追逐磷酸碱蛋白:使用磷酸酶陷阱的选择性富集方法的发展*

  • DéboraBrochtrentini.
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    分子病理研究所 - IMP,Bohr-Gasse 7,A-1030维也纳,奥地利;
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  • Jakob Fuhrmann.
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    分子病理研究所 - IMP,Bohr-Gasse 7,A-1030维也纳,奥地利;
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  • 卡尔梅吉特勒
    一致
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    分子病理研究所 - IMP,Bohr-Gasse 7,A-1030维也纳,奥地利;

    奥地利科学院分子生物技术研究所 - IMBA,Bohr-Gasse博士3,A-1030维也纳,奥地利
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  • 蒂姆克劳森
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    分子病理研究所 - IMP,Bohr-Gasse 7,A-1030维也纳,奥地利;
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  • 作者脚注
    *导致这些结果的研究已收到欧洲共同体的第七框架计划(FP7 / 2007-2013)/ Grant协议No.241548 - Meiosys和262067 - Prime-XS以及来自奥地利科学基金的SFB F3402,P 22570 - B09(DBT)和TRP 308-N15。 IMP由Boehringer Ingelheim资助。
    本文含有补充材料。

      抽象的

      精氨酸磷酸化是一种新兴的翻译后蛋白质改性,其涉及细菌应激反应。尽管早期的报道表明,由于磷酸碱的酸性损伤所产生的技术困难,从未使用现代质谱法研究了精氨酸磷酸化也发生了精氨酸磷酸化。如最近所示,MCSB和YWLE蛋白来自枯草芽孢杆菌用作高度特异性的蛋白质精氨酸激酶和磷酸酶耦合,塑造磷酸碱蛋白质组。用一个B.枯草芽孢杆菌 Δywle.作为精氨酸 - 磷酸化蛋白的源,我们能够使质谱(MS)方案适应精氨酸改性的特殊化学性质。尽管进行了这一进展,但鉴于将在磷酸肽富集程序期间与磷酸杀菌素竞争的巨大丰富的丝氨酸/苏氨酸磷酸化以及在数据依赖性MS采集期间,鉴于磷酸碱/苏氨酸磷酸化的蛋白质精氨酸磷酸化的分析仍然具有挑战性。因此,我们列出了作为磷蛋白质分析中的初始步骤选择富集精氨酸磷酸化蛋白的方法。为此目的,我们开发了ywle磷酸酶的基材捕获突变体,其保留朝向精氨酸磷酸化蛋白的结合亲和力,但不能水解捕获的基材。通过测试许多活性位点取代,我们鉴定了稳定结合精氨酸磷酸化蛋白的YwLe突变体(C9A)。通过阻碍磷酸酶突变体的低聚,我们进一步提高了基材捕获效率。工程化Ywle捕集器有效地捕获了复杂的精氨酸磷酸化蛋白B.枯草芽孢杆菌 Δywle.细胞提取物,从而促进了大量细胞蛋白质修饰中磷酸碱位点的鉴定。总之,我们提出了一种用于选择性富集的新型工具及其对精氨酸磷酸化的后续MS分析,这是一个很大程度上忽略的蛋白质修饰,对真核细胞信号传导可能是重要的。
      蛋白质的翻译后修饰是所有活细胞使用的重要信号转导机制。可逆蛋白质磷酸化几乎涉及细胞调节的几乎各方面,例如生长,增殖和存活,响应于细胞内和细胞外刺激。由于有效的磷酸富集技术和敏感的MS仪器的发展,蛋白质磷酸化的广泛影响已被揭示,这最终能够实现大规模磷蛋白质分析(
      • roux p.p.
      • Thibault P.
      磷蛋白质的年龄段;从大数据集到蛋白质功能的推动。
      )。然而,大多数研究仅限于分析丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸磷酸化,因为它们最适合目前可用的方法。虽然几十年前描述了组氨酸,精氨酸和赖氨酸残留物的磷酸化,但它们的分布仍然难以捉摸,因为这些修饰是酸不稳定,因此与标准MS方法不相容。稳定性的差异来自于磷酸碱,磷酸孔和磷酸酐残基的事实中,磷酸盐与氮原子(N-磷酸化)连接,形成酸不稳定的磷酸键(
      • 除了P.G.
      • attwood p.v.
      • Piggott M.J.
      专注于磷酸甘油和磷酸。
      )。相比之下,在磷素,磷酸磷脂和磷酸磷酸磷酸核素残余物中,磷酸盐部分与羟基(O-磷酸化)连接,得到酸稳定的磷酸酯键(
      • 除了P.G.
      • attwood p.v.
      • Piggott M.J.
      专注于磷酸甘油和磷酸。
      )。酸性条件是大多数磷蛋白酶方案中固有的。因此,我们的团队建立了一个TIO2基于磷蛋白酶的工作流程与酸性不稳定磷酸化分析相容(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。我们使用开发方法在革兰氏阳性细菌中研究蛋白质精氨酸磷酸化 枯草芽孢杆菌,揭示磷酸碱在细菌应激反应调节中的中心作用(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。
      为此,已经表明精氨酸磷酸化是一个重要但很大程度上未开发的蛋白质修饰。蛋白质精氨酸磷酸化的证据主要在20世纪70年代和20世纪80年代获得(参考文献中审查。
      • 除了P.G.
      • attwood p.v.
      • Piggott M.J.
      专注于磷酸甘油和磷酸。
      • CieœlaJ.
      • Frączykt.
      • 骑行W.
      蛋白质碱性氨基酸残基的磷酸化:重要但容易错过。
      )。例如,在一系列研究中,Wakim和同官员部分纯化了显示的染色质激酶 体外 精氨酸磷酸化活性对组蛋白H3。这种激酶可以与两个小鼠白血病细胞分离(
      • Wakim B.T.
      • aswad g.d.
      小鼠白血病细胞核激酶 - 来自小鼠白血病细胞的核激酶,Ca(2 +) - 钙调蛋白依赖性磷酸盐中的核激酶。
      )和静态鼠心脏内皮细胞(
      • Wakim B.
      • Grutkoski P.
      • 沃恩阿。
      • Engelmann G.
      与主动分割细胞相比,刺激静态大鼠心脏内皮细胞中的Ca2 + -Calmodulin活化组蛋白3精氨酸激酶。
      )。然而,不能确定激酶的身份,这些研究也没有使用现代MS的技术进行研究。详细描述的第一蛋白质精氨酸激酶是MCSB,发生在 B.枯草芽孢杆菌 和相关的革兰氏阳性细菌(
      • Fuhrmann J.
      • 施密特A.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Turgay K.R.
      • Mechtler K.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      MCSB是一种蛋白质精氨酸激酶,其磷酸化并抑制热休克调节剂CTSR。
      )。通过对转录阻遏物CTSR的活性产生负面调节III类热休克基因的表达,包括伴侣蛋白和蛋白酶,以及包括伴侣蛋白和蛋白酶的表达,MC​​SB在压力条件下起作用。 MCSB. gene itself (
      • Fuhrmann J.
      • 施密特A.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Turgay K.R.
      • Mechtler K.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      MCSB是一种蛋白质精氨酸激酶,其磷酸化并抑制热休克调节剂CTSR。
      ,
      • Kirstein J.
      • Zühlked。
      • 杰斯州U.
      • Turgay K.
      • Hecker M.
      酪氨酸激酶及其活化剂控制CTSR热冲击压缩机的活性 B.枯草芽孢杆菌.
      )。除了CTSR,MCSB已被证明至少40种不同的蛋白质 体内 以压力依赖的方式(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。尖锐地,MCSB不显示已知的丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸蛋白激酶的任何同源性,但它对磷酸磷酸化的磷酸酯,其磷酸化的游离精氨酸或肌酸的胍基团,其用作短期能量储存分子。结果,序列同源性搜索不能将MCSB样蛋白精氨酸激酶与代谢酶区分开来。在 B.枯草芽孢杆菌,MCSB的活性由蛋白质 - 精氨酸磷酸酶Ywle抵消(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      ,
      • elsholz A.
      • Turgay K.
      • Michalik S.
      • 黑暗B.
      • Gronau K.
      • Oertel D.
      • Mäderu。
      • 伯恩哈特J.
      • BECHER D.
      • Hecker M.
      • 杰斯州U.
      蛋白质精氨酸磷酸化对枯草芽孢杆菌生理的全局影响。
      )。尽管对蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶(PTP)进行序列和结构同源性,但
      使用的缩写是:PTP,蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶; Acn,乙腈; PSM,肽光谱匹配; BPA. , p - 苯并 - L - 苯丙氨酸; DiZpk,3-(3-甲基-3H-二氮杂物-3-基) - 丙普氨基羰基-NE-L-赖氨酸; TIO.2, 二氧化钛。
      1使用的缩写是:PTP,蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶; Acn,乙腈; PSM,肽光谱匹配; BPA. , p - 苯并 - L - 苯丙氨酸; DiZpk,3-(3-甲基-3H-二氮杂物-3-基) - 丙普氨基羰基-NE-L-赖氨酸; TIO.2, 二氧化钛。
      ywle对磷脂茎非常具体。在主动部位本地化的高度保守的PTP签名基序中的单个氨基酸取代(苏氨酸代替异亮氨酸)建立了对发音磷杀素选择性负责的极性滤波器(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。生物信息和生物化学分析确定了一个 善意 精氨酸磷酸酶,CG31469 果蝇黑胶基,封存特征苏氨酸过滤器残留物(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。因此,精氨酸磷酸化可以是广泛和高度忽略的蛋白质修饰。
      除了磷酸酯键的酸敏感性之外,用于在较高真核生物中分析精氨酸磷酸化的另一个重要警告是O-磷酸化的显着丰度,其可能隐藏在其他,较少代表的磷酸化的存在。例如,已经提出了人体细胞的磷酸溶和物中可能存在超过100,000 o-磷酸化位点(
      • C.
      基于质谱的蛋白质组学解码信号网络。
      )。目前,常规的磷蛋白质研究能够在真核细胞系中鉴定超过10,000种磷酸肽(
      • 迪帕尔玛斯。
      • Zoumaro-djayoon A.
      • 彭米
      • 发布H.
      • 预想赛C.
      • 慕尼宫
      • Heck A.J.
      在干草堆中找到相同的针?免疫亲和力沉淀和金属基亲和力色谱法富集的磷酸酪氨酸肽的比较。
      )。这种丰富的磷酸化可以在磷酸化富集程序期间与磷酸碱进行竞争,以及在数据依赖性MS采集期间优先选择。在这里,我们提出了一种方法,用于在MS分析之前富集用于精氨酸磷酸化的样品。为此目的,我们开发了一种ywle磷酸酶捕获突变体,其可用于从细胞提取物中拉下精氨酸磷酸化蛋白。产生的样品复杂性的降低应极大地促进真核样品中的精氨酸磷酸化。

