基质金属蛋白酶10底物降解的时间分辨分析*

  • Pascal Schlage.
    隶属关系
    SchafmattstrstR学院生物学系Eth苏黎世。瑞士8093苏黎世;
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  • Fabian E. Egli.
    隶属关系
    SchafmattstrstR学院生物学系Eth苏黎世。瑞士8093苏黎世;
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  • Paolo Nanni.
    隶属关系
    苏黎世功能基因组学中心苏黎世,Uzh / Eth苏黎世,Winterthurerstr。 190,8057苏黎世,瑞士;
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  • 劳伦W.王
    隶属关系
    Lerner Research Institute,Lerner Research Insture,克利夫兰诊所,9500欧元大道,俄亥俄州克利夫兰44195;
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  • Jayachandran N. Kizhakkedathu
    隶属关系
    英国大学哥伦比亚大学,病理学和实验室医学系,血液研究中心,4.401生命科学研究所,2350健康科学商城,温哥华,不列颠哥伦比亚省,加拿大V6T 1Z3
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  • 孙伊斯州的APTE.
    隶属关系
    Lerner Research Institute,Lerner Research Insture,克利夫兰诊所,9500欧元大道,俄亥俄州克利夫兰44195;
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  • Ulrich Auf Dem Keller
    一致
    应解决谁的通信:埃尔苏黎世,生物学系,分子健康科学研究所,Schafmattstr。 22,8093苏黎世,瑞士。 Tel.:Port.41-44-633-3392;传真:+ 41-44-633-1147;
    隶属关系
    SchafmattstrstR学院生物学系Eth苏黎世。瑞士8093苏黎世;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了瑞士国家科学基金会(31003A_140726)和欧洲委员会(Marie Curie International Reinoproation Grant; FP7-People-2010-RG / Skintermomics)的支持支持,由国家健康研究院(HL107147和EY021151 )到SSA,由Eth苏黎世的资金。 J.N.K.承认迈克尔史密斯卫生研究职业调查员学者奖。
    本文包含补充图。 S1至S4和表S1至S9。
      蛋白水解是一种不可逆的翻译后修饰,通过调节生物活性介质的活性来影响和细胞间通信。理解蛋白酶功能的关键是在生理环境中系统范围内识别切割事件及其动态。尽管近期基于质谱的蛋白质组学进行了高通量底物筛选的进步,但目前的方法患有高假阳性率,并且仅捕获单一蛋白酶活性状态。这里,我们在复杂蛋白质组中基于复用终端胺同位素标记的基于多路复用末端胺同位素标记的工作流程。这种方法显着提高了基底鉴定的置信度,并通过裂解位点的特异性和结构可及性对切割事件进行分类。我们证明了伴随植物跨越肽和Neo-N和/或Neo-C Termini的伴随定量,以估计非植垢和切割形式的底物蛋白的相对比。通过将该策略应用于将基质金属蛋白酶10(MMP10)底物中脱纤维细胞分泌物进行描述,我们将细胞外基质蛋白质蛋白1(ADAMTSL1)鉴定为直接MMP10底物,并揭示了血小板衍生的生长的MMP10依赖性突出瘤因子受体α(PDGFRα)以及I型胶原的顺序处理。数据已被沉积在蛋白质十六种联盟中,标识符PXD000503。
      历史上被认为是蛋白质的非特异性降解的机制,现在将蛋白水解被认为是影响主要的内细胞和细胞内信号传导过程的特定不可逆的翻译后修饰(
      • 土耳其人B.
      • turk d.s.a.
      • 土耳其人V.
      蛋白酶信号传导:切削刃。
      ,
      • Khokha R.
      • 穆尔蒂A.
      • Weiss A.
      金属蛋白酶及其炎症和免疫的天然抑制剂。
      )。蛋白酶特异性地处理生物活性蛋白质,它们的受体和相关蛋白质在互连的相互作用网络中称为蛋白酶网(
      • auf dem keller u.
      • Doucet A.
      • 总体上行
      系统生物学时代的蛋白酶研究。
      )。蛋白酶网的失调可能导致或导致病理,例如有损的组织修复,癌症和神经变性疾病。因此,更好地理解蛋白水解网络中的各种蛋白酶的功能及其互连是利用蛋白酶作为治疗干预的靶标的前提(
      • 总体上行
      • Kleifeld O.
      肿瘤微环境 - 意见:验证基质金属蛋白酶作为药物靶标和癌症治疗的抗靶标。
      )。
      为了解决这个问题,已经开发了几种强大的技术,用于蛋白酶基材的系统范围发现, IE。 底物降解,复合物和活性蛋白质素(
      • 罗杰斯L.
      • 总体上行
      蛋白质溶解后翻译改性蛋白质:蛋白质组学工具和方法。
      ,
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • Gevaert K.
      当代位置蛋白质组学策略研究蛋白质加工。
      )。基于质谱的方法的常见原理是通过测试蛋白酶新产生的N-末端肽(蛋白质新末端)的富集和监测(
      • 赋予F.
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      质谱驱动蛋白酶底物降解组。
      )。通过化学标记和亲和树脂(阳性选择)或通过耗尽内肽(阴性选择)(否定)蛋白质N Termini富含复合蛋白质粒子(
      • 赋予F.
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      质谱驱动蛋白酶底物降解组。
      )。已经成功地应用了两种研究,以表征N-术语,并使用鉴定蛋白酶基材 体外 或基于细胞的系统,最近也是如此 体内 (
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Eckhard U.
      • Fingleton B.
      • 总体上行
      血管渗透性血管渗透性增加和皮肤炎症中补体激活的系统水平分析。
      ,
      • 脚龙S.
      • BINIOSSEK M.L.
      • 甘兹M.
      • Gomez-Auli A.
      • Bengsch F.
      • Noel A.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • Boerries M.
      • BUSCH H.
      • Reinheckel T.
      • 席克宁o.
      缺失半胱氨酸组织蛋白酶B或L对鼠皮肤蛋白质组和降解产生差异影响。
      )。对蛋白C Termini的分析进一步扩展了负富集方法(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      ,
      • 席克宁o.
      • 禁止o.
      • HUESGEN P.F.
      • 总体上行
      蛋白质羧基末端的蛋白质组分析:C谓词。
      )并具有在自然阻止的数据上记录数据的一般优势(例如 乙酰化)N末端和内肽在同一实验中(
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Eckhard U.
      • Fingleton B.
      • 总体上行
      血管渗透性血管渗透性增加和皮肤炎症中补体激活的系统水平分析。
      )。
      即使在识别新的蛋白水解切割事件中也是成功的,这也可以通过正交方法验证,高通量基质发现方法可能遭受高量的假阳性识别,特别是在采用时 体外 systems (
