整合性代谢途径彩易福彩揭示了骨关节炎的新型治疗靶标*

  • Beatriz Rocha.
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    Grupo deInvestigacióndeRuumatología(GIR),Unidad deProteómica,愚蠢 - Complejo Headyario Universitario de ACoruña,Sergas,Sergas,De ACoruña,Coruña,西班牙。
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  • Berta Cillero-vertor
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    Maastricht多峰分子成像研究所(M4I),Maastricht大学成像群,Maastricht大学,荷兰
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  • Gert Eijkel.
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    Maastricht多峰分子成像研究所(M4I),Maastricht大学成像群,Maastricht大学,荷兰
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  • 瓦伦蒂娜坎米亚
    一致
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    Grupo deInvestigacióndeRuumatología(GIR),Unidad deProteómica,愚蠢 - Complejo Headyario Universitario de ACoruña,Sergas,Sergas,De ACoruña,Coruña,西班牙。
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  • Patricia Fernandez-Puente
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    Grupo deInvestigaciónderumatología,incib-complejo hosephyario大学大学德·塞尔吉纳,塞尔科,AgrupaciónCica-in-Inibic,Univeryidad deAcoruña,Coruña,西班牙
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  • 马丁·罗克斯
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    Maastricht多峰分子成像研究所(M4I),Maastricht大学成像群,Maastricht大学,荷兰
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  • Cristina Ruiz-Romero
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    Grupo deInvestigacióndeRuumatología(GIR),Unidad deProteómica,愚蠢 - Complejo Headyario Universitario de ACoruña,Sergas,Sergas,De ACoruña,Coruña,西班牙。
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  • ron m.a. heeren.
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    Maastricht多峰分子成像研究所(M4I),Maastricht大学成像群,Maastricht大学,荷兰
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  • 弗朗西斯科J.Blanco
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    Grupo deInvestigacióndeRuumatología,incib-complejo hosephyario大学大学大学,塞尔库纳,Sergas,Deparamento de Medicina Universidad de ACoruña,Coruña,西班牙
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  • 作者脚注
    *这项工作由FondoInvestigaciónSanitaria-Spain提供资金(授权号码PI14 / 01707,PI16 / 02124,PI17 / 00404,DTS17 / 00200,CIBER-CB06 / 01/0040和RETIC-RIER-RD12 / 0009/0018), 2013-2016的国家科学计划开发和技术创新计划的一部分,由ISCIII-General的评估和促进研究 - 欧洲区域发展基金(联邦联邦)的“一种制造欧洲的方式”资助。 GIR的蛋白质组学单位属于PRB2-ISCIII(Grant Number Pt17 / 0019/0014)。 B.R.由徐达德加利亚(IN606B-2016/004)提供支持。该研究部分在M4I研究计划内进行,由荷兰省林堡省的经济支持,作为“链接”计划的一部分。提交人声明他们没有对本文内容的利益冲突。
    本文含有补充材料。
      在骨关节炎(OA)中,软骨再生的损伤可能与间充质基质细胞(MSCs)的有缺陷的软骨内分化有关。因此,了解MSC的软骨发生期间的蛋白质组学和代谢组相关的分子事件,可以为治疗干预提供替代靶标。这里,基于氧化硅酸的蛋白质组学彩易福彩确定了43种蛋白质,其与代谢途径有关,其丰度在OA人骨髓MSCs(HBMSCs)的软骨发生过程中显着改变。然后,通过基质辅助激光解吸/电离质谱成像(MALDI-MSI)在这些细胞中彩易福彩代谢物的水平和分布,并进行健康对照,导致在分化的早期阶段识别特征代谢物谱。最后,整合途径彩易福彩表明,与健康细胞相比,在软骨发生期间在OA HBMSCS中下调了UDP-葡萄糖酸合成和氨基糖代谢。这些代谢途径中的改变可能干扰透明质酸(HA)和其他相关软骨细胞外基质(ECM)组分的生产。这项工作提供了一种新的综合洞察力洞察骨关节炎MSCs的分子改变,通过增强软骨发生,可以通过增强软骨发生。