      实验步骤

       B.枯草芽孢杆菌 Cultures

      A B.枯草芽孢杆菌 携带A. ywle. :: SPECR. 染色体插入(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )在液体Luria-Bertani培养基中生长。在37℃下生长过夜的培养物在2L新鲜培养基中稀释至 A600 0.05,并在37℃下孵育200rpm轨道摇动直至 A600 达到0.8。诱导热应激并因此增加MCSB活动(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      ),在15分钟的时间跨度上升温至48℃,然后将培养物在该温度下再保持30分钟。通过以4000rpm离心收获细胞30分钟并用缓冲液洗涤(25米m Tris / HCl,pH 7.5,100米m NACL)。将干燥的丸粒等分试样储存在-80℃。

       DNA构建设计

      以前公布的质粒用于两者 B.枯草芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus ywle. expression (
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。它们对应于含有全长的PET21A(+)(Novagen,Darmstadt,德国)矢量 ywle. 基因融合到C末端六甲酰组氨酸标签。使用Quikchange II站点定向诱变套件(安捷伦Technologies,Santa Clara,CA)生成突变ywle版本。通过DNA序列分析验证所有构建体。

       蛋白质表达和纯化

      ywle. G.STE. 过度表达 大肠杆菌 BL21(DE3)应变。将细胞在37℃下在37℃下,在加入100mg / ml氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基中,直至指数阶段( A600 达到0.6〜0.8)。然后用0.5米诱导表达m 异丙基1-硫代-β-D-半乳糖醇3小时。通过以4000rpm离心收获细胞30分钟,用缓冲液a洗涤(25米m Tris / HCl,pH 7.5,300米m NaCl),并在-80℃下储存干燥。用于生产含有人工氨基酸的蛋白质 BPA. 和 DiZPK, the YwlE G.STE. 将含有特异性琥珀色密码子突变的表达载体转化为 大肠杆菌 BL21(DE3)载体携带用于编码的正交TRNA和合成酶对负责掺入非自然氨基酸的质粒。质粒pdule-p BPA. (
      • Farrell I.S.
      • Toroney R.
      • Hazen J.L.
      • mehl r.a.
      • 下巴J.W.
      具有遗传编码的二苯甲酮的相互光交联蛋白质。
      )和psupar-mb-dizpk-rs(
      • 张米
      • 林S.
      • 歌曲X.
      • 刘杰。
      • 傅y.
      • GE X.
      • 傅X.
      • 昌Z.
      • 陈P.R.
      遗传掺入的交联剂揭示了酸性抗性的伴侣合作。
      )被用来添加 BPA. 分别分别是二氧化棉氨基酸。表达条件是相同的,除了将培养物补充有四环素25μg/ ml和1米m BPA. (Bachem,Bubendorf,瑞士)或34μg/ ml氯霉素和1米m Dizpk(由陈博士提供)。
      为了纯化,将细胞粒料重悬于含有1mg / ml溶菌酶的缓冲液中,0.1μmm PMSF和10μg/ ml DNase,在冰上孵育30分钟,并通过超声处理中断。通过在4℃下以20,000rpm离心30分钟并加载裂解物30分钟2+ - 在缓冲A中平衡的 - 硝基乙酸柱(HISRAP HP,GE Healthcare Lifescience)使用阶梯式咪唑梯度进行洗涤,通常在25和50米处进行m 浓度。他标记的蛋白质用250米洗脱m 咪唑和使用Vivaspin设备浓缩(GE Healthcare Lifescience)。然后使用25米平衡的Hiprep 26/10脱盐柱(GE Healthcare Lifescience)进行缓冲交换。m Tris / HCl,pH 7.5,100米m NACL。 When YwlE G.STE. 被纯化用于结晶试验,Ni2+ - 将硝基乙酸酯洗脱级分施用于超级电蛋白-75柱(准备级; GE Healthcare Lifesciences),用20米平衡m Tris / HCl,pH 7.5,100米m NACL。在加入10%甘油后,将蛋白质等分试样在-80℃下储存。这 B.枯草芽孢杆菌 Ywle C7a突变体用于比较 B.枯草芽孢杆菌G. StearotherMophilus. ywle捕获突变体(补充图S2以相同的协议表达和纯化。分析ywle G.STE. 使用25米的Superdex 75 3.2 / 30柱(GE Healthcare Lifesciences)进行通过分析凝胶过滤的低聚状态m Tris / HCl,pH 7.5,100米m NaCl.

