基于肽的相互作用蛋白质组学

      蛋白质 - 蛋白质相互作用通常由位于蛋白质的本质上无序区域(IDRS)中的短线性基序(纤薄)介导。苗条介导的相互作用难以研究,并且许多功能相关的相互作用可能仍未被发现。最近,用合成肽与定量质谱相结合的拉下来作为一种强大的筛选方法,以研究由纤细介导的蛋白质 - 蛋白质相互作用。具体地,固定在纤维素膜上的合成肽阵列提供一种可伸缩的方法,以识别许多肽的相互作用伴侣并联。在这次MILEVIEW中,我们简要介绍了蛋白质 - 蛋白质相互作用的细长的相关性,概述了现有的筛选技术,讨论了基于肽的相互作用屏幕的独特优势,并提供了用于设置这种基于肽的屏幕的实际建议。

      图形概要

      大多数蛋白质与他人互动以发挥自己的生物学功能。因此,研究蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)为潜在的健康和疾病的分子过程提供机械洞察力。传统上,认为PPI被折叠的球状结构域介导。这种方式形成的相互作用往往是稳定的,通常形成复合物,以满足一个分子机制。然而,细胞还需要反应刺激并以灵活和多功能的方式适应它们的环境。为此,蛋白质通过信号传导级联的信息,彼此相互作用,用于贩运或被标记为降解。在所有这些情况下,蛋白质相互作用,但如果这些相互作用是可逆的并且瞬态,系统只能起作用。
      在过去的几十年中,很明显,也可以参与PPI所涉及未获得固定的三维结构的蛋白质部分(
      • Keskin O.
      • Gursoy A.
      • Nussinov R.
      蛋白质 - 蛋白质相互作用的原理:蛋白质相互作用的优选方式是什么?
      )。在多细胞生物中,大约40%的氨基酸残基在所谓的内在无序区域(IDRS)(
      • 薛b。
      • Keith Dunker A.
      • Uversky V.N.
      在蛋白质内在病症分布中有序顺序:来自病毒的3500蛋白蛋白蛋白和生命的三个域。
      )。近年来,IDRS的兴趣一直在上升,因为他们被发现在许多生物过程中发挥着关键作用。例如,IDRS在所谓的中心蛋白中特别丰富(IE。 PPI网络中具有高连接性的蛋白质),表明这些地区是PPI的重要介质(
      • Haynes C.
      • oldfield c.j.
      • 济F.
      • Klitgord N.
      • Cusick M.E.
      • Radivojac P.
      • Uversky V.N.
      • vidal m.
      • iakoucheva l.m.
      内在病症是来自四个真核椎间囊的中心蛋白的常见特征。
      )。实际上,IDRS经常含有短线性图案(纤细) - 通常少于十个氨基酸的短区域,可介导PPI,后翻译或两者(
      • Davey N.E.
      • van Roey K.
      • 耐候r.j.
      • Toedt G.
      • UYAR B.
      • 阿尔滕贝格B.
      • 伙计A.
      • Diella F.
      • Dinkel H.
      • 吉布森T.J.
      短线性图案的属性。
      ,
      • TOMPA P.
      • Davey N.E.
      • 吉布森T.J.
      • Madan Babu M.
      分子生物学家的一百万肽基序。
      )。苗条的小型信息含量仅基于肽序列的生物信息预测,必须在尝试建立新的肽域连接时进行易于易于和护理(
      • 吉布森T.J.
      • Dinkel H.
      • van Roey K.
      • Diella F.
      真核生物蛋白短监管基序的实验检测:良好实践的提示以及坏。
      )。此外,IDRS在液体相分离中发挥着核心作用 - 该方法在其中蛋白质聚集在一起形成没有膜限制的细胞器(
      • 加藤米
      • 汉t.w.
      • 谢S.
      • Shi K.
      • 杜X.
      • wu l.c..
      • Mirzaei H.
      • 金匠e.j.
      • LongGood J.
      • PEI J.
      • 格兰顿N.V.
      • Frantz D.E.
      • 施耐德J.W.
      • 陈S.
      • Li L.
      • Sawaya M.R.
      • 艾森伯格D.
      • Tycko R.
      • Mcknight S.L.
      RNA颗粒的无细胞形成:低复杂性序列结构域在水凝胶中形成动态纤维。
      ,
      • BANANI S.F.
      • Lee H.O.
      • Hyman A.A.
      • 罗森m.k.
      生物分子凝聚液:细胞生物化学的组织者。
      )。这些细胞器的组装由瞬态,多价相互作用驱动(
      • BANANI S.F.
      • Lee H.O.
