金属蛋白酶脱落细胞表面蛋白鉴定的蛋白质组学方法*

      金属蛋白酶通过金属蛋白酶的许多膜蛋白细胞外域的蛋白水解裂解(脱落)是哺乳动物细胞响应环境和生理变化的重要调节机制。在这里,我们描述了一种用于分析细胞表面脱落的蛋白质组学系统。该方法利用诱导细胞的短期培养上清液作为起始材料,其次是凝集素 - 亲和纯化,脱糖基化和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。通过同位素稀释实现蛋白质的相对定量。在该研究中,已知从活化的单核细胞和内皮细胞中鉴定了已经已知脱落的许多蛋白质,从而验证该方法。此外,新鉴定了一组蛋白质是脱落。该方法提供了对筛位蛋白质的筛选方式的不偏不偏。
      细胞膜结合蛋白的蛋白水解提供了调节蛋白质功能的翻译方式,并已被证明通过所谓的胞外脱落的过程控制许多可溶性细胞因子,受体,粘附分子和生长因子的产生(
      • Schlondorff J.
      • Blobel C.P.
      金属蛋白酶 - 解丁基:能够促进细胞 - 细胞相互作用并通过蛋白质 - 胞外瘤脱落触发信号的模蛋白。
      ,
      • Mullberg J.
      • Althoff K.
      • Jostock T.
      • 罗斯约翰斯。
      截止膜蛋白对细胞因子生物学的重要性。
      )。异常脱落可以促进类风湿性关节炎和癌症等疾病(
      • Blobel C.P.
      蛋白水解在细胞表面上的显着作用。
      )。 Ectodomain Shedding的关键球员是亚当(adIsintegrin. an meTalloprootease)金属蛋白酶的家族(
      • Schlondorff J.
      • Blobel C.P.
      金属蛋白酶 - 解丁基:能够促进细胞 - 细胞相互作用并通过蛋白质 - 胞外瘤脱落触发信号的模蛋白。
      ,
      • Mullberg J.
      • Althoff K.
      • Jostock T.
      • 罗斯约翰斯。
      截止膜蛋白对细胞因子生物学的重要性。
      )。 ADAMS的特征在于由保守的结构域结构,由N-末端信号序列组成,然后是基础域,金属蛋白酶和Disintegrin结构域,通常含有表皮生长因子重复,跨膜结构域和A的半胱氨酸的区域。细胞质尾部(
      • 黑色r.a.
      • 白金。
      亚当斯:专注于蛋白酶域。
      )。
      肿瘤坏死因子-α转换酶(TACE / ADAM-17)
      使用的缩写是:TACE,肿瘤坏死因子-α-转化酶; 1D,一维; 2D,二维; DRM,DEXTER-Ras-Myc.; HMVEC,人体成人真皮微血管内皮细胞; WGA,小麦胚芽凝集素; MS / MS,串联质谱; IC-3,Immunex Compien-3; PMA,Phorbol 12-Myristate 13-醋酸盐; TNF-α,肿瘤坏死因子-α; IL,白细胞介素; CHAPS,3 - [(3-胆氨基甲基丙基)二甲基氨基嘧啶] -1-丙二磺酸; dthiothreitol; LDL,低密度脂蛋白; SHPS-1,SH2含域酪氨酸磷酸酶底物1; h,人; r,受体。
      1使用的缩写是:TACE,肿瘤坏死因子-α-转化酶; 1D,一维; 2D,二维; DRM,DEXTER-Ras-Myc.; HMVEC,人体成人真皮微血管内皮细胞; WGA,小麦胚芽凝集素; MS / MS,串联质谱; IC-3,Immunex Compien-3; PMA,Phorbol 12-Myristate 13-醋酸盐; TNF-α,肿瘤坏死因子-α; IL,白细胞介素; CHAPS,3 - [(3-胆氨基甲基丙基)二甲基氨基嘧啶] -1-丙二磺酸; dthiothreitol; LDL,低密度脂蛋白; SHPS-1,SH2含域酪氨酸磷酸酶底物1; h,人; r,受体。
      是第一个亚当家族蛋白酶作为脱乳酶的特征。最初通过其裂解膜结合的protnf-α的能力,TNF-α的前体形式,导致来自细胞的可溶性TNF-α(
      • 黑色r.a.
      • rauch c.t.
      • Kozlosky C.J.
      • Peschon J.J.
      • 松弛J.L.
      • Wolfson M.F.
      • Castner B.J.
      • 库存K.L.
      • 雷迪P.
      • Srinivasan S.
      • 纳尔逊N.
      • Boiani N.
      • Schooley K.A.
      • Gerhart M.
      • 戴维斯R.
      • Fitzner J.N.
      • 约翰逊R.S.
      • Paxton R.J.
      • 3月C.J.
      • Cerretti D.P.
      金属蛋白酶脱胶素,释放来自细胞的肿瘤坏死因子-α。
      ,
      • 苔藓m.l.
      • jin s.l.
      • Milla M.E.
      • Bickett D.M.
      • Burkhart W.
      • 卡特H.L.
      • 陈W.J.
      • 粘土W.C.
      • 迪斯伯里J.R.
      • 哈桑德勒D.
      • 霍夫曼C.R.
      • Kost T.A.
      • 兰伯特M.H.
      • Leesnitzer M.A.