       YWLE的结晶和结构溶液 G.STE.

      ywle. G.STE. 通过在96孔板中在19℃下在96孔板中脱落蒸汽扩散方法生长晶体。 ywle. G.STE. 通过将100nL的蛋白质(80mg / ml)与含有2的100nL储层溶液混合通过混合100nl蛋白质(80mg / ml)来结晶 m 硫酸铵和100米m Tris / HCl,pH8.2。晶体属于单斜空间组 P21 并包含一个ywle G.STE. 每个不对称单位的二聚体。对于低温保护,将晶体转移到补充有25%甘油的结晶溶液中,然后在液氮中闪蒸冷冻。使用Pilatus探测器(Dectris,Baden,Switzerland),在λ=0.9762Å处的瑞士光源(光束线X06SA)收集单波长异常分散实验的数据。衍射数据索引并与MOSFLM集成(
      • Sarmiento M.
      • Puius Y.A.
      • 芬特S.W.
      • k y.f.
      • 吴L.
      • 赵玉。
      • 劳伦斯D.S.
      • ALMO S.C.
      • 张Z.Y.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶1B底物识别性能的结构基础。
      )和用scala缩放(
      • 埃文斯P.
      数据质量的缩放和评估。
      )。硒位点与SNB(
      • 周下午节。
      • 米勒R.
      SNB版本2.0的设计与实现。
      ),用尖锐进行晶体序列(
      • Bricogne G.
      • vonrhein c.
      • Flensburg C.
      • 舒尔茨米
      • Paciorek W.
      结构决定中的阶段信息的生成,表示和流动:夏普2.0周围和周围的发展。
      )和溶剂扁平与所罗门(
      • 亚伯拉罕J.P.
      • Leslie A.G.W.
      牛线粒体F-1 ATP酶结构测定的方法。
      )。所得到的电子密度图具有优异的质量,允许YWLE和结合的磷酸盐和水分子的明确追踪。该结构是用程序ARP / WARP(
      • Langer G.
      • 科恩S.X.
      • Lamzin V.S.
      • Perrakis A.
      使用ARP / Warp Version 7用于X射线晶体学的自动大分子模型建筑。
      ),o(
      • 琼斯T.A.
      • zou j.y.
      • 杨丹S.W.
      • kjeldgaard m.
      改进的电子密度图中蛋白质模型的方法和这些模型中的误差的位置。
      ),傻瓜(
      • Emsley P.
      • 京局K.
      Coot:用于分子图形的模型建筑工具。
      )和CNS(
      • Brunger A.T.
      • 亚当斯P.D.
      • 陆军上午。
      • Delano W.L.
      • Gros P.
      • Grosse-Kunstleve R.W.
      • 江泽民
      • Kuszewski J.
      • unges m.
      • Pannu N.S.
      • 阅读r.j.
      • 米饭
      • Simonson T.
      • 沃伦G.L.
      晶体学&NMR系统:一种用于大分子结构测定的新软件套件。
      ),用Pymol(SchrödingerPortland,Or,LLC)制备分子插图。概述了数据收集,分阶段和细化统计 补充表S1.

       Ywle-ysoszyme下拉

      精氨酸 - 磷酸化的溶菌酶用作试验YwLe突变体与精氨酸磷酸化的结合的模型蛋白。选择溶菌酶,因为(1)其优异的稳定性,(2)其高碱性的性质,其促进磷酸化形式通过阳离子交换色谱纯化,(3)其小尺寸,促进了完整的蛋白质质量测量磷酸化率估计。为了获得纯磷酸化形式,60mg溶菌酶(Sigma)被磷酸化 体外 10毫克重组 G. StearotherMophilus. MCSB(如前所述纯化(
      • Fuhrmann J.
      • 施密特A.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Turgay K.R.
      • Mechtler K.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      MCSB是一种蛋白质精氨酸激酶,其磷酸化并抑制热休克调节剂CTSR。
      ))在50米中m TRIS / HCl,pH 7.5,50米m KCl, 8 mm MgCl2, 1 mm 在35℃下ATP 1小时。通过4000离心清除反应g 20分钟并施加到5-ml HITAP肝素HP柱(GE Healthcare Lifesciences),用25米平衡m TRIS / HCl,pH 7.5,50米m KCL。通过50米的50分钟的线性KCl梯度分离磷酸化和不磷酸化的形式m to 1 m 最终浓度(补充图S1A)。对于磷酸化分析,早期洗脱级分用70%乙腈(ACN),0.1%甲酸稀释,迅速转移到静态纳米电喷雾电离发射器(ES380,Proxeon,West Palm,FL),直接注入LTQ-Velos在距离800 V蛋白质群体的靶标质谱仪(Thermo Scientific)以100,000(补充图S1B)。派对呈现高纯度(>99%)保持单磷酸化的溶菌酶形式进行进一步使用。
      对于下拉实验,Ywle首先绑定到磁珠(Dynabeads His-Tag Hiss-Tag Histation&25米的下拉,Invitrogen)m Tris / HCl,pH 7.5,300米m NaCl, 1 mm DTT。通过将珠孵育前后的上清液中的蛋白质浓度与通过Bradford方法(Bio-rad蛋白质测定试剂盒)测量来估计结合的蛋白质。通过在25米中培养7μmol溶菌酶,通过将7μmol的珠粒固定的ywle孵育7μmol珠粒菌,进行磷尿苷结合m Tris / HCl,pH 7.5,100米m KCl, 1 mm DTT在4°C下温和搅拌下1小时。然后用25米洗涤珠子三次m Tris / HCl,pH 7.5,150米m NaCl, 1 mm DTT。通过在SDS样品缓冲液中沸腾珠粒洗脱蛋白质,其允许通过SDS-PAGE直接分析。或者,通过在100米处孵育珠子进行Ywle键的蛋白质的洗脱m Tris / HCl,pH 7.5,100米m NaCl containing 10 mm phospho-l-Arginine三钠盐(多伦多研究化学品,加拿大)在室温下2小时。程序imagej(
      • 施耐德C.A.
      • Rasband W.S.
      • Eliceiri K.W.
      nih图像到imagej:25年的图像分析。
      )用于在SDS-PAGE凝胶中定量Coomassie染色蛋白条带。
      测试Dizpk的光电区或 BPA. - aining纱 G.STE. 将突变体捕获到精氨酸 - 磷酸化蛋白,等摩尔量的ywle G.STE. 将突变体和磷碱或对照溶菌酶在12μm一起孵育在一起m 在4℃下浓缩1小时。然后使用100W长波汞灯(UVP,Upland,CA)将样品暴露于UV光30分钟(或根据另外指示)。 ywle的共价连接 G.STE. 然后通过SDS-PAGE分析溶菌酶。

