在功能上探测蛋白质组的化学方法*

  • Doron Greenbaum.
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    加利福尼亚州旧金山加州大学药物化学系94143
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  • Amos Baruch.
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    加利福尼亚州旧金山加州大学生物化学与生物物理学系94143
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  • Linda Hayrapetian.
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    加利福尼亚州旧金山加州大学生物化学与生物物理学系94143
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  • zsuzsanna darula
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    加利福尼亚州旧金山加州大学药物化学系94143

    匈牙利科学院生物研究中心,匈牙利H-6701塞格德,生物研究中心
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  • 阿尔玛伯林名
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    加利福尼亚州旧金山加州大学药物化学系94143
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  • Katlin F. Medzihradszky.
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    加利福尼亚州旧金山加州大学药物化学系94143

    匈牙利科学院生物研究中心,匈牙利H-6701塞格德,生物研究中心
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  • Matthew Bogyo.
    一致
    应解决谁的通讯:加州大学,旧金山校区,盒子0448,513 Parnassus Ave.,San Francisco,CA 94143-0448。电话:415-502-8142;传真:415-502-4315
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    加利福尼亚州旧金山加州大学生物化学与生物物理学系94143
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  • 作者脚注
    *这项工作是由国家卫生机构的支持支持NCRR 01614和RR12961(对匈牙利奖学金委员会(ZD)的Eotvos奖学金,并通过资金提供资金基础科学的桑德勒计划(DG,LH,AB和MB)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734条仅为Indi-Cate这一事实。
      随着完全基因组序列的可用性,重点向蛋白质功能的理解转移。我们开发了一种功能性蛋白质组学方法,其利用化学反应性荧光探针在复杂混合物中使用化学反应性荧光探针,借助于它们的催化活性鉴定酶。该方法允许使用单一的二维分离在各种条件下比较多种酶的活性变化。探针还可用于使用荧光显微镜将活性酶定位在完整细胞中。此外,探针使筛选能够在粗裂解物或完整细胞内选择各种酶家族成员的选择性小分子抑制剂。最终,该技术允许快速鉴定靶向它们的潜在药物靶标和小分子铅化合物。
      在过去的几年中,已经确定了多种生物的完整基因组序列。这些努力之后是对给定蛋白质组的所有蛋白质的基因的注释。虽然这些信息可能证明有价值,但仍然需要大量的努力来确定个体基因产品的功能。通过分析在整个多种生物体的共产模式(
      • Marcotte e.m.
      • Pellegrini M.
      • Thompson M.J.
      • yeates t.o.
      • 艾森伯格D.
      一种组合算法的蛋白质功能基因组预测。
      ,
      • 艾森伯格D.
      • Marcotte e.m.
      • Xenarios I.
      • yeates t.o.
      后基因组时代的蛋白质功能。
      )。此外,响应于不同刺激的转录基因组变化的分析允许基于转录共调控的相似功能基因进行聚类(
      • eisen m.b.
      • 斯派曼P.T.
      • 棕色p.o.
      • Botstein D.
      基因组表达式模式的聚类分析与显示。