      • McCauley P.
      • McGeehan G.
      • 米切尔J.
      • Moyer M.
      • Pahel G.
      • rocque w.
      • overton l.k.
      • Schoenen F.
      • Seaton T.
      • 苏J.L.
      • BECHERER J.D.
      克隆一种解毒素化金属蛋白酶,其方法处理前体肿瘤坏死因子-α。
      )。随后的工作,主要涉及TACE敲除小鼠和细胞(
      • Peschon J.J.
      • 松弛J.L.
      • 雷迪P.
      • 库存K.L.
      • Sunnarborg S.W.
      • 李D.C.
      • 罗素W.E.
      • Castner B.J.
      • 约翰逊R.S.
      • Fitzner J.N.
      • Boyce R.W.
      • 纳尔逊N.
      • Kozlosky C.J.
      • Wolfson M.F.
      • rauch c.t.
      • Cerretti D.P.
      • Paxton R.J.
      • 3月C.J.
      • 黑色r.a.
      哺乳动物发展中外胚层脱落的重要作用。
      )表示,许多其他蛋白质的脱落是由TACE介导的。这些包括转化生长因子-α, l - 选择素,P75 TNF RECEPOR,淀粉样蛋白前体,CD30,IL-6受体,NOTCH 1受体,生长激素结合蛋白和巨噬细胞菌落刺激因子受体(
      • Peschon J.J.
      • 松弛J.L.
      • 雷迪P.
      • 库存K.L.
      • Sunnarborg S.W.
      • 李D.C.
      • 罗素W.E.
      • Castner B.J.
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      • rauch c.t.
      • Cerretti D.P.
      • Paxton R.J.
      • 3月C.J.
      • 黑色r.a.
      哺乳动物发展中外胚层脱落的重要作用。
      ,
      • Buxbaum J.D.
      • 刘k.n.
      • 罗y.
      • 松弛J.L.
      • 库存K.L.
      • Peschon J.J.
      • 约翰逊R.S.
      • Castner B.J.
      • Cerretti D.P.
      • 黑色r.a.
      肿瘤坏死因子-α-转化酶的证据参与了阿尔茨海默蛋白蛋白前体的调节α-分泌酶切割。
      ,
      • 布鲁C.
      • Logeat F.
      • Gupta n。
      • 贝斯蒂亚C.
      • Lebail O.
      • DOEDENS J.R.
      • 坎帕诺A.
      • roux p.
      • 黑色r.a.
      • 以色列A.
      涉及陷波信号传导的新型蛋白水解裂解:Disintegrin-Metallopotease Tace的作用。
      ,
      • 汉森H.P.
      • 饮食饮食司。
      • Kisseleva T.
      • Mokros T.
      • Mentlein R.
      • lange H.H.
      • 墨菲G.
      • lemke h.
      来自karpas 299淋巴瘤细胞的CD30脱落由TNF-α-转换酶介导。
      ,
      • 张Y.
      • 江j。
      • 黑色r.a.
      • Baumann G.
      • 弗兰克S.J.
      肿瘤坏死因子-α-转化酶(TACE)是生长激素结合蛋白(GHBP)脱落酶:金属蛋白酶TACE / ADAM-17对于(PMA诱导的)GH受体蛋白水解和GHBP生成至关重要。
      ,
      • 罗维迪达E.
      • Paccagnini A.
      • Del Rosso M.
      • Peschon J.
      • dello sbarba p.
      TNF-α-转化酶在接受活化的巨噬细胞中切割巨噬细胞菌落刺激因子受体。
      ,
      • Althoff K.
      • 雷迪P.
      • 伏特N.
      • 罗斯约翰斯。
      • Mullberg J.
      白细胞介素-6受体和肿瘤坏死因子-α的脱落。秸秆序列对跨膜蛋白的切割模式的贡献。
      )。在所有这些研究中,通过假设驱动的方法而不是通过筛选过程进行与TACE的连锁。
      蛋白质脱落是一个与mRNA的表达水平无关的翻译后事件;因此,筛选蛋白质脱落事件需要蛋白质组学方法。为了分离脱落蛋白,其中许多来自细胞上清液,我们首先利用凝集素 - 亲和纯化步骤来分离糖蛋白。一个 N - 随后用于降低蛋白质的异质性,从一维SDS-PAGE(1D-PAGE)凝胶上增强了分辨率的蛋白质的异质性。定量比较受监管 相对 本构脱落,使用新型硫醇烷基化试剂进行稳定同位素稀释。根据胰蛋白酶碎片的质谱分析,我们已经鉴定了几种金属蛋白酶释放的蛋白质,包括已知的蛋白质是脱落的蛋白质等。