      • Hyman A.A.
      • 罗森m.k.
      生物分子凝聚液:细胞生物化学的组织者。
      ,
      • 李鹏
      • Banjade S.
      • 程H.-C.
      • 金斯。
      • 陈B.
      • 郭L.
      • Llaguno M.
      • hollingsworth J.v.
      • 国王D.S.
      • BANANI S.F.
      • russo p.s.
      • 江Q.-x.
      • 尼克松B.T.
      • 罗森m.k.
      多价信号蛋白组装中的相变。
      )通过恒定的形成和分离这些相互作用,保持液体性质。
      学习由IDRS介导的PPI对于我们对细胞生物学的理解至关重要。与此同时,他们的可逆和瞬态性质使实验难以研究此类互动(Fig. 1):经典亲和力净化质谱(AP-MS)是一种非常通用的方法,尤其是当它与量化结合时(Q-AP-MS)(
      • 迈耶克。
      • Selbach M.
      定量亲和纯化质谱:一种研究蛋白质 - 蛋白质相互作用的多功能技术。
      ,
      • 杨杰。
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      基于质谱的蛋白质组学照明蛋白质相互作用网络的空间和时间组织。
      )。然而,尽管AP-MS适用于稳定的相互作用,但它可能无法检测由纤细介导的弱绑定。或者,接近标记方法可以揭示弱相互作用,因此用于映射膜的蛋白质蛋白质(
      • Trinkle-Mulcahy L.
      基于邻近的互动型映射的基于近似性标记方法的最新进展。
      ,
      • youn J.-Y.
      • 邓汉W.H.
      • 洪S.J.
      • 骑士J.D.R.
      • Bashkurov M.
      • 陈G.I.
      • Bagci H.
      • rathod b.
      • Macleod G.
      • eng s..m.
      • 昂热S.
      • 莫里斯Q.
      • 法比安米。
      • CôtéJ.-f.
      • Gingras A.-​​C.
      高密度接近映射显示MRNA相关颗粒和体的亚细胞组织。
      )。然而,接近标记检测蛋白质分层化,不一定是PPI。此外,任何给定的蛋白质包含许多潜在的纤细,并且AP-MS和接近标记都不提供足够的信息来分配对特定主题的观察到的相互作用。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1实验研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。 蛋白质 - 蛋白质相互作用范围从涉及结构化区域(左)的稳定相互作用从涉及本质无序区域(右)的瞬态相互作用。不同的实验方法更适合于特异性的相互作用,也取决于结合亲和力。
      高通量肽的相互作用蛋白质组学最近成为一种强大的技术,用于研究IDRS介导的PPI。在这里,我们审查了这种方法,讨论了它涉及的实际意义和概述未来的观点。要设置现场,我们将首先概述研究肽介导的相互作用的现有方法。

       学习纤细介导的蛋白质 - 蛋白质相互作用的方法概述

      尽管上面概述的挑战,但IDRS具有一个实际上促进其实验分析的固有性质:它们可以独立于全长蛋白质的上下文施加它们的功能。这意味着可以使用短肽研究由纤细介导的纤细介导的相互作用。这使得能够系统地设计筛选肽介导的相互作用(表I.)。研究肽介导的相互作用的方法可以广泛地分类为遗传和生化筛网(
      • Blikstad C.
      • 伊万森Y.
      鉴定涉及短线性图案的蛋白质 - 蛋白质相互作用的高通量方法。
      )。
      表I.研究肽 - 蛋白质相互作用的筛选方法概述
      肽库大小域/蛋白质来源
      蛋白质组学肽 - 噬菌体展示(PROP-PD)10,000-1,000,000∼10(
      • Davey N.E.
      • SEO M.
      • Yadav V.K.
      • jeon J.
      • 尼姆斯。
      • Krystkowiak I.
      • Blikstad C.
      • 董D.
      • 马克诺瓦
      • kim p.m.
      • 伊万森Y.
      通过人蛋白质组内部无序区域的噬菌体展示发现短线性图案介导的相互作用。
      ,
      • 伊万森Y.
      • Arnold R.
      • McLaughlin M.
      • 尼姆斯。
      • Joshi R.
      • 雷D.
      • 刘B.
      • Teyra J.
      • Pawson T.
      • Moffat J.
      • 李S.S.-C.
      • 西德湖S.
      • kim p.m.
      PDZ结构域通过使用人和病毒噬菌体肽蛋白酶显示PDZ结构域的大规模相互作用分析。
      )
      Y2H>100,000,000<50(
      • 杨米
      • 吴Z.
      • 领域S.