      )。虽然这些方法有助于将蛋白质大致分类为家庭,但在大酶家族内的特定成员的作用仍然是一项艰巨的任务。
      蛋白质组学方法通过分析和鉴定蛋白质水平的批量变化来解决基因组方法中的一些间隙(
      • 鸽子A.
      蛋白质组学:将基因组学转换为产品?
      ,
      • Pandey A.
      研究基因和基因组的蛋白质组学。
      )。然而,这些方法仅为丰富的蛋白质和具有困难生化特性的蛋白质提供信息(IE。 膜蛋白通常被排除在分析之外。此外,对于大多数酶,它们的活性,因此它们的功能由复杂的翻译后对照调节。因此,甚至在许多情况下甚至蛋白质组学谱提供了如何在功能上调节酶的不完全图片(
      • Gygi S.P.
      • Rochon Y.
      • Franza B.R.
      • Aeberberold R.
      酵母蛋白质与mRNA丰度之间的相关性。
      )。
      经典的遗传方法是试验和真实方法,用于将功能分配给特定基因产品。在许多生物学系统中,可以破坏所需的基因并评估所得的表型。然而,这种过程通常是乏味的,并且在多种相关蛋白质具有相似的功能的情况下,补偿调整使得结果难以解释。
      为了规避这些问题,可以使用小分子来操纵蛋白质目标的活性(
      • 斯托克尔B.R.
      化学遗传学的边疆。
      ,
      • 舍瑞斯S.L.
      由合成有机化学激情引起的化学遗传学。
      )。这种“化学遗传学”方法利用小分子的文库以筛选给定的生物过程的化合物。然后可以使用所得“命中”开始将功能分配给特定酶或蛋白质靶标。然而,该过程的效用受到识别小分子相关靶标的困难任务的限制。
      在传统药物发现的情况下,筛选小分子文库以筛选单个预定靶标。铅化合物通常使用大型化学文库鉴定使用 体外 测定。尽管这些化合物中的许多含量对纯化的靶标有效,但是通常在粗蛋白质组中的选择性中已知几乎是已知的。因此,允许筛选细胞和组织提取物中的小分子抑制剂或完整细胞的方法将允许基于多种标准鉴定铅化合物,例如效力,选择性和细胞渗透性。此外,可以将化合物筛选在整个酶家族中,从而增加鉴定用于治疗介入的有用化合物的机会。
      我们已经开发了化学反应性亲和力探针,其可用于(i)识别给定酶系列的成员在蛋白质组中,(ii)确定个体家族成员的相对活性水平(iii)在细胞内定位活性酶, (iv)筛选小分子文库,直接在粗蛋白质提取物中用于抑制剂,其最终用于确定特定靶酶的生物学功能。在这项研究中,我们选择专注于木瓜蛋白酶蛋白酶的原因。首先,这些蛋白酶被合成为无活性的酶,翻译后被激活(
      • Cygler M.
      • Sivaraman J.
      • Grochulski P.
      • 库仑R.
      • Storer A.C.
      • Mort J.s.
      大鼠Procathepsin的结构B:PROREGION抑制半胱氨酸蛋白酶活性的模型。
      ,
      • 库仑R.
      • Grochulski P.
      • Sivaraman J.
      • Ménardr.
      • Mort J.s.
      • Cygler M.
      人类procathepsin L的结构揭示了突出抑制的分子基础。
      )。它们的活性也可以通过与大分子抑制剂的相互作用来调节,导致转录/平移谱的转录/平移谱不同,其仅提供有关其功能调节的有限信息。其次,瓜素家族由许多密切相关的家庭成员组成,其功能定义不佳(
      • 查普曼H.A.
      • Reese R.J.
      • Shi G.-P.
      人体生物中半胱氨酸蛋白酶的新兴作用。
      )。第三,已经开发出这种酶的许多小分子共价抑制剂,其可用于探针设计(参见参考文献。
      • 肖e.
      肽基重氮甲烷作为半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶的抑制剂。
      )。最后,已发现这些酶在许多疾病病症(如癌症)中发挥着重要作用(
      • 燕斯。
      • Sameni M.
      • Sloane B.F.
      组织蛋白酶B和人肿瘤进展。
      ),骨质疏松症(
      • GELB B.D.
      • Shi G.P.
      • 查普曼H.A.
      • desnick r.j.
      Pycnodysossosiss,一种由组织蛋白酶K缺乏引起的溶酶体疾病。
      ),哮喘(
      • 查普曼H.A.
      • Reese R.J.
      • Shi G.-P.
      人体生物中半胱氨酸蛋白酶的新兴作用。
      )和类风湿性关节炎(
      • iwata Y.
      • Mort J.s.
      • Tateishi H.
      • 李娥。
      巨噬细胞表明L,类风湿性关节炎骨髓内骨侵蚀的因素。
      )使它们成为药物开发的潜在重要酶。