      图形概要

      关节软骨是一种带有有限的修复能力的结缔组织,可归因于其缺血性质和低有丝分裂细胞活性。由于其损伤后的愈合反应差,因此对骨关节炎(OA)感到高敏感
      使用的缩写是:
      OA.
      骨关节炎
      agg.
      agrecan.
      CH. 6S
      软骨素-6-硫酸盐
      COL1A1
      胶原醛alpha-1(i)链
      COL2A1
      胶原素alpha-1(ii)链
      COL10A1
      胶原醛alpha-1(x)链
      判别彩易福彩
      DMoads.
      疾病改性骨关节炎药物
      ECM.
      细胞外基质
      噱头
      糖酰胺聚糖
      透明质酸
      HBMSCS.
      人骨髓间充质基质细胞
      IHC.
      免疫组织化学
      ks.
      硫酸角瘤
      MSI
      质谱成像
      PCA.
      主要成分彩易福彩
      PGS.
      蛋白质成像素
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      UGDH.
      UDP-葡萄糖6-脱氢酶
      UGP2
      UTP-葡萄糖-1-磷酸尿素转移酶。
      1使用的缩写是: OA.
      骨关节炎
      agg.
      agrecan.
      CH. 6S
      软骨素-6-硫酸盐
      COL1A1
      胶原醛alpha-1(i)链
      COL2A1
      胶原素alpha-1(ii)链
      COL10A1
      胶原醛alpha-1(x)链
      判别彩易福彩
      DMoads.
      疾病改性骨关节炎药物
      ECM.
      细胞外基质
      噱头
      糖酰胺聚糖
      透明质酸
      HBMSCS.
      人骨髓间充质基质细胞
      IHC.
      免疫组织化学
      ks.
      硫酸角瘤
      MSI
      质谱成像
      PCA.
      主要成分彩易福彩
      PGS.
      蛋白质成像素
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      UGDH.
      UDP-葡萄糖6-脱氢酶
      UGP2
      UTP-葡萄糖-1-磷酸尿素转移酶。
      (
      • oldershaw r.a.
      细胞来源用于调节关节软骨:过去,地平线和未来。
      )。 OA目前被认为是涉及所有关节组织的病理变化的异质疾病,包括软骨,滑动,潜力骨,弯月面和韧带(
      • Poole A.R.
      骨关节炎作为整个关节疾病。
      )。健康和OA关节组织含有间充质基质细胞(MSCs),具有可能参与OA中的软骨病变修复的软骨性容量(
      • Alsalameh S.
      • amin R.
      • Gemba T.
      • Lotz M.
      正常和骨关节炎人关节软骨中间充质祖细胞的鉴定。
      ,
      • Hermida-gómezT.
      • Fuentes-Boquete I.
      • gimeno-longas m.j.
      • muiños-lópeze.
      • Díaz-Prado S.
      • de toro f.j.
      • Blanco F.J.
      在健康和骨关节炎滑膜中表达间充质干细胞标志物的细胞的定量。
      )。因此,与健康相比,从半月板损伤和早期OA获得的关节组织在MSC中富集(
      • Sekiya I.
      • Ojima M.
      • Suzuki S.
      • yamaga m.
      • 堀江米
      • Koga H.
      • Tsuji K.
      • Miyaguchi K.
      • Ogishima S.
      • Tanaka H.
      • Muneta T.
      人的间充质干细胞在滑膜液中膝关节增加,具有退化软骨和骨关节炎。
      ,
      • Matsukura Y.
      • Muneta T.
      • Tsuji K.
      • Koga H.
      • Sekiya I.
      弯月面损伤后滑液中的间充质干细胞增加。
      )。这些发现表明关节软骨再生的失败可能不是MSC供应中的限制的结果,但可能与恢复健康软骨稳态的尝试期间MSCs的有缺陷性化软化物分化有关。能够刺激关节中MSCs的软弱性能力的药物代表了开发软骨保护治疗或疾病改性骨关节炎药物(DMoads)的有吸引力的方法(
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      疾病改性骨关节炎药物的新靶点:软骨发生和润荷。
      )。在这方面,最近已经显示在手术诱导的OA大鼠模型中,即直接施用在关节空间中的特定小分子,能够通过WNT信号通路调节抑制关节破坏,因此是潜在疾病改性的候选者OA治疗(
      • Deshmukh V.
      • 胡H.
      • Barroga C.
      • 博塞拉德C.
      • KC S.
      • 巨大的
      • 斯图尔特J.
      • Chiu K.
      • Ibanez M.
      • Pedraza M.
      • SEO T.
      • 做L.
      • 町S.
      • Cahiwat J.
      • 谭b。
      • Tambiah J.r.S.
      • 兜帽J.
      • 车道n.E.
      • Yazici Y.
      WNT途径的小分子抑制剂(SM04690)作为治疗膝关节骨关节炎的潜在疾病改性剂。
      )。因此,阐明了治疗MSCs的软骨形成分化的机制可导致鉴定可用作替代DMoads发育的靶标的新型分子标记。
      已应用蛋白质组学方法来增加从不同组织获得的MSCs的分化过程的知识增加(
      • jeony.j.
      • kim J.
      • 町J.H.
      • 钟下飞
      • Chae J.I.
      骨髓,胎盘和脂肪组织的人间充质干细胞作为细胞疗法来源的对比彩易福彩。
      )。例如,最近对秘密和蛋白质组特征进行了无标签的相对量化策略,对接受软骨发生的HBMSCs(
      • Henrionnet C.
      • 吉拉特P.
      • 毛派D.
      • Vincourt J.B.
      • Pinzano A.
      无标记的蛋白质的可标记相对定量作为软骨修复生物工程替代品中软骨发生质量控制的非侵入性方法。
      ,
      • Peffers M.J.
      • 柯林斯J.
      • Loughlin J.
      • Proctor C.
      • CLEGG P.D.
      衰老间充质干细胞软骨,成骨和胎生物构建体的蛋白质组学彩易福彩。
      )。然而,与基于稳定同位素标记的蛋白质量化相比,无标记的蛋白质组学方法对蛋白质量化的较低,更精确,并且较少可再现,例如稳定同位素标记,例如通过细胞培养物(Silac)中的氨基酸(
      • Collier T.S.
      • Sarkar P.
      • Franck W.L.
      • 饶光。
      • Dean R.A.
      • Muddiman D.C.
      细胞培养氨基酸稳定同位素标记的直接比较及定量蛋白质组学的光谱计数。
      ,
      • 李Z.
      • 亚当斯里..
      • Chourey K.
      • 赫斯特G.B.
      • Hettich R.L.
      • 锅C.
      无标签,代谢标记和在LTQ Orbitrap Velos上定量蛋白质组学的无标记化学品标记的系统性比较。
      )。后者是最精确的定量质谱(MS)方法之一,因为差异标记的样品在实验工作流程中很早组合,这最小化了样品处理过程中的误差(
      • Bantscheff M.
      • Schirle M.
      • 甜蜜曼G.
      • 瑞克J.
      • Kuster B.
      蛋白质组学中的定量质谱:批判性综述。
      ,
      • 陈X.
      • 魏S.
      • 姬y。
      • 郭X.
      • 杨F.
      使用SILAC的定量蛋白质组学:原则,应用和发展。
      ,
      • 苏明。
      • 陈J.X.
      • Selbach M.
      氧化铝飞允许体内准确蛋白质定量。
      )。因此,我们以前基于Silac应用了定量蛋白质组学,从健康供体中获得的HBMSCs的软骨间分化期间评估细胞内蛋白质谱的调节(
      • Rocha B.
      • Calamia V.
      • Mateos J.
      • Fernández-puente p.
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      人骨髓间充质干细胞的代谢标记,用于定量彩易福彩其软骨形成分化。
      )。
      除了蛋白质表达外,代谢途径改变也与软骨发生的调节有关。最近据报道糖酵解,线粒体呼吸和尿酸途径涉及腺嘌呤三磷酸(ATP)振荡,其在预充电凝结中起重要作用(
      • kwon h.j.
      • ohmiya y。
      软骨发生中ATP振荡期间代谢产物差异变化的代谢组分彩易福彩。
      )。其他研究还发现了在使用藻酸盐珠粒中的3D培养的HBMSCs的软骨间分化过程中脂肪酸合成和氨基酸产生的变化 1H核磁共振光谱(
      • jang m.y。
      • 春S.I.
      • MUN C.W.
      • 洪库斯。
      • Shin J.W.
      用质子(1H)核磁共振光谱法作为3D培养人间充质干细胞软骨分化生物标志物的代谢物变化的评价。
      )。因此,在软骨发生过程中对代谢变化的全局彩易福彩也可能提供有关该过程的分子机制和潜在标志物的重要信息。
      因此,我们之前通过基质辅助激光解吸/电离质谱成像(MALDI-MSI)不同的脂质物种在从接受软骨发生的HBMSCs(
      • Rocha B.
      • Cillero-牧师B.
      • Eijkel G.
      • Bruinen A.L.
      • Ruiz-Romero C.
      • 赫尔滕下午
      • Blanco F.J.
      用质谱成像表征软质分化的脂质标志物。
      )。虽然我们的前面的研究在健康环境中提供了关于软骨发生的重要见解,但OA患者HBMSCs的蛋白质组学和代谢组彩易福彩将在病理条件下提高我们对软骨形成过程的理解。这有助于确定治疗干预的新分子机制和靶标。在此,我们在软骨形成模型中评估了OA HBMSCs的特征蛋白质组学和代谢组变化。使用Silac-MS,我们发现从OA患者获得的HBMSCs的软骨发生期间43种蛋白质中的统计学上显着的改变。 MALDI-MSI研究的代谢变化彩易福彩揭示了分化早期和后期之后的OA和健康HBMSCs的显着差异,特别暗示了OA中的改变的戊糖/葡糖野途径。这种知识可能是发展未来疗法的工具。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      在本工作中进行的每个蛋白质组学和MALDI-MSI实验的实验设计和统计学理由将在每个子部分中详细描述。蛋白质组学研究的发现阶段对三种不同的OA生物样品进行,没有技术复制。 MALDI-MSI彩易福彩在三次控制和五种不同的OA样本上进行,每个条件有两种技术复制。

       人骨髓标本

      从OA患者的股骨头那样获得骨髓样品作为小梁骨活组织检查标本(n = 13)经历髋关节替代手术,捐赠者没有关节疾病的历史(控制, n = 11)。所有组织样本都是由组织库和尸检服务在医院德·哥尔鲁尼亚大学提供。 oa患者在美国风湿病学院确定的标准之后诊断出来(
      • altman r.
      • asch E.
      • Bloch D.
      • 博尔G.
      • Borenstein D.
      • Brandt K.
      • 克里斯蒂W.
      • Cooke T.D.
      • Greenwald R.
      • Hochberg M.
      开发骨关节炎分类和报告的标准。膝关节骨关节炎的分类。美国风湿病协会的诊断与治疗标准委员会。
      )。在手术前从患者获得知情同意。该研究得到了当地伦理委员会(西班牙加利西亚)的批准。患者数据收集包括人口统计和临床特征(年龄,体重,体重指数等) 补充表S1.

       细胞标记和软弱化分化

      将HBMSCS被隔离并如前所述标记(
      • Rocha B.
      • Calamia V.
      • Casas V.
      • Carrascal M.
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      人间充质干细胞经历脑内间充质分分的疏肠彩易福彩。
      )。首先基于其对CD34和CD45的消极性以及CD73,CD90,CD105和CD166的阳性来表征HBMSCs,流式细胞术及其对软骨,骨和脂肪组织的分化潜力(
      • Cicione C.
      • Díaz-Prado S.
      • muiños-lópeze.
      • Hermida-gómezT.
      • Blanco F.J.
      人骨髓间充质干细胞的分子曲线和细胞表征:供体对软骨发生的影响。
      ,
      • Cicione C.
      • muiños-lópeze.
      • Hermida-gómezT.
      • Fuentes-Boquete I.
      • Díaz-Prado S.
      • Blanco F.J.
      严重缺氧对骨髓间充质干细胞分化电位的影响。
      )。简而言之,5×104 细胞在Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM)4.5g / l葡萄糖中缺少精氨酸和赖氨酸,补充有10%透析的FBS,2米m l谷氨酰胺和抗生素,含有28 mg / L. l-Arginine-HCL-13C615N4 (arg10)和146 mg / l l-LYSINE-HCL-13C6 (LYS6)或标准表格 l-Arginine HCL-12C614N4l-LYSINE-HCL-12C6 (lys0)(来自米德斯,德国的Silantes)。每周转移细胞直至实现100%标记。在使用Celltiter 96-an含有非放射性细胞增殖测定(Promega,Madison,Wisconsin)试剂盒中补充有不同同位素的氧化培养基中的细胞活力和正常生长速率。
      然后用含有10ng / ml TGF-β的软骨分子分化培养基在3D高密度颗粒质量培养物或微粉型中培养硅酸盐标记的细胞群。3 14天。 micromass. 体外 用于将干细胞分化引入软骨内谱系的培养系统已被广泛地立体化,并在我们的实验室中表征,在我们的实验条件下维持细胞活力和细胞外基质组分的合成(
      • Cicione C.
      • Díaz-Prado S.
      • muiños-lópeze.
      • Hermida-gómezT.
      • Blanco F.J.
      人骨髓间充质干细胞的分子曲线和细胞表征:供体对软骨发生的影响。
      ,
      • Cicione C.
      • muiños-lópeze.
      • Hermida-gómezT.
      • Fuentes-Boquete I.
      • Díaz-Prado S.
      • Blanco F.J.
      严重缺氧对骨髓间充质干细胞分化电位的影响。
      ,
      • Cicione C.
      • muiños-lópeze.
      • Hermida-gómezT.
      • Fuentes-Boquete I.
      • Díaz-Prado S.
      • Blanco F.J.
      诱导软骨性分化的替代方案:转化生长因子-β超家族。
      )。
      在培养2天和14天后收集微粉粉并在-80℃下储存直至进一步彩易福彩。在蛋白质组学彩易福彩中使用的HBMSCs从三个OA患者的股骨头获得。对于MALDI-成像实验,微粉化在37℃下嵌入10%明胶中,并立即在-80℃下冷冻。对于这些成像实验,包括来自五个另外的OA患者的样品和三个没有关节疾病病史的人。另外,基因表达测定使用OA和从独立实验,5和八个控制HBMSCs进行。