      用酵母双杂交系统分析蛋白质肽相互作用。
      ,
      • mu y.
      • CAI P.
      • 胡斯
      • 马。
      • 高雅。
      酵母三杂交筛选特殊肽库的PDZ结构域的不同内部结合特异性的表征。
      )
      酵母表面显示100.,000,000.<5(
      • Blikstad C.
      • 伊万森Y.
      鉴定涉及短线性图案的蛋白质 - 蛋白质相互作用的高通量方法。
      ,
      • BidlingMaier S.
      • 刘B.
      酵母表面显示人cDNA文库的构建和应用,以确定翻译后修饰依赖性蛋白质相互作用。
      )
      蛋白质微阵列<100<200(
      • 琼斯R.B.
      • GORDUS A.
      • Krall J.A.
      • Macbeath G.
      使用蛋白质微阵列的ERBB受体的定量蛋白质相互作用网络。
      ,
      • stiffler m.a.
      • 陈俊克。
      • GrantCharova V.P.
      • 雷Y.
      • FUCHS D.
      • Allen J.E.
      • Zaslavskaia L.A.
      • Macbeath G.
      PDZ域绑定选择性在鼠标蛋白组上进行了优化。
      )
      肽阵列(古典)<1,000; <1,000,000(高密度阵列)<10(
      • Buus S.
      • 罗伯格J.
      • forsströmb.
      • Nilsson P.
      • Uhlen M.
      • Schafer-nielsen C.
      使用超高密度肽微阵列的线性抗体表位的高分辨率映射。
      ,
      • carmona s.j.
      • 尼尔森M.
      • Schafer-nielsen C.
      • Mucci J.
      • Altcheh J.
      • Balouz V.
      • Tekiel V.
      • Frasch A.c.
      • Campetella O.
      • Buscaglia C.A.
      • AgüeroF.
      对传染病的高通量免疫学:使用下一代肽微阵列进行抗原决定簇的快速发现和映射。
      )
      肽阵列(+质量规格)<1,000整个蛋白质组(
      • Dittmar G.
      • Hernandez D.P.
      • Kowenz-Leutz E.
      • Kirchner M.
      • Kahlert G.
      • Wesolowski R.
      • Baum K.
      • Knoblich M.
      • hofstätterm.
      • Muller A.
      • 狼J.
      • reimer u.
      • 莱特阿。
      普里斯卡:肽基质上的蛋白质相互作用筛网揭示了内在无序的C /EBPβ的相互作用占状印迹和修饰依赖性偶联。
      ,
      • 迈耶克。
      • Kirchner M.
      • UYAR B.
      • 程J.-Y.
      • Russo G.
      • Hernandez-Miranda L.R.
      • Szymborska A.
      • Zauber H.
      • rudolph i.-m.
      • Willnow T.E.
      • Akalin A.
      • Hautke V.
      • Gerhardt H.
      • Birchmeier C.
      • Kühnr.
      • Krauss M.
      • Diecke S.
      • 奇怪的准噶
      • Selbach M.
      无序区域的突变通过产生越琥氨酸基序可以引起疾病。
      )
      噬菌体展示,酵母双杂交(Y2H)和酵母表面显示是研究肽蛋白质相互作用的普遍遗传筛选方法。然而,这些方法遭受困难以识别依赖于翻译后修改(PTMS)的相互作用。这是一个重要的限制,因为一些PTMS在IDRS中富集并且经常发挥重要的监管作用(
      • Davey N.E.
      • van Roey K.
      • 耐候r.j.
      • Toedt G.
      • UYAR B.
      • 阿尔滕贝格B.
      • 伙计A.
      • Diella F.
      • Dinkel H.
      • 吉布森T.J.
      短线性图案的属性。
      ,
      • van Roey K.
      • 吉布森T.J.
      • Davey N.E.
      图案开关:细胞监管中的决策。
      ,
      • 呸A.
      • Forman-Kay J.D.
      通过翻译后修饰调节本质上无序的蛋白质功能。
      ,
      • 亲爱的A.L.
      • Uversky V.N.
      内在疾病和后期改性:生物暗物质的较暗一侧。
      )。涉及覆盖人蛋白质组的所有无序区域的噬菌体展示文库(
      • Davey N.E.
      • SEO M.
      • Yadav V.K.
      • jeon J.
      • 尼姆斯。
      • Krystkowiak I.
      • Blikstad C.
      • 董D.
      • 马克诺瓦
      • kim p.m.
      • 伊万森Y.
      通过人蛋白质组内部无序区域的噬菌体展示发现短线性图案介导的相互作用。
      )。但是,有很多值得注意的例外情况(
      • Teyra J.
