t test was used.

      结果

       人体精子核的分离,纯度和生化特性

      我们比较了高质量和低质量人体精子之间的核蛋白质的组成,旨在鉴定蛋白质丰度变化,该变化可用于更好地分类精子样品的生育潜力。为实现这一目标,我们将精子样本分成两个人群;一种具有高质量精子和另一种具有低质量的单元格,使用从先前描述的一个适应的不连续的Percoll梯度协议(
      • de mateo s.
      • 卡斯蒂略J.
      • estanyol准
      • Ballesca J.L.
      • Oliva R.
      人体精髓核的蛋白质组学表征。
      )。简而言之,覆盖三种不同的密度梯度,并将精子样品放在顶部,然后离心。与在100/60%Percoll接口处的颗粒相比,颗粒在管底部的精子具有更高的密度(Fig. 1A)。我们以前表征了这些人群并表明大多数(>相反,90%的较低致密细胞的形态和运动(本文称为低质量)具有明显差的形态和运动性(本文称为低质量),高密度细胞富含形态正常,运动和高肥沃的精子(
      • 荷内·克
      • Hethington L.
      • ogle R.
      • Velkov T.
      • 贝克M.
      良好和差的人体精子的蛋白质组学分析表明了几种蛋白质经常调节了几种蛋白质。
      )(这里称为高质量)。每个分数的精子图像显示在 Fig. 1B。低质量级分中的细胞通常显示形态缺陷,包括无定形头(Fig. 1B,上部图像,黑色箭头),与来自高质量分数的细胞形成对比,在其形态上正常细胞富集(Fig. 1B,较低的图像,白色箭头)(可以找到用于施用的捐赠者的原始精液分析 补充表S1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1通过Percoll密度梯度分离高质量的精子。 A,将射精放置在不连续的Percoll梯度上,如图所示。高品质的精子具有比低质量细胞更高的密度。 B,从高(下)或低(上)质量栓级分中获得的完整精子的相位对比图像。黑色箭头表示非晶头,白色箭头表示正常的形态。 C,从高(低)或低(上)质量人精子的CTAB洗涤剂处理后获得的核的直接对比图像。秤栏=5μm.
      为了分离核,如前所述用洗涤剂CTAB处理完整的精子细胞(
      • de mateo s.
      • 卡斯蒂略J.
      • estanyol准
      • BallescàJ.L.
      • Oliva R.
      人体精髓核的蛋白质组学表征。
      )。为了表征核制剂的纯度,拍摄直接干扰对比(DIC)图像(Fig. 1C)。计数来自高位的400多核(Fig 1B,较低),或低(Fig. 1B使用直接干扰对比(DIC)的上部)质量细胞证明没有裂缝尾部或中间件的证据。此外,没有存在圆形细胞污染,表明核的群体是高度纯度的,这也以前由其他人报告(
      • de mateo s.
      • 卡斯蒂略J.
      • estanyol准
      • BallescàJ.L.
      • Oliva R.
      人体精髓核的蛋白质组学表征。
      )。在确认这方面,在高质量和低质量的精子中分离出蛋白质组学分析,主要的非核精子蛋白(例如 管蛋白,蛋白激酶A锚定蛋白3和4,以及几种热休克蛋白质)并不明显。

       染色质压实在低质量分数中的差异

      尽管来自低质量分数的细胞显示出比高质量分数更高的异常形态的百分比,但是当我们只观察核时,这不是这种情况。两人群体都产生了非常相似的图像,具有很少有关核形态学粗略差异的证据。因此,确定是否存在生物化学变化,我们用SDS / EDTA挑战精子(
      • Bedford J.
      • 弯腰
      • Calvin H.
      核染色质在形态学正常的人体精子中的结构特征和稳定性的变化。
      )。以前的作品表明,在短时间内孵育时,染色质压实较差的精子(在这种情况下定义,它们在电子显微镜下看起来“颗粒状”)迅速,显示染色质不紧凑(紧凑的精子核非常电气致密)(
      • Bedford J.
      • 弯腰
      • Calvin H.
      核染色质在形态学正常的人体精子中的结构特征和稳定性的变化。
      )。如所示 Fig. 2A,一些精子的染色质来自低质量群体经历了快速的裂缝,或扩大SDS / EDTA治疗后(Fig 2A,白色箭头)。为了量化这一点,使用Image J.示出了来自三种供体的实施例,测量治疗后的群体中的核区域。Fig. 2B)。在每种情况下,从高到低质量的细胞的DAPI染色面积显着增加。然而,显示这种增加的细胞总数在捐赠者之间变化。该数据表明,尽管观察到的核形态没有核形态粗略差异,但衍​​生自低质量精子的染色质更容易受到SDS-EDTA处理的影响,而不是衍生自高质量细胞的那些,因此可能不太紧凑。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2用SDS / EDTA治疗后,低质量精子的细胞核更容易受到裂缝的影响。 以下占领分数 A,高(上)和低(较低)质量的精子遭于用SDS / EDTA挑战,然后用DAPI染色。显示出脱稠的核(白色箭头);秤栏=5μm. B来自DAPI荧光区的盒子和晶须曲线图>从三个供体中分离的精子和低质量群体中的100个细胞,并进行裂缝(*p < 0.00001).