       细胞分化的免疫组织化学彩易福彩

      对于软骨发生评估,Micromass颗粒在OCT嵌入基质(BDH化学物质,普尔,英国)中冷冻,并用冷静电(Leica Microsystems,Barcelona,SP)切割4μm,用于免疫组化评价。将切片用针对聚集体的单克隆抗体(1:100,Abcam,UK),软骨素-6-硫酸盐(1:500,亚琛GmbH,德国),硫酸克拉甘酸盐(1:100,Santa Cruz生物技术),II型(1:200,ABCAM),I型(1:1000,ABCAM)和X型胶原蛋白(Sigma Aldrich,St.Louis,Mo)。过氧化物酶/ DAB化学物质 TM值 DAKO EnVision TM值 使用检测套件(Dako,巴塞罗那,西班牙)。用血清瓦米液染色,并用Eukitt树脂安装。使用imagej软件(NIH,Bethesda,MD)测量每个inmunohistochemical测定的正常性阳性的百分比。为每个供体选择三个代表性图像(控制, n = 5和OA, n = 4)并用于相对量化。

       MALDI-MSI的样品制备

      使用低温恒温器(10μm),将安装在氧化铟锡(ITO)上,高导电载玻片(Delta Technologies,Stillewater,Mn)上获得并储存在-80℃直至进一步彩易福彩。在基质施用之前,将载玻片放入室温下在真空干燥器中,并筛选20分钟。制备溶解在70%乙醇中的10mg / ml的9-氨基吖啶(9-AA)(9-AA)(Sigma-Aldrich,Zwijndrecht,荷兰)的基质溶液。然后使用HTX TM喷雾器(HTX Technologies,LLC,北卡罗来纳州)将基质沉积在组织截面上。首先用基质溶液冲洗喷雾器(5mL)的完整环,然后施加到样品表面。泵的基质流速为120μL/ min,将空气压力设定为10psi,选择85℃的嵌段温度。喷涂装置的阶段以1200mm / min的速度移动,并且喷嘴与玻璃载玻片之间的距离设定为40mm。在每次通过之间的30秒施加四层基质,以实现均匀的基质覆盖。另外,喷雾图案的角度为90°,并用3mm的线间距调节。

       蛋白质提取和凝胶消化

      使用混合物米勒和含有6的裂解缓冲液的组合从微粉粉中萃取蛋白质 m 尿素,2 m 硫脲,4%的乳酪,30米m TRIS基础,如前所述(
      • Rocha B.
      • Calamia V.
      • Mateos J.
      • Fernández-puente p.
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      人骨髓间充质干细胞的代谢标记,用于定量彩易福彩其软骨形成分化。
      )。使用Bradford测定(Sigma)测定总蛋白质浓度。重(第14天的Micromass)和光(第2天的微粉粉),然后根据测量的蛋白质浓度将样品混合在1:1的比例中,并将15μg的每个混合样品分解到10%SDS-PAGE上。凝胶用Coomassie蓝色染色,切除10个凝胶带。用50%乙腈(ACN)在25米中洗涤凝胶块m 碳酸氢铵溶液直至完全抵抗。然后用10米减少样品m 二硫醇在56℃下30分钟,并用54米烷基化m 在黑暗中碘乙酰胺10分钟。在37℃下用6.66ng /μl测序级改性胰蛋白酶(Promega)进行消化过夜。向肽混合物中加入三氟乙酸(TFA)(最终浓度1%)以停止酶促反应。然后用50%ACN / 0.1%TFA从凝胶块中萃取肽。提取的肽混合物脱盐并浓缩,采用螺母(甘露糖,核苷酸,MD),在SpeedVac中干燥并储存在-80℃直至LC-MS / MS彩易福彩。

       质谱彩易福彩

      通过将捕获柱加入C18二氧化硅基柱中的纳米系统(Tempo,Eksigent,Dublin,Ca)中使用倒进的相色谱分离肽级分,通过将捕获柱加载到C18二氧化硅的柱中(IntegryAfit C18,Proteopopepl II,75μm,10.2cm,5 μm,300Å,新目标,woburn,ma)。在120分钟的线性梯度(移动相B:0.1%TFA 80%ACN)中以350ng / min的流速洗脱肽,与α-氰基-4-羟基氨基酸基质混合( 3mg / ml以1.2μl/ min的流速,使用自动观察者(Suncollect,Sunchrome,Friedrichsdorf,Germany)沉积在Maldi板上。
      数据采集​​采用4800 Maldi-TOF / TOF仪器(AB SCIEX,Foster City,CA),具有200 Hz重复率(ND / YAG激光)。 MS全扫描光谱从800到4000 m/z 使用1500激光射击和3800kV的激光强度获得含有含肽的LC斑点的每种肽的LC斑点。在筛选MS正反射器模式中的所有LC-MALDI样品位置后,在1kV的碰撞能量下进行自动选择的前体的破碎,具有碰撞诱导的解离(CID)气体(空气)。选择最多12个具有上述信号/噪声比(S / N)的每个点位置的最强烈离子信号作为串联质谱(MS / MS)彩易福彩的前体,不包括常见的胰蛋白酶自水解峰和基质峰。 MS / MS的镜头数量为1800,激光强度设定为4700 kV。执行第二MS / MS,排除在先前的MS / MS中选择的前体。 s / n的前兆 >选择30以鉴定在第一MS / MS彩易福彩中未鉴定的蛋白质。

       蛋白质组学数据彩易福彩

      在没有技术复制的情况下对三种不同的OA生物重复进行蛋白质组学数据彩易福彩。使用4000系列资源管理器v.3.7获取数据。使用ProteinPilot™软件V.4.0(AB SCIEX)进行蛋白质鉴定和定量。在Uniprot / Swissprot数据库中搜索每个MS / MS频谱(UNIPROT 2015_05序列版本,其中包含547,599序列和195,014,757个残留物,使用Paragon算法使用分类法抑制_ Homo SAPIens。使用以下蛋白质单滴搜索参数:样品型设定为氧化硅(Lys +6,Arg + 10),甲硫氨酸残基的氧化为可变改性,碘乙胺残留物的碘化物残留为固定改性,并且最多允许胰蛋白酶的错过裂缝。蛋白质产品还计算了一个置信度百分比,未使用的分数,这反映了击中的概率是假阳性的。数据也被标准化以通过偏压校正加载误差。针对包含前进和反转序列的连接数据库允许保存为1%的错误发现速率。常见的污染物如胰蛋白酶自分解峰和基质离子信号被排除在彩易福彩之外。使用Paragon算法搜索使用的相同公差匹配理论离子和峰值。用于匹配的公差是基于有关在Paragon方法对话框中选择的仪器的质量准确性的信息。我们认为只有那些改变的统计学意义 p 价值 <从第2天到第14天的表达式的0.05和±20%。使用Uniprot数据库进行致致浓缩的调制蛋白的富集彩易福彩。