      材料和方法

      所有用于合成肽环氧化物的化学物质购自高级切菜(路易斯维尔,KY)和Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis,Mo)。纯化的人肝组织蛋白酶B和H和纯化的土耳其肝脏组织蛋白C购自CALBIOCHEM(圣地亚哥,CA)。纯化,重组人组织蛋白酶K,F和V是DieterBrömme(Mt. Sinai Medicine,New York,NY)的一种善意的礼物。纯化的重组人类组织素L是Vito Turk(Jozef Stefan Institute,Ljubljana,斯洛文尼亚)的一种善意的礼物。

       合成协议

       合成乙基(2s,3秒) - 氧化硅酸硅-2,3-二羧酸甲酯和乙基(2r,3r) - 氧化乙烷-2,3-二羧酸盐和DCG-04-

      (2R,3R) - 氧化锆-2,3-二羧酸盐的合成与(2S,3S)异构体(
      • Bogyo M.
      • Verhelst S.
      • Bellingard-Dubouchaud V.
      • Toba S.
      • Greenbaum D.
      具有放射性标记的亲电衬底类似物的溶酶体半胱氨酸蛋白酶的选择性靶向。
      )。在其他地方报告DCG-04的合成(
      • Greenbaum D.
      • 我dzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.L.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )。

       合成BODIPY558 / 568-DCG-04,BODIPY588 / 616-DCG-04,BODIPY530 / 550-DCG-04,BODIPY493 / 503-DCG-04-

      从分子探针(Eugene或)购买的所有荧光团。通过使用所报道的DCG-04的合成方案将末端生物素化赖氨酸用赖氨酸替换终端生物素化赖氨酸来合成DCG-04的自由氨基版(
      • Greenbaum D.
      • 我dzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.L.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )。自由氨基DCG-04(6mg,8.8μmol,1.5 eq)和Bodipy558 / 56-OSU
      使用的缩写是:OSU, O- 琥珀酰亚胺酯; ABP,基于活动的探针; CID,碰撞诱导的解离; E-64,反式环氧琥珀酰 - l-lecylamido(4-胍)丁烷; HPLC,高压液相色谱; IEF,等电聚焦,MS,质谱; PSL,位置扫描库; dthiothreitol; 2D,二维。
      (3.0mg,6.0μmol,1.0 eq),Bodipy 588/616-OSU(1.0 eq),Bodipy530 / 550-OSU(1.0 eq),或Bodipy493 / 503-OSU(1 eq)溶解在100μl2所以。然后加入二异丙基乙胺(12.0μmol,2.0当量)。通过高压液相色谱(HPLC)监测反应。 2小时后,将产品纯化在C上18 使用0-100%水 - 乙腈的线性梯度反相HPLC柱(Delta pak;水)。合并级分并冻干至干。通过质谱法证实产物的同一性。电喷雾质谱如下:[m + h]为bodipy558 / 568-dcg-04 c计算49H69BF.2N8O10 979.5,发现978.5; Bodipy 588/616-DCG-04 C.60H76BF.2N9O12S 1196.5,发现1197.0; Bodipy530 / 550-DCG-04 C.57H69BF.2N8O10 1075.5,发现1075.0;和Bodipy493 / 503-DCG-04 C.49H63BF.2N8O10S 1005.4,发现1004.5。

       位置扫描库的合成 -

      使用96孔歧管(Flexchem;罗宾斯科学)进行P2常数PSL文库的合成。使用P2位置的恒定氨基酸和在可变位置处使用恒定氨基酸和所有天然氨基酸(减去半胱氨酸和甲硫氨酸)的等因素混合物构建。使用基于其报告的偶联率的氨基酸等当量的比例产生等值混合物(
      • 奥斯特勒·赫什
      • Winkle J.H.
      • 哈什辛伏特。
      • houghen r.a.
      肽文库:竞争偶联中受保护氨基酸相对反应率的测定。
      )。通过树脂载荷将总混合物调节至10倍过量的总氨基酸。对于恒定位置,使用10倍过量偶联单个氨基酸。除了天然氨基酸之外,还使用一组42种非天然疏水氨基酸用于恒定的P2位置(参见 表I.)在补充材料中)。在固相肽合成的标准条件下使用二异丙基碳二亚胺和羟基苯唑唑来进行偶联。通过加入90%三氟乙酸,5%水,5%三异丙基盐水2小时,从树脂中从树脂中切割文库和单一组分。收集切割溶液,并通过加入冷乙醚沉淀产物。分离固体产物,将粗肽溶解在我身上2所以(50米m 库存)基于每个混合物的平均重量。将文库和单个化合物储存在-20℃并进一步稀释至10米m 库存板用于实验。

       yq-(r,r)eps和yg-(r,r)eps的合成

      使用针对DCG-04报道的方案在固体载体上合成所有单组分肽环氧化物(
      • Greenbaum D.
      • 我dzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.L.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )。通过加入90%三氟乙酸,5%水,5%三异丙基盐水从树脂中切割抑制剂2小时。冰冷的乙醚(15mL)用于沉淀产物。将粗产物纯化在C上18 使用0-100%水 - 乙腈的线性梯度反相HPLC柱(水)。将含有产物的级分合并,冷冻并冻干至干燥。通过质谱法证实产物的同一性。电喷雾质谱如下:[m + h]计算为yg-(r,r)eps c17H21N3O7 380.1,发现380.1; YQ-(R,R)EPS C.20H26N4O8 451.2, found 451.2.

       抑制剂的放射性标记

      所有化合物均用先前报告的议定书碘(
      • Bogyo M.
      • Verhelst S.
      • Bellingard-Dubouchaud V.
      • Toba S.
      • Greenbaum D.
      具有放射性标记的亲电衬底类似物的溶酶体半胱氨酸蛋白酶的选择性靶向。
      )。

       细胞和组织裂解物的制备

      在缓冲液A中搅拌组织(50米)m Tris, pH 5.5, 1 mm DTT, 5 mm MgCl2,250米m 蔗糖),提取物以1,100×离心 g 在4℃下10分钟,将上清液以22,000×离心 g 在4°C下30分钟。使用缓冲液A中的玻璃珠均匀化细胞,并将上清液离心15,000× g 在4°C下15分钟。通过BCA蛋白质定量(Pierce)测定最终上清液(可溶)的总蛋白质浓度。

       用DCG-04,125i-DCG-04,125i-MB-074,125i-yQ-(R,R)EPS,Yellow-DCG-04,Blue-DCG-04,Green-DCG-标记裂解物和纯化的组织蛋白蛋白标记。 04或Red-DCG-04