       生成条款图书馆

      为了确定来自高质量和低质量的精子群的核组合物之间的定量差异,我们使用所有理论光谱或SWATH的顺序窗口激活进行蛋白质组学分析。在胰蛋白酶消化之后,随机选择由6个供体的5个高和6个低质量级分组成的11个样品,并通过在数据相关模式下运行质谱仪来产生光谱库。产生的文库由389个蛋白质组成,其包含1331个肽和8797个光谱,以1%的全局假发现率(FDR)组成。相比之下,体细胞核核制剂的蛋白质组学分析通常产生〜2500〜20000℃蛋白质鉴定(
      • 卡斯蒂略J.
      • Amaral A.
      • Oliva R.
      精子核蛋白质组及其表观遗传潜力。
      )。然而,需要认识到,保护DNA,精子具有高度紧凑的细胞核,已被描述为晶状体(几乎)无核状(
      • Balhorn R.
      • Corzett M.
      • Mazrimas J.
      • 沃特金斯B.
      鉴定公牛protamine二硫化物。
      ,
      • Shalgi R.
      • Seligman J.
      • kosower n.s.
      大鼠精子硫醇状态在成熟过程中的动态:用荧光标记剂Monobromobimane的分析。
      ,
      • Saogaros W.
      • 帕尼姆S.
      在精子成熟期间人蛋白质中的二硫键形成。
      )。这解释了为什么与细胞细胞核相比,为什么我们发现总蛋白质鉴定的量减少(
      • 卡斯蒂略J.
      • Amaral A.
      • Oliva R.
      精子核蛋白质组及其表观遗传潜力。
      )。
      我们对唯一出版的研究中的精子核蛋白列表的比较(
      • de mateo s.
      • 卡斯蒂略J.
      • estanyol准
      • Ballesca J.L.
      • Oliva R.
      人体精髓核的蛋白质组学表征。
      )显示在 补充图。S1。我们最初担心两项研究中只发现蛋白质重叠〜50%。但是,似乎(1)样本纯度和(2)冗余命中的报告解释了差异。审查De Mateo独有的列表 等等。 (
      • de mateo s.
      • 卡斯蒂略J.
      • estanyol准
      • BallescàJ.L.
      • Oliva R.
      人体精髓核的蛋白质组学表征。
      ),我们可以识别一些不太可能与核有关的蛋白质,这表明可能发生了对核准备的微小污染。实例包括白蛋白,蛋白激酶A锚固蛋白3或4,许多线粒体蛋白质(
      • Aitken R.J.
      • 面包师M.A.
      蛋白质组学在理解精子细胞生物学中的作用。
      )纤连蛋白(
      • Fusi F.
      • 布朗森R.
      精子表面纤连蛋白表达在电容后表达。
      ),铁蛋白(
      • 奇康A.
      • Kroos M.
      • Koster J.
      • 范艾济科H.
      铁,铁蛋白和铜在精液等离子体中。
      ), 乳酸脱氢酶 (
      • 戈德伯格E.
      • 霍技C.
      小鼠精子特异性乳酸脱氢酶的组织发生。
      ),前列腺酸磷酸盐(
      • 山药l.t.
      人酸磷酸酶的临床意义:综述。
      )和小管蛋白。然而,也许最大的差异是蛋白质命中的方式。 de mateo. 等等。 似乎在报告蛋白击中时使用了冗余( IE。 如果一个肽与多种蛋白质匹配,则报告所有蛋白质),而我们的报告使用非冗余命中(即,如果发现一个肽与许多蛋白质匹配,但在同一蛋白质组内,并且第二肽是发现仅匹配一个蛋白质同种型,然后仅报告该蛋白质同种型)。没有“正确的”方法给定冗余报告给出了许多误报,但留下了一些错误的否定,而非冗余报告给出较少的误报,但可能无法识别存在的蛋白质。然而,这两种方法大大夸大了列表之间的差异。例如,De Mateo报告了15种组蛋白H2b的同种型 等等。 (
      • de mateo s.
      • 卡斯蒂略J.
      • estanyol准
      • BallescàJ.L.
      • Oliva R.
      人体精髓核的蛋白质组学表征。
      ),而我们的列表仅包含组蛋白H2b2e,h2bfm和h2b1a。但是,所有15 h 2b同种型都是由de mateo报告的 等等。 不会有一个独特的肽(我们的研究需要的东西),因为它们仅在蛋白质N末端的少数氨基酸不同,其富含赖氨酸和精氨酸(由胰蛋白酶切割的相同氨基酸)。因此,在这个例子中,我们只有3个“重叠蛋白质”,而实际上,如果两种方法使用非冗余报告,则列表将非常接近。因此,我们的标准更加严格,可能解释了这两个研究报告的识别之间的差异。来自两个列表的蛋白质标识(de Mateo 等等。和我们的)给出 补充表S2.