       MALDI-FT-ICR-MSI实验

      喷涂的组织切片被光学扫描并进口到Fleximaging 4.1软件(Bruker Daltonik GmbH,Bremen,Germany)以定义要成像的样本区域。然后使用配备有SmartBeam II ND:YAG激光器的Bruker 9.4 T Solarix FT-ICR质谱仪进行彩易福彩组织切片。彩易福彩来自每个供体的样品。重复彩易福彩。使用质量/充电之间的红色磷(Sigma)的溶液进行仪器外部校准(m/z)50-1000 DA在MALDI-FT-ICR-MSI彩易福彩之前。在线校准的彩易福彩参数如下:模式,线性;阈值(ABS),1×105;大众耐受,10 ppm;参考群众 m/z 193.07602(9-AA), m/z 346.05471(AMP), m / z. 426.02104(ADP)和 m/z 505.98737(ATP)。使用FlexControl软件以30μm的空间分辨率获取数据。每个质谱在由负电离模式中的100万个激光镜头的单次扫描中获得,在质量范围内 m/z 100-1000DA,激光功率为22%,频率为2000 Hz。使用Fleximaging 4.1软件(Bruker Daltonik GmbH)生成差异表达代谢物的MALDI-MSI图像。还使用±0.001Da的质量窗口获得这些图像,并使用根部平方(RMS)标准化。在MSI彩易福彩之后,将载玻片漂洗在70%乙醇中以除去基质。然后,随后用苏木精和曙红染色载玻片(H.&e)。使用Mirax Desk扫描仪(Zeiss,Gottingen,Germany)获取所有染色组织切片的光学图像,以在空间上与组织学分布相同。

       MALDI-FT-ICR-MSI数据的多变量统计彩易福彩

      主要成分彩易福彩(PCA)和判别彩易福彩(DA)寻找在第2天和第14天收集的样本之间的光谱相似性和差异,使用内部建造的化疗2014A(Mathworks,Natick,MA) )。 MS原始数据首先转换为MATLAB格式。然后,组合从所有OA和控制供体的两个时间点的MSI实验中产生的所有光谱都在PCA之前结合和峰值摘。使用内部内置的PEAPI软件执行峰值拣选,以将数据设置为尺寸,以实现所需的计算方法(
      • Eijkel G.B.
      • Kaletas B.
      • van der Wiel I.M.
      • 克罗斯省。
      • luinder下午
      • heeren r.m.a.
      与生物组织表面的MALDI和SIMS成像质谱数据集相关联。
      )。用作DA输入的主要组件的数量限制为总数谱的四分之一,以防止DA模型过度接收。 PCA-DA独立应用于生物学和技术复制,以评估捐赠者之间的再现性。数据彩易福彩后, m/z 选择值以进一步识别。代谢物与DF1分数载荷>±5根据PCA-DA彩易福彩,以及 p 价值 <Mann-Whitney测试0.05被认为是显着改变的。

       通过串联质谱法识别代谢物鉴定

      使用CID在离子阱质量彩易福彩器中使用CID在来自MALDI-LTQ-ORBITRAP ELITE质谱仪中的CID进行串联质谱(MS / MS)在使用38的碰撞能量和0.7Da的隔离宽度的微粉部分上直接在Micromass部分上进行。使用Xcalibur Software 2.3.26(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)彩易福彩数据。与代谢产物和脂质数据库(例如人代谢数据库(HMDB)相比,标识基于前体质量和MS / MS彩易福彩的高质量准确度和MS / MS彩易福彩。 http://www.hmdb.ca (
      • Wishart D.S.
      • 珠宝T.
      • GUO A.C.
      • 威尔逊M.
      • 诺克斯C.
      • 刘Y.
      • Djoumbou Y.
      • Mandal R.
      • Aziat F.
      • 董娥。
      • Bouatra S.
      • Sinelnikov I.
      • ARNDT D.
      • 夏J.
      • 刘P.
      • yallou f.
      • Bjorndahl T.
      • Perez-Pineiro R.
      • Eisner R.
      • 艾伦F.
      • Neveu V.
      • GRINER R.
      • Scalbert A.
      HMDB 3.0- 2013年的人类代谢数据库。
      ),梅林(http://metlin.scripps.edu )(
      • 史密斯C.A.
      • O'Maille G.
      • 想要e.j.
      • 秦币
      • Trauger S.A.
      • Brandon T.R.
      • Custodio D.E.
      • Abagyan R.
      • Siuzdak G.
      Metlin:代谢物质谱数据库。
      )和lipidmaps(www.lipidmaps.org. )(
      • Fahy E.
      • 苏克斯
      • COTTER D.
      • Subramaniam S.
      Lipid地图在线工具进行脂质研究。
      )。对于分配,选择5 ppm质量准确度作为公差窗口。如果数据库中不可用MS / MS光谱或与预期理论光谱不匹配,则对HMBD,Metin或LipidMaps中的前体质量匹配的代谢物被进行手动解释,以试图将实验MS / MS光谱与预期的片段匹配结构。概述了代谢物分配,具有相应的质量误差和MS / MS结构验证,总结在 补充表S2。作为一个例子,我们分配了峰值 m/z 540.0474 to the [M-H2 哦] 基于精确质量差(1.1ppm)和碰撞诱导离子解离后的MS / MS谱的解释,离子腺嘌呤二磷酸(ADP) - 脂肪 m/z 540.0533 (补充图。S1 )。

       富集,途径和整合代谢彩易福彩

      来自OA的比较彩易福彩的差异表达的代谢物 相对 控制和第2天 相对 使用MetaboAnalyst软件4.0进一步进行第14天进行富集和途径彩易福彩(
      • 冲J.
      • Soufan O.
      • 李C.
      • Caraus I.
      • 李S.
      • Bourque G.
      • Wishart D.S.
      • 夏J.
      MetaboAnalyst 4.0:朝着更透明和整合的代谢组科彩易福彩。
      )。途径彩易福彩结合了从富集和拓扑彩易福彩中获得的结果,以可视化所研究条件中涉及的最相关的代谢过程。 MetaboAnalyst基于不同的数据库,包括基因和基因组的京都百科全书(Kegg)(
      • Kanehisa M.
      • goto s.
      • 佐藤Y.
      • 川西米
      • Furumichi M.
      • Tanabe M.
      数据,信息,知识和原则:返回GEGG的新陈代谢。
      ),小分子途径数据库(SMPD)(
      • 珠宝T.
      • 苏y.
      • f
      • 梁Y.
      • 诺克斯C.
      • Maciejewski A.
      • Poelzer J.
      • Huynh J.
      • 周Y.
      • ARNDT D.
      • Djoumbou Y.
      • 刘Y.
      • 邓兰
      • GUO A.C.
      • 汉B.
      • PON A.
      • 威尔逊M.
      • rafatnia s.
      • 刘P.
      • Wishart D.S.
      SMPDB 2.0:对小分子路径数据库的大改善。
      )和HMBD用于鉴定相关的代谢途径。最后,我们进行了组合代谢组和蛋白表达研究的综合彩易福彩。在该彩易福彩中,代谢物和基因/蛋白均被映射到Kegg代谢途径,以进行过度表示彩易福彩(ORA)和拓扑彩易福彩。拓扑彩易福彩使用给定途径的结构来评估匹配的蛋白质/代谢物的相对重要性,基于其相对位置。用于ORA和拓扑彩易福彩的算法分别是高度测量测试和之间的中心性。途径意义由富集彩易福彩确定,影响值基于拓扑彩易福彩。途径被认为是显着的 p 从富集彩易福彩计算的值≤0.05。

       RNA提取和定量实时PCR测定

      根据制造商的说明,使用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad)分离总RNA。在RNA提取后,根据制造商的说明,使用Superscript TM VILO TM cDNA合成试剂盒逆转1μgRNA逆转录成互补DNA(cDNA),并通过定量实时PCR(QRT-PCR)彩易福彩。反应在96孔板中进行,用塔克曼通用主混合(应用生物系统,福斯特城,加利福尼亚州),在96孔板中进行重复。使用来自Roche网站的Universal Probe文库工具设计了UTP-葡萄糖-1-尿嘧啶丙烯酶(UGP2),UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)和核糖体蛋白L13A(RPL13A)的引物。使用QBase +软件(Biogazelle,Gent,Belgium)彩易福彩数据。基因表达被标准化为管家基因RPL13A(在发生稳定性稳定性稳定性稳定性稳定性彩易福彩后选择),并且相对于第2天的X倍变化表示为序列引物,探针和PCR条件 补充表S3.