        ywle. G.STE. 使用B.枯草芽孢杆菌ΔYwle细胞提取物的体外下拉

      对应于〜1.5升的干颗粒 B.枯草芽孢杆菌 在15毫升25米中重新悬浮培养m Tris / HCl,pH 7.5,100米m 用3mg / ml溶菌酶,10μg/ ml dNase,0.1米加压NaClm PMSF和1X完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)并在冰上温育30分钟。细胞被超声处理破坏,并且通过以20,000离心清除裂解物g 30分钟。使用Bradford方法估计蛋白质含量。将38mg蛋白质提取物的等分试样与1mg纯化混合 G. StearotherMophilus. Ywle(D117a,c9a或c9a f39 BPA. 在结合缓冲液中,一式三份(25米)m Tris / HCl,pH 7.5,100米m NaCl)在最终体积为2毫升,导致YWLE G.STE. 浓度为30μm。 ywle的绑定 G.STE. 磷酸碱在4℃下进行1小时。然后将相当于6mg His-TagaDabeads(Invitrogen),在结合缓冲液中平衡,向每个样品中加入,并在搅拌下在4℃下孵育样品。用1ml结合缓冲液洗涤珠子两次,并重悬于200μl相同缓冲液的最终体积。在SDS样品缓冲液中煮沸2%所得悬浮液的等分试样,并通过SDS-PAGE直接分析。剩余的样品用2米降低m DTT在56℃下30分钟,用10米烷基化m 在室温下在黑暗中碘乙酰胺30分钟,并在37℃下用5μg胰蛋白酶金(质谱级,麦氨酸,麦迪逊,Wi)消化过夜。基于保留时间和UV强度(214nm)分布在整体柱上的所得上清液的0.1%等份的0.1%等分试样(Ultimate Plus配备百分比PS-DVB柱, 5厘米×200μm,所有Dionex / Thermo-Fisher Scientific)。通过中性pH的反相C18固相萃取从缓冲液试剂中纯化每种样品(Strata-x 200 mg盒,现象,托兰,CA)。将冻干样品重新悬浮于20μlH2o和tio2 使用0.5mg钛5-μm树脂(GL科学,东京,日本)的磷肽富集是根据用于酸性稳定性磷酸化的最近发表的(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。简而言之,将临界结合步骤在调节至pH 4的乳酸盐/乙酸盐溶液中进行30分钟(300mg / ml乳酸,12.5%乙酸,0.2%庚二丁酸,60%ACN),这是一种条件不会发生磷酸碱的显着水解(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。使用溶剂A(200mg / ml乳酸,75%AcN,2%三氟乙酸,2%庚二丁酸),溶剂B(200mg / ml乳酸,75%ACN ,10%乙酸,0.1%七氟丁酸,pH 4,用NH3),溶剂C(80%AcN,10%乙酸)。最后,用1%NH洗脱结合的肽3 解决方案。此外,根据FASP方案()根据FASP方案处理30mg为下拉制备的蛋白质提取物(
      • WiśniewskiJ.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      蛋白质组分析的通用样品制备方法。
      )和所得固相提取纯化的胰蛋白酶消化的三种1mg等分试样提交给TiO2 使用1mg硫苯甲酸树脂富集。
      注意,我们无法观察到任何 体外 binding of the YwlE G.STE. 将突变体捕获到精氨酸 - 磷酸化的肽样品(数据未显示)。这与磷酸酶具有明显降低的使用磷酸肽作为基材的能力(
      • Pinna L.
      • Donella-Deana A.
      磷酸化的合成肽作为研究蛋白质磷酸酶的工具。
      )。因此,在磷酸尼浓缩方法中,我们在此报告,TIO2 磷肽富集步骤不能避免。

       LC-MS / MS

      在最终的3000 RSLC纳米流色谱系统(Thermo Scientific)上实现了所有肽混合物的反相分离。如前所述(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      ),0.5%乙酸(pH 4.5带NH3)被用作装载溶剂,以防止磷酸碱水解在预先除柱中的盐(Pepmapacclaim C18,5mm×0.3mm,5μm,Thermo Scientific)中。通过将线性梯度施加来自220%至35%溶剂B(80%ACN,0.08%甲酸)的线性梯度,在C18分离柱(Pepmapacclai1 C18,0.75mm,2μm,Thermo Scientific)上实现了肽分离。或以230 nL / min的流速为240分钟(分别下拉和霰弹枪样品)。溶剂A是2%ACN,0.1%甲酸。通过UV检测监测分离,检测器的出口直接耦合到纳米电喷雾电离源(Proxeon Biosystems)的MS分析。
      使用Picotip Nanospray发射器提示(新目的,Woburn,MA),将样品注入LTQ orbitrap Velos电子转移解离质谱仪(Thermo Sciencific),电压为1.5 kV。以阳性电离模式以数据依赖性方式分析肽,施加两种不同的碎片方法:碰撞诱导的解离和电子转移解离。选择调查扫描以60,000的分辨率获取,并且选择具有等于或高于2+的充电状态的六个最丰富的信号,并为肽碎片分析选择了1500计数的强度阈值。对于MS / MS实验,将前体离子分离在以观察到的2.1-DA窗口内分离 m/z。为了防止重复的肽的重复破碎化,从MS / MS分析动态地排除选定的前体30秒。在标准多级激活方法中,在标准多级活化方法中,在35%的常规碰撞能量下以35%的常规碰撞能量实现了碰撞的解离碎片35%的抗磷酸化前体。对于电子转移解离,将肽与氟蒽阴离膜一起温育,允许充电 - 状态依赖性孵育时间(90ms对于3 +带电肽),并在离子阱分析仪中检测所得肽片段。

       数据分析

      使用蛋白质发现者软件套件(1.4.0.288,Thermo Scientific)提取原始数据,并针对组合的前进/颠倒数据库搜索 B.枯草芽孢杆菌 (菌株168)使用吉祥物(3.2.07版,矩阵科学,英国,总共4455个条目)加入(总共4455个条目)的Uniprot参考蛋白质组。将半胱氨酸的氨基甲酰化被设定为固定改性。选择丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸和精氨酸和蛋氨酸氧化的磷酸化作为可变修饰。由于胰蛋白酶乳化剂在磷酸化精氨酸中受损,所以允许最多两个错过的裂解位点,而两种末端的完全胰蛋白酶切割是必需的。肽质量偏差设定为5ppm;使片段离子具有0.8da的质量偏差。使用过滤器工具评估错误的发现率(
      • KällL.
      • 坎特伯雷J.D.
      • 韦斯顿J.
      • 贵族W.S.
      • maccoss m.j.
      霰弹枪蛋白质组学数据集的半监督学习肽鉴定。
      )在蛋白质发现者包里。将结果滤出肽等级1和高识别置信度,对应于1%的假发现率。当不再通过其他重复或实验中的额外高分辨率识别不进一步支持,从分析中排除低分肽(吉祥物评分≤18)。在将肽被映射到多于一种蛋白质序列的罕见情况下,报告了两种蛋白质命中。对于可靠的磷酸化位点分析,所有磷酸肽击中都会被磷光体软件自动重新成分(
      • Taus T.
      • KöcherT.
      • Pichler P.
      • Paschke C.
      • 施密特A.
      • Henrich C.
      • Mechtler K.
      使用磷光体的普遍和自信的磷酸化位点定位。
      )在蛋白质发现者软件套件中。当报告的荧光粉概率大于90%时,我们认为磷酸化位点是本地化的。谱报告含糊不清的磷酸化定位(荧光粉现场概率<90%)单独报告 补充表S2-S5 并且被排除在进一步的分析之外。当在一个样品中获得同一磷酸肽的多种肽 - 光谱匹配(PSM)时,我们选择仅呈现PSM呈现最佳识别/定位分数妥协。将多个冗余PSM根据其荧光粉概率分为三类(90%-94%,94%-97%和97%-100%)进行排名;据报道,PSM呈现最佳吉祥物评分在获得的最高磷光体类别中。在磷酸肽具有指向不同磷化局部的多个PSM的情况下,手动检查相应的光谱。因此,PSM呈现错误或不确定的本地化的PSM被排除在磷酸肽的最终列表中。值得注意的是,82.5%的局部精氨酸磷酸化非常高(>99%)概率得分。乘法磷酸化肽(在单独的标签中报道 补充表S1至S4)也被排除在分析之外,因为它们不能被分类为“磷酸化类型”类别。

       定量分析

      为了更好地判断九个下拉样品的磷酸碱含量的差异(D117a,c9a和c9a f39 BPA. 一式三份),所有鉴定的磷酸氨肽肽根据来自MS1全扫描的时间强度色谱图的总面积定量。为此目的,软件天际线版本2.1.0.4936(
      • 席克宁B.
      • rardin m.
      • 麦克莱恩B.
      • Zawadzka A.
      • Frewen B.
      • Cusack M.
      • Sorensen D.
      • Bereman M.
      • 静E.
      • 吴C.
      • verdin E.
      • Kahn R.
      • Maccoss M.
      • 吉布森B.
      使用MS1提取的离子色谱图在天际线上独立和无标记定量蛋白质组学数据的定量。应用于蛋白质乙酰化和磷酸化。
      )与标准数据依赖性分析MS1过滤设置一起使用,不同之处在于在转换设置中应用了0.01 Th的离子匹配公差,并且仅考虑了MS / MS标识的10分钟内的扫描。我们手动检查并纠正了所有峰值分配,以保证最少的干扰和选择正确峰值。仅呈现0.9或更高的同位素点 - 产物的峰(其意味着峰不需要呈现低干扰和与检测中的肽的可靠相似性)被包括在最终分析中。缺失值表示不存在含有高于0.9以上同位素点产品的定义峰的峰,这意味着在各种样品中检测(或完全不存在)的磷酸肽。为了避免冗余,当检测到多个充电状态时,只保留最丰富的充电状态。在发现磷酸肽的九种情况下,在没有甲硫氨酸氧化,相应的总面积得到总结。总体而言,在下拉实验中鉴定的136个磷酸甘油肽的肽,我们能够量化132(97%)。

       数据可用性

      本研究的质谱数据已提交给Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizcaínoJ.A.
      • CôtéR.G.
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Pérez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • ríosd.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      )并分配标识符PXD000560。 ywle. G.STE. RCSB蛋白质数据库中提供了Crystal结构,其中包含加入代码PDB 4PIC.