       定量SWATH分析

      为了定量比较来自高质量和低质量的精子核,八种男性的蛋白质和精子核被隔离并在Triple-ToF 6600上以SWATH模式运行。使用自由软件统计分析包(Perseus)进行相对量化(www.perseus-framework.org.)。数据是日志2 转化为减少样品扩散,然后标准化为每个单独样品的中值值,以考虑变化。使用配对的韦尔奇 t 测试,我们鉴定了蛋白质的显着蛋白质变化,蛋白质是截止值的最小标准 p <0.05且折叠变化不小于2.总共26个蛋白质在本组之间显着差异,其表示此处鉴定的总蛋白质的6.7%(269.69中)。可以找到具有重要调节的蛋白质 表I..
      表I.在Percoll密度梯度分离后,在低质量人体精子中的显着规定的蛋白质
      UNIPROT RESIVITION#基因名称蛋白质名称日志2 Fold Changep value
      P27487DPP4二肽肽酶4.-5.206.01E-06.
      O00468agn.一咧嘴-4.825.30E-05.
      P54107CRISP1富含半胱氨酸的分泌蛋白1-4.440.004512
      P35052GPC1甘锡-1-3.780.000514
      P11388TOP2ADNA Topoisomerase 2-α-3.610.000816
      Q7Z6Z7HUWE1E3泛素 - 蛋白质连接酶Huwe1-3.500.00303
      P26641EEF1G伸长因子1-gamma-3.260.000194
      P26640vars.缬氨酸 - TRNA连接酶-3.250.000107
      P04083ANXA1Annexin A1 -3.230.001318
      P02751FN1纤连蛋白-3.0670.003391
      Q8IX12CCAR1细胞分裂周期和凋亡调节蛋白1-3.010.012372
      Q15046卡尔斯赖氨酸 - TRNA连接酶-2.976.36E-05.
      P15144ANPEP.氨肽酶N.-2.820.004911
      P29692-2EEF1D伸长系数1-delta的同种型2-2.690.000117
      P26583HMGB2高迁移率组蛋白B2-2.590.03805
      P30101PDIA3蛋白质二硫键 - 异构酶A3-2.580.000584
      P06748NPM1核磷-2.520.003851
      P24534EEF1B2伸长因子1-beta-2.490.003658
      Q5BF6-7ODF2外致密纤维蛋白的同种型7-2.470.00268
      O95473SYNGR4Synaptogyrin-4.-2.310.015401
      P49913Cathelicidin抗微生物肽-2.250.005459
      P30084ECHS1Enoyl-CoA水解酶,线粒体-2.240.001973
      Q04837SSBP1单链DNA结合蛋白,线粒体-2.120.007349
      P07355-2ANXA2Annexin A2的同种型2-2.090.035633
      P14923jup.交界处普拉克戈班蛋白-2.080.015926
      P39023RPL360s核糖体蛋白L3-2.010.000688