       统计彩易福彩

      A p 价值 <0.05被认为是统计上显着的,统计测试是双面的。使用GraphPad Prism Software 7.0彩易福彩数据。并在图中呈现为平均值±s.e.平均(SEM)。两组比较(第2天 相对 第14天)使用Mann-Whitney测试进行,具有显着的值,如下所示:*p 价值 <0.05, **p 价值 <0.01, ***p 价值 <0.001,N.S.不重要。

      结果

       软弱化分化的对照和OA HBMSCs的特征

      衍生自正常个体和OA患者的HBMSCs在软骨间分化培养基中造粒并培养14天。为了确认HBMSCs的软骨诱导,使用免疫组化彩易福彩评估众所周知的软骨细胞标志物。符合以前的研究(
      • Rocha B.
      • Calamia V.
      • Mateos J.
      • Fernández-puente p.
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      人骨髓间充质干细胞的代谢标记,用于定量彩易福彩其软骨形成分化。
      ,
      • Rocha B.
      • Calamia V.
      • Casas V.
      • Carrascal M.
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      人间充质干细胞经历脑内间充质分分的疏肠彩易福彩。
      )我们观察到骨髓(agg),软骨素-6-硫酸盐的上调(CH6S)和角膜硫酸盐(KS)在第2天的第14天受到脑菌因子的影响,这些差异有统计学意义(*p 价值 <0.05(agg和ks); ***p 价值 <0.001 (CH6S)),证明我们在我们的培养条件下的正常HBMSCs的软化性分化( Fig. 1A1C)。 OA HBMSCs还显示出统计上显着的较高表达水平的CH6S和Ks在肺泡的第14天(*p 价值 <0.05)。然而,与第14天的对照HBMSCs相比,Ks和Agg的表达水平显着降低(*p 价值 <0.05)。胶原甲酰基-1(II)链(IHC)结果的免疫组织化学(IHC)在第14天也是阳性的,用于控制和OA HBMSCs(Fig. 1D),尽管在评估的两个时间点之间没有统计学上的显着差异。另外,OA中,被认为是纤维纤维/去纤维细胞标记物的胶原α-1(I)链(COL1A1)的表达(*p 价值 <0.05)但在软骨发生过程中没有对照微扫描(Fig. 1E)。最后,IHC彩易福彩证明了胶原甲α-1(X)链(COL10A1)的较高存在,被认为是软骨细胞肥大的标准标记,与对照样品相比,在第14天的OA细胞颗粒中(Fig. 1F),与对照细胞相比,这表明OA HBMSCs的早期肥厚表型。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1控制和OA HBMSCs的软骨化分化。 A,聚集的免疫缩编, B,软骨素-6-硫酸盐, C,硫酸角酸, D,胶原醛alpha-1(ii)链, E,胶原醛alpha-1(i)链和 F,胶原醛α-1(X)链,在2至14天的软骨发生后评估对照和OA Micromass。 inmunoany彩易福彩的代表性图像(正常, n = 4;哦, n = 5)显示在面板中(放大倍数X20)。在 ( A-F. ),定量彩易福彩数据显示为平均百分比阳性/总微卡区域±SEM。 *p 价值 <0.05, **p 价值 <0.01, ***p 价值 <0.001(Mann Whitney测试)。 C, 控制; OA,骨关节炎; 2D,2天; 14D,14天。

       在OA HBMSCs的软骨发生过程中差异表达蛋白质

      彩易福彩和定量软骨发生,未分化(第2天)和分化(第14天)HBMSCs在OA患者期间发生的蛋白质变化(n 使用Silac-MS进行比较= 3)。实验工作流程(补充图S2)对于软骨内诱导的HBMSCs的蛋白质组学彩易福彩导致​​鉴定281个蛋白质(补充表S4),其中43种蛋白质显示出统计学意义(±20%的变化; p 价值 <0.05)软骨发生的两个阶段之间的定量差异(表I.)。所确定的蛋白质的详细信息及其相应的肽显示在 补充表S5.
      表I. OA. HBMSCs中的软骨发生调节蛋白,通过Silac和Nano-LC-MS / MS彩易福彩在这项工作中鉴定
      ACC第号码
      a 根据Swissprot和Trembl数据库的蛋白质登录号。
      蛋白质名称基因符号Pept(95%)
      b 用于蛋白质鉴定的独特肽(Pept)的数量为95%的置信度。
      比率
      c 平均氧化氧化率(n = 3)在第14天的HBMSCs中表示相对蛋白质丰度,而软弱化分化的第2天。
      p value EF.
      d 误差因子(平均比率的误差),由蛋白质导频4.0软件进行量化精度计算。MS =质谱; LC =液相色谱; Silac =细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记; OA HBMSCs =骨关节炎人骨髓间充质干细胞。
      蛋白质在有软骨菌分化的第14天增加
       Q044461,4-α-葡聚糖分支酶GBE1624110.0051,612
       P215895'-核苷酸5NTD415590.0301438
       P15121醛糖还原酶AKR1B1327790.046 EF. > 2
       P15144氨肽酶N. ANPEP. 2016370.0001086
       P07355Annexin A2ANXA28814580.0001085
       P08758Annexin A5ANXA55015830.0001096
       P25705ATP合成酶亚基α,线粒体 atpa. 512710.0421255
       P06576ATP合成酶亚单位β,线粒体 ATPB. 1612310.0241194
       P98160底层膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或PERCENANHSPG2219400.0301652
       P12109胶原素alpha-1(vi​​)链COL6A1815120.0401480
       P12110胶原醛alpha-2(vi)链COL6A21919210.0001179
       P12111胶原醛alpha-3(vi)链COL6A38718660.0001112
       P14625内升HSP90B1.3015140.0021272
       P04406甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH. 6213620.0121263
       P62826GTP结合核蛋白ran420270.0111492
       Q9BTM1组蛋白H2a型1-jH2AFJ1121350.0051572
       P62807组蛋白H2B型1-C / E / F / G / I.hist1h2bc.2325160.0001471
       P62805组蛋白H4hist1h4a.1925180.0031688
       P00338l - 脱氢酶A链 LDHA 3015450.0011247
       P07195l - 递乳脱氢酶B链 LDHB. 720990.0251757
       P43490烟酰胺磷酰基转移酶 n 415010.0331507
       P30041过氧杂志毒素-6PRDX6513800.0321323
       P00558磷酸甘油激酶1PGK13814370.0481433
       P18669磷酸性蛋白酶1PGAM11414020.0001164
       P02545prelamin-a / c lmna. 4514200.0211343
       Q6DRA6推定的组蛋白H2b Type 2-Dhist2h2bd.535950.0061539
       P46940Ras GTPase-活性蛋白质IQGA1319380.0451885
       P04179超氧化物歧化酶[Mn],线粒体 SOD21620400.0021434
       P24821塔斯卡林 跨国公司 1817560.0341674
       P29401Transketolase. TKT. 417060.0431631
       P60174Triosephosphate异构酶TPI12615300.0011264
       O14773三肽基肽酶1TPP1416580.0061257
       Q16851UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶酶UGP2214490.0491443
      蛋白质在有软骨形成分化的第14天下降
       P6198114-3-3蛋白伽玛1433G100.7910.0461254
       P6227740s核糖体蛋白S13RS1320.6010.0381580
       P13639伸长因子2.EEF290.6820.0241374
       P21333菲拉莫-A Flna. 560.5090.0011475
       P13489核糖核酸酶抑制剂RNH1130.2390.034 EF. > 2
       P50454Serpin H1.serpinh1.210.5770.0021351
       Q9Y490塔林1TLN1170.4250.0171974
       Q01995Transgelin. tagln. 150.1710.000 EF. > 2
       P67936Tropomyosin alpha-4链TPM4110.2970.0011480
       O60701UDP-葡萄糖6-脱氢酶 UGDH. 110.7590.0261255
      a 根据Swissprot和Trembl数据库的蛋白质登录号。
      b 用于蛋白质鉴定的独特肽(Pept)的数量为95%的置信度。
      c 平均氧化氧化率(n = 3)在第14天的HBMSCs中表示相对蛋白质丰度,而软弱化分化的第2天。
      d 误差因子(平均比率的误差),由蛋白质导频4.0软件进行量化精度计算。MS =质谱; LC =液相色谱; Silac =细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记; OA HBMSCs =骨关节炎人骨髓间充质干细胞。
      从这43个蛋白质,33显着增加,10%显着降低。上调的蛋白质包括软骨ECM的几种典型的结构蛋白,包括PERCECAN(
      • Wilusz R.E.
      • Sanchez-Adams J.
      • 桂税F.
      关节性软骨围粒体基质的结构和功能。
      ),三种α链条的VI胶原蛋白(
      • 罗y.
      • Sinkeviciute D.
      • 嘿。
      • Karsdal M.
      • Henrotin Y.
      • Mobasheri A.
      • ÖnnerfjordP.
      • Bay-Jensen A.
      细胞软骨中的次胶原蛋白。
      )或Tenascin(
      • Hafegawa M.
      • 吉士达T.
      • SUDO A.
      塔斯卡林-C在关节软骨中的作用。
      ),还有许多不同的糖酵解酶,例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),磷酸糖激酶1(PGK1)和Triosephysephate异构酶(TPI1)。下调的蛋白质包括细胞骨架相关蛋白质,例如对吡喃素素α-4链(TPM4),倒下粘附剂-1(TLN1)和转蛋白(TAGLN)。
      为了进一步阐明参与OA HBMSCs的软弱化分化的分子机制和相关的生物学功能,我们使用基因本体(GO)数据库(GO)数据库(补充图S3)。在不同attiton的晚期阶段(第14天)的33例蛋白参与了三个主要的生物过程:(a)代谢,包括糖酵解(Gapdh,Pgam1,pgk1,Tpi1,Ldha),葡萄糖醛酸酯互连(Akr1b1,Ugdh,Ugp2 )和戊糖磷酸途径(TKT); (b)ECM组织(ANXA2,COL6A1,COL6A2,COL6A3,TNC); (c)转录调节(H2AFJ,HIST1H2BC,HIST1H4A)。相反,第14天的蛋白质降低主要是与(a)细胞骨架重组(tln1,tpm4,tagln)相关; (b)转录的调节(RNH1); (c)蛋白质合成,折叠和运输(EEF2,SerpinH1)。