      实验步骤

       Dexter-Ras-Myc(DRM)细胞 -

      DRM TACE + / +和TACE - / - 细胞系(
      • Peschon J.J.
      • 松弛J.L.
      • 雷迪P.
      • 库存K.L.
      • Sunnarborg S.W.
      • 李D.C.
      • 罗素W.E.
      • Castner B.J.
      • 约翰逊R.S.
      • Fitzner J.N.
      • Boyce R.W.
      • 纳尔逊N.
      • Kozlosky C.J.
      • Wolfson M.F.
      • rauch c.t.
      • Cerretti D.P.
      • Paxton R.J.
      • 3月C.J.
      • 黑色r.a.
      哺乳动物发展中外胚层脱落的重要作用。
      )如所述培养(
      • 罗维迪达E.
      • Paccagnini A.
      • Del Rosso M.
      • Peschon J.
      • dello sbarba p.
      TNF-α-转化酶在接受活化的巨噬细胞中切割巨噬细胞菌落刺激因子受体。
      )。编码编码逆转录病毒(如上所述)(
      • Kinsella T.M.
      • Nolan G.P.
      蜕皮载体快速且稳定地产生高滴度重组逆转录病毒。
      )并用于重建TACE - / - DRM细胞中的功能全长TACE。通过用含有空载体的逆转录病毒转染TACE - / - DRM细胞来产生对照细胞。通过功能性重构测定证实了TACE的表达。简而言之,通过脂多糖(1μg/ ml)刺激DRM TACE - / - 单核细胞,通过酶联免疫吸附测定分析TNF和TNF受体的脱落(Opteia TM; Pharmingen)。

       人类成年皮肤微血管内皮细胞(HMVEC) -

      HMVECS(Biowhittaker / Clonetics,Walkersville,MD)在EGM2MV媒体(Biowhittaker / Clonetics)中生长至通过6.每2-3天用新鲜培养基喂养培养物并每5天通过一次。通过,80-90%的汇合培养物轻轻胰蛋白酶化(Biowhittaker / Clonetics),T175烧瓶在10,000个细胞/厘米处接种2 in 35 ml of media.

       细胞刺激 -

      在刺激之前,将DRM细胞在1升旋转瓶中膨胀,播种为2.5×105 细胞/ ml,生长至〜2-3×106 在800ml生长培养基中的细胞/ ml。通过用冷,无血清RPMI 1640(Invitrogen)洗涤两次并在冷,酚红,无血清无血清RPMI 1640(Invitrogen)中制备DRM细胞进行刺激。将洗涤的细胞置于8×10的T175烧瓶中6 将细胞/ ml在25ml酚红和无血清RPMI 1640中加入IC-3(25μg/ ml)和/或PMA(100ng / mL)(ICN Biomedicals,Inc.,极光,哦)适当的烧瓶。用5%的CO在37℃下孵育90分钟的烧瓶2。收获所有烧瓶中的上清液,以1200rpm,4°C离心10分钟; 0.22-μm过滤(康宁玻璃Inc.,康宁,NY)并用蛋白酶抑制剂(175μg/ ml苯基甲基磺酰磺酰磺酰硫化物处理,4.75μg/ ml Leupeptin,6.9μg/ ml胃蛋白酶A和2.5μg/ ml EDTA)处理。上清液浓缩(Centricon Plus-80,10-KDA截止; Millipore,Bedford,Ma;在纯化之前,对于高达80毫升的体积。
      对于HMVEC刺激,使用通道6,90%汇合细胞。将生长培养基轻轻替换为EBM-2基础培养基(Biowhittaker /批判,),培养培养物14小时。用酚红EBM基础培养基(Biowhittaker /批判)轻轻替换培养基,并补充有烧瓶的一半,炎症细胞因子混合物4小时。细胞因子混合物由100ng / ml HCD40L(Immunex,西雅图,WA),2ng / ml HIL-1β(Immunex),2ng / mlHTNFα(Biosource International,Inc.,Camarillo,CA),100个单位/ ml人体干扰素-γ(Biosource International,Inc.,Camarillo,Ca),30 ng / ml人体成纤维细胞生长因子 - 基础(Chemicon International,Inc.,Temecula,CA),100 ng / ml Htweak(Chemicon International),和10 ng / ml人血管内皮生长因子(Chemicon International)。在4小时后,将PMA(100ng / ml)(ICN Biomedicals,Inc。)加入到含细胞因子的烧瓶中,将其孵育另外一小时。所有烧瓶中的上清液都是上面收获的。对于细胞因子刺激的细胞每10个全部上清蛋白质产量8 细胞为6.3mg,而未刺激的对照细胞产生3.0mg。