      裂解物(100μl的100μl缓冲液B中的100μg总蛋白质(50米)m Tris, pH 5.5, 5 mm MgCl2, 2 mm 除非另有说明,否则DTT)或纯化的组织蛋白蛋白(缓冲液B中0.1μg)在25℃下标记1小时。将DCG-04加入到10μ的最终浓度m。所有放射性抑制剂储备溶液的等量量(约106 每个样品CPM用于所有标记实验。将荧光化合物加入到样品中以终浓度为0.1μm。通过加入4×SDS样品缓冲液(用于一维SDS-PAGE)或通过将固体尿素添加至最终浓度为9.5的样品淬灭样品 m (对于2D SDS-PAGE)。使用ABI 377 DNA测序仪分析荧光样品。使用由制造商提供的15厘米平板制备标准15%SDS-PAGE凝胶,厚度为0.4mm。在35 mA的恒定电流下加载样品并电泳,电压限制为750V。使用制造商提供的基因扫描软件创建凝胶图像。在一些实验中,通过标准SDS-PAGE分析荧光样品,然后用分子动力学台风激光扫描仪进行扫描。

       原位荧光标记

      将树突状细胞(DC2.4)镀在24孔盘上(105 细胞/孔)嵌入无菌显微镜盖玻片,在含有10%胎牛血清的RPMI培养基中。 16小时后,用1mL TC-199培养基洗涤细胞,并与1μ孵育m 在37°C的TC-199中的Green-DCG-04在12小时内。用1mL TC-199洗涤细胞三次,并在无探针培养基中温育5小时。随后,在缓冲液A中裂解细胞并在12.5%SDS-PAGE上使用荧光扫描器分析或在荧光显微镜下观察。

       凝胶电泳

      如上所述执行一维SDS-PAGE和二维IEF(
      • Bogyo M.
      • Shin S.
      • McMaster J.s.
      • Ploegh H.L.
      通过活性位点为导向的亲和探针揭示蛋白酶体的底物结合和序列偏好。
      )。

       竞争标签和数据分析

      大鼠肝脏裂解物(100μl的100μl缓冲液B中的总蛋白质(50米)m Tris, pH 5.5, 5 mm MgCl2, 2 mm DTT))或纯化的组织蛋白酶(100μl缓冲液A中的1μg蛋白质)与10μ预孵育m 每个图书馆会员(从10米摊薄m Me2股票在室温下30分钟。然后通过添加标记样品 125I-DCG-04至每种样品,然后在室温下进一步温育1小时。通过加入4×样品缓冲液淬灭样品,通过SDS-PAGE分辨,并通过磷定影(分子动力学)分析。定量对应于每种标记蛋白酶的带。将抑制剂处理的样品与未治疗的对照样品进行比较。如前所述分析了竞争百分比数值(
      • 纳撒蒂特。
      • Bogyo M.
      共价抑制剂定位扫描文库的全局分析蛋白酶谱系特异性。
      )使用eisen和同事编写的程序树视图和群集(
      • eisen m.b.
      • 斯派曼P.T.
      • 棕色p.o.
      • Botstein D.
      基因组表达式模式的聚类分析与显示。
      )。这些程序可以从中获得 www.microarrays.org..

       大鼠肝脏纯化和鉴定亲和力标记的蛋白酶

      在缓冲液C中制备的蛋白质裂解物(50米m Acetate buffer, 5 mm DTT,0.1%Triton X-100)与5μ孵育m DCG-04在室温下为1.5小时。孵育后,通过用缓冲液D预平衡的PD10柱通过蛋白质裂解物(50μmm Tris-Base 7.4, 150 mm NaCl),用相同的缓冲液洗脱蛋白质。将SDS加入洗脱的蛋白质至最终浓度为0.5%,溶液煮沸10分钟,用缓冲液D稀释2.5倍(以将SDS浓度降低至0.2%),并与100μL床体积孵育在室温下预先洗涤链霉蛋白珠1小时。用缓冲剂D洗涤珠子五次,在100μlSDS样品缓冲液存在下沸腾10分钟,洗脱结合的蛋白质。对于2D分析,用IEF样品缓冲液将SDS样品缓冲液中的样品稀释1:1(9.5 m加入5%β-巯基乙醇,2%Nonidet P-40,1.6%吡啶,pH5-7和0.4%吡啶,pH3.5-10)和纯Nonidet P-40(25%的样品) 。将样品施加到IEF管凝胶中,并在1000V电泳13小时,然后在15%SDS-PAGE凝胶上分离。将所得凝胶固定在12%乙酸中,根据报道的方案,用银染色50%甲醇(
      • Bogyo M.
      • Shin S.
      • McMaster J.s.
      • Ploegh H.L.
      通过活性位点为导向的亲和探针揭示蛋白酶体的底物结合和序列偏好。
      )。切除斑点,用胰蛋白酶消化,并通过逆相HPLC在最终系统上分馏,配备了FAMOS自动注射器(LC Packings,San Francisco,CA)。实验条件如下:1-μL注射; 75微米×150毫米Pepmap柱;溶剂A(h2o含0.1%甲酸);溶剂B(乙腈,甲酸0.1%甲酸;梯度,0-30%溶剂B以〜250nl / min的流速为40分钟。对QSTAR四极正交的加速 - 飞行时间串联进行质谱检测信息依赖性采集模式中的质谱仪(应用生物系统/ MDS SCIEX,Foster City,CA);接下来的是5-S CID采集,其中每个测量扫描的最丰富的离子被选为前兆。所有单电荷的离子以及一些胰蛋白酶自溶剂产品被排除在前体离子选择之外。碰撞能量是优化和自动调整的,根据电荷状态和 m/z 选定前体离子的值。在调查收购中记录的质量范围是 m/z 300-1400。对于CID实验,较低的质量限制变为 m/z 60.使用两点外部校准测量所有数据。该仪器提供〜8000分辨率和30ppm的大规模精度,在MS和CID模式下具有外部校准。使用MS / MS数据(伦敦,英国矩阵科学有限公司)自动通过吉祥物数据库搜索自动识别蛋白质。