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • Kaiserman D.
      • 赋予F.
      • Demeyer K.
      • 赫尔森K.
      • 潮气米
      • 鸟p.i.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      探讨蛋白质组学蛋白质组学蛋白质溶解事件的效率。
      )。通过用测试蛋白酶孵育蛋白质组后,通过在多个时间点监测N-末端肽的丰度来减少这些。
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • Kaiserman D.
      • 赋予F.
      • Demeyer K.
      • 赫尔森K.
      • 潮气米
      • 鸟p.i.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      探讨蛋白质组学蛋白质组学蛋白质溶解事件的效率。
      )。在这种基于硅酸的方法中,作者有效地从旁观者切割中区分,但它限制在三个时间点。因此,它不允许记录用于测定用于处理事件的表观动力学参数所需的N-末端肽的相对丰度的动力学轮廓。 agard. 等等。 优雅地通过使用所选的反应监测(SRM)来克服这些限制
      使用的缩写是: SRM
      选定的反应监测
      尾巴
      末端胺同位素标记的基材
      MMP.
      基质金属蛋白酶
      PDGFR.
      血小板衍生的生长因子受体
      亚当
      含有解肢和金属蛋白酶域域的蛋白质
      Adamts.
      亚当与血小板上的图案
      adamtsl.
      Adamts样蛋白质
      itraq.TM值
      用于相对和绝对定量的Isobaric标签
      格库尔
      内蛋白酶gluc.
      mmrrc.
      突变鼠标区域资源中心
      Mef.
      小鼠胚胎成纤维细胞
      DMEM.
      Dulbecco的改良Eagle的媒介
      FBS.
      胎牛血清
      HPG-ALD
      超支化聚甘油醛
      HCD.
      更高的能源碰撞解离
      TPP.
      跨蛋白质组学管道
      接收器操作特征
      图片
      蛋白质组学鉴定蛋白酶切割位点
      SBGN.
      系统生物学图形符号。
      1使用的缩写是: SRM
      选定的反应监测
      尾巴
      末端胺同位素标记的基材
      MMP.
      基质金属蛋白酶
      PDGFR.
      血小板衍生的生长因子受体
      亚当
      含有解肢和金属蛋白酶域域的蛋白质
      Adamts.
      亚当与血小板上的图案
      adamtsl.
      Adamts样蛋白质
      itraq.TM值
      用于相对和绝对定量的Isobaric标签
      格库尔
      内蛋白酶gluc.
      mmrrc.
      突变鼠标区域资源中心
      Mef.
      小鼠胚胎成纤维细胞
      DMEM.
      Dulbecco的改良Eagle的媒介
      FBS.
      胎牛血清
      HPG-ALD
      超支化聚甘油醛
      HCD.
      更高的能源碰撞解离
      TPP.
      跨蛋白质组学管道
      接收器操作特征
      图片
      蛋白质组学鉴定蛋白酶切割位点
      SBGN.
      系统生物学图形符号。
      与阳性N-末端富集平台相结合,并并行地确定数百种胱天蛋白酶切割事件的表观催化效率(
      • agard n.j.
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 林恩A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      通过定量靶向蛋白质组学的蛋白质分解的全局动力学分析。
      )。在类似的方法中,同一组通过记录Caspase-Maved Neo-N Termini的时间课程来表征对凋亡癌药物的细胞反应(
      • Shimbo K.
      • HSU G.W.
      • Nguyen H.
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      半胱天冬酶切割底物的定量分析揭示了凋亡中不同的药物诱导和细胞型模式。
      )。虽然在量化中非常强大和高度准确,但该方法强烈地利用了天冬氨酸残基后甲壳酶的规范切割特异性,并要求涉及两种类型的质谱仪的两级过程。因此,希望通过以无偏见的方式在单个实验中监测复杂蛋白质中Neo-n Termini的时间分辨率产生。
      这种分析平台的发展将需要一种可靠的方法,用于易于执行,快速且高度复杂的蛋白质N末端的系统范围内的术语。通过Itraq-inerial胺同位素标记符合底物(尾部)的所有这些标准,一种已经应用于2plex和4plex实验中的多重N-末端分析技术,以映射基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9底物降解 体外 (
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      ITRAQ尾部定量蛋白质组学的MMP-2和MMP-9衬底降解的多重N-末端分析。
      )最近,最近在存在或不存在免疫调节蛋白酶MMP2的情况下定量分析发炎小鼠皮肤的蛋白质组和N-末端 体内 (
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Eckhard U.
      • Fingleton B.
      • 总体上行
      血管渗透性血管渗透性增加和皮肤炎症中补体激活的系统水平分析。
      )。
      在这里,我们利用8plex-Itraq试剂利用ITRAQ尾部的多重能力,以通过时间通过复合样品在复杂样品中通过测试蛋白酶监测Neo-N-末端肽的产生。首先,使用Gluc作为试验蛋白酶,具有规范裂解特异性,我们建立了时间分辨底物降级的工作流程。记录动力学谱明显增加了与二元系统相比鉴定的切割事件的置信度,并基于具有不同效率的加工事件的集群,分类初级切割特异性以及二级结构元素。通过包括N-末端富集之前的数据,我们将我们的分析扩展到Neo-C末端肽,并伴随着Neo-N Termini和Neo-C Termini的产生以及跨越裂解的胰蛋白酶肽的丰富降低在同一实验中的网站。接下来,我们将这种方法应用于基质金属蛋白酶10的几乎阐明的底物降解的时间分辨分析(MMP10)。这种重要的伤口和肿瘤相关的蛋白酶通过在伤口边缘处的突起和迁移角质细胞附近的皮肤成纤维细胞附近而分泌,并且在侵蚀性肿瘤细胞中也高度表达(
      • Krampert M.
      • 布洛赫W.
      • Sasaki T.
      • bug
      • 鲁西克T.
      • 狼E.
      • Aumailley M.
      • 公园W.C.
      • Werner S.
      基质石化酶 - 2(MMP-10)在受伤皮肤中基质降解和角质形成细胞组织中的基质金属蛋白酶-2(MMP-10)的活性。
      ,
      • 玛明尔米
      • 乳房C.
      • 骗局W.
      • Brauchle M.
      • 公园W.C.
      • Werner S.
      基质细胞生长因子对基质素-2表达的调节:对正常和受损伤口愈合的影响。
      ,
      • Muller D.
      • 呼吸r.
      • Engelmann A.
      • Millon R.
      • 布朗纳G.
      • 弗雷希H.
      • Dumont P.
      • Eber M.
      • Abecassis J.
      胶原酶相关金属蛋白基因在人肺或颈部肿瘤中的表达。
      )。我们的分析揭示了血小板衍生的生长因子受体α(PDGFRα)的MMP10依赖性脱落,加工ADAMTS样蛋白1(ADAMTSL1)和I型胶原蛋白的多种切割,其可以通过时间分辨丰度概况进行验证和分类他们相应的neo-n termini。