      • 黄鹤
      • 耆那教
      • 关X.
      • 董A.
      • 刘Y.
      • Tempel W.
      • Min J.
      • 桐y.
      • kim p.m.
      • 糟糕的G.D.
      • 西德湖S.
      对人SH3结构域系列的综合分析显示出各种非规范特异性。
      ),通常筛选这种文库,其针对相当小的预选诱饵蛋白。这是因为与同时产生许多单独的诱饵蛋白质相关的实际挑战。因此,这些方法通常具有有限的产量(少量蛋白质诱饵肽毛细血管库)。
      肽介导的相互作用也可以生物化学上。这些测定的先决条件是在固相肽合成的发展,这使得能够用规定氨基酸序列的肽的化学生产(
      • merrifield r.b.
      固相肽合成。 I.四肽的合成。
      )。具有合成肽的相互作用测定具有以下优点,即发生后改变的修饰可以在合成期间直接掺入肽中。而且,代替将定义的氨基酸掺入给定位置,可以使用不同氨基酸的混合物。这产生简并肽文库(即,在特定位置具有随机氨基酸的肽混合物)。近30年前,Lewis Cantley实验室使用这种退化的磷酸肽库,其在中央位置中的不变性磷酸蛋白酶作为与诱饵的相互作用筛选,其作为诱饵(SH2)结构域作为诱饵(
      • 松阳Z.
      • Shoelson S.E.
      • Chaudhuri M.
      • GISH G.
      • Pawson T.
      • haser w.g.
      • 王F.
      • 罗伯茨T.
      • Ratnofsky S.
      • Lechleider R.J.
      SH2结构域识别特定的磷酸肽序列。
      )。 Edman脱脂肽的劣化,然后沿着肽的不同位置显示平均氨基酸组合物,从而识别出SH2结构域的“共有”结合基质。该方法仅限于所选蛋白质结构域的分析(一个诱饵针对肽毛皮文库)。通过将蛋白质/域固定在蛋白质微阵列上的蛋白质/结构域来增加诱饵侧的吞吐量(
      • 琼斯R.B.
      • GORDUS A.
      • Krall J.A.
      • Macbeath G.
      使用蛋白质微阵列的ERBB受体的定量蛋白质相互作用网络。
      ,
      • stiffler m.a.
      • 陈俊克。
      • GrantCharova V.P.
      • 雷Y.
      • FUCHS D.
      • Allen J.E.
      • Zaslavskaia L.A.
      • Macbeath G.
      PDZ域绑定选择性在鼠标蛋白组上进行了优化。
      )。然而,这降低了肽侧的产量,因为现在必须测试单个肽(而不是简并肽库)。蛋白质微阵列也很难产生和限于检测相对高的亲和相互作用。
      代替将蛋白质诱饵固定到下拉肽,也可以将肽固定为诱饵以拉下相互作用的蛋白质。该设置的一个关键优点是肽可以以高密度固定。所得到的高局部肽浓度允许富集具有低结合亲和力的蛋白质。另一个优点是增加的产量:具有定义氨基酸组合物的多肽可以通过所谓的点合成并行合成(
      • 弗兰克拉
      斑点合成:在膜载体上的位置可寻址,平行化学合成的易于技术。
      )。现场合成产生固定在纤维素膜上的数千种不同肽的阵列,即使质量控制以这种形式更难以(见下文)。纤维素是一种吸引力的支持,因为它是生物相容性,亲水性,廉价,环保,并且在广泛的反应条件下稳定(
      • Klemm D.
      • Heublein B.
      • Fink H.-P.
      • Bohn A.
      纤维素:迷人的生物聚合物和可持续原料。
      )。传统上,纤维素上的肽阵列用单一的丙蛋白探针,随后被特异性抗体或荧光/放射性标签对感兴趣的杂种蛋白质(
      • Volkmer R.
      • Tapia V.
      • Landgraf C.
      用于研究蛋白质相互作用域的合成肽阵列。
      )。这种肽阵列的常见申请是映射抗体识别的线性表位(
      • Buus S.
      • 罗伯格J.
      • forsströmb.
      • Nilsson P.
      • Uhlen M.
      • Schafer-nielsen C.
      使用超高密度肽微阵列的线性抗体表位的高分辨率映射。
      )或鉴定通过重组表达的蛋白质结构域识别的肽(
      • Tapia V.E.
      • Nicolaescu E.
      • 麦当劳C.B.
      • 穆斯维。
      • OKA T.
      • inayoshi Y.
      • Satteson A.c.
      • Mazack V.
      • Humbert J.
      • gaffney c.j.
      • Beullens M.