       凝集素 - 亲和纯化 -

      为了将可溶性糖蛋白分离在细胞上清液中,使用琼脂糖结合的小麦胚芽凝集素(WGA)(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,Ca)进行凝集素 - 亲和层析。简而言之,将2-4mg浓缩的上清液蛋白与250μl洗涤的WGA-琼脂糖珠孵育在4ml的Hepes / NaCl缓冲液中(10米m HEPES,pH 7.5,含0.15 m NaCl)在封端的微生物旋转色谱柱(Bio-rad,Hercules,Ca)中。在旋转振荡器上在4℃下孵育1小时后,用5ml的HEPES / NaCl缓冲液洗涤柱三次。然后用3ml 0.5洗脱凝集素结合蛋白 m N - 乙酰 - d-Glucosamine在Hepes / NaCl缓冲液中。过量的 N - 乙酰 - d从WGA洗脱液中除去葡萄氨酰胺7.5倍浓度(Centricon YM-10,10-KDA截止; Millipore,Bedford,MA,高达2mL的体积),然后使用方法在室温下蛋白质沉淀在洗涤剂和脂质存在下稀释溶液中蛋白质的定量回收(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )。

       脱糖基化 -

      N使用重组从糖蛋白中除去庚烷 N - 糖苷酶F,也称为 N-glycanase或pngasef(Glyko,Inc.,Novato,CA)。如供应商的指示进行脱糖基化反应。

       一维电泳 -

      使用Tris / Glycine 4-20%梯度凝胶(Novex凝胶; Invitrogen,Carlsbad,CA)在还原条件下进行1D-PAGE。使用来自Bio-rad(HERCULES CA)的固定的11-CM固定的pH梯度条进行2D分离的第一尺寸。将脱糖基化的蛋白质与再水化缓冲液混合(8 m urea, 2% CHAPS, 45 mm DTT,0.5%两种透光剂,pH 3-10(Bio-rad)和0.0002%溴酚蓝。使用来自Amersham Biosciences,Inc的IPGphor系统进行等电聚焦。使用Bio-rad的4-20%梯度标准凝胶用于第二尺寸。通过用胶体蓝(Invitrogen)染色来检测蛋白质带/斑点。

       蛋白质还原,烷基化和消化 -

      从1D-PAGE凝胶中切除蛋白质点/带,通过用200μm的混合物来洗涤而抵抗m NH4HCO3/乙腈(1:1)。用DTT降低蛋白质,用碘乙酰胺烷基化或 N - 乙基 - 碘乙酰胺(如“结果”所示),并如所述用胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)消化的凝胶中(
      • 舍甫琴科A.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      蛋白质银染色聚丙烯酰胺凝胶的质谱测序。
      )。 N - 用盐酸乙胺(D0或D 5形式)和碘酸酐合成乙基 - 碘乙酰胺(D0或D5形式)。通过在质谱分析之前通过真空离心浓缩胰蛋白胨肽。