      结果和讨论

       探测设计和应用于原油匀浆和完整细胞 -

      几个实验室已经开发出小分子的电子手机,其向几种不同酶家族的亲核活性位点残留物显示出特异性的反应性。这些包括丝氨酸(
      • 刘Y.
      • Patricelli M.
      • Cravatt B.
      基于活性的蛋白质分析:丝氨酸水解酶。
      ,
      • 基德D.
      • 刘Y.
      • Cravatt B.f.
      复杂蛋白质粒中的分析丝氨酸水解酶活性。
      )和半胱氨酸(
      • Bogyo M.
      • Verhelst S.
      • Bellingard-Dubouchaud V.
      • Toba S.
      • Greenbaum D.
      具有放射性标记的亲电衬底类似物的溶酶体半胱氨酸蛋白酶的选择性靶向。
      ,
      • Greenbaum D.
      • 我dzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.L.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      ,
      • Faleiro L.
      • Kobayashi R.
      • fearnhead h.
      • Lazebnik Y.
      多种CPP32和MCH2是凋亡细胞中存在的主要活性胱天冬酶。
      )水解酶,以及醛脱氢酶(
      • 亚当G.C.
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
      )。在每种情况下,已经设计了一种对酶家庭成员具有宽不可逆反应性的电子单,同时对自由循环的亲核试剂如硫醇,羟基和胺保持相对惰性。所得的基于活性的探针(ABP)可用于在来自细胞或组织样品中共价标记蛋白质复杂混合物中的特异性靶酶。我们的实验室基于一般半胱氨酸蛋白酶抑制剂反式环氧琥珀酰基 - 的结构开发了探针 - l-lecylamido(4-胍)丁烷(E-64)(
      • Greenbaum D.
      • 我dzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.L.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )。这些ABP可用于亲和标签蛋白石族海藻蛋白蛋白酶。它们还允许通过掺入生物素亲和力标记来快速纯化标记的蛋白酶。在这里,我们使用E-64的核心肽环氧化物类似物,用于为木瓜蛋白石族半胱氨酸蛋白酶产生四种荧光标记的ABPS( Fig. 1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1荧光ABPS DCG-04,黄色DCG-04,RED-DCG-04,GREEN-DCG-04和BLUE-DCG-04的结构。
      这些探针包括四个不同的荧光部分,每个荧光部分具有非重叠的激励和发射光谱,允许复用探针。基于在DNA测序方案中常用的荧光团的激发和发射波长选择四种Bodipy类似物。我们推理使用配备有高强度激光的标准DNA测序装置可以可视化和量化荧光标记的蛋白质。 图2A 显示凝胶图像,从培养八种不同纯化或重组蛋白质族西半胱氨酸蛋白半胱氨酸蛋白酶,然后在ABI 377 DNA测序仪上分析(参见“材料和方法”)。使用这些探针,可以根据荧光标记的分子量和发射波长的差异来在单个凝胶泳道中加载所有八种蛋白酶并区分各自的蛋白质。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2使用荧光ABPS的木瓜蛋白酶家庭蛋白酶的亲和力标记。A,将纯化的组织丝(如图)稀释成pH5.5缓冲液并用100n标记m 黄色DCG-04,RED-DCG-04,绿色DCG-04或BLUE-DCG-04为1小时。样品在15%SDS-PAGE凝胶上分离,并使用如“材料和方法”所述的ABI 377 DNA测序仪可视化标记的带。 B,将来自大鼠肝脏的总细胞提取物稀释成pH5.5缓冲液并用10μ标记m DCG-04, 125I-DCG-04(约1×106 cpm), or 100 nm 红色,蓝色,绿色和黄色dcg-04。在15%SDS-PAGE凝胶上分离样品,并且可视化标记的带(如图所示 底部)通过亲和印迹或放射自显影或使用分子动态Typhoon激光荧光扫描仪。
      接下来将在衍生自组织匀浆中衍生的复杂蛋白质混合物中剖面相同的四个探针。 图。2B 显示通过用生物素化探针DCG-04,放射标记的DCG-04的放射标记版和DCG-04的四种荧光类似物标记获得的半胱氨酸蛋白酶的分布。所有ABP标记为相同的四种主要蛋白酶(带1-4)种类,只有对每个探针观察到的相对强度差异。这些结果表明,分子远端亲和位点的结构不同标记基团对化合物共价改变其靶标的能力几乎没有影响。
      由于ABPS的目标蛋白酶的共价修饰需要改性活性位点硫醇亲核试剂,因此标记强度可用作酶活性的间接测量。因此,与只能用于监测特定蛋白质的大量水平的抗体不同,这些试剂允许分析酶活性水平的变化。过去,我们的实验室使用这些试剂在肿瘤进展/细胞侵袭和白内障地层如肿瘤进展/细胞侵袭和白内障地形成时遵循半胱氨酸蛋白酶的活性(
      • Bogyo M.
      • Verhelst S.
      • Bellingard-Dubouchaud V.
      • Toba S.
      • Greenbaum D.
      具有放射性标记的亲电衬底类似物的溶酶体半胱氨酸蛋白酶的选择性靶向。
      ,
      • Baruch A.
      • Greenbaum D.
      • levy e.t.
      • 尼尔森P.A.
      • 吉拉杜
      • Kumar n.m.
      • Bogyo M.
      定义间隙结通信,蛋白水解和白内障地层之间的链接。
      )。因此,这些新开发的ABP提供了一种有效的方法,用于监测蛋白质组内蛋白酶活性的变化。
      因为荧光探针是可渗透的,所以它们是用于在完整细胞或组织切片中的蛋白酶活性成像的理想工具。 Fig. 3 显示直接标记的树突细胞系DC2.4 原位 使用Green-DCG-04或用E-64预处理,然后用荧光探针标记。用绿色ABP直接处理的细胞显示溶酶体隔室的荧光染色模式。已经预处理的E-64预处理的细胞在整个细胞溶溶胶中显示出弥散荧光,可能由于残留的自由探针未被清洗。通过SDS-PAGE和荧光检测在成像,裂解和分析后收集细胞。得到的曲线表明,通过荧光探针标记多种蛋白酶物种,并通过用E-64预处理细胞完全抑制这些蛋白酶。因此,在非预处理的电池中观察到的荧光染色代表活性蛋白石族半胱氨酸蛋白酶的定位。该方法可能适用于组织样品,可以作为从重要临床样品的组织中的图像蛋白酶活性作为实体瘤的组织中的图像蛋白酶活性的方便方式。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3蛋白酶活性的定位 原位. 在无血清培养基中培养DC2.4细胞,并用Green-DCG-04处理过夜(1μm 最终浓度)(A) 或者 (B用10μ预处理m E-64为1小时,然后用1μ标记m 绿色DCG-04。加入新鲜培养基,将细胞温育5小时以除去多余的探针。通过荧光显微镜观察细胞(左侧面板)然后收集,在SDS样品缓冲液中裂解,并通过ABI 377 DNA测序仪上的SDS-PAGE分析(右图)。用未处理的细胞中标记的蛋白酶用 数字。注意所有蛋白酶种类的完全竞争通过E-64预处理。