      实验步骤

       细胞生长和分泌蛋白的制备

      Mmp10 - / - 从UC Davis(菌株#011737-UCD)的突变小鼠区域资源中心(MMRRC)获得小鼠,并通过在3T3方案之后连续传递建立从13.5天血浆中分离的永生化的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(
      • Todaro G.J.
      • 绿色H.
      小鼠胚胎细胞在培养中生长的定量研究及其开发成立。
      )。 Balb / c 3T3成纤维细胞在Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM)中培养,补充有1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清(FBS), Mmp10 - / - MEFS在同一媒体上培养加0.1米m 非态氨​​基酸和55μm 如前所述收集β-巯基乙醇和分泌的蛋白质(
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      )。简而言之,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞,在无血清DMEM中孵育缺乏24小时,并补充有蛋白酶抑制剂的上清液(0.5米m PMSF and 1 mm EDTA)通过用3kDa截止膜(Amicon(Millipore,Billerica,MA)来浓缩。在换媒体到50米后m HEPES缓冲液(pH 7.8),使用Bradford测定(BiORAD,Hercules,CA)来确定蛋白质浓度,其将其调节至2mg / ml蛋白和250米m hepes(ph 7.8),1 m HEPES,pH 7.8。制备0.25mg浓培养上清液的等分试样并在-80℃下储存直至进一步使用。

       用蛋白酶消化分泌物

      浓缩(〜500×)BALB / C 3T3分泌物以酶:蛋白质比为1:100(w / w),在37℃下最多16小时孵育。自动激活(16小时,37°C)MMP10(R&D Systems,Minneapolis,Mn)加入到浓缩(〜600×)上清液中 Mmp10 - / - MEFs (220 nm 最终集中; 1:170酶:蛋白质比(w / w)),在10米的存在下在37℃下温育高达16小时m CaCl2 和 100 mm NACL。对照样品(无蛋白酶)仅与等同的缓冲液孵育,并且使用来自相同批料的蛋白质制剂用于各个实验的每个条件。

       8plex-Itraq-tails协议

      ITRAQ-TAILS分析遵循先前已发表的协议(
      • Kleifeld O.
      • Doucet A.
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • Gioia M.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • 总体上行
      通过末端胺同位素标记鉴定和定量蛋白水解事件和天然n末端的基材。
      )但用8plex-(
      • 选择L.
      • d'ascenzo m.
      • recrekin n.r.
      • Pappin D.
      • 罗斯P.
      • 威廉姆斯B.
      • Guertin S.
      • Pribil P.
      • 李克。
      8-Plex定量脑脊液蛋白表达中受试者中静脉内免疫球蛋白治疗的脑脊液蛋白表达的变化。
      )代替4plex-Itraq试剂。使用8plex-Itraq试剂在1:4蛋白:Itraq(w / w)的比例中标记0.25mg蛋白酶处理或对照泌酯的等分试样。胰蛋白酶消化后(胰蛋白酶金(Promega,Madison,Wi); 1:100酶:蛋白质(w / w))在富集N-末端肽之前除去蛋白质(w / w)蛋白(w / w)。使用435kDA HPG-ALD聚合物(无需商业或来自Flintbox Innovation Network,全球知识交流和创新网络(http://www.flintbox.com/public/project/1948/))在三倍过量(w / w)和在先前描述的条件下(
      • Kleifeld O.
      • Doucet A.
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • Gioia M.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • 总体上行
      通过末端胺同位素标记鉴定和定量蛋白水解事件和天然n末端的基材。
      )。将样品冷冻并在-20℃下储存直至进一步使用。