       质谱-

      在Micromass Qtof 1仪器(Micromass UK Ltd.,Wythenshawe,United Kingdom)上进行胰蛋白酶肽的质谱分析。使用LCPackings(San Francisco,CA)50-μm内直径C,通过在线微小型液相色谱 - 电喷雾离子化 - 串联质谱(MS / MS)分析进行测序。18 柱子。使用以5μl/ min操作的Eldex微泵(NAPA,CA)开发梯度,并且在喷射器之前分开流动,使得通过柱的流速为〜250nl / min。柱的流出物涉及含有铂电极和新物镜(剑桥,MA)未涂覆的熔融二氧化硅尖(360-μm外径,内径,拉动的新物镜(剑桥,MA)的升高(剑桥,MA),到一个10微米的开口)。质谱仪在数据依赖性MS / MS模式下操作,并且通过使用吉祥物计划搜索非冗余蛋白质序列数据库来识别蛋白质(
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库来搜索基于概率的蛋白质识别。
      )。对每个样品进行第二液相识/ MS采集(仅限MS模式)以产生用于定量的精确离子强度数据。

      结果

       单核细胞中金属蛋白酶血液蛋白的鉴定 -

      许多金属蛋白酶介导的脱落事件由Phorbol酯如PMA诱导并被羟胺酸化合物如IC-3(
      • 马蹄N.M.
      • 哈兰·埃姆
      • 特纳。
      膜蛋白分泌酶。
      ,
      • Mohler K.m.
      • P.R..
      • Fitzner J.N.
      • Cerretti D.P.
      • 阿尔德森姆
      • Derwar S.S.
      • 托兰斯D.S.
      • OTTEN-EVANS C.
      • 格林斯特格T.
      • Weerawarna K.
      • Kronheim S.R.
      • Petersen M.
      • Gerhart M.
      • Kozlosky C.J.
      • 3月C.J.
      • 黑色r.a.
      通过肿瘤坏死因子加工抑制剂对抗致死剂量的内毒素。
      )。分离脱落蛋白,从野生型骨髓衍生的单核细胞(DRM)细胞中收集细胞上清液(
      • Peschon J.J.
      • 松弛J.L.
      • 雷迪P.
      • 库存K.L.
      • Sunnarborg S.W.
      • 李D.C.
      • 罗素W.E.
      • Castner B.J.
      • 约翰逊R.S.
      • Fitzner J.N.
      • Boyce R.W.
      • 纳尔逊N.
      • Kozlosky C.J.
      • Wolfson M.F.
      • rauch c.t.
      • Cerretti D.P.
      • Paxton R.J.
      • 3月C.J.
      • 黑色r.a.
      哺乳动物发展中外胚层脱落的重要作用。
      )在IC-3的存在或不存在下用PMA刺激。从六个单独的实验中,平均4.0mg上清液蛋白质来自109 IC-3存在下的细胞;从九个单独的实验中,平均每10个4.3毫克9 在没有IC-3的情况下获得细胞。因为在两个样品中没有在蛋白质的总量中检测到统计学上显着的差异,所以推导出血液蛋白组成的小部分,并且大多数上清蛋白源自正常细胞周转和代谢。当用胰蛋白酶消化上清蛋白并由MS / MS分析时,确认这一点。这些数据显示细胞上清液中最突出的蛋白质是各种形式的热休克蛋白,肌动蛋白和代谢途径酶。
      与这种观察一致,我们无法辨别从一对细胞上清液(有和没有IC-3)获得的2D(等电聚焦和SDS) - 凝胶上的染色模式的任何差异(图。1A 和数据未显示)。虽然2D-PAGE被广泛使用并被公认为蛋白质组学的基本工具,但它似乎只显示了复杂样品中最丰富的蛋白质(
      • Gygi S.P.
      • Corthals G.L.
      • 张Y.
      • Rochon Y.
      • Aeberberold R.
      二维凝胶电泳的蛋白质组分析技术评价。
      ,
      • 史密斯r.d.
      探测蛋白质 - 看到整个画面?
      )。因此,很明显,需要额外的蛋白质分级来辨别这些样品中低丰度蛋白之间的定量差异。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1在没有金属蛋白酶抑制剂IC-3的情况下,用PMA刺激90分钟的DRM TACE + / +细胞的2D-PAGE凝胶。A,200μg上清液,衍生自〜5×107 将细胞加载到凝胶上。 B,从5.8mg总上清液蛋白(衍生自〜3×109 细胞),通过WGA凝集素 - 亲和纯化获得的所有糖蛋白是 N - 将和装载到凝胶上。蛋白质分配基于数据库与串联质谱()。从每种蛋白质中鉴定的肽数目 括弧.