      • Schwartz C.E.
      • Landgraf C.
      • Volkmer R.
      • 牧牛地A.
      • Farooq A.
      • Bollen M.
      • Sudoss M.
      戈尔布-ITO-霍尔综合征蛋白PQBP1的WW领域的Y65C畸变突变影响其结合活性和管料酸盐前培养物。
      )。这种方法仅限于一次研究的单一捕食蛋白(许多肽诱饵,单候选猎物)。
      也可以使用质谱法鉴定与固定肽相互作用的捕食蛋白。在这种情况下,肽通常偶联至珠子。重要的是,因为肽 - 蛋白质相互作用通常具有低亲和力,所以下拉实验需要低严格条件,这通常会导致许多非特异性粘合剂。因此,使用定量质谱法至关重要,以评估哪种相互作用真正特异性。一般思路是用适当的负面控制执行并行控制下拉下拉(例如 突变或未修饰的肽)。然后,定量蛋白质组学可以区分特定的相互作用伴侣免于非特异性背景粘合剂。通过Matthias Mann实验室在2004年通过定量蛋白质组学的这种肽下拉的组合是由Matthias Mann实验室开创的,并且已经成功地研究了PTMS和序列基序对肽 - 蛋白质相互作用的影响(
      • Schulze W.X.
      一种用于肽蛋白质相互作用的新型蛋白质组学筛选。
      ,
      • Selbach M.
      • 保罗F.E.
      • Brandt S.
      • 盖伊
      • Daumke O.
      • 回来
      • Dehio C.
      酪氨酸磷酸化细菌蛋白的宿主细胞酰蛋白酶。
      ,
      • vermeulen M.
      • Mulder K.W.
      • Denissov S.
      • pijnappel w.w.m.p.
      • van schaik f.m.a.
      • varier r.a.
      • Baltissen M.P.A.
      • 斯坦尼贝格H.G.
      • Timmers H.T.M.
      作者:张莹莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹,王莹
      ,
      • 赵某。
      • 岳Y.
      • 李Y.
      • 李H.
      新型组蛋白修饰的“读者”的识别与表征。
      )。在这些实验中,捕食的数量是巨大的并且对应于所用蛋白质裂解物的复杂性。相反,肽诱饵通常用于单独的下拉实验中。这限制了可以并联使用的肽诱饵的数量(少量肽诱饵对复合蛋白质组)。

       高通量肽基相互作用蛋白质组学

      最近,已经组合了上述肽下拉方法的有利部分(Fig. 2):用全细胞裂解物探测肽阵列探测用全细胞裂解物探测肽阵列,并使用定量质谱法鉴定相互作用蛋白质(
      • Dittmar G.
      • Hernandez D.P.
      • Kowenz-Leutz E.
      • Kirchner M.
      • Kahlert G.
      • Wesolowski R.
      • Baum K.
      • Knoblich M.
      • hofstätterm.
      • Muller A.
      • 狼J.
      • reimer u.
      • 莱特阿。
      普里斯卡:肽基质上的蛋白质相互作用筛网揭示了内在无序的C /EBPβ的相互作用占状印迹和修饰依赖性偶联。
      ,
      • 迈耶克。
      • Kirchner M.
      • UYAR B.
      • 程J.-Y.
      • Russo G.
      • Hernandez-Miranda L.R.
      • Szymborska A.
      • Zauber H.
      • rudolph i.-m.
      • Willnow T.E.
      • Akalin A.
      • Hautke V.
      • Gerhardt H.
      • Birchmeier C.
      • Kühnr.
      • Krauss M.
      • Diecke S.
      • 奇怪的准噶
      • Selbach M.
      无序区域的突变通过产生越琥氨酸基序可以引起疾病。
      ,
      • 冈田H.
      • UEZU A.
      • Soderblom E.J.
      • Mamoseley 3rd,
      • Gertler F.B.
      • Soderling S.H.
      肽阵列X-Linking(PAX):一种新的肽 - 蛋白质识别方法。
      )。在所有三种情况下,通过点通过质谱法孵育14-18 MEL肽在纤维素膜上合成纤维素膜,以通过质谱法鉴定结合伴侣。通过DITTMAR和同官员在肽基质“(PRISMA)(PRISMA)上的这种设置具有以下优点:它能够实现具有高通量的相互作用筛网,用于诱饵和捕食(许多肽诱饵与复合蛋白质组猎物)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2基于肽的相互作用蛋白质组学。 可以使用来自复合蛋白质混合物的肽 - 下拉来确定短无序肽区域的相互作用伴侣。为此,在纤维素膜上合成肽,其允许N-或C-末端偶联,分析突变的序列或插入各种后期改变。用蛋白质提取物温育膜后,可以通过质谱法鉴定相互作用的蛋白质。然后可以揭示给定肽序列或修饰的特异性的相互作用。
      上述三个出版物采用整体概念来解决来自不同角度的生物学问题。冈田 等等。 将PhotoactivaTable氨基酸掺入它们的肽并使用光学源,以共价捕获相互作用的蛋白质(
      • 冈田H.