       肽分馏和LC-MS / MS分析

      通过使用聚硫代乙基A的强阳离子交换色谱法(SCX)分级,从前和富集蛋白质N末端的肽混合物进行分级TM值 100 mm×2.1 mm,5μm,200埃柱(Polylc Inc.,Columbia,MD)和Agilent Technologies 1100系列HPLC系统(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)。肽与柱结合,用100%缓冲液a洗涤(10米m 磷酸钾,25%乙腈,pH 2.7)60分钟并通过逐渐增加缓冲液B洗脱(缓冲液A + 0.5 m 氯化钾在5分钟内达到5%,然后在35分钟内达到35%,最终在10分钟内达到100%。使用C18 Omix提示(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)和根据214/280 NM吸收色谱图,收集二十七个级分并合并到八个级分。分别在LTQ - α1-XL(XL)或LTQ-orbitrap Velos(Velos)质谱仪(Thermo Fischer Scientific,Bremen,Bremen,Germany)上分析来自Gluc和MMP10实验的肽级分。 (eksigent Technologies,Dublin,CA)。将一个微量肽加载到自制作的尖端柱上(XL:75μm×70mm;螺丝:75μm×150mm),用C18材料(AQ,3μm200,Bischoff GmbH,莱昂贝格,德国)和在55分钟内(螺丝螺旋:250nl / min,62分钟,使用0至37%的乙腈的梯度,梯度从0-37%的乙腈(35%乙腈)洗脱。全扫描MS光谱(XL:300-2000 m / z; velos:300-1700 m / z),分辨率为60000(XL)或30000(VELOS),在400 m/z 累积到目标值为5E5(XL)或1E6(VELOS)。碰撞诱导的解离(CID)MS / MS光谱以来自三个(XL)或八个(VELOS)最强大的信号的数据依赖性方式以500(XL)或1000(VELOS)的阈值高于500(XL)或1000(VELOS)的阈值标准化的碰撞能量为35%和30ms(XL)或10ms(VELOS)的激活时间。为了在ITRAQ报告离子区域中获得光谱信息,使用较高的能量碰撞(HCD)进一步破碎相同的前体,其具有42%(XL)或45%(VELOS)的归一化碰撞能量,并记录光谱分辨率为7500,400米/ z。启用充电状态筛选,拒绝单充电状态。已经选择用于MS / MS的前体质量被排除在为90秒(XL)或45秒(VELOS)的进一步选择,并且排除窗口设定为20ppm。

       MS数据分析

      Mascot Distiller v2.4.3.3(矩阵科学,波士顿,MA)用于从原始文件中提取峰列表,并用于合并相应的CID / HCD谱对。峰值列表(MGF)由Mascot V2.3搜索引擎(Matrix Science,Boston,MA)对抗鼠标Uniprotkb数据库(2012_03释放; 54232条目),逆转诱饵序列以及常见污染物的序列和Pluc或人类MMP10分别添加,并进行以下参数:半arg-C用于酶特异性,允许最多两个错过的裂缝;氨基甲酰基(C),ITRAQ(K)作为固定修改;乙酰基(N-术语),ITRAQ(N-术语),氧化(M)和脱染(NQ)作为可变修饰;父质量误差10 ppm,片段质量误差为0.8 da。对于Gluc实验,使用相同的参数来进行额外的搜索,但使用半gluc作为酶,允许最多五个错过的裂解。杂种管道(TPP v4.6,Rev 1,Build 201212051643)(
      • 德意曲e.w.
      • 门多萨L.
      • Shteynberg D.
      • Farrah T.
      • 林H.
      • 塔斯曼N.
      • 太阳Z.
      • Nilsson E.
      • 普拉特B.
      • Prazen B.
      • ENG J.K.
      • 马丁D.B.
      • nesvizhskii a.i.
      • Aeberberold R.
      Trans-Qualeomic管道的导游。
      )用于二次验证吉祥物搜索结果,并从从预拉出和拉出样品获得的所有肽级分中编制单个肽列表。首先,使用“精确的质量分布”并省略“NTT模型”,通过将“最小肽长度”设定为1,并省略“NTT模型”来处理数据。接下来,使用IProShet用于额外验证,并将肽前容的结果与多种搜索组合,并且仅具有≥0.9的iProShet概率的肽(对应于虚假发现率(诱饵)<后续分析中包含1%)。对于相对量化,使用i-tracker的修改版本从MGF文件中提取ITRAQ报告器离子强度(
      • shadforth i.p.
      • Dunkley T.P.
      • Lilley K.S.
      • Bessant C.
      I-Tracker:用于使用ITRAQ的定量蛋白质组学。
      )具有ITRAQ制造商提供的0.1Da和纯度校正的大容差,并分配给过滤肽。

       肽注释,聚类和序列徽标的产生

      将多种CID合并,并将肽分配给蛋白质并用Clipper分析管道将其在加工成熟蛋白中的位置注释(
      • auf dem keller u.
      • 总体上行
      Clipper-and-ind-ind-indeomic管道用于自动分析尾部N-轨道组数据。
      )。 ITRAQ记者离子强度被标准化为所有通道的总和,最大值为最高值为1.0,并且使用用于R的MFuzz封装进行丰富的聚类(
      • Kumar L.
      • m e.f.
      MFUZZ:用于软阵列的软阵列数据软件包。
      )Mestime()函数以确定最佳义革显示参数(
      • Schwammle V.
      • Jensen O.N.
      一种简单而快速的方法,可以确定模糊C均值集群分析的参数。
      )。 r统计环境(2.15.3版)与Rstudio相结合(http://www.r-project.org/)和棱镜5.0(GraphPad软件)用于曲线拟合,使用ROCR包进行ROC曲线分析(
      • 砂光机O.
      • Beerenwinkel N.
      • Lengauer T.
      鹏R:可视化R.的分类器性能。
      )。通过网页计算裂解现场特异性(
      • 席克宁o.
      • auf dem keller u.
      • 总体上行
      蛋白质组衍生的肽文库的因子XA底座映射,使用网页,蛋白质组学鉴定的资源得到改善。
      )使用icelogo生成并生成徽标(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )。使用PROTEUS2算法的本地安装预测二次结构(
      • 蒙哥马利S.
      • Cruz J.A.
      • Shrivastava S.
      • ARNDT D.
      • Berjanskii M.
      • Wishart D.S.
      PROTEUS2:用于综合蛋白质结构预测和基于结构的注释的Web服务器。
      )和使用WebLogo可视化(
      • 骗子G.E.
      • hon
      • Chandonia J.M.
      • Brenner S.E.
      WebLogo:序列徽标生成器。
      )。系统生物学图形符号(SBGN)地图是使用CellDesigner(
      • Kitano H.
      • Funahashi A.
      • 松山y.
      • oda k。
      利用生物网络的图形表示的过程图。
      ,
      • Funahashi A.
      • Morohashi M.
      • Kitano H.
      • Tanimura N.
      CellDesigner:基因监管和生物化学网络的过程图编辑器。
      )。