      结果

       开发精氨酸磷酸酶捕获突变体

      “底物捕获磷酸酶”是指催化失活的突变酶,但保留它们的底物结合能力。通常,通过突变含有底物去磷酸化的活性位点残基来阻断催化步骤。结果,基质被捕获在磷酸酶的催化​​袋中,并且在大多数情况下,酶 - 底物相互作用足以稳定,用于共致纯化。捕获突变体已被广泛用于许多蛋白质酪氨酸磷酸酶的表征,作为分离和鉴定其生理基质的方法(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。 ywle精氨酸磷酸酶具有与类似催化机制的低分子量PTP的结构和序列同源性(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。细菌Ywle是由最小磷酸酶核心组成的17-KDA蛋白,并且缺乏额外的结构基序,例如额外的衬底识别结构域。因此,ywle是一种非常混杂的精氨酸磷酸酶,其意义上是它特别靶向磷酸碱残留物,无论蛋白质背景如何。因此,我们推理Ywle捕获突变体可以用作分离精氨酸磷酸化蛋白的普遍工具。
      与典型的蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶相似,ywle精氨酸磷酸酶采用两个关键的活性位点残基用于去磷酸盐的基材:Cys-9和Asp-117在Ywle中 G.STE. 。半胱氨酸残基作为攻击基材的磷中心的亲核试剂,导致共价磷酸 - 半胱氨酸中间体(蛋白质 - 精氨酸磷酸酶 - Cys•PO3 )(
      • 张Z.Y.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶研究的化学和机械方法。
      )。在酪氨酸磷酸酶捕获突变体中,半胱氨酸残基通常被丝氨酸取代,阻碍了去磷酸化反应中的初始步骤,并导致形成稳定的非共价PTP-Ser•PO3-substrate复杂(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。在Ywle中,催化天冬氨酸作用(1)作为将外酸的一般酸质子质子,如将水分子的一般碱作为一般碱,以水解Cys-Po3 反应中间体,从而释放游离磷酸盐并再生活性酶。重要的是,天冬氨酸(ASP-117)位于 d - 在底物结合物上封闭磷酸化残余物的活化。在酪氨酸磷酸酶中,底物结合诱导8-至12-Å的偏移 d-环形。该运动将基板保持在适当位置,并将临界天冬氨酸残基与基板紧密接近(
      • 张Z.Y.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶研究的化学和机械方法。
      )。在天冬氨酸突变的捕获磷酸酶中,残余物通常突变为丙氨酸,因此催化被阻止但是 d - 保持和随后的基板的封装被维持(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。
      为了获得YwLe精氨酸磷酸酶的底物捕获突变体,我们产生了三种突变版本的高活性和稳定的蛋白质 G. StearotherMophilus.,ywle. G.STE. 。这些突变体是在最近报告的同源的晶体结构的基础上设计的 B.枯草芽孢杆菌 phosphatase YwlE B.SUB. 。 ywle的结构数据 B.SUB. C7s突变体与游离磷脂酸孵育(PDB 4KK4)表明,与PTP Cys / Ser突变体相反,对于YwLe,Cys / Ser突变导致形成磷酸化的丝氨酸残基,而不是稳定的蛋白质 - 精氨酸磷酸酶-Ser•Po3-substrate复杂(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。虽然这个ywle突变体几乎没有活跃(
      • Fuhrmann J.
      • Subramanian V.
      • 汤普森P.R.
      用催化氧化还原基抑制剂靶向精氨酸磷酸酶YwLe。
      ),因为活性酶未被再生,所以它不是合适的捕获突变体,因为不磷酸化的基质被释放。因此,我们突变了ywle的催化半胱氨酸 G.STE. 对于丙氨酸,从而完全废除亲核反应性。而且,Ywle的高分辨率晶体结构 B.SUB. 用活性位点捕获的底物模拟精氨酸(PDB 4KK3)显示催化天冬氨酸与精氨酸底物的胍基团形成氢键(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。因此,除了经典的D117a突变之外,我们还测试了D117N突变,旨在在该位置保持氢键。
      为了评估其基材捕获能力,我们纯化了ywle的他标记的重组形式 G.STE. C9A,D117A和D117N突变体通过HIS标签下拉对其与精氨酸磷酸化蛋白质的结合进行了测试。为此目的,我们通过磷酸化鸡溶菌酶制备了磷酸碱基模型蛋白质 体外 通过重组MCSB精氨酸激酶并随后通过阳离子交换色谱法从不磷酸化的形式纯化磷酸化的溶菌酶(补充图S1A)。获得的磷酸碱基模型蛋白为100%单磷酸化,磷酸化位点分布在七个不同的精氨酸残留物中(补充图S1B和S1C )。 Fig. 1 shows that the YwlE G.STE. 半胱氨酸突变体 - 但出乎意料地,不是两个天冬氨酸突变体 - 可以稳定地结合精氨酸磷酸化的基质。另外,为了进一步确认Cys / Ala突变的捕获效果,并比较替代Ywle蛋白的底物捕获效率,我们测试了各自的突变 B.枯草芽孢杆菌 ywle磷酸酶。我们还观察到ywle的绑定 B.SUB. C7a至磷脂蛋白蛋白,尽管效率降低(补充图S2)。因此,我们雇用了更高效的 G. StearotherMophilus. ywle蛋白在所有后续捕获突变体下拉。值得注意的是,在两者中 B.枯草芽孢杆菌G. StearotherMophilus. Ywle Cys / Ala突变体,结合的磷脂碱溶菌酶,但不是不相磷酸化的对照,可以部分地用游离磷酸碱孵育部分释放,证明了精氨酸磷酸化溶菌酶与活性位点的特异性结合(补充图S2)。因此,得出结论,Ywle Cys / Ala突变体可以有效地捕获精氨酸磷酸化的蛋白质。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1测试ywle. G.STE. 磷酸碱结合的活性位点突变体。 A,下拉实验用于评估三个他标记的三个的结合 G. StearotherMophilus. YwLe突变体(YwLe D117N,D117a和C9a)朝向精氨酸 - 磷酸化模型蛋白,溶菌酶溶菌酶。不磷酸化的溶菌酶被用作对非特异性结合评估的对照。 B,对凝胶带的定量分析 A,绘制磷酸碱之间的蛋白质比率 相对 control pull-downs.