      • UEZU A.
      • Soderblom E.J.
      • Mamoseley 3rd,
      • Gertler F.B.
      • Soderling S.H.
      肽阵列X-Linking(PAX):一种新的肽 - 蛋白质识别方法。
      )。虽然这使得能够高度严格的洗涤条件,但鉴定的蛋白质清单仍然包含许多非特异性污染物。因此,另外两种研究采用定量来区分特异性粘合剂。 DITTMAR和同事使用了滑动窗口方法(重叠“瓷砖的”肽)来沿C /EBPβα的序列映射绑定伙伴(
      • Dittmar G.
      • Hernandez D.P.
      • Kowenz-Leutz E.
      • Kirchner M.
      • Kahlert G.
      • Wesolowski R.
      • Baum K.
      • Knoblich M.
      • hofstätterm.
      • Muller A.
      • 狼J.
      • reimer u.
      • 莱特阿。
      普里斯卡:肽基质上的蛋白质相互作用筛网揭示了内在无序的C /EBPβ的相互作用占状印迹和修饰依赖性偶联。
      )。它们还评估了PTMS的影响,因为斑块合成允许包含磷酸化,甲基化(单酮,二,三),瓜粉化,乙酰化,喋喋不克,雄性等等。在我们自己的工作中,我们使用PRISMA研究蛋白质紊乱区域中的疾病导致突变如何导致蛋白质 - 蛋白质相互作用的变化(
      • 迈耶克。
      • Kirchner M.
      • UYAR B.
      • 程J.-Y.
      • Russo G.
      • Hernandez-Miranda L.R.
      • Szymborska A.
      • Zauber H.
      • rudolph i.-m.
      • Willnow T.E.
      • Akalin A.
      • Hautke V.
      • Gerhardt H.
      • Birchmeier C.
      • Kühnr.
      • Krauss M.
      • Diecke S.
      • 奇怪的准噶
      • Selbach M.
      无序区域的突变通过产生越琥氨酸基序可以引起疾病。
      )。在这里,我们组合无标签量化(
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.a.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )细胞培养中的氨基酸(Silac)(
      • ong s. -e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )确定特定的相互作用伙伴和突变对相互作用的影响。

       实践考虑因素

      在设计PRISMA屏幕时,应考虑几个实际点。首先,需要整体实验设计和用于数据分析和定量的策略:因为在肽下拉实验中鉴定的蛋白质将由非特异性互动者占主导地位,所以为单次特定互动者设计声音量化策略至关重要。量化方法,如无标记量化,氧化硅酸和化学标记是所有可能的选择(
      • Ankney J.A.
      • astor ankney J.
      • 救长A.
      • 陈X.
      基于质谱的蛋白质组学中的相对和绝对定量。
      )。这些方法中哪一种最适合给定的prisma屏幕取决于该屏幕的目标。在这种情况下关键问题是:比较哪些对照将进行任何给定的肽下拉?哪种统计策略将用于识别特定约束力?需要多少重复?屏幕中应包含哪些正面和阴性对照?
      第二个问题是如何获得纤维素阵列。尽管可以手动进行点合成(
      • Hilpert K.
      • Winkler D.F.H.
      • 汉考克里..
      肽阵列纤维素载体:点合成,时间和成本有效的方法,用于合成大量肽的平行和可寻址的方式。
      )使用像Multipep合成器(Intavis AG,​​Köln,德国)这样的专用机器更方便(为此目的)(
      • Volkmer R.
      • Tapia V.
      • Landgraf C.
      用于研究蛋白质相互作用域的合成肽阵列。
      )。或者,可以直接从JPT肽技术(德国)等公司直接订购定制肽阵列。这些肽斑点的直径为2-3mm,典型的屈服率在5-10nmol(平均15-MEL肽8-17μg)之间。这种高局部浓度有助于鉴定低亲和力相互作用。
      第三,无论如何进行现场合成如何,在设计肽序列时应考虑几个点。 FMOC基固相肽合成从C末端朝向N末端进行, IE。 在生物肽合成的相反方向(
      • 字段G.B.
      • 高贵的R.L.