       免疫斑分析和酶谱

      浓缩细胞培养上清液 Mmp10 - / - 用重组MMP10孵育MEF,如ITRAQ尾试验所述。对于免疫印迹分析,通过SDS-PAGE分析等量的总蛋白质,转移到硝酸纤维素膜(Whatman,Clifton,NJ)中并用针对胶原蛋白I(Chemicon,Temecula,Ca),MMP2(Novus Biologicals,Littleton,CO )或pdgfrα(r&D Systems,Minneapolis,Mn)。使用针对血压出蛋白结构域2的肽施加的抗体分析重组adamTSL1(
      • Hirohata S.
      • 王L.W.
      • Miyagi M.
      • 燕L.
      • seldin m.f.
      • 凯恩D.R.
      • Crabb J.W.
      • APTE S.S.
      punctin,一种新型的Adamts样分子,adamtsl-1,细胞外基质。
      )。使用辣根过氧化物酶共轭二抗和增强的化学发光(ECL)反应通过将膜暴露于X射线膜(富士医疗,日本)来了解带状的响应和增强的化学发光(ECL)反应。
      使用具有1mg / ml明胶的明胶酶谱来观察与MMP10孵育的SectReTomes中的凝胶溶解度,用1mg / ml明胶,用含有1mg / ml酪蛋白的凝胶进行酪蛋白酶酶。

       底物切割测定

      重组人PDGFRα(残留物24-524)购自R.&D Systems,Minneapolis,Mn和重组人AdamTsL1(同种型1)如前所述(
      • Hirohata S.
      • 王L.W.
      • Miyagi M.
      • 燕L.
      • seldin m.f.
      • 凯恩D.R.
      • Crabb J.W.
      • APTE S.S.
      punctin,一种新型的Adamts样分子,adamtsl-1,细胞外基质。
      )。将自动活化的MMP10(16小时在37℃下)与50米中的候选底物一起温育m Tris-HCl, 200 mm NaCl and 5 mm CaCl2 在37°C下16小时。通过SDS-PAGE分析反应产物,并通过银染色或免疫印迹可视化。
      质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizCaino J.A.
      • 科特兰特。
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • 里奥斯D.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      )数据集标识符PXD000503。

      结果

       实验设置和肽分类

      为了建立复杂样品中蛋白水解分析的工作流程,我们对已经与内蛋白蛋白酶Gucc(pROC)孵育的BALB / C 3T3小鼠成纤维细胞进行细胞培养上清液(金黄色葡萄球菌 蛋白酶V8)作为1,2,4,8和16小时的测试蛋白酶(0,12和16小时)至8plex-Itraq-tail分析(Fig. 1A)。通过在富集N-末端肽之前组合样品,我们鉴定了总共3017个半胰蛋白N-末端或完全胰蛋白内肽(补充表S1),其中1645可以通过N-末端或赖氨酸ITRAQ标签进行量化。 Gluc特异性地将底物蛋白C-末端切割成谷氨酸(E),并且在天冬氨酸(D)残留物后具有更低的效率(
      • 席克宁o.
      • 总体上行
      用于鉴定蛋白酶切割位点的蛋白质组衍生的数据库可搜索的肽文库。
      ,
      • 侯玛杰。
      • 德拉博克
      葡萄球菌蛋白酶:对谷氨酰胺键的蛋白水解酶。
      )。胰蛋白酶作为工作蛋白酶产生的定义定义的两种主要类别的可量化肽(Fig. 1B):(1)裂解事件:半gluc,半胰蛋白新n-n Termini(E / D.itraq.X-R)和半胰蛋白,半GLUC NEO-C Termini(R.X-Kitraq.-x-e / d); (2)非裂解事件:非Gluc,半胰蛋白天然N Termini(ITRAQ(AC) m(x).x-(kitraq.)-R)和完全胰蛋白内部肽(R.X-Kitraq.-x-r)。因为即使在16小时后,孵育与Gluc的NondenaTuced蛋白质产量也仅在不完全消化中(
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      )由于许多未遗产的切割,所有类别的肽可以细分为含有谷氨酸或天冬氨酸的那些序列(错过的裂解位点)。然而,由于从多重重叠切割事件中解释数据分辨数据不会允许有意义的结论,因此我们只包括肽与单一错过的裂解位点。这允许通过内部切割以及Neo-N-末端肽的次级切割来监测非Gluc,半胰蛋白天然N末端和完全胰蛋白内肽的劣化。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1通过时间解决丰度简档的裂解事件的高置信度识别。 A, 实验装置。来自BALB / C 3T3成纤维细胞的分泌物与Gluc一起孵育,以增加时间段,并通过8Plex-Itraq-Teats分析。将对照(C)分别与0,12和16h的缓冲液一起温育。 B,肽分类。 Gluc切割底物蛋白C-末端至E和D残留物,在用工作蛋白酶胰蛋白酶(TRP)消化时被监测为半胰蛋白酶肽(切割事件)的NEO-N和C Termini。伴随,胰蛋白酶释放内部胰蛋白酶肽和自然N Termini,类似于非裂解事件。 AC:乙酰化。 C,模糊C意味着Neo-N Termini的丰度谱的聚类,可量化的内部胰蛋白酶肽和天然N末端。在Gluc孵育(簇N.1)之后具有时间依赖性的肽的肽与随时间相对恒定的肽分离(簇N.2)。 ColorKey表示会员值α。 Ctrl:12小时和16小时控制。 D,分别对应于簇N.1和簇N.2中肽对应的切割位点的icelogo分析。 P1位置中的e的高患病率表明,通过时间依赖性的丰富增加,正确地将Gluc生成的Neo-n Termini(切割事件)分配给簇N.1。分配给簇N.2的肽(时间无关)是内部胰蛋白酶肽(P1中的r)或天然N末端(MIN在P1中的M)。 E,接收器操作特征(ROC)分析以测试分类器的分类事件的性能。分类器基于肽簇的成员资格(α),随着时间依赖性的丰富增加。以低误阳性率的高真正阳性率表示高性能。 F,同样的分析 C 但是对于新的Termini。 ColorKey表示会员值α。 Ctrl:12小时和16小时控制。