       使用ABPS在粗组织提取物中筛选木瓜蛋白质西半胱氨酸蛋白酶的选择性抑制剂 -

      也许ABP的最强大的属性是他们能够促进筛查针对完整酶家族的小分子抑制剂,而不需要首先鉴定,克隆和表达个体靶标。此外,从筛选过程中获得的数据不仅提供了潜在的铅化合物的效力,而且提供了含有许多密切相关的家庭成员的生理相关样品中化合物的选择性。
      为了证明这种方法的效用,基于含有DCG-04探针中含有的环氧化物电泳核的核心肽骨架设计了一系列的小分子抑制剂文库(图4A)。最初,合成PSL,其中通过一系列天然和非天然氨基酸扫描单个氨基酸位置,而剩余的两个位置与所有可能的天然氨基酸(减去半胱氨酸和蛋氨酸)的混合物偶联)。由此产生的余辉纤维纤维纤维化由361个成员组成。通过所有天然氨基酸扫描P3和P4位置的恒定氨基酸表明这些元素没有显着促进抑制剂与蛋白酶靶标的选择性的选择性(数据未示出)。因此,呈现仅扫描用于扫描恒定P2位置的数据。增加PSL中的小分子的多样性,我们将42个疏水性非天然氨基酸作为构建块(见 表I在补充材料中)。此外,每个天然氨基酸偶联到环氧化物的镜像对映体形式(2R,3r 相对 2s,3s)。以前的作品表明,立体化学的变化有利于抑制剂对活跃点的主要侧的结合,从而在我们的图书馆中产生更多多样性(
      • Schaschke N.
      • Assfalg-Machleidt I.
      • Machleidt W.
      • 土耳其人D.
      • 莫里达尔L.
      E-64类似物为表达蛋白酶B的抑制剂对环氧琥珀基的绝对构型的作用。
      )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4筛选肽环氧化物PSL。A,含有(S,S)或(R,R)环氧化物的一般PSL支架的结构。 PSL包含固定的P2位置(X由19天然氨基酸的异喹臭混合物组成的P3和P4位置(所有天然氨基酸减去半胱氨酸和蛋氨酸,加上Norleucine; 混合)。 B,比色簇显示禁止数据。 PSL用于通过用单独的恒定P2文库进行预处理样品,然后用贴标签来突突大鼠肝提取物中的蛋白酶 125I-DCG-04。使用相对于控制未处理样品的每个靶标记强度用于产生百分比竞争值。使用设计用于分析微阵列数据的程序进行聚类和可视化这些结果数据(参见“材料和方法”)。 数字 沿着 最佳 对应于中列出的个体非天然氨基酸 . 单封信 代表每种天然氨基酸的单字母代码。 n 对应于代替甲硫氨酸的Norleucine以避免侧链氧化问题。这 树结构最佳剩下图表 通过分层聚类获得,并指示与连接轮廓的线的高度的函数的相似度。大鼠肝脏未知的蛋白酶带编号为1-4,对应于所示的带 。这 彩色钥匙 显示在 底部.
      首先将PSLS筛选在大鼠肝匀浆中DCG-04的初级蛋白酶靶标(图2的带1-4。2B;看 图4B.)。通过用每个文库预处理的预处理进行评估,然后用标记来评估效力 125I-DCG-04和SDS-PAGE和Autoradography分析。每个图书馆阻止DCG-04阻挡有源网站标记的能力被测量为相对于未处理控制的百分比竞争。使用由eisen和同事开发的软件可视化产生的值(
      • eisen m.b.
      • 斯派曼P.T.
      • 棕色p.o.
      • Botstein D.
      基因组表达式模式的聚类分析与显示。
      )旨在分析从微阵列分析产生的数据。该软件将颜色分配给数值竞争值,并允许基于各个位置的相似性进行群集(x 轴)和酶家庭成员(y 轴)。得到的“群集族”显示在 图4B..