       一代改进的ywle G.STE. C9A Trapping Mutant

      接下来测试特定的交联步骤是否可用于共价链接捕获Ywle G.STE. 对于捕获的基材,旨在改善精氨酸磷酸化蛋白的纯度和产率。为此目的,我们插入了一种人工氨基酸残基, p - 苯并 - L-phenylalanine( BPA. ),在ywle中 G.STE. 在底物结合位点附近的战略位置捕获突变体,允许紫外引起的相互作用蛋白的光源。我们确定了两个合适的位置,F39和F119(Fig. 2A),并产生重组ywle G.STE. C9A突变体含有该突变体 BPA. 使用琥珀色密码子抑制系统的残留物 大肠杆菌 如前所述(
      • Farrell I.S.
      • Toroney R.
      • Hazen J.L.
      • mehl r.a.
      • 下巴J.W.
      具有遗传编码的二苯甲酮的相互光交联蛋白质。
      )。为了测试底物交联,我们孵化了Ywle G.STE. C9A F39 BPA. 和 F119 BPA. 具有精氨酸磷酸化溶菌酶的突变体并将其暴露于紫外光。 SDS-PAGE分析表明,包含该突变体 BPA. 氨基酸在位置39,但不在119处,可以与精氨酸 - 磷酸化模型蛋白交联(Fig. 2B)。虽然交联似乎是高度特异性的,但由于在不磷酸化的控制中没有观察到交联,但整体量的交联ywle G.STE. -substrate很低。相比之下,他的标签下拉的ywle G.STE. C9A F39 BPA. 突变体显示与普通ywle相对于普通ywle的磷脂菌溶菌酶改善 G.STE. C9a捕获突变体(补充图S3A),证明交联而不是底物结合效率低下。我们试图通过增加紫外线暴露时间来改善交联产量(补充图。S3B),以及通过测试替代,不那么庞大的人工光学源性光敏氨基酸,DiZPK(3-(3-甲基-3H-二嗪-3-基)-PropaminoCarbon-nε-l-Lysine(
      • 张米
      • 林S.
      • 歌曲X.
      • 刘杰。
      • 傅y.
      • GE X.
      • 傅X.
      • 昌Z.
      • 陈P.R.
      遗传掺入的交联剂揭示了酸性抗性的伴侣合作。
      )),在相同的位置(补充图。S3C)。然而,由于这些尝试未能提高交联效率,因此我们丢弃了ywle捕获突变方法中的交联步骤的使用。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2开发改进的ywle G.STE. trapping mutant. A,水晶结构 G. StearotherMophilus. Ywle蛋白质(PDB 4PIC)。顶部面板显示二聚体结构,含有磷酸盐群(红色/橙色)占催化部位。有助于二聚体相互作用的F39残基以深红色显示。底板详细介绍了一个YWLE分子的催化位点,其中有些部位 BPA. 在棍子中表示(F119和F39)。供参考,催化残基Cys-9和ASP-117也显示为黄色。化学结构的 BPA. 不自然的氨基酸也呈现在左下角的插图中。 B,光关键词 BPA. - aining纱 G.STE. 将突变体捕获到磷酸碱模型蛋白(溶菌酶)。等摩尔数量的ywle G.STE. 和溶菌酶(12μm 浓缩)在4℃下孵育1小时并暴露于UV光30分钟。不磷酸化的溶菌酶用作阴性对照。共价联系 BPA. - aining纱 G.STE. 通过SDS-PAGE分析模型基板。交联产品标有红色星号。通过MS分析证实了所指示的频带的身份。 C,ywle的低聚分析。这 G. StearotherMophilus. 通过分析尺寸排阻色谱法分析YwLe C9a捕获突变体及其PHE39变体进行低聚状态分布。单体物种在洗脱型材中表示( x - XIS:毫克洗脱体积; y - XIS:MAU中的280nm的吸光度),具有蓝色背景,二聚体和高阶低聚物分别以光和深灰色。
      尺寸排除色谱显示纯化的ywle G.STE. 在溶液中存在作为单体,二聚体和高阶低聚物(三聚体和四聚体)的混合物。评估YWLE的效果 G.STE. 寡聚化对底物结合,我们追求了一种结构方法。我们结晶了ywle. G.STE. 并以高分辨率解决二聚体蛋白的三维结构。 ywle的晶体结构 G.STE. 二聚体显示,二聚化通过催化位开口周围的界面进行,从而阻碍基材的结合(Fig. 2A补充图S4)。因此,底物结合 - 并且通过延伸,磷尿苷蛋白捕获 - 可能受Ywle的影响 G.STE. 寡聚化。正如Ywle所透露 G.STE. 结构,F39残留物是Ywle Dimer界面的中心部件,与相邻分子进行了紧密接触(Fig. 2A补充图S5)。由于这一发现,我们比较了各种ywle G.STE. C9A F39通过分析尺寸排阻色谱法为其寡聚化状态。 Fig. 2C shows that YwlE G.STE. C9A and YwlE G.STE. C9A F39A以类似的方式洗脱,表现出广谱的不同低聚物,而ywle G.STE. C9A F39W突变体具有较少的低聚物质,主要作为二聚体存在。值得注意的是,YWLE C9A F39的尺寸排阻色谱分析 BPA. 突变体,最初用于光关键,揭示了一种纯的单体形式。因此,我们假设单体F39 BPA. 突变体在与精氨酸磷酸化蛋白结合时更有效,即使进行UV交联步骤。

       原则上的证据实验:使用B.枯草芽孢杆菌细胞提取物捕获突变突变体下拉

      接下来,我们想测试发育的ywle捕获突变体是否能够从复杂样品中以内源浓度从复合样品中拉下精氨酸磷酸化蛋白质。为此目的,我们使用了来自a的细胞提取物 B.枯草芽孢杆菌 Δywle. 菌株可以积累大量的精氨酸磷酸化蛋白质。我们比较了使用三种不同的磷酸酶突变体ywle鉴定的精氨酸磷酸化肽的数量 G.STE. C9A, C9A F39 BPA. 和d117a。 ywle. G.STE. D117A突变体用作阴性对照,因为在磷酸碱中没有检测到的可检测结合 体外 pull-downs (Fig. 1)。 C9A F39. BPA. 用于评估ywle寡聚化对诱捕活性的影响。为了评估程序的技术重现性,所有实验均使用相同的三份完成 B.枯草芽孢杆菌 Δywle. 细胞提取物制剂。为了进行比较,通过“霰弹枪”磷蛋白酶分析相同的细胞提取物( IE。 通过用胰蛋白酶消化总蛋白质含量,用TiO富集磷酸肽2,并执行LC-MS / MS分析)。 Fig. 3 表明,平均在每个ywle中可以识别23个磷酸氨肽肽 G.STE. C9a下拉,一个明显更大的数字(p 值= 0.01)比每个YWLE中鉴定的精氨酸磷酸化的数量 G.STE. D117A下拉(平均每实验9)。总共,ywle G.STE. C9a下拉导致鉴定35个独特的磷酸肽肽,映射到28个蛋白质(补充表S2),而D117A下拉导致14个独特的磷酸肽肽分布在12次蛋白(补充表S3)。值得注意的是,在D117A下拉下粘附的磷酸甘油肽肽可以从未剥夺到磁珠或该突变体的低捕获活性的污染物中导致污染物。重要的是,在Ywle C9a下拉中,只能鉴定五种磷素/磷酸胆碱/磷酸酪氨酸肽,其中两种源自蛋白质的蛋白质也是精氨酸磷酸化的。结果表明ywle G.STE. C9A捕获活性可用于选择性地从细胞提取物中富含精氨酸磷酸化的蛋白质。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3ywle的MS分析 G.STE. 使用捕获突变的下拉 B.枯草芽孢杆菌 cell extracts. A,图表描绘了使用所示ywle的下拉实验中鉴定的独特磷酸肽的数量 G.STE. 突变体。为了比较,在霰弹枪磷蛋白质分析中鉴定的磷酸肽数 B.枯草芽孢杆菌 Δywle. 提供细胞提取物。显示了每个实验重复所获得的结果。 B,Venn图表证明了在下拉实验中获得的磷酸碱识别之间的重叠( 最佳 图表)或霰弹枪分析与ywle之间 G.STE. C9A pull-downs (底部 图表)。数字代表精氨酸磷酸化肽的数量( 剩下 图表)或精氨酸 - 磷酸化蛋白质( 正确的 每个实验中识别的图表。在这种情况下,数据集代表了三种实验复制中获得的非冗余识别之和。
      在ywle中鉴定出更大数量的磷酸盐碱位点 G.STE. C9A F39 BPA. 下拉:每次复制实验平均透露87个磷酸肽肽,导致共121个独特的精氨酸磷酸肽分布在68多种不同的蛋白质( Fig. 3, 补充表S4)。该发现表明Ywle的单体形式 G.STE. 在捕获精氨酸磷酸化蛋白质方面确实更有效。另外,我们进行了定量分析,比较了根据其基于MS1的提取的离子色谱图的下拉实验中鉴定的所有磷酸甘油肽的丰度(补充表S6)。所有九个下拉样品(D117a,c9a和c9a f39 BPA. 在所有磷酸肽的存在下检查了一式一式一式一式一式一式。结果总结在 补充图S6。明确的观察结果之一是磷酸甘油肽不仅存在更大的数量,而且在C9A F39中的较高强度下存在 BPA. 下拉比D117A和C9A下拉(补充图S6)。尽管C9A样品中的肽以类似的强度范围分布为D117A下拉的型号,但在C9A实验中,磷酸甘油肽肽以明显更大的数量存在(补充图S6)。因此,对于D117A阴性对照的三个重复下拉下的大多数(83%)的峰值检查也是明显的,不能检测到磷酸碱肽峰,表明这些磷酸肽肽中不存在样品。这进一步证实磷酸碱可以通过Ywle C9a蛋白有效富集,并且F39 BPA. 在捕获磷酸蛋白蛋白中,单体形式显着更有效。关于这一点,应该注意的是,虽然ywle相同 G.STE. 在所有实验中与细胞提取物一起孵育,最终量的ywle G.STE. C9A F39 BPA. 与磁珠绑定小于ywle G.STE. c9a和ywle D117A (补充图S7)。一个合理的解释是ywle G.STE. C9A和D117A单个HIS-标签可以将多个YWLE蛋白(通过低聚保持在一起)到磁珠,导致相对于YWLE的明显更大的珠子粘合能力 G.STE. C9A F39 BPA. 。因此,我们不能排除ywle的可能性 G.STE. C9A F39 BPA. 不同的污染物群可以与珠子结合而不是D117A对照。最重要的是,鉴定磷酸肽中磷酸碱的比例平均非常高-96.7%。这个数字明显更大(p 价值= 0.005)比在霰弹枪分析中,其中磷酸碱基仅存在于鉴定的磷酸肽的85.3%(补充表S5)。因此,我们假设改善的结合性能,而不是升高的污染蛋白水平,占在ywle的帮助下折叠的大量磷酸甘油肽 G.STE. C9A F39 BPA. 突变体。此外,尽管在所有实验中显示了一式三份分析,但在所有实验中显示出良好的技术再现性(补充图S8),霰弹枪分析与捕获突变下拉之间的重叠相当低(Fig. 3B),表明下拉可能不会像霰弹枪分析那样朝向丰富的磷酸化。的确,而ywle G.STE. C9A F39 BPA. 下拉鉴定了10个精氨酸磷酸化的转录调节剂(补充表S4)表示通常在低丰度下发生的一类蛋白质,只能在霰弹枪分析中观察到3种精氨酸磷酸化的转录调节剂(补充表S5)。这进一步证明了表演磷酸碱的选择性富集的优点,以便在细胞中产生更全面的观点。