       与健康对照相比,OA软骨发生的代谢变化

      因为氧化硅酸量量化的超过45%的差异化蛋白质涉及糖酵解和其他代谢过程,因此我们研究了OA HBMSCs的代谢谱,并将其与健康供体的细胞相比为对照。通过马尔迪 - 傅里叶变换 - 离子回旋谐振 - MSI在对照的冷冻液中彩易福彩代谢物水平和分布(n = 3) and OA (n = 5)第2天(未分化)和第14天(早期分化阶段)的微粉化。
      组合多变量统计彩易福彩 - 特别是主成分彩易福彩(PCA)和判别彩易福彩(DA) - 在所得的所得光谱上进行的 m/z 范围100-1000DA,独立应用于控制和OA样本。这些彩易福彩表明,第2天收集的微谱的代谢曲线显着不同于控制中的第14天的微粉表(Fig. 2A2B)和OA条件(Fig. 2C2D)。最初,我们观察到,健康和患病细胞在第2天表现出类似的代谢型材,呈现较高丰富的核苷酸,例如UMP,UDP和UDP-N - 乙酰基葡糖胺(UDP-GLCNAC)。然而,它们在第14天表现出标记的代谢差异。例如,磷酸磷酸二羟基丙酮磷酸酯(DHAP)和胆固醇硫酸胆固醇的水平增加,对健康的软骨细胞样细胞(Fig. 2B,正载荷),而几种糖核苷酸如ADP-核糖和UDP-葡萄糖,以及脂肪酸如油酸,硬脂酸和花生酸等脂肪酸,在有软骨菌分化的14天内特异于OA软骨细胞样细胞(Fig. 2D,正负荷, 补充表S2)。我们在OA样品中鉴定了35个代谢物,在第2天和第14天之间存在显着歧视(Fig. 3, p <0.05)。最后,为了确定哪种代谢物在软骨分化期间对健康和OA HBMSCs进行特异性,然后将多元统计彩易福彩应用于所有样品(Fig. 2E2F)。如频率图所示 Fig. 2E,第二判别函数(DF2)显示了根据其代谢组合物对照和OA样品之间的明显差异。基于其载荷,对照和OA之间的代谢物主要是核苷酸,糖种和磷脂酸相关分子(Fig. 2F)。一方面,对照样品的代谢谱(Fig. 2F,正载荷)包括几种相关的代谢物,例如溶血磷脂酸LPA(18:0),环状磷脂酸CPa(18:1)和CPA(18:0),以及磷脂酸PA(16:1_18 :0),PA(18:0_18:2)和PA(18:0_18:1)。另一方面,特征OA代谢型材证实了包括ADP,UMP和UDP的丰富核苷酸;几种脂肪酸如油酸和硬脂酸;某些糖种类,如葡萄糖单磷酸盐, N - 乙酰甘糖胺 - 磷酸(GlcNAC-P),ADP-核糖和UDP-GLCNAc;特异性磷脂如磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)物种(Fig. 2F负载负荷)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2接受软骨发生的控制和OA HBMSCs表现出不同的代谢特征。 A, B, E,基于代谢组分谱的PCA-DA彩易福彩的直方图分解图,并在对照HBMSCs的第2天和第14天之间区分(A OA. HBMSCS的第2天和第14天(B),控制和oa hbmscs(E经历有软骨生分化。 B, D,判别职业1(DF1)光谱加载图,显示在对照HBMSCs的第2天和第14天之间的判别质量(B OA. HBMSCS的第2天和第14天(D经历有软骨生分化。 F,判别职业2(DF2)光谱加载图,显示控制之间的鉴别质量(第2天和第14天) 相对 OA. Micromass(第2天和第14天)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3由于软骨性分化过程,在OA HBMSCs中改变了代谢物。 35种代谢物(包括磷脂)的水平显着改变(p 价值 <0.05)与软骨分化的第2天相比,在第14天。 Dhap,Dyhidroxyacetone磷酸盐; Pa,磷脂酸; CPA,循环磷脂酸; Lysopa,溶血磷脂酸; p,磷酸盐; Pg,磷脂酰甘油; pi,磷脂酰肌醇。

       途径彩易福彩显示,与对照相比,OA HBMSCS中五种差分代谢过程的改变

      使用MetaboAnalyst软件,通过途径彩易福彩确定这些代谢物的功能作用(Fig. 4A4B)。提供了用于控制和OA样品的所有代谢途径 补充表S6补充表S7。在控制和OA样品中,在软骨发生过程中,嘌呤和嘧啶代谢途径显着改变(Fig. 4A4B; p <0.003)。在OA样品中特别明显调节五种额外的代谢途径(Fig. 4B; p <0.05)包括半乳糖代谢,氨基糖和核苷酸代谢,淀粉和蔗糖代谢,糖酵解或葡糖生成,以及甘油脂代谢。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4软骨发生过程中HBMSCs中观察到的代谢和整合途径彩易福彩概述。 A, B,控制中的代谢途径显着改变(A)和OA(B)在软骨发生的第2天和第14天之间的HBMSCs。 C, D,通过整合途径彩易福彩进行控制,观察到前10名改变的途径(C)和OA(D)软骨发生期间的HBMSCs。基于超人陈述彩易福彩(ORA)鉴定的所有匹配途径被圆形可视化,圆尺寸指示途径影响(任意尺度)。圆圈的颜色表明不调整 p values (y 轴)从途径浓缩彩易福彩,红色< 0.003; orange < 0.2, and yellow <0.4面板A和红色< 0.02; orange < 0.1, and yellow <3.5面板B. x 轴代表根据拓扑彩易福彩的中心性程度增加代谢途径影响。用星号突出显示的术语被显着改变(p 价值 < 0.05).
      为了进一步阐明正在进行软骨形成分化的正常和OA HBMSCs中所涉及的代谢途径,我们还使用来自显着调节的蛋白质和代谢物的数据集进行整合途径彩易福彩。该彩易福彩考虑了与特定途径(富集彩易福彩)和网络结构匹配的代谢物/蛋白质的总数,考虑到途径内的分子(拓扑彩易福彩)的位置。对于控制途径彩易福彩,我们综合了17个代谢物(补充图S4)具有51个已知的蛋白质,其在进骨发生的对照HBMSCs中显示出统计学上显着的定量变化(
      • Rocha B.
      • Calamia V.
      • Mateos J.
      • Fernández-puente p.
      • Blanco F.J.
      • Ruiz-Romero C.
      人骨髓间充质干细胞的代谢标记,用于定量彩易福彩其软骨形成分化。
      )。在彩易福彩OA样品中,我们组合了35种代谢物(Fig. 3)在软骨发生的两个时间点之间的OA HBMSC中有43种蛋白质显着调节(表I.)。糖酵解途径统计学意义(p 价值 <在两个控制中(Fig. 4C)和OA(Fig. 4D)样品。涉及健康细胞软骨性分化的其他途径是半乳糖代谢和果糖/甘露糖代谢,但它们并不重要(补充表S8)。相比之下,五种途径被显着改变(p 在OA HBMSCS进行中间化合物组织中的价值= 0.05):pentose和葡萄糖酸酯互联;半乳糖,淀粉和蔗糖新陈代谢;氨基糖和核苷酸糖代谢;和不饱和脂肪酸的生物合成(Fig. 4D补充表S9 )。