      整个恒定氨基酸残基的聚类数据分组了数据,使得显示与所有靶标的总体差的残留物定位在右侧,并且显示出普遍强的结合的残留物将左侧定位。群体中间的剩余残基显示出各种酶的一定程度的选择性。来自聚类的结果表明与环氧化物的(R,R)对映体连接的非天然氨基酸和天然氨基酸提供了最大的靶选择性。
      由DCG-04标记的每个主要蛋白酶物种的特异性分布还确定了几种残基,该残基聚集在曲线曲线中心,该曲线中心赋予提取物中单个蛋白酶种类的独特特异性。因此,该方法利用具有有限的结构多样性的文库(〜80)产生有趣的铅化合物。一种较大,更结构不同的小分子文库的类似筛选可能提供更多抑制剂引线。鉴于筛选和蛋白质提取物的相对容易性,使用该方法可以清楚地访问这种大屏幕。

       添加选择性小分子抑制剂后蛋白酶活性的分析变化 -

      从筛选肝提取物中的图书馆数据分析表明,几个PSL显示出与单个蛋白酶的选择性结合。我们选择专注于恒定P2谷氨酰胺(R,R)环氧化物库,因为其在提取物中的蛋白酶2的高度选择性。肝提取物用Red-DCG-04探针直接标记或用文库处理,然后用蓝色DCG-04探针标记。然后将样品组合并进行等电聚焦的第一尺寸,然后通过DNA测序仪在第二维中的SDS-PAGE进行分析(图5A)。该方法允许分析单个凝胶中的多个数据通道,其可以合并以确定在抑制剂文库存在下每种蛋白酶物种的活性变化。所得到的2D型材明确证明谷氨酰胺(R,R)文库特异性结合单个蛋白酶(点2)的活性位点,如蓝色通道中的标记损失所示。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5抑制剂治疗后蛋白酶活性的分析变化。A,用100 n处理肝提取物(100μg总蛋白质)m Red-DCG-04或10μm AC-XX-Q-(R,R)EPS库30分钟,然后用100 nm 蓝色DCG-04。用IEF样品缓冲液淬灭反应,并在单个IEF管凝胶上加入等量的每种反应量。将标记的蛋白质在15%SDS-PAGE上分离并使用ABI 377 DNA测序仪进行分析。这 较低的面板显示 红色的蓝色的 镜头覆盖在单个图像上 中间板 显示单个荧光通道。注意抑制剂治疗时圈带蛋白酶的活性丧失。 B,通过DCG-04标记的肝提取物的单步亲和纯化纯化肝提取物中的活性蛋白酶。通过液相色谱 - MS - 飞行时间CID切除并测序银染色斑点。与Ac-XX-Q-(R,R)-EPS文库抑制的标记蛋白酶对应的银染点被鉴定为组织蛋白酶()B.还鉴定了其他木瓜蛋白酶家族蛋白酶并标记为 箭头.
      为了确定由小分子文库选择性靶向的蛋白酶的身份,我们使用了生物素标记的DCG-04来进行来自肝提取物的所有标记的蛋白酶的单步亲和纯化。得到的银染色的2D型材表明,所有荧光标记的蛋白酶可以从粗提物迅速纯化并与标记型材相关(图5B.)。对应于带2的银染点被切除并通过液相色谱 - MS - 飞行时间CID测序鉴定为组织蛋白酶B(Fig. 6)。此外,通过该方法鉴定了其他几个组织素家族成员,包括Cathepsins Z,H,C和J.
      图缩略图GR6.
      Fig. 6从凝胶纯化的亲和纯化的半胱氨酸蛋白酶产生的胰蛋白酶肽的典型CID光谱。 前体离子是 m/z 647.34 (2+)。在液相色谱/ MS分析在由2D电泳纯化的蛋白质的液相色谱/ MS分析期间,在四极孔正交加速度串联质谱仪(Pulsar; MDS Sciex)中获得频谱。在通过2D电泳纯化的蛋白质的胰蛋白质分析期间,在信息依赖性采集模式中。看 )。吉祥物的数据库搜索使用这些和其他CID数据将蛋白质鉴定为Codepsin Z.插图显示了该仪器提供的分辨率。