       protamine 2和组蛋白在低质量的细胞内不会改变

      几份报告表明,不孕症男性缺乏protamine 2(
      • 穆罕默德H.N.-e.
      • 穆罕默德S.
      • Shahnaz R.
      • Maryam A.
      • 沙哈拉河
      • Fariba M.
      • 穆罕默德米
      精子DNA损伤的影响和精子缺乏对ICSI施肥和胚胎发育的影响。
      )或具有protamine 1 / protamine 2的比例的变化(
      • Balhorn R.
      • 芦苇S.
      • Tanphaichitr N.
      异常的protamine 1 / protamine 2在不孕症人类雄性的精子中的比率。
      ,
      • Aoki v.w.
      • Moskovtsev S.I.
      • 威利斯J.
      • 刘L.
      • Mullen J.B.M.
      • Carrell D.T.
      DNA完整性在protamine缺陷的人精子中受到损害。
      )。此外,其他人提出,在不育的精子中,组蛋白量增加了(
      • Foresta C.
      • Zorzi M.
      • Rossato M.
      • varotto a。
      精子核不稳定和脂肪染色蓝蓝色:无育人中精子的特征异常持久性。
      )。然而,我们的SWATH数据表明,Protamine 2也不是任何组蛋白蛋白质显着不同。为了确认这一点,我们使用针对组蛋白H3的抗体比较高质量和低质量的精子馏分。如图所示 (Fig. 3A),我们发现在对加载对照α-小管蛋白归一化时H3的水平没有变化。绘制了用于比较的定量SWATH数据(Fig 3B)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3组蛋白H3的水平在高质量和低质量的精子群之间是一致的。 A,SDS的免疫印迹从高质量和低质量的精子中提取蛋白质从三种射精分离,使用抗H3探测。在加入马萝卜过氧化物酶共轭二抗后,用化学发光可视化交叉反应带。较低的印迹:在记录化学发光后,剥离硝化纤维素的一抗,重新阻断并用抗α管蛋白探测。获得的化学发光信号被使用负载控制。 B,根据高质量和低质量的精子细胞之间的SWATH分析的大量组织H3证明了人口之间没有显着差异(n = 8, p > 0.05).