       基于时间依赖性丰富的裂解事件的高置信分类器

      在高通量降级降级数据集的解释中的一项重大挑战是裂解事件和非切割事件之间的歧视。在先前的方法中,利用Gluc的规范裂解位点特异性基于胰腺处理和对照样品中的N-末端肽的丰度比来建立用于切割事件的分类器(
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      )。虽然这种强烈增加了对基板鉴定的置信度,但仍然与相对高的假的发现率相关约15%。为了建立具有较高敏感性和特异性的分类器,我们提取了来自已知的单裂解事件(Neo-N末端)和已知的非切割事件(天然N Termini和内胰蛋白肽)的新N-末端肽的子数据集(Fig. 1B; 补充表S2)。接下来,我们使用模糊C意味着聚类,这些群体特别适合于分析时间课程分析(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      )根据所有八个样本中的相对丰富分配肽到两个群集(Fig. 1C)。如所预期的,簇N.1中的肽的丰度以时间依赖的方式增加并且在所有三种对照样品中较低,而簇N.2中的肽在所有样品中相对恒定。通过网页生成的裂解特异性徽标(
      • 席克宁o.
      • auf dem keller u.
      • 总体上行
      蛋白质组衍生的肽文库的因子XA底座映射,使用网页,蛋白质组学鉴定的资源得到改善。
      )和icelogo(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )揭示簇N.1的实际上包括衍生自依赖于Gluc依赖性切割事件的肽(E / D在P1位置; Neo-N末端),而通过胰蛋白酶产生的肽和蛋白质组(时间无关)的肽治疗(时间无关)簇N.2(M(引发剂甲硫氨酸)中的P1:Natural N Termini或r在P1:内部胰蛋白酶肽)(Fig. 1D)。如先前的研究中所观察到的,在引发剂蛋氨酸后开始的天然n Termini衍生自这些培养条件下释放到沉淀物中的细胞质蛋白(
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      )。在模糊聚类肽中可以属于多个集群,并且它们对特定集群的分配程度由所谓的隶属α确定。我们利用这一关系来建立乳沟的分类器 相对 基于集群成员资格值的非裂解事件。该分类器在接收器操作特征(ROC)分析中表现出优异的性能,以误报率为98%的最佳真正阳性率<5%和隶属阈值为0.61(Fig. 1E)。

       监测Neo-C末端肽

      虽然尾部聚焦在N-末端肽上,从而在监测由蛋白水解裂解产生的Neo-N末端,如果在N-末端富集之前包括来自分析的数据也允许分析Neo-C末端肽。为此目的,我们将肽与胰蛋白酶生成的N和Gluc-errived C末端组合,其在其序列中覆盖ITRAQ标记的赖氨酸,因此是可量化的(Fig. 1B; neo-c termini;裂解事件)通过我们已知的非裂解事件(天然N Termini和内胰蛋白肽)的数据集(补充表S3)。同样,我们应用模糊C意味着群集到这个子数据集,可以将来自非裂解事件的Gluc活动的Neo-C Termini分开(Fig. 1F)。此外,ROC分析根据Neo-N Termini的群集成员身份值和0.62的最佳阈值定义了分类器的类似性能。Fig. 1E)。这证明了通过时间分辨的8plex-Itraq-tail分析有效地识别Neo-C Termini。