       基于图书馆筛查数据的选择性抑制剂设计 -

      使用来自我们PSL的扫描信息,我们合成了几种旨在验证图书馆方法的单独化合物。在所有情况下,将P3酪氨酸作为放射性碘的位点,并且基于靶选择性选择P2残基。选择附着于(R,R)环氧化物抑制剂(YQ-(R,R)-EP)的P2谷氨酰胺是因为其对提取物中的组织蛋白酶B的选择性,并且选择了P2甘氨酸作为阴性对照。组织蛋白酶B特异性ABP MB-074(
      • Bogyo M.
      • Verhelst S.
      • Bellingard-Dubouchaud V.
      • Toba S.
      • Greenbaum D.
      具有放射性标记的亲电衬底类似物的溶酶体半胱氨酸蛋白酶的选择性靶向。
      )被用作与YQ-(R,R)-EP比较的对照。加入化合物以在宽浓度范围内提取,并通过标记评估每种靶标的活性 125I-DCG-04(图7A)。正如所料,YQ-(R,R)-EPS和MB-074选择性地阻止了组织蛋白酶B频带的标记(第2号),而YG-(R,R)-EPS对所有蛋白酶的抑制表现出很少或没有抑制。新开发的组织蛋白酶B抑制剂也是放射碘的并且用于标记肝匀浆(图7B.)。将标记型材与组织蛋白酶B特异性探针的曲线进行比较 125I-MB-074和一般反应性探针 125I-DCG-04。像MB-074这样的YQ-(R,R)-eps显示了识别为组织蛋白酶B的带的选择性标记。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7从文库筛选中评估特定蛋白酶抑制剂。 阴性对照化合物的竞争分析(YG-(R,R)EPS),从文库筛查中鉴定的组织蛋白酶B-特异性化合物(YQ-(R,R)EPS)和先前描述的组织蛋白酶B特异性抑制剂(MB-074)显示。将几种浓度的每种化合物与100μg总肝脏提取物一起温育30分钟,然后用125I-DCG-04为1小时。 ,组织素。 A,每个化合物的抑制剂量反应曲线。 B,直接标记100μg总肝提取物,用下碘期版本的DCG-04,MB-074和YQ-(R,R,)EPS。注意组织蛋白酶B的MB-074和YQ-(R,R)EPS的特异性。
      我们得出结论,通过筛选有限复杂性的文库,可以快速识别结构上不同类的组织蛋白酶B选择性抑制剂。所得的铅化合物虽然不过度有效,但现在是用于设计优化抑制剂的模板,这些抑制剂与CA-074类的细胞不可渗透的组织蛋白酶B抑制剂不同。毫无疑问,这种方法也可用于通过更广泛的图书馆筛查努力选择性地定位其他组织素家族成员。
      总之,我们开发了识别复杂蛋白质组内相关酶的家庭的工具。这些工具可用于确定这些酶的相对活性水平,并在活细胞中可视化它们的本地化。这些工具还允许快速设计和筛选小分子抑制剂,用于选择靶标。在目前的研究中,我们通过筛选粗肝提取物中的一小组文库成功地确定了一种新的组织蛋白酶B选择性抑制剂。此外,我们开发了一种迅速分析从粗细胞提取物中多个靶标产生的大数据集的快速分析。该方法允许快速比较抑制剂,以及基于结构函数关系中的相似性的目标。这种通用型蛋白质组学方法虽然在此应用于木瓜蛋白酶家庭蛋白酶,但也可用于通过设计和合成新的类特异性亲和力探针的新系列的各种酶系列。

      致谢

      我们感谢DieterBrömme(MT. Sinai Medicine)和Vito Turk(Jozef Stefan Institute)的纯化组织丝的礼物。我们感谢David Ginzinger的帮助,以帮助操作ABI DNA测序器并进行数据分析进行故障排除。

      补充材料

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