       换分析表明,蛋白质的核保留是低致密精子的标志

      检查 表I. 证明,在低质量的馏分细胞内,所有蛋白质在基团之间显着差异。从种系发育的角度来看,可以合理地解释该数据。在精子发生期间,将精子基因组包装在晶状态附近(
      • Balhorn R.
      protamine的精子核蛋白质。
      )。在这些事件期间,核体积的特征减少到任何体细胞的大小约为17(
      • Champroux A.
      • Torres-Carreira J.
      • gharagozloop.
      • 德夫特J.
      • Kocer A.
      哺乳动物精子核组织:居住和漏洞。
      )使能更流体动力头的形状和保护DNA免受毒性损伤(
      • Balhorn R.
      protamine的精子核蛋白质。
      )。导致核量减少的过程尚不清楚,但可能涉及泛素依赖性降解(
      • Nakamura N.
      泛素化调节精子细胞器的形态发生和功能。
      )和/或蛋白质和核压实的人类去除(
      • Lehti M.S.
      • kotaja n。
      • Sironen A.
      KIF3A对于精子尾部形成和Manchette功能至关重要。
      ,
      • 周J.
      • 杨F.
      • Leu N.A.
      • 王p.j.
      MNS1对于小鼠的精子发生和运动睫状体功能至关重要。
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      • Mendoza-Lujambio I.
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      • Dixkens C.
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      • Hoyer-Fender S.
      • 恩格尔W.
      • Neesen J.
      HOOK1基因在异常精子头形状(AZH)突变小鼠中是非功能性的。
      ,
      • 周J.
      • 杜y.-r.
      • 秦w.-h。
      • 胡y.-g.
      • 黄y.-n.
      • 宝L.
      • 手。
      • Mansouri A.
      • xu g.-l.
      RIM-BP3.是一种对精子发生至关重要的人类相关的蛋白质。
      ,
      • 张Z.
      • 沉X.
      • 芭蕾舞伙伴。
      • Wilkinson B.M.
      • 司法M.J.
      • flickinger c.j.
      • HERR J.C.
      • 埃迪·埃法克
      • 施特劳斯J.F.
      Meig1对小鼠的精子发生至关重要。
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      Katanin P80和Microtubete在雄性配子生产中切断的重要作用。
      )。不太可能,但可能仍然是一个因素,是小管状复合物(
      • 罗素L.D.
      SpermaTiD-Sertoli管骨骨架作为从大鼠后期精子的头部消除细胞质的装置。
      )蛋白质的异质专业化除去(
      • 丹尼斯F.C.
      • 史密斯L.B.
      • muckett p.j.
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      LKB1是哺乳动物睾丸中的美精子释放的精子释放的必要调节因子。
      )。低致密的精子具有更多丰富的蛋白质的发现表明,这些过程中的一个或多个核对的失败,通过该过程减少了核体积。为了验证SWATH分析,我们进行了免疫印迹。选择蛋白质拓扑异构酶2α(TOP2A)和蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3),因为它们显着折叠变化及其在显影精子的细胞核内的潜在重要性。采用高质量和低质量的人精子的核,通过SDS-PAGE提取和分离的蛋白质。转移后,用抗抗体抗体抗纤维素溶液。如图所示,PDIA3蛋白在低质量的精子核内更丰富(Fig. 4A)。可以看出变化的供体间变异。例如,捐助者1(Fig 4A)尽管接近载荷,但似乎具有比捐助者3更少的PDIA3(Fig 4B)。然而,在所有情况下,PDIA3在低质量精子级分的核中始终如一。这符合绘制成常规表达的蛋白质组学数据(Fig. 4C)(注意,与高质量精子细胞相关的负值是因为对中值的归一化)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4在衍生自低质量分数的精子中以大量检测PDIA3。 A,人体精子射精来自个体供体,通过Percoll密度梯度分离出高质量和低质量的级分。然后通过SDS-PAGE裂解从精子中分离的核,并通过SDS-PAGE分离。转移后,将硝酸纤维素用针对PDIA3的一抗探测。在加入马萝卜过氧化物酶共轭二抗后,用化学发光可视化交叉反应带。示出了分子量标记的近似位置。 B,将用于免疫印迹的相同样品的相等尺寸的等分样品加载到SDS页面中,通过银染色来检测运行和总蛋白质。 C) 根据高质量和低质量的精子细胞之间的SWATH分析的PDIA3丰度在后者内显示出明显的丰富度(n = 8, *p < 0.01).
      对PDIA3的完整精子的免疫细胞化学分析显示出染色的巨大变化(Fig. 5A)。该蛋白质被显示为位于包括冗余核封的电池的几个不同面积(Fig. 5A,ii,a),perinuclect theca(Fig. 5A,ii,b)和残留细胞质(Fig. 5B,ii,c)。注意,它是由于这个原因(特别是残留的细胞质染色),即免疫印迹 Fig. 4 是针对孤立的核进行的。我们观察到,在低质量的精子级分中,使用PDIA3比较高质量的精子3的精子阳性。在大多数情况下,染色与精子形态不佳,与PDIA3在低质量细胞中较高的观点一致。然而,鉴于染色模式的变化,我们没有进一步追求这一点。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5PDIA3的免疫细胞化学分析。 固定并沉淀到聚赖氨酸幻灯片上。在用0.2%Triton-x和用3%BSA封闭的渗透性之后,将细胞与初级抗PDIA3抗体孵育,然后仲α荧光-488-缀合的抗体和DAPI染色。 A,(i)Spermatozoa的相位图像,(ii)使用抗PDIA3抗体的免疫荧光图像。在A-冗余的核包膜中可以观察到染色,B-Perinuclectha,C-残余细胞质。 (III)DAPI和PDIA3荧光的精子DNA,(IV)复合图像的DAPI染色。秤栏=5μm. B,对高质量和低质量细胞群之间检测到PDIA3荧光的细胞的比较(n = 3, *p = <0.01).