      因为大多数细胞表面蛋白质含有一种或多种碳水化合物基团,所以从细胞膜释放的蛋白质可能是糖基化的。 WGA含有一组密切相关的分离菌素,可以结合含唾液酸或末端的寡糖 N - 对于许多哺乳动物分泌和膜糖蛋白是常见的 - 乙酰甘氨酸。因此,选择共轭的WGA-琼脂糖从细胞上清液中选择糖蛋白的亲和纯化。在凝集素 - 亲和分级后,对分离的糖蛋白进行 N - 通过重组处理通过治疗方法 N - 糖苷酶F具有减少糖蛋白异质性的效果,因此增强了聚焦在SDS-PAGE(1D-PAGE)凝胶的蛋白质。
      N - 通过2d-and 1d-page分析了替代溶胶化蛋白(见 图。1BFig. 2)。与含有IC-3的培养物的样品相比(未示出的数据)相比,确定几个2D页斑点是独特的,或者在没有用IC-3未处理的细胞获得的上清液中的强度是独特的或增加的强度(用PMA刺激细胞在这两种情况下)(图。1B)。在WGA富集糖蛋白的富集之前,这些斑点是不可检测的(图。1A),显然是因为它们在未分叉的细胞上清液中的丰度相对较低。切除含有这些斑点的凝胶块,并通过胰蛋白酶的凝胶消化后串联质谱法鉴定它们的蛋白质含量(表I.)。除了生成的松蛋白和小管蛋白,从2D页实验中鉴定的蛋白质是1型跨膜蛋白(表I.),从而表明凝集素 - 亲和步骤在消除细胞质蛋白方面具有合理有效。鉴定了所有的胰蛋白胨肽(表I.)衍生自相应膜蛋白的细胞外结构域,如通过脱落释放的蛋白质预测的。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2WGA凝集素 - 亲和纯化后,来自DRM TACE + / +细胞的上清蛋白的1D-PAGE凝胶。 N-D.eglycosylation。 在金属蛋白酶抑制剂IC-3的存在或不存在下,用PMA刺激DRM TACE + / +细胞90分钟。从等数量的细胞获得的蛋白质(~1×109 细胞)在每个车道中加载。从凝胶中切除匹配的蛋白质条带,用DTT减少,用同位素的光(D0)或重形状(D5)用DTT烷基化 N - 乙基 - 碘乙酰胺,用胰蛋白酶消化凝胶。将来自匹配带的肽组合并通过质谱分析。离子强度测量用于测定D0 / D5比率,其反映了混合物中的相对蛋白质量。染色模式除了频段外,染色模式可重复>鉴定为杂种受体Sorla的200kDa(例如)。在大多数情况下,凝胶染色表明,在没有IC-3的情况下SORLA脱落,并且通过IC-3抑制了脱落,表明该蛋白质也是金属蛋白酶缩短的受体。 C# 表示烷基化半胱氨酸; M *表示甲硫氨酸亚砜。
      表I.通过串联质谱法鉴定的肽序列在凝胶胰蛋白酶消化的2D-PAGE斑点之后(Fig. 1)
      a 从entrez,www.ncbi.nlm.nih.gov:80获得蛋白质描述。
      b 小写m表示甲硫氨酸亚砜。
      c N - 糖基化位点,ASN被酶促转换为ASP N - 糖苷酶F处理。
      虽然 N-D.eglycosylation减少蛋白质异质性,它不会消除它。因此,由于等电点和/或分子质量偏移产生的差异 O- 糖基化和其他修饰,大多数蛋白质出现在2D页凝胶上的多个斑点,并且许多斑点含有多个蛋白质(Fig. 1)。这使蛋白质定量通过凝胶扫描和密度测定非常困难。为了克服这个问题,我们建立了一种蛋白质定量方法,将1D页与稳定同位素稀释结合。蛋白质首先通过1D-PAGE分馏(Fig. 2)。然后从1D凝胶中切除具有相同分子量(具有和不含IC-3)的匹配的蛋白质条对。用DTT降低蛋白质,并用同位素光烷基化半胱氨酸 N - 乙基 - 碘乙酰胺(D0)或重 N-D.5 - 乙基 - 碘乙酰胺(D5)和用胰蛋白酶消化的内凝胶。通过质谱结合并通过质谱分析胰蛋白酶消化物。
      从1D-PAGE凝胶中鉴定的蛋白质包括在2D-GEL实验中鉴定的所有蛋白质(参见 Fig. 1表I.)。此外,对于这些蛋白质,通过比较D0和D5离子的强度来确定含半胱氨酸肽的含半胱氨酸肽相对定量的蛋白质(Fig. 2)。显示了用于定量的这些离子对的两个例子(Fig. 3)。 D0的比较 相对 D5强度透露接近1的肽接近1的肽,热休克73蛋白和 N - 糖苷酶F(Fig. 2)。预期的比例为1 N - 糖苷酶F,因为相等的量 N在脱糖基化处理期间加入到每个样品中的糖苷酶F.在凝集素纯化之前,Saposin和热休克73蛋白是细胞上清液中最丰富的蛋白质中,分别代表非金属蛋白酶介导的血清和分泌的蛋白质。相反,在缺乏IC-3的样品中,确定几种膜蛋白,包括LDLR,淀粉样蛋白A4蛋白,AXLR,SHPS-1和CD14(Fig. 2)。我们得出结论,这些蛋白质通过IC-3可抑制的金属蛋白酶脱落。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3展开质谱截面,显示用于定量肽的离子对的实例。 通常观察到离子对的质量差为5或10da,取决于给定肽中的半胱氨酸数量。 A,(m + h2)2+ 离子肽GC#SFLPDPYQK来自Saposin(见 )。 B,(m + h2)2+ 肽的离子C#VPFFYGGC#GGNR来自淀粉样蛋白A4(见 )。 C# 表示烷基化半胱氨酸。
      将该实验重复几次,并且除了非常高的分子量蛋白外,1D-PAGE凝胶模式非常可再现(>200 kda)命名为混合受体Sorla(Genpept:O88307)。在大多数情况下,染色模式表明在没有IC-3的情况下脱落,但在金属蛋白酶抑制剂的存在下,Sorla脱落。在一些情况下( Fig. 2),Sorla的Shedding并不明显。在这种特殊凝胶中没有Sorla的原因是未知的,但它可能是因为凝胶质量的可变性,或者这种大蛋白质可能不会再现地迁移。