       切割位点特异性和结构可达性的动力学子分类

      在下一步中,我们进一步将分配的新末端肽分类为隶属值至少为0.61,因此对簇N.1(切割事件)具有高信心。由此,可以形成与Gluc孵育后的三种肽的三种肽,其与Gluc孵育后的时间依赖性丰度(Fig. 2A)(补充表S4),其与先前对复合蛋白质蛋白分解的动力学分析(
      • agard n.j.
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 林恩A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      通过定量靶向蛋白质组学的蛋白质分解的全局动力学分析。
      )。为了严格分配肽与不同的簇,我们只包括肽值≥0.8的肽。使用伪第一顺序动力学的良好方程我们确定了一系列明显的 kcat / km. values of 400–800 M−1s−1 对于子群中的裂解事件N.1.2,其包括在可测量范围内的丰富曲线(
      • agard n.j.
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 林恩A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      通过定量靶向蛋白质组学的蛋白质分解的全局动力学分析。
      )(补充图。S1)。为了进一步表征每个子群中的切割事件,我们再次产生iceLogos进行切割现场特异性(Fig. 2B)。这些表明在天冬氨酸后的Gluc切片分配到衍生自最低效率的裂解事件的肽的亚簇N.1.1。此外,二次结构的韦布罗戈的表示显示谷氨酸后裂解的偏移,以便在效率降低的裂缝时进行高效的加工事件(Fig. 2C)。值得注意的是,对于六种蛋白质,将C-末端与在同一蛋白质中的谷氨酸蛋白分配给两种或三种簇,表明在不同位点和不同的效率下进行多次切割。与蛋白质结构有关,低效率的裂解位点位于螺旋或板材中,由此以更高的效率处理环绕物(Fig. 2D)。因此,在复合蛋白质群中的蛋白水解加工的8plex-Itraq-tails动力学分析可以有效地分类原发性切割位点特异性和结构可接近性。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2切割位点特异性和结构可达性的动力学子分类。 A,Gluc生成的Neo-N Termini的副群。分配给群体N.1的肽,隶属≥0.8分配给三个子平整板,其具有慢速,中等和对Gluc孵化的丰富。 ColorKey表示会员值α。 Ctrl:12小时和16小时控制。 B,Icelogo分析对应于分配给每个子簇的肽的Gluc切割位点。将效率的裂解较低的C-末端分配给扩张事件的亚簇N.1.1,而中等和快速簇包含谷氨酸后衍生自有效裂解的新N-末端肽。 C,每个子簇中的Gluc切割的二次结构偏好。通过Proteus2预测剪发键周围的二级结构元件,并对每个子簇中的切割位点对齐。对于所有群集,仅包括C末端到谷氨酸。亚聚簇N.1.3的高切割效率与延伸环的患病率相关。 l:循环; - 答:螺旋; B:表格。 D,结构元素与相同蛋白质内的结构元素和切割效率的相关性。根据模板3ub5a(p63260),2jzx(p60335;残基11-169)和1wvn(p60335;残留物278-348),来自P63260(左)和P60335(右)的瑞士模型存储库(右)分别为P63260(左)和P60335(右)。指示由8Plex-Itraq-tail鉴定的Gluc切割位点(P1(e):红色; p1':黄色)。在循环中裂解(Piye 167.168吉尔瓦尔和vmle168.169TLSQ)比螺旋更有效(Eyde364.365SGPS)或Beta纸张(TTHE283.284LTIP),通过时间解决的ITRAQ尾部分析表明二级结构元素之间的歧视。

       用内部切割位点降低丰富的肽

      拥有用于监测Kinetic 8Plex-Itraq-teats的监测Neo-N和Neo-C Termini的时间分辨的动力学模型,我们分析了天然N Termini和内部全胰蛋白酶肽的丰富曲线,其在其上含有单一谷氨酸或天冬氨酸顺序 (Fig. 3A;切割事件)。通过其时间依赖于Gluc孵育的时间依赖性丰富,将这些潜在的已知的裂解与已知的非切割事件区分开的相同原理,包括衍生自这些裂解事件和已知的非切割事件的肽(Fig. 3A;内部胰蛋白酶肽和天然n末端; 补充表S5)被分配到两个集群(Fig. 3B)。如预期的那样,100%分配给簇I.1(α≥0.8)的肽在Gluc孵育后显示时间依赖性的丰富减少是天然的N末端或内胰蛋白肽,其序列含有E或D,由此簇I .2包括41%天然N末端和内部胰蛋白酶肽,含有59%,没有内部E或D残留物。此外,簇I.1中的78%的肽在其序列中含有谷氨酸和22%的天冬氨酸,而该比例为簇I.2中含有肽的E或D肽的36%(E)至64%(D)。同样,这与谷氨酸后谷氨酸后的效果较高,而是许多潜在的切割位点与蛋白酶的结构无法访问。对于群体I.1中具有时间依赖性降低的20个肽中的五种,我们还鉴定了相应的Neo-N Termini,其伴随地表现出丰富的增加,如内部胰蛋白肽所例类 Fig. 3C。该切割事件进一步通过检测Neo-C末端肽,揭示所有三个事件, IE。 内部胰蛋白酶肽的降低和Neo-N-末端和Neo-C末端肽的增加的丰度,所有这些都显示出相同的动力学(Fig. 3C)。因此,对胰蛋白酶肽的降低和相应的新末端或Neo-C末端的增加的定量分析允许估计非植垢和切割形式的底物蛋白的比率。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3时间依赖性减少丰富的养殖部位遍布肽。 A,解剖事件的分类。通过内部切割(切割事件),含有单个E或D的自然N末端和含有单个E或D的内部胰蛋白肽。没有内部E或D的相同类型的肽不受Gluc(非切割事件)的影响。实线描绘了切割的天然n末端和虚线切割的内部胰蛋白肽。黑线表明养殖网站跨越肽,蓝线Neo-C和红线Neo-n Terminus。 TRP:胰蛋白酶; AC:乙酰化。 B,模糊C意味着可量化的裂解位点跨越肽和非植物内胰蛋白肽和天然n末端的丰度谱的聚类。在Gluc孵育(簇I.1)之后具有时间依赖性的肽的肽与具有相对恒定的丰度(簇I.2)的肽分离。 Ctrl:12小时和16小时控制。 C,时间分辨分析跨越养分肽的丰富度和相应新N和Neo-C Termini的伴随增加。 D,Neo-N Termini的二次切割以序列含有内部E或D. Cluster Ne.4代表Neo-N Termini,在Gluc孵育的2至4小时的丰富增加,随后对二次切割减少。对于所有群集看 。 ColorKey表示会员值α。 Ctrl:12小时和16小时控制。 E,通过在e之后通过Gluc切割快速生成Neo-N末端的示例,并通过二次处理在D之后通过二次处理进行内部Neo-N末端的外观。