      利用9-芴基甲氧基羰基氨基酸的固相肽合成。
      )。因此,标准点合成因此导致通过其C末端和自由N末端固定的肽。用乙酰化N末端合成肽通常有益,因为这(i)消除了正电荷,因此更好地反映了N末端参与酰胺键和(ii)的蛋白质序列内的情况使肽成为肽更稳定(
      • 凯茨C.
      • Levy-Beladev L.
      • Rotem-Bamberger S.
      • rito t.
      • RüdigerS.G.D.
      • 弗里德勒A.
      使用肽阵列研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )。因为通过其C Termini固定的肽不适合于筛选游离C Termini的相互作用伴侣,还开发了倒置膜上的肽的方法(
      • Boisguerin P.
      • 林根罗
      • AY B.
      • Radziwill G.
      • Moelling K.
      • 董兰
      • Volkmer-engert R.
      用游离C Termini合成纤维素膜结合肽的改进方法可用于PDZ结构域结合研究。
      )。考虑到单个耦合步骤的产量不是100%也很重要。因此,正确合成的全长肽的产率随着肽长度的增加而降低,这就是为什么肽不应长于约15个氨基酸。幸运的是,这与苗条的长度不到10个氨基酸(
      • Davey N.E.
      • van Roey K.
      • 耐候r.j.
      • Toedt G.
      • UYAR B.
      • 阿尔滕贝格B.
      • 伙计A.
      • Diella F.
      • Dinkel H.
      • 吉布森T.J.
      短线性图案的属性。
      ,
      • TOMPA P.
      • Davey N.E.
      • 吉布森T.J.
      • Madan Babu M.
      分子生物学家的一百万肽基序。
      )。此外,氨基酸的具体组合难以合成(
      • Tickler A.K.
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      “难肽”序列的固相合成概述。
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      FMOC肽合成膜的化学。
      )。未在一个偶联循环中掺入氨基酸导致在该位置缺失的肽。通过掺入封端步骤可以防止这种缺失,其阻断在随后的合成循环中缺陷的肽链(
      • Hilper K.
      • Winkler D.F.H.
      • 汉考克里..
      纤维素结合的肽阵列:制备和应用。
      )。虽然这导致截短的肽,但它应该降低肽与错误序列产生的假阳性鉴定的风险。
      肽的氨基酸组成是另一个重要因素。如果肽含有半胱氨酸,则肽与蛋白质之间的二硫键可能导致假阳性结果。在这些情况下,应考虑在孵育步骤期间加入还原剂,然而必须与用于肽固定化的化学相容。此外,尽管通常不会从纤维素洗脱肽,因此未在质谱仪中鉴定,含有含有蛋白酶的裂解位点的序列( 例如 R / K对于胰蛋白酶)也将被消化,因此成为质量规格测量中的丰富肽物种。为了避免错误识别,因此它们应该包括在蛋白质序列数据库中,以稍后搜索质谱。
      对于实际的下拉实验,使用包含推定的相互作用伙伴的细胞提取物是有利的。例如,对于神经元背景中的相互作用,使用来自神经元细胞系的提取物(
      • 迈耶克。
      • Kirchner M.
      • UYAR B.
      • 程J.-Y.
      • Russo G.
      • Hernandez-Miranda L.R.
      • Szymborska A.
      • Zauber H.
      • rudolph i.-m.
      • Willnow T.E.
      • Akalin A.
      • Hautke V.
      • Gerhardt H.
      • Birchmeier C.
      • Kühnr.
      • Krauss M.
      • Diecke S.
      • 奇怪的准噶
      • Selbach M.
      无序区域的突变通过产生越琥氨酸基序可以引起疾病。
      ),对于核蛋白质核提取物的互动伴侣是一个不错的选择(
      • Dittmar G.
      • Hernandez D.P.
      • Kowenz-Leutz E.
      • Kirchner M.
      • Kahlert G.
      • Wesolowski R.
      • Baum K.
      • Knoblich M.
      • hofstätterm.
      • Muller A.
      • 狼J.
      • reimer u.
      • 莱特阿。
      普里斯卡:肽基质上的蛋白质相互作用筛网揭示了内在无序的C /EBPβ的相互作用占状印迹和修饰依赖性偶联。
      )。无论采用何种提取物,它应该相当浓缩(5mg蛋白质/ mL)以增加屏幕的敏感性(
      • Dittmar G.
      • Hernandez D.P.
      • Kowenz-Leutz E.
      • Kirchner M.
      • Kahlert G.
      • Wesolowski R.
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      普里斯卡:肽基质上的蛋白质相互作用筛网揭示了内在无序的C /EBPβ的相互作用占状印迹和修饰依赖性偶联。
      ,
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      • UYAR B.