       鉴定单核细胞的TACE介导的脱落 -

      将上述事件与TACE活动,TACE - / - DRM细胞链接(
      • Peschon J.J.
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      • 雷迪P.
      • 库存K.L.
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      • 3月C.J.
      • 黑色r.a.
      哺乳动物发展中外胚层脱落的重要作用。
      )用全长的TACE重建。用空载体转染的TACE - / - 细胞中的TACE重构细胞系的蛋白质脱落谱的比较显示1D-PAGE的可见差异( Fig. 4)。从1D-PAGE凝胶中切割的所选区域的定量分析显示出几种蛋白质的肽数量的变化,包括杂化受体SORLA,LDLR,淀粉样蛋白A4,AXLR,IL-1R-2和IL-6R-1。因此,这些蛋白质最有可能被TACE脱落。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4来自PMA刺激的DRM的上清液蛋白的1D-PAGE凝胶。 TACE - / - 细胞和PMA刺激的DRM TACE - / - 通过全长TACE重建,继WGA凝集素 - 亲和纯化和 N - 显示了 - 显示。从等数量的细胞获得的蛋白质(~1×109 细胞)在每个车道中加载。从凝胶中切除匹配的蛋白质带,用DTT减少,用同位素光(D0)或重形式(D5)烷基化。 N - 乙基 - 碘乙酰胺,用胰蛋白酶消化凝胶。通过质谱合并胰蛋白酶肽并分析。离子强度测量用于测定D0 / D5比率,其反映了两种蛋白质混合物中的相对蛋白质量。标有蛋白质乐队 ** 与对照细胞相比,显然含有含Tace的细胞中的蛋白质。从该带鉴定的蛋白质包括过氧化毒素1(P35700),内皮蛋白C受体(Q64695)和蒽酮肽M(S64719)。因为没有从这些蛋白质中回收含半胱氨酸的肽,因此不能从数据中获得定量测量。 C# 表示烷基化半胱氨酸。