       顶部2A与低质量的精子头有关

      免疫印迹表明TOP2A(Fig. 6A)在低质量分数内更丰富,这与定量SWATH数据一致(Fig. 6B)。免疫组织化学染色证明TOP2A被定位于冗余核封(Fig. 7A)。冗余核信封包括在精子发育过程中核心后核包膜的多余面具。显示TOP2a与DAPI染色核的接近度(Fig. 7A,iv)。覆盖层演示了TOP2A是精子细胞的核隔室的一部分。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6TOP2A在源自低质量分数的精子中更丰富。 来自个体供体的人精子通过Percoll密度梯度分馏。完整细胞裂解并落入SDS-PAGE。转移后,将硝酸纤维素探测用一抗抗体 A,top2a(上污染)。在加入马萝卜过氧化物酶共轭二抗后,用化学发光可视化交叉反应带。较低的印迹:在记录化学发光后,剥离硝化纤维素的一抗,重新阻断并用抗α管蛋白探测。 B,根据高质量和低质量的精子细胞之间的SWATH分析的TOP2A丰度在后者内显示出明显的丰富(n = 8, *p = 0.0001).
      图缩略图GR7.
      Fig. 7Phematozoa中TOP2A的免疫荧光检测证明蛋白质与无定形头有关。 固定并沉淀到聚赖氨酸幻灯片上。在用0.2%Triton-x和3%BSA封闭的渗透性之后,将细胞与初级抗TOP2A抗体孵育,然后仲α荧光-488-共轭抗体和DAPI归备 A,(i)精子的相位图像,(ii)使用抗TOP2A抗体荧光的免疫荧光图像在精子内,(III)精子DNA的DAPI染色,(IV)DAPI和TOP2A荧光的复合图像。秤栏=10μm. B,对高质量和低质量细胞群之间检测到TOP2A荧光的细胞的比较(n = 3, *p = <0.0001).
      在我们的分析期间,我们注意到一些精子细胞染色2A,而其他细胞没有。为了进一步调查这一点,我们将精子的次数计数为TOP2A阳性的高和低质量的级分,发现在低质量分数中为TOP2A的更多精子阳性差异(Fig. 7B)。
      最后,我们确定了精子的形态,对Top2a染色是阳性的。为了实现这一目标,我们分离出高质量和低质量的精子,然后进行了对两种群体中TOP2A阳性的精子细胞的形态。无论他们的起源都来自潜在权限,我们发现,对于Top2a的绝大多数精子阳性展示了非晶头(Fig. 8)。随着高质量的贫困部分富集形态正常的精子,这种数据解释了为什么TOP2A在较低质量的细胞中更丰富。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8TOP2A与非晶弹性头有关。 来自高质量或低质量的Percoll分馏的细胞染色针对TOP2A的免疫染色。然后在它们的形态方面评估蛋白质阳性的那些细胞。该图表显示了高质量和低质量的精子(n = 3个供体,100个细胞计数/分数)。