      • 程J.-Y.
      • Russo G.
      • Hernandez-Miranda L.R.
      • Szymborska A.
      • Zauber H.
      • rudolph i.-m.
      • Willnow T.E.
      • Akalin A.
      • Hautke V.
      • Gerhardt H.
      • Birchmeier C.
      • Kühnr.
      • Krauss M.
      • Diecke S.
      • 奇怪的准噶
      • Selbach M.
      无序区域的突变通过产生越琥氨酸基序可以引起疾病。
      )。需要大约10毫升裂解物,以覆盖具有200个斑点的阵列(〜30厘米2,肽网格:0.37cm×0.37厘米,JPT)。通常建议在4℃下进行下拉,并使用蛋白酶抑制剂。然而,最终洗涤缓冲液不应含有蛋白酶抑制剂,以确保有效的后续消化。在下拉洗涤后,纤维素膜可以空气干燥并储存。对于样品制备,各个斑点需要从纤维素膜切除并转移到96孔板的个体孔中。我们发现鼠标耳机是该步骤的有用工具,而干膜比湿润更容易处理。由于静电效应,切除的斑点倾向于从96孔板的孔中排斥,因此已经证明已经用消化缓冲液填充孔。然后可以以96孔格式进行还原,烷基化和消化。
      质谱测量的关键因素是色谱梯度的长度,因此是屏幕所需的总测量时间。在我们的经验中,单个下拉样品的复杂性相当低(几百蛋白质),这允许在质谱仪上进行相对较短的分析时间。梯度的长度应适用于蛋白质组学覆盖的所需深度,例如基于阳性对照样品。
      为了解释结果,重要的是要记住Prisma是一个 体外 筛选方法:具有诱饵的细胞裂解物的组合可能会带来从未在生理条件下满足的相互作用伙伴,从而导致错误的阳性鉴定。因此,在任何生物学结论可以从数据中抽出之前,需要在更多生理条件下进行验证的具体随访实验。

       结论和前景

      如上所述,PRISMA筛查是研究PPI的强大技术,所述PPI在无序的蛋白质区(IDRS)中由短线性图案(纤细)介导。这将有助于通过提供有价值的序列识别特异性的有价值的洞察力来表征新的Slim-Diame交互对。更好地了解指导这些瞬态相互作用的规则可能有助于我们在分子/细胞生物学中回答不同的问题,例如如何通过液 - 液相分离产生蛋白质 - 蛋白质相互作用的形成凝结物(
      • BANANI S.F.
      • Lee H.O.
      • Hyman A.A.
      • 罗森m.k.
      生物分子凝聚液:细胞生物化学的组织者。
      )或提供关于新出现的小型细胞素的功能的提示(
      • Leslie M.
      微型蛋白的新宇宙上升了细胞生物学和遗传学。
      )。一些检测到的肽也可以激活或抑制它们的相互作用伴侣的活性,并因此提供诊断或治疗目的。
      普里斯卡方法是可扩展的,每天已经生产数十种肽的数据。将来,进一步的样品制备自动化,更快的质谱仪和高效系统(如Evosep系统)(
      • Bache N.
      • Geyer P.E.
      • Bekker -Jensen D.B.
      • HOERNING O.
      • Falkenby L.
      • TREIT P.V.
      • 娃娃S.
      • Paron I.
      • MüllerJ.B.
      • 梅尔F.
      • 奥尔森J.V.
      • vorm o.
      一种新型LC系统在预先形成的梯度中嵌入分析物,以获得快速的超强植物蛋白质组学。
      )每天能够分析超过100个样品。通过TMTPRO组合多路复用(
      • 汤普森A.
      • WölmerN.
      • koncarevic s.
      • 塞尔特S.
      • BöhmG.
      • legner h.
      • 施密普
      • Kienle S.
      • 捏P.
      • höhlec.
      • Berfelde A.
      • Martinez-Pinna R.
      • Farztdinov V.
      • Kuhn K.
      • 派克I.
      TMTPRO:基于脯氨酸的Isobaric 16-Plex Tandem Mass标签试剂集的设计,合成和初始评估。
      )能够进行量化和组合测量多达16个样品,这有效地导致每天约1600分析。例如,使用16plexTMTPRO将允许在每个位置中的15个氨基酸长肽的丙氨酸扫描,并将其与单次运行中的野生型肽的酰胺进行比较。因此,我们预测基于肽的相互作用蛋白质组学将继续为我们提供无序区域的令人难以估量的区域,短线性图案及其功能的令人难以偏见的见解。

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