        OA. HBMSCS中葡萄糖酸合成途径的改变在进骨发生

      鉴于我们发现pentose和葡萄糖酸盐互联(Kegg Pathway Map00040)是OA HBMSCs的软骨发生过程中的主要改变的代谢途径之一(Fig. 4D),我们调查了MALDI-MSI的记者基质。该彩易福彩的主要结果如图所示 Fig. 5。在该途径中,UDP-葡萄糖 - 在由UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(UGP2)催化的反应中,由葡萄糖单磷酸(GP)和UTP合成了UDP-葡糖醛酸的关键中间体。我们的蛋白质组学数据( 表I.)显示UGP2的显着增加(p 价值 <0.05)在第14天与第2天相比,与葡萄糖单磷酸盐水平的降低相关(Fig. 5A和UTP。用UDP-葡萄糖6-脱氢酶(UGDH)氧化UDP-葡萄糖以产生UDP-葡糖醛酸(Fig. 5B)。值得注意的是,在蛋白质组学彩易福彩中观察到与第2天相比,UGDH第14天的显着减少(表I., p 价值 <0.03),这可能有助于在第14天在第14天在第14天在第14天中检测到的二维葡萄糖(Fig. 5B)。虽然UGP2在蛋白质中显着增加,但不是mRNA水平(Fig. 5F),我们确实在第14天发现在OA HBMSCS的第14天进行了大量下调(Fig. 5G, p 值≤0.05)。同样在该途径内,GLCNAC-P衍生自葡萄糖单磷酸盐并转化为UDP-GLCNAC。在第14天收集的Micromasses中,GLCNAC-P和UPD-GLCNAC水平均减少(Fig. 5D5E)。这表明在OA HBMSCs的软骨形成分化期间氨基糖核苷酸代谢的下调。总的来说,这些数据表明,在可以影响HA合成的OA细胞的软骨间分化期间,在可能影响HA合成的细胞间分化期间,其产生其他关键糖胺聚糖(GAG)和蛋白多糖的生产(PGS )来自软骨ECM。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5在OA HBMSCs中UDP-葡萄糖酸互联途径和氨基糖代谢涉及的空间分布和代谢变化。 A-E. ,MALDI-MSI图像显示葡萄糖单磷酸盐的丰富和空间分布(A),UDP-葡萄糖(B),UDP-葡糖醛酸(C ), N - 乙酰 - 葡糖胺 - 磷酸盐(D)和UDP-N - 乙酰甘糖胺(E)在白内生的第2天(左)和14(右)的OA Micromass中。 F, G,通过QRT-PCR的UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶酶(F)和UDP-葡萄糖6-脱氢酶(G)。在(a-e)中,通过根感方形标准化数据。在 ( F-G. ),数据表示为5个独立实验的平均值±SEM。 * p 价值 <0.05,N.S.不重要。
      代谢物离子贴图和H的比较&E染色突出了葡萄糖单磷酸的不同区域分布。我们观察到在第2天收集的OA微量测量呈现较高水平的微粉渣中的葡萄糖单磷酸盐,而该代谢物在第14天的微瘤细胞中显示出更高的丰富( Fig. 5A)。另一种糖酵解中间体代谢物,例如DHAP,也主要在第14天(第14天)分布在微核心的细胞中(补充图S5)。这些发现表明,在第14天,核心局部化的HBMSC具有较高的糖酵解活性。与微量扫描的周边区域局部的HBMSC相比,这导致葡萄糖消耗量增加。

       未分化的OA HBMSCs具有改变的磷酸磷酸盐途径

      一旦观察到对照和OA HBMSC的软骨发生期间所涉及的代谢途径,我们接下来旨在确定在软骨发生开始前可能改变的其他特异性代谢物。通过这种目标,我们将其在未分化阶段(第2天)的代谢谱进行了比较。在此时间点的OA和对照之间的三十二个代谢物的水平是不同的(补充表S10)。其中,10分类为核苷酸,6次糖磷酸盐,5个磷脂酸(PA) - 相关代谢物,3个肌醇相关代谢物,2个脂肪酸和1个糖核苷酸。最后,还鉴定了15种磷脂物种。这些数据的统计彩易福彩表明,OA患者的未分化HBMSCs包含较高水平的糖,例如磷酸肌醇,葡萄糖单磷酸盐,果糖1,6-二磷酸(FRU-1,6-P2),以及与对照相比的核糖5-磷酸盐细胞 (补充图S6 )。
      最后,我们进行了代谢物集合浓缩彩易福彩(MSEA),以确定在这种早期有软骨生分化阶段受到哪种途径。我们的结果显示了20个富集的途径(补充图S7),其中4在OA中有显着上调(p 价值 <0.02):Pentose磷酸盐途径(PPP),蠕动效应,乳糖合成和葡糖生成。接下来,我们使用MetaboAnalyst进行代谢途径彩易福彩,以表征这些代谢物的功能作用,并估计途径内的节点重要性。根据该彩易福彩,我们确认发现嘌呤新陈代谢和PPP显着改变(p 价值 <0.025)在OA HBMSCS中与第2天的对照相比(补充图S7, 补充表S11)。使用Fleximaging Software检查在第2天中获得的PPP中涉及的若干代谢物的强度和空间分布和在第2天获得的控制微粉部分(补充图S8)。在这些代谢物中,核糖-5-磷酸盐和核糖1,5-双磷酸盐差异地分布在微粉部分上,在对照微粉的外周细胞中具有相对较高的强度。相反,在位于OA微核心的核心的细胞中主要检测到代谢物,这表明该区域的增殖程度较高。