      讨论

      男性不孕症是一种日益增长的医疗状况。虽然通过各种辅助生殖技术(ART)提供了解决方案,但有许多缺点。首先,该技术价格昂贵,平均成本/周期达到12-18K左右。其次,没有保证成功。在美国(2015年),464个报告诊所进行了231,936个循环,其中只有60,778次导致活产出生产(26%的成功率)。第三,它非常谨慎,具有最常见的辅助构想形式,即细胞内精子注射(ICSI),涉及雌性的激素刺激,然后是卵母细胞检索。然而对于许多夫妻,很明显,不需要推荐辅助概念(
      • 品牌M.
      • 汉密尔顿C.
      • 德布林J.
      • Nelen W.
      • 克雷梅勒J.
      IVF.对底部队列中持续妊娠率的相对贡献。
      )。尽管有这些担忧,但每年诉诸艺术的夫妻数量增加〜10%,随着公众越来越意识到艺术选项和可用性,将继续增长(
      • Schultz r.m.
      • 威廉姆斯C.J.
      艺术科学。
      )。
      健康从业者面临的问题 体外 施肥诊所相似是需要帮助的人的分类。目前,诊断雄性因子不育症依赖于2个标准。其中的第一个包括未在没有成功的情况下保持不受保护的性交。然而,在尝试的第一年失败的夫妻队的~50%将在第二年内设想,没有任何医疗干预(
      • 鼻子H.
      • 鼻子T.
      • evers J.
      • 柯林斯J.
      未经治疗的底层夫妇中的自发妊娠预后:沃尔彻氏初级保健研究。
      )因此,需要进一步的标准。为此,进行精液分析,将男性患者分类为肥沃或不育,根据世界卫生组织1980年出版的指导方针(
      )。但是,由于在正确预测不孕症中发现的不良差距,修订的值于1987年,1992年,1999年,并于2010年再次发布(
      )。精液分析考虑总精子数量和运动和形态学正常细胞的百分比。在表面上,精液分析将有利于肥沃和不孕症的分类。然而,一些报告表明,精液分析缺乏真正的诊断(
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      精子形态学评估:肥沃和肥沃的严格标准的诊断潜力和比较分析。
      )。
      诊断雄性因子不孕症的替代方法是建立一种蛋白质生物标志物的面板,其表达与精子施肥潜力相关。使用标记面板的优点是能够涵盖比单独的精液分析的“生育能力”的更多方面。例如,随着男性分类为“特发性不孕”,我们已经表明,外致密的光纤1(ODF1)几乎没有它们的精子(
      )。 ODF1是一种伴侣,调节弹性头的连接到尾部。尽管有“正常”精液型材,但缺乏ODF1的精子非常脆弱,随着时间的推移,容易斩首,这可能解释他们的不孕症(
      • Hethington L.
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      外致密纤维1的不足是特发性男性不孕症的标记和潜在驱动器。
      )。感兴趣的是,该目前的报告发现第二个ODF家族成员在低质量细胞的精子核中更加丰富,即ODF2。最初,这种发现令人惊讶,因为ODF2是精心认出的,精子鞭毛的主要蛋白质(
      • 陈J.V.
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      氯苯蛋白在CentroSomes上对Polo样激酶1的适当有丝分子功能的要求。
      )而不是核心。然而,在进一步检查后,我们注意到我们的蛋白质组学平台检测到ODF2-IsoOform 9转录物的独特肽。这种同种型(Q5BF6-7,NP_702910)是睾丸表达的转录物,并且由于替代的起始位点而产生,使蛋白质是独特的N末端。序列的检查证明ODF2-IsoOform 9的N末端具有核定位信号(
      • ba a.n.n.
      • Pogouts A.
      • 荣获N.
      • 摩西上午
      NLSTRADAMUS:一种简单的隐马尔可夫模型,用于核定位信号预测。
      )。实际上,并且在音乐会上,ODF2特异性同种型已经位于精子发生期间的生殖细胞核中(
      • RIVPIN E.
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      • kierszenbaum a.l.
      睾丸外致密纤维2(ODF2)转录物的基因组来源,加工和发育表达及ODF2蛋白的新核磁定位。
      )。
      虽然缺乏ODF1是某些男人的不孕症的生物标志物,但它肯定不适用于所有男人。因此,将需要一组标记来诊断一个男性因子不孕症表型阵列。以前,成熟精子中的PRM1 / 2比的变化通常与差的生殖结果相关(
      • Oliva R.
      protamines和男性不孕症。
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      精子的临床用途蛋白质1 / protamine 2比的临床用途。
      )。在这项研究中,我们发现PRM2或人群之间的检测到的组蛋白肽没有变化( Fig. 3, 补充表S3)。虽然我们的结果最初似乎与以前的发现有所不同,但这些研究往往是肥沃和不孕症的比较。当protamine比率和水平已经是来自同一个体的钙分离的分数,小(
      • 卡斯蒂略J.
      • 西蒙L.
      • de mateo s.
      • 刘易斯S.
      • Oliva R.
      原生和密度梯度离心精子的protamine / DNA比率和DNA损伤来自不孕患者的精子。
      )没有变化(
      • Mengual L.
      • BallescáJ.L.
      • ascaso c.
      • Oliva R.
      从患者和对照组之间的Percoll级分中显着的蛋白质含量和P1 / P2比率的差异。
      )被观察到。 PDIA3和TOP2A都保持了一些承诺,以识别具有差的精子头部形状的样品。 PDIA3先前已经定位在大鼠精子膜上,并且是已知参与几种蛋白质二硫键的伴侣伴侣(
      • Frickel E.-M.
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      ERP57是多功能硫醇二硫化物氧化还原酶。
      )。此列表中包含的是主要的组织代表性复杂类1(MHC)(
      • Antoniou A.n.
      • 福特S.
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      • 奥斯本A.
      • 艾略特T.
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      氧化还原酶ERP57有效地减少了部分折叠优先于完全折叠的MHC I类分子。
      )。虽然体细胞蛋白质,PDIA3的还原酶活性导致MHC蛋白的展开,导致其靶向破坏(
      • Antoniou A.n.
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      氧化还原酶ERP57有效地减少了部分折叠优先于完全折叠的MHC I类分子。
      )。这种作用机制可以解释为什么PDIA3在很大程度上与质量差的精子相关。虽然我们通过PDIA3获得的非常异质的信号,但人精子的染色使得难以进一步研究这种现象。