       内皮细胞中金属蛋白酶的鉴定 -

      为了确定这种方法是否可用于鉴定其他细胞类型脱落的蛋白质,我们进行了HMVEC的研究。用炎性细胞因子的混合物处理HMVEC,其次是PMA诱导脱落,并将细胞上清液与未刺激的HMVEC上清液进行比较。凝集素 - 亲和纯化和 N - 通过1d-page分析上清液蛋白,上清液(Fig. 5)。总的来说,两种蛋白质谱非常相似,并且一些差异可能归因于作为细胞刺激的一部分添加的细胞因子(例如 乐队标记为干扰素-γ)。然而,两种HMVEC衍生的蛋白质,锯齿状1和内皮细胞蛋白C受体被从蛋白质带中鉴定出在细胞因子/ PMA处理的样品中具有更大的染色强度(Fig. 5)。使用同位素编码的差分半胱氨酸标记方法的蛋白质定量证明,这两种蛋白质在刺激的细胞上清液中确实丰富了(Fig. 5)。虽然我们没有确定IC-3对其释放的影响,但两者都是跨膜蛋白,因此可能通过脱落来释放。实际上,内皮细胞蛋白C受体先前被鉴定为内皮细胞中的金属蛋白酶血液蛋白(
      • 徐J.
      • qu d.
      • ESMON N.L.
      • ESMON C.T.
      内皮细胞蛋白C受体的金属蛋白解释放。
      ),从而验证应用于HMVEC的方法。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5WGA凝集素 - 亲和纯化后HMVEC中的上清蛋白的1D-PAGE凝胶和 N-D.eglycosylation。 HMVEC与细胞因子未经处理或刺激,然后PMA诱导脱落。从8×10获得的蛋白质6 将细胞加载到每个车道中。从凝胶中切除匹配的蛋白质带,用DTT减少,用同位素光(D0)或重形式(D5)烷基化。 n乙基 - 碘乙酰胺,用胰蛋白酶消化凝胶。组合胰蛋白酶肽并通过质谱分析分析。离子强度测量用于测定D0 / D5比率,其反映了两种蛋白质混合物中的相对蛋白质量。 C# 表示烷基化半胱氨酸。

      讨论

      使用两种不同的细胞系统,在该研究中鉴定了几种已知或涉及金属蛋白酶血液蛋白的蛋白质。这些包括淀粉样蛋白A4蛋白,IL-1R-2,IL-6R-1, l-Selectin,M-CSFR,Sorla,AxLR和内皮细胞蛋白C受体(
      • Peschon J.J.
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      受体酪氨酸激酶ARK通过同性恋结合介导细胞聚集。
      )。因此,该蛋白质组学技术被验证为可用于蛋白质脱落的研究中的方法。此外,该研究涉及许多额外的蛋白质作为金属蛋白酶脱落,包括LDLR,SHPS-1和锯齿状1.在LDLR的情况下,TACE显示为负载蛋白酶,以及一些先前鉴定的血液蛋白质(例如 Sheddase没有确定X1R和杂交受体Sorla)。
      LDLR被称为细胞表面受体,其与LDL结合,血浆中的主要胆固醇载玻片脂蛋白,并通过内吞作用将LDL转化为细胞(
      • 棕色M.S.
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      胆固醇稳态的受体介导的途径。
      )。其他LDLR基因家族蛋白质,包括Sorla(见 Fig. 4,已经发现这里发现的血液蛋白在这里被TACE释放)从事广泛的生物功能(
      • 赫兹J.
      LDL受体基因家族:(UN)大脑中的预期信号传感器。
      )。跨膜糖蛋白SHPS-1是蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶SHP-2的生理基质,属于抑制受体超家族。 SHPS-1在巨噬细胞和神经组织中大量表达,并致力于调节受体蛋白 - 酪氨酸激酶下游的细胞内信号传导事件,并整合介导的细胞骨骼重组和细胞运动性(
      • inagaki K.
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      SHPS-1调节整联蛋白介导的细胞骨骼重组和细胞运动性。
      )。锯齿状1是受体凹口的配体1.通过凹口1的锯齿状1信号传导1在血液缺陷中发挥作用。金属蛋白酶介导的LDLR,SHPS-1和锯齿状1的功能意义仍有待进一步探索。
      2D-PAGE上的全局蛋白质组显示器可能主要限于更加丰富的表达和稳定的蛋白质(
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      探测蛋白质 - 看到整个画面?
      )但在2D-PAGE之前应用靶向蛋白质分离和修饰程序可能会产生有意义的结果。如这里所示(Fig. 1),如果仔细选择起始材料(在这种情况下的短期细胞上清液),可以在2D-PAGE上有效地显示一组低丰度蛋白,其中最多的蛋白质是免疫抑制蛋白,并且在仔细选择起始材料(在这种情况下),并且电泳前面是一个电泳凝集素 - 亲和分级和脱糖基化。此外,甚至1D-PAGE,低成本,可重复和用于比较和表征蛋白的快速方法,发现对这些样品有效。通过组合适当的样品制备,1D-PAGE,同位素稀释和质谱,我们已经证明了一种比较复杂混合物中蛋白质的相对丰度的方法。

      致谢

      我们感谢Jacque Wilk,Raymond Davis,Allison Wallace,Min Shen进行技术援助; jeffrey fitzner合成 N - 乙基 - 碘乙酰胺;和Anne Aumell用于批判性读取稿件。

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