      讨论

      刺激药物刺激 体内 已经提出了MSCs中软骨发生的诱导作为骨关节炎治疗的有希望的治疗方法(
      • Roubille C.
      • Pelletier J.P.
      • Martel-Pelletier J.
      对骨关节炎管理的新和新出现的治疗方法:梦想与个性化的药物成真吗?
      ),因为它们可能有助于克服关节软骨的限制再生能力。为了提供DMoads的发展的新靶标,已组合蛋白质组学和代原方法以鉴定在软骨形成早期阶段的代谢途径中的改变 体外 3D骨关节炎HBMSCS和健康对照模型。最初,使用IHC测定评估我们模型中对照和OA HBMSCs的软骨内分化。虽然噱头的表达更高,但如ch6在软骨发生的第14天,OA HBMSCs在白内生的第14天中发现了S和Ks,在分化的软骨阶段也表现出更高的肥厚/纤维化表型。 MSC肥大的特征在于细胞体积增加,胶原型X,基质金属蛋白酶和碱性磷酸酶活性的表达(
      • 学员D.
      • Millan C.
      • Öztürke.
      • Maniura-Weber K.
      • Zenobi-Wong M.
      调节软骨细胞和间充质干细胞中肥厚分化的分子与生物物理机制。
      )。此外,MSCs具有肥厚表型表达,并优先于II型胶原蛋白(
      • Scotti C.
      • Tonnarelli B.
      • Papadimitropoulos A.
      • Scherberich A.
      • Schaeren S.
      • Schauerte A.
      • Lopez-rioS J.
      • Zeller R.
      • 巴贝罗A.
      • 马丁I.
      用人成人间充质干细胞作为发育工程范式的核心骨形成的重新训练。
      ),其表示纤维纤维,而不是透明软骨形成。因此,促进软骨性分化,同时防止软骨形成MSCs的肥大对于在软骨再生的策略中应用MSC是必不可少的。因此,观察到的差异支持在OA中MSCs分化的潜在分子改变的振作。
      为了阐明这些紊乱,进行了一种氧化硅策略,以定量地描述经历有软骨生分化的OA HBMSCs的细胞内蛋白质谱。在干细胞发生的两次早期步骤,第2天和第14天(第14天)之间改变了四十三个蛋白质的改变了统计学意义(表I.)。从这种蛋白质的副本中,最大的官能团包括参与代谢过程的那些,了解软骨发生,软骨生理学和病理生理学(
      • Mobasheri A.
      • vannucci s.j.
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      • Martín-Vasallo P.
      软骨细胞的葡萄糖运输和代谢:理解软骨发生,骨骼发育和软骨降解骨关节炎的关键。
      )。除了UGDH之外,所有这些蛋白质在白霜发生的第14天增加。此外,大多数调节蛋白涉及糖酵解途径,表明通过软骨分化诱导的增强糖酵解活性。这与软骨的甘露糖本质一致,并且与先前报告的糖酵解后的糖酵解率较高,与增殖性MSC(
      • 王D.W.
      • 细胞B.
      • Gimble J.m.
      • awad h.a.
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      氧对脂肪衍生成年干细胞增殖和代谢的影响。
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      • Shirmanova M.V.
      • Zagaynova E.v.
      NAD(P)H的双光子flim and在经历成骨或软骨内分化的间充质干细胞中的表现。
      )。所有这些数据都提供了支持HBMSCS软骨发生的调节中代谢变化的关键作用,特别是甘露糖途径的增强。与我们之前的关于经历该过程的健康HBMSCs的蛋白质组学变化的已发表的数据,可以得出结论,糖酵解的转变是OA和对照HBMSC的软骨发生中的常见代谢特征。这也指出,早期分化的细胞主要依赖于糖酵解作为能源。
      最近已经采用代谢物彩易福彩来研究不同培养条件对脂肪和骨质发生分化的影响对MSCS代谢的影响(
      • klontzas m.e.
      • vernardis s.i.
      • Heliotis M.
      • Tsiridis E.
      • Mantalaris A.
      脐带血间充质干细胞的成骨分化的代谢组彩易福彩显示出对骨质发生剂的差异敏感性。
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      • 穆尼克辛
      • kim J.
      • 刘Y.
      • 洛根下午
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      不同氧气张力下的彩易福彩和骨质发生分化过程中人间充质干细胞代谢的气相色谱 - 质谱彩易福彩。
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      • 谭杰。
      • 王Y.
      • 王S.
      • 张恩。
      • 吴S.
      • 袁Z.
      • 朱克。
      使用液相色谱 - 质谱法对OP9-DL1细胞脂肪转化的未明确的代谢组合彩易福彩:对胸腺脂肪发生的影响。
      )。例如,添加 l-Carnitine在BMSC的脂肪切征期间降低了许多饱和和不饱和的长链脂肪酸的水平,以及参与糖酵解,葡糖生成和丙酮酸代谢途径的代谢物的产生(
      • 富士川克。
      • Takami T.
      • 福井Y.
      • Quintanilha L.F.
      • Matsumoto T.
      • Yamamoto N.
      • Sakaida I.
      L-肉碱对人骨髓衍生间充质干细胞的评价效果。
      )。基于培养氧水平,Muñoz 等等。 描述了HBMSCs的成骨分化期间谷氨酸溶解,三羧酸循环和亚酸酯天冬氨酸梭的差异(
      • 穆尼克辛
      • kim J.
      • 刘Y.
      • 洛根下午
      • 马T.
      不同氧气张力下的彩易福彩和骨质发生分化过程中人间充质干细胞代谢的气相色谱 - 质谱彩易福彩。
      )。最后,已经提出了使用代谢谱作为MSCs软骨形成分化的标记(
      • jang m.y。
      • 春S.I.
      • MUN C.W.
      • 洪库斯。
      • Shin J.W.
      用质子(1H)核磁共振光谱法作为3D培养人间充质干细胞软骨分化生物标志物的代谢物变化的评价。
      )。
      在目前的工作中,我们首次申请了MALDI-FT-ICR-MSI技术,以在软骨发生的早期阶段进行对照和OA HBMSCs的代谢变化来表征和定位代谢变化。这种代谢物彩易福彩提供了关键发现,包括在与对照组相比时在OA HBMSCs的分化中显着改变了35种代谢物的鉴定。这些代谢物与在OA软骨发生中差异调节的43种蛋白质组合,被映射到几种互连的途径(补充图S9)。值得注意的是,参与合成UDP-葡萄糖合成的代谢物水平在OA细胞中始终如一地改变(Fig. 5)。我们在第14天观察到与对照相比,OA细胞中前体UDP-葡萄糖的积累。这种积累的可行性原因可能是我们在这种工作中检测到​​的UGDH酶的下调,在这种情况下,通过蛋白质组学和基因表达彩易福彩。 UGDH需要将UDP-葡萄糖转化为UDP-葡萄糖醛酸,从而直接参与软骨Gag和PGS的合成(
      • Egger S.
      • Chaikuad A.
      • Kavanagh K.L.
      • Oppermann U.
      • Nidetzky B.
      UDP-葡萄糖脱氢酶:潜在药物靶标的结构和功能。
      )。有趣的是,老化期间已经描述了UGDH的增加,并与HA积累和信号传动改变相关联(
      • 辛普森下午
      • 嗯A.
      • 托马斯D.
      • 斯蒂芬斯P.
      • Steadman R.
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      老化成纤维细胞抗性表型成熟,因为透明质酸依赖性CD44 /表皮生长因子受体信号传导受损。
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      老年非人类动物脑灰质的星形胶质细胞合成过量的透明质酸。
      )。其他研究还表明,UGDH表达水平的调节促进了显着增加的噱头,并增强了微粉化培养物中的软骨发生 体外 (
      • Clarkin C.E.
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      UDP-葡萄糖脱氢酶的调节足以调节透明质酸的生产和释放,控制硫酸化GAG合成,促进软骨发生。
      )。在软骨中,与正常相比,骨关节炎组织中UGDH蛋白表达减少(
      • 文y.
      • 李杰。
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      UDP-葡萄糖脱氢酶在关节软骨细胞中调节蛋白多糖合成:其可能的缺陷和调节骨关节炎。
      )。我们在本文报告的UGDH的下调可能对UDP-葡糖醛酸的合成产生负面影响,因此改变了软骨适当官能团所需的ECM PGS和GAG的产生。此外,UDP-葡萄糖醛酸可以是脱羧至UDP-木糖,这对于将GAG与蛋白多糖核心蛋白的连接至关重要(
      • Vigetti D.
      • Karousou E.
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      • de luca g.
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      Hyaluronan:生物合成和信号。
      )。
      此外,这项工作证明了与对照组的OA HBMSCs的软骨发生中氨基糖代谢(己糖胺途径)的改变。葡萄糖胺(GLCN)是关节软骨ECM中存在的重要氨基糖,以及用于GAG和PG合成的前体。几个以前的研究已经探索了GLCN及其衍生物(如GLCNAC)的效果在软骨修复上。这些研究表明这些分子能够增强相关软骨PG的生物合成,并通过抑制促炎介质的活性来防止炎症(
      • varghese s.
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      • Hashimoto S.
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      兔N-乙酰葡糖胺的软化活性与实验性骨关节炎的兔。
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      N-乙酰葡糖胺可防止IL-1β介导的人软骨细胞的活化。
      )。此外,目录显示GLCN通过增加转化生长因子β1基因表达的增加来促进软骨发生并刺激GAG合成(
      • Hwang N.S.
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      • 坎阿尔A.
      • Elisseeff J.
      用葡糖胺加强水凝胶中鼠胚胎干细胞的软弱化学分化。
      )。另外,据报道,具有GLCN的改性聚乙二醇水凝胶,以增强HBMSCs的软骨发生,纤维化低纤维化和肥厚性软骨标记物的表达(
      • 姚H.
      • 薛J.
      • 王Q.
      • 谢R.
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      • 秦d.
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      最后,我们评估了在软骨发生的第2天进行了对照和OA HBMSCs的分子变化。我们的代谢物彩易福彩表明,核糖-5-磷酸盐和核糖-1,5-双磷酸盐在OA中显着增加,指向PPP的增强活性与对照组相比。 PPP产生核糖-5-磷酸酯 诺维 核苷酸合成(
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      )。我们的研究结果表明,OA HBMSCs优先使用该途径的氧化分支来获取通过DNA和RNA合成的细胞增殖至关重要的核糖-5-磷酸酯。这可能表明,与对照组相比,第2天的OA HBMSCs可以维持增殖性阶段(特别是位于微核心的那些细胞),这反过来可能引发早期的软骨形成分化。完全,在未分子化状态下检测到的这些代谢改变可能表明OA细胞的软弱性分化中的较早上游呼吸困难。
      总之,我们的研究结果揭示了特定代谢过程的关键作用作为细胞生成分化早期发病时的关键调节因子。预计这些途径将改善对正常和患病环境中软骨发生的代谢调节的理解。具体地,本文报道的UDP-葡糖醛酸合成途径的改变提供了新的分子靶标,可以对影响影响软骨等软骨的疾病的未来治疗发育进行调查。

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据通过骄傲的伙伴储存库(//www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD012879)使用DataSet标识符PXD012879和MSCS OA Silac质谱成像的项目名称。

      致谢

      我们感谢来自楚阿科鲁尼亚骨科部门的病理服务,为骨髓样本提供给Tamara Hermida,用于HBMSCS分离和表征,以及NOA GOYANES获取MicroMass部分。我们还要感谢MariaEugeniaVázquizMosquera帮助QRT-PCR数据彩易福彩和IHC量化。

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