      讨论

      在这里,我们报告了特定的磷酸碱粘合剂的开发,其可用作亲和工具,以在MS分析之前富含精氨酸磷酸化蛋白。通过选择性富集赋予的良好优点已经证明了酪氨酸磷酸化分析。酪氨酸磷酸化比丝氨酸和苏氨酸磷酸化得多,通常仅代表疫苗磷蛋白酶(全球分析)研究中的磷酸肽鉴定的1%至2%。 DI Palma和同事将两种人细胞系中的酪氨酸磷酸化鉴定的数量与免疫沉淀有选择性磷酸酪氨酸富集进行了两种人体细胞系中的两种人体细胞系。虽然通过多维策略的深层磷酸溶解(TI) 4+-Imac之后是亲水性相互作用液相色谱分级)可以识别约300磷酸酪氨酸肽,靶向免疫亲亲亲爱的富集能够鉴定2000多种酪氨酸磷酸化(
      • 迪帕尔玛斯。
      • Zoumaro-djayoon A.
      • 彭米
      • 发布H.
      • 预想赛C.
      • 慕尼宫
      • Heck A.J.
      在干草堆中找到相同的针?免疫亲和力沉淀和金属基亲和力色谱法富集的磷酸酪氨酸肽的比较。
      )。这清楚地表明,由于主要丝氨酸/苏氨酸磷酸化的显着掩蔽效应,霰弹枪分析不足以提供真核样品中的蛋核样品中所谓的磷酸化。因此,我们预计特定的富集方法对于鉴定各种真核系统中的磷酸碱蛋白也必须是必不可少的。
      以前,文献中报道了两种磷酸碱基粘合剂。霍夫曼 等等。 报道,来自SRC激酶的SH2结构域可以与A的精氨酸 - 磷酸化肽结合 Kd of 550 ± 150 μm (
      • Hofmann F.T.
      • Lindemann C.
      • Salia H.
      • Adamitzki P.
      • Karanicolas J.
      • Seebeck F.P.
      含有肽作为人造SH2配体的磷酸甘油碱。
      )。然而 Kd 朝向相应的磷酸酪氨酸肽估计为0.13±0.094μmm (
      • Hofmann F.T.
      • Lindemann C.
      • Salia H.
      • Adamitzki P.
      • Karanicolas J.
      • Seebeck F.P.
      含有肽作为人造SH2配体的磷酸甘油碱。
      );因此,富集精氨酸磷酸化将是不合适的。福尔曼 等等。 报告了获得的特定磷酸氨氨酸抗体 体外 通过噬菌体展示技术(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。尽管该抗体可以在点印迹和ELISA实验中专门识别纯化蛋白质中的磷脂碱,但是对于鉴定YwLe精氨酸磷酸酶的基础,却是基本的,但它未能检测到精氨酸磷酸化 B.枯草芽孢杆菌 Δywle. 细胞提取物(未发布数据)。在各种动物系统中进行的免疫试验未能产生选择性抗体,即使含磷碱蛋白和肽可以大量生产。据推测,P-N键的固有尺寸可通过经典免疫方法获得对磷酸碱的抗体,其依赖于抗原内化和在酸性pH条件下的内体/溶酶体隔室中的加工(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。因此,基于抗体的磷酸富集富集程序,例如为磷酸酪氨酸开发的磷酸富集程序(
      • 迪帕尔玛斯。
      • Zoumaro-djayoon A.
      • 彭米
      • 发布H.
      • 预想赛C.
      • 慕尼宫
      • Heck A.J.
      在干草堆中找到相同的针?免疫亲和力沉淀和金属基亲和力色谱法富集的磷酸酪氨酸肽的比较。
      ),不太可能为磷酸杀菌实施。
      我们在此报告的磷脂粉粘合剂由衍生自细菌ywle的捕获突变体组成 G.STE. 精氨酸磷酸酶。磷蛋白酶分析 B.枯草芽孢杆菌 缺乏ywle揭示了至少231个精氨酸残基的磷酸化,而没有精氨酸磷酸化可以在a中鉴定 B.枯草芽孢杆菌 wild-type strain (
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。这清楚地表明Ywle是靶向任何蛋白质背景下的精氨酸磷酸化的混杂磷酸酶。 ywle可以与在完全人工模型底物中引入的精氨酸磷酸化位点结合的观察结果,例如鸡蛋溶菌酶,进一步证实缺乏蛋白质基质偏好。因此,细菌ywle磷酸酶可以用作一般磷酸氨氨酸粘合剂,以检测各种生物系统中的精氨酸磷酸化。尽管对酪氨酸磷酸酶构成同源性,但我们组最近的一项研究表明,尽管有结构同源性,但我们对磷酸甘油的特异性揭示了Ywle的特异性。 Ywle的高分辨率晶体结构与一系列突变研究一起表明,这些特异性可以通过两个独立的选择性过滤器来解释(
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。首先,在ywle的情况下,粘合袋的深度选择了同源蛋白质修饰的尺寸,从而允许较大的磷脂(例如磷酸酪氨酸或磷酸碱)去磷酸化。其次,在基板结合口袋的底部存在苏氨酸残基(T11)用作“极性过滤器”,其感测磷酸碱基残余物的亲水性胍基的存在。但是,重要的是,据报道,在微酸性pH水平ywle下显示出一些酪氨酸去磷酸化活性(
      • Musumeci L.
      • Bongiorni C.
      • Tautz L.
      • 爱德华兹·
      • Osterman A.
      • Perego M.
      • 鼬T.
      • Bottini N.
      低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶 枯草芽孢杆菌.
      );因此,选择性磷碱结合应始终在中性到略微碱性条件下进行。另外,ywle同源物 G. StearotherMophilus. 被证明是一种非常稳定的蛋白质,可以容易地大量获得,典型的产量为每升60毫克的ywle蛋白质 大肠杆菌 表达文化。因此,重组ywle G.STE. 磷酸酶理想地适用于磷酸碱基亲和力工具。另一个优点是可以使用游离磷酸盐或竞争性抑制剂钒酸盐,在需要高纯度的精氨酸磷酸化蛋白的情况下,可以从Ywle疏水阀或竞争性抑制剂钒酸盐中特异性洗脱精氨酸磷酸化蛋白。
      磷酸酶捕获突变体下拉可用于两种不同的方法, 体外体内 (
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。在里面 体外 方法,纯化的磷酸酶突变体与含有磷酸化底物的蛋白质提取物一起温育,随后分离并分析捕集底物络合物。该方法需要仔细控制蛋白质提取物中的内源性磷酸酶活性,这可能在捕获突变结合之前潜在地消除磷酸化。作为向样品中加入的一般磷酸酶抑制剂会干扰捕获突变体结合, 体外 方法需要在细胞裂解之前灭活内源性磷酸酶。这意味着精氨酸磷酸酶必须遗传敲除或 体内 灭活。对于基于半胱氨​​酸的磷酸酶,例如YWLE,PTP和一些一般磷酸酶,可以通过将普通的细胞渗透性抑制剂施加到细胞培养基来容易地实现这一致。可以用烷基化试剂如碘乙酰胺洗掉过量的抑制剂,使抑制剂不会干扰随后的捕获突变结合。普通酸盐的使用还具有增加内源性磷酸化水平的优点,如前所述,对于普通植物治疗 B.枯草芽孢杆菌 (