      TOP2A是通常涉及DNA拓扑的改变的蛋白质。具体地,TOP2A的酶活性导致DNA内的瞬时双链突出。这些临时断裂允许一个DNA链通过另一种,产生或释放扭转应力(
      • Champoux J.J.
      DNA拓扑异构酶:结构,功能和机制。
      )。酶对精子发生非常重要,因为拓扑异构酶活性是成功的减数分裂(
      • COBB J.
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      雄性小鼠减少甲基异构酶I和II的表达及函数分析。
      )。此外,具有临床剂量的依托泊苷(TOP2A抑制剂)的小鼠的长期治疗,导致染色体和精子形态像差(
      • Marchetti F.
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      依托泊苷诱导小鼠精子细胞和干细胞精肽中的染色体异常。
      )。这并不令人惊讶,除了它在精子发生中的作用外,Top2a还参与组蛋白以protamine过渡(
      • COBB J.
      • miyaike m.
      • Kikuchi A.
      • 亨德尔M.A.
      在浓缩铬醇中的减数事件:组蛋白H3磷酸化,拓扑异构酶IIα定位和染色体凝结。
      )。这是兴趣的,与不孕症男性一样,与肥沃的男性相比,Protamine 1和Protamine 2之间的Protamine 1和Protamine 2之间的比例可以不同(
      • Bianchi P.
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      • Bizzaro D.
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      脱氧核糖核酸抗蛋白对小鼠和人成熟精子的荧光染色和原位贴上翻译的影响。
      )。鉴于这种数据,我们的初始假设是TOP2A的表达可能与通过异常组蛋白或预蛋白水平的精子染色质压实。然而,血管和免疫印迹都证明这是不正确的。相反,我们发现在几乎所有病例中,Top2a与差的头部形态相关。
      较差的精子头形态和TOP2A表达的病因之间的关联尚未解释。一个想法是,在精子发生期间,在细胞伸长阶段的末端发生核压实。同时,除去精子功能不需要的蛋白质。几种方法可能影响这一点,包括泛素依赖性降解和/或汉蛋白和核压实的人类去除(
      • Lehti M.S.
      • kotaja n。
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      KIF3A对于精子尾部形成和Manchette功能至关重要。
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      MNS1对于小鼠的精子发生和运动睫状体功能至关重要。
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      HOOK1基因在异常精子头形状(AZH)突变小鼠中是非功能性的。
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      RIM-BP3.是一种对精子发生至关重要的人类相关的蛋白质。
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      Meig1对小鼠的精子发生至关重要。
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      • stratton c.j.
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      • yanagimachi r.
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      Katanin P80和Microtubete在雄性配子生产中切断的重要作用。
      )。关于前者,我们实验室的先前工作在高质量和低质量的精子细胞(未显示的数据)之间标记的抗泛素抗体标记的蛋白质没有差异。因此,缺乏证据来支持这个想法。然而,许多遗传淘汰模型建议人类形成核压实和暗示,核蛋白质去除是至关重要的。例子包括 KIF3A (
      • Lehti M.S.
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      KIF3A对于精子尾部形成和Manchette功能至关重要。
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      MNS1对于小鼠的精子发生和运动睫状体功能至关重要。
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      ),Meig1(
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      Meig1对小鼠的精子发生至关重要。
      ) SPEM1 (
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      • yanagimachi r.
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      缺乏SPEM1导致异常的细胞质去除,精子变形和男性不育症。
      )和katanin p80(
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      Katanin P80和Microtubete在雄性配子生产中切断的重要作用。
      )。 Manchette是一种类似的裙子结构,可在伸长的弹性头周围形成(
      • kierszenbaum a.l.
      • RIVPIN E.
      • tres l.l.
      精子头部成型的分子生物学。
      )。当马氏横向向鞭毛横向移动时,它不仅塑造细胞,而且有助于紧凑核(
      • kierszenbaum a.l.
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      )。因此,随着低质量的细胞含有更丰富的核蛋白,我们推测这种发现与贫困的人类形成有关。不幸的是,这种模型将难以使用人类睾丸部分进行测试,因为一个不能在睾丸发育阶段的高低精度质量之间进行区分。
      总之,我们发现核蛋白质的保留是质量劣质精子的标志,如这里所定义的。此外,TOP2A与无定形精子头高度相关,因此是临床实践中的男性因子不孕的潜在新生物标志物。

      数据可用性

      所有原始MS文件(DDA和SWATH)以及生成的库(包含注释光谱)都可以在Proteomexchange联盟上(http://proteomecentral.proteomexchange.org)(PXD014210)通过带有数据集标识符MSV000083954的大规模伙伴存储库。处理数据可用 补充表S3.

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