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )。迄今为止,ywle及其T11同源物代表唯一描述的精氨酸磷酸酶系列。值得注意的是,酪氨酸磷酸酶和双特异性磷酸酶都没有表现出精氨酸去磷酸化活性 体外 (
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。此外,Ywle仅对观察到的所有精氨酸去磷酸化活性负责 B.枯草芽孢杆菌 cell extracts (
      • Fuhrmann J.
      • Mierzwa B.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Lehner A.
      • Charpentier E.
      • 克劳森T.
      鉴别磷酸碱的结构基础,革兰氏阳性细菌中的磷酸盐碱基特异性蛋白磷酸酶。
      )。该观察结果表明该细菌中没有其他磷酸酶,包括丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸酶的家族成员,其显示对真核磷酸酶的催化​​单位的相当守恒,可以去磷酸化磷酸盐碱。因此,除非样品中存在特定的磷酸氨基磷酸酶,否则应该可以在此期间保持精氨酸改性 体外 捕获突变体下拉。主要优势 体外 方法是它可以应用于任何细胞类型,组织或器官样本,并且它可以容易地缩放。
      或者,主要缺点 体外 通过表达捕获突变磷酸酶可以克服方法 体内。对于酪氨酸磷酸酶,已经观察到捕获突变体的过表达增加了细胞中的净磷酸化含量,因为捕集器的结合保护磷酸化位点免受内源性磷酸酶活性(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。 ywle捕获突变体是相同的效果。因此,不需要先前了解内源性精氨酸磷酸酶或对其活动的控制 体内 方法。该方法的缺点是需要遗传操纵,以便在感兴趣的生物体中引入ywle捕获突变体,并且该系统用于掺入非天然氨基酸 BPA. ,需要更高效的Ywle C9a F39 BPA. 捕获突变体,目前仅限于 大肠杆菌 和一些真核细胞系(
      • Farrell I.S.
      • Toroney R.
      • Hazen J.L.
      • mehl r.a.
      • 下巴J.W.
      具有遗传编码的二苯甲酮的相互光交联蛋白质。
      ,
      • h
      • 冈萨基y.
      • Kobayashi T.
      • Hayashi A.
      • Sakamoto K.
      • Yokoyama S.
      通过特异性掺入光反应性氨基酸的蛋白质光交联在哺乳动物细胞中。
      )。
      以前的研究表明,精氨酸磷酸化可能存在于非常不同的生物体中,例如肉芽病毒(
      • 威尔逊M.E.
      • Consigli R.A.
      蛋白激酶活性与粒化病毒感染粒细胞髓病毒的纯化衣壳相关的功能。
      )和哺乳动物(
      • Wakim B.T.
      • aswad g.d.
      小鼠白血病细胞核激酶 - 来自小鼠白血病细胞的核激酶,Ca(2 +) - 钙调蛋白依赖性磷酸盐中的核激酶。
      ,
      • Wakim B.
      • Grutkoski P.
      • 沃恩阿。
      • Engelmann G.
      与主动分割细胞相比,刺激静态大鼠心脏内皮细胞中的Ca2 + -Calmodulin活化组蛋白3精氨酸激酶。
      )。最有意思的是,未识别的精氨酸激酶已经描述不仅与染色质紧密相关,而且还能够靶向组蛋白H3(
      • Wakim B.T.
      • aswad g.d.
      小鼠白血病细胞核激酶 - 来自小鼠白血病细胞的核激酶,Ca(2 +) - 钙调蛋白依赖性磷酸盐中的核激酶。
      ,
      • Wakim B.
      • Grutkoski P.
      • 沃恩阿。
      • Engelmann G.
      与主动分割细胞相比,刺激静态大鼠心脏内皮细胞中的Ca2 + -Calmodulin活化组蛋白3精氨酸激酶。
      ),表明磷脂可能在表观血症中起着新的作用。这表明有效的磷脂碱分析方法的发展可能导致不同生物研究领域的许多新颖和激动的结果。

      结论

      在这项工作中,我们展示了由卷曲的捕获突变形式组成的特定磷酸碱粘合剂的发展 G.STE. 精氨酸磷酸酶。基于YWLE的磷酸氨胺蛋白富集程序可以与pH优化的磷蛋白蛋白工作流组合使用(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )鉴定复杂真核样品中的精氨酸磷酸化(Fig. 4在其中升高的O-磷酸化数量可能模糊磷酸碱的存在。原则上的ywle下拉实验证明了从细胞提取物中有效地分离精氨酸磷酸化蛋白,以及丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸磷酸化的显着降低。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4复杂样品中精氨酸磷酸化的提出方法。 通过使用Ywle可以进行对精氨酸磷酸化的全局分析 G.STE. 捕获突变体(灰色)以特异性结合精氨酸 - 磷酸化的蛋白质(步骤1)。 ywle. G.STE. 可以分离具有结合磷酸氨蛋白的捕集物,从而消除了妨碍妨碍鉴定不足的磷酸化的高度丰富的O-磷酸化(步骤2)。然后可以使用特殊的TiO通过质谱法鉴定所得样品中存在的精氨酸磷酸化位点 2基于磷酸富集的富集方案,针对酸不稳定磷酸化进行了优化(
      • 施密特A.
      • 特伦蒂尼D.B.
      • Spiess S.
      • Fuhrmann J.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      • 克劳森T.
      定量磷蛋白酶揭示蛋白质精氨酸磷酸化在细菌应激反应中的作用。
      )(步骤3),然后是LC-MS / MS分析(步骤4)。

      致谢

      我们感谢陈辰博士为Dizpk氨基酸和骄傲的团队提供数据沉积。

      补充材料

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