       次级切割事件对新N末端的影响

      监测蛋白酶切割事件随时间的特定优点是还可以捕获新N-末端肽的可能性,因为在实验的时间框架内通过产生或不同的蛋白酶通过产生或不同的蛋白酶额外的蛋白酶,因此在初始增加的丰度降低。由此,新的Ne-n末端的丰度降低可能由第二有限蛋白水解事件或截断形式的截截面的未特异性劣化产生。为了测试Kinetic 8Plex-Itraq-tail检测这些事件,我们分析了含有单个谷氨酸或天冬氨酸的Gluc衍生的新N个Termini的丰富曲线。从我们对内部切割位点分析中确定的大量未缺少的裂解( Fig. 3B),模糊C意味着与单个未存在的切割的E或D残留物的新N-末端肽的聚类产生三种簇,其与增加与Neo-n Termini类似的裂解效率相关,它们在其序列中不含有E或D(补充图S2; 补充表S6;将NE.1集群NE.3)。然而,在Gluc孵化后初始快速增加之后,将该课程的20个Neo-N末端分配给第四簇Ne.4基于2至4小时后的丰富的连续减少(补充图S2Fig. 3D)。这种丰富的曲线可以通过高效的上游裂解和更慢的二级处理事件来解释。这可能受到初级切割现场序列的差异(谷氨酸 相对 P1中的天冬氨酸)。实际上,我们可以识别辅助切割事件,也是相应的第二个新N个末端( Fig. 3E),在谷氨酸后与上游切割组合后产生的。因此,时间分辨的8plex-Itraq-tail允许检测受次级裂缝影响的切割事件,并且在2plex实验中错过仅监控单个时间点。

       通过时间解决分析识别MMP10依赖性切割事件

      已经建立了使用Gluc作为试验蛋白酶的蛋白水解切割事件的时间分辨分析的8plex-Itraq-tail,用规范性切割特异性,我们将改性方法应用于鉴定MMP10,重要的伤口和肿瘤蛋白酶介导的新切割的方法只有很少的底物是已知的(
      • Krampert M.
      • 布洛赫W.
      • Sasaki T.
      • bug
      • 鲁西克T.
      • 狼E.
      • Aumailley M.
      • 公园W.C.
      • Werner S.
      基质石化酶 - 2(MMP-10)在受伤皮肤中基质降解和角质形成细胞组织中的基质金属蛋白酶-2(MMP-10)的活性。
      ,
      • 玛明尔米
      • 乳房C.
      • 骗局W.
      • Brauchle M.
      • 公园W.C.
      • Werner S.
      基质细胞生长因子对基质素-2表达的调节:对正常和受损伤口愈合的影响。
      ,
      • Muller D.
      • 呼吸r.
      • Engelmann A.
      • Millon R.
      • 布朗纳G.
      • 弗雷希H.
      • Dumont P.
      • Eber M.
      • Abecassis J.
      胶原酶相关金属蛋白基因在人肺或颈部肿瘤中的表达。
      )。为此目的,我们将来自MMP10缺陷的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的上清液用自活化的重组MMP10孵育1,2,4,8,12和16小时(0和16小时控制)并记录时间 - 通过8Plex-Itraq-tails的所得肽的溶解性曲线(Fig. 4A)。我们使用的重组MMP10的浓度高于高于内源MMP10的900倍,该MMP10在细胞培养上清液中测量(
      • 金H.S.
      • 尚T.
      • 陈祖
      • pflugfelder s.c.
      • 李D ..
      TGF-β1通过人角膜上皮细胞刺激明胶酶(MMP-9),胶原酶(MMP-1,-13)和基团(MMP-3,-10,-11)的产生。
      ,
      • 李D ..
      • 尚T.Y.
      • 金H.S.
      • 所罗门A.
      • Lokeshwar B.L.
      • pflugfelder s.c.
      受调节胶原酶MMP-1,-8和-13和基质SINM-3,-10和-11的表达由人角膜上皮细胞进行调节。
      )。然而,在与蛋白酶温育之前,泌酯浓缩600倍,得到类似的酶:蛋白质(w / w)的比例。这些参数基于以前的研究(
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      ITRAQ尾部定量蛋白质组学的MMP-2和MMP-9衬底降解的多重N-末端分析。
      ,
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      ,
      • Kleifeld O.
      • Doucet A.
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • 席克宁o.
      • Kaidhan R.K.
      • 斯塔尔A.E.
      • 福斯特L.J.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • 总体上行
      复合样品中末端胺的同位素标记鉴定蛋白质N-末端和蛋白酶切割产物。
      )但实际的酶活性可能会显着不同 体内。重要的是,通过酪蛋白酶谱和成熟和活性蛋白酶的N末端的尾谱分析和尾部分析,活化的MMP10在整个孵育时间上稳定。补充图S3)。我们确定了385个半胰蛋白N末端和1264个完全胰蛋白内肽(补充表S7),我们从其中提取由潜在的切割事件(半胰蛋白酶Neo-N Termini)的221个肽的亚数据集以及衍生自预期的非切割事件的521个肽(51个可量化的天然N Termini和470可量化的完全胰蛋白酶内肽)(Fig. 4B; 补充表S8)。模糊C意味着该子数据集的聚类和0.9的严格α-值阈值,其在67个肽之间有鲁棒地区分,其在所有样品中具有相对恒定的丰度(簇M. 2)( Fig. 4C)。基于Gluc试验实验中Neo-N Termini的数据,我们从簇M.1中提取了38个肽,其在控制通道(0和16h)中具有少于25%的相对丰度值的相对丰度。该步骤有效排除肽,其可能是由基础蛋白水解产生的。 38个相应的裂解位点的icelogo分析显示p3和亮氨酸中的高脯氨酸,p1'中的亮氨酸或异亮氨酸,其指示MMP介导的加工(
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      ITRAQ尾部定量蛋白质组学的MMP-2和MMP-9衬底降解的多重N-末端分析。
      ,
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      ),建议,确实由MMP10或其他由MMP10激活的MMP10或其他MMP直接生成了大多数观察到的NEO-N Termini(Fig. 4D)。相同对对应于簇M2中肽的切割位点的分析在P1中产生高患病率,因此在与试验蛋白酶孵育时展示了蛋白质组的一般稳定性。值得注意的是,通过我们的选择标准,无法将211个肽分配给两个群集中的任何一个,强烈提高对识别的信心 善意 MMP10依赖性切割事件。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4MMP.10衬底降低组的时间分辨分析。 A, 实验装置。秘密组合 Mmp10 - / - 将MEF与重组MMP10或缓冲液(对照(C))一起温育,并通过8Plex-Itraq-tail分析。 B,通过MMP10和胰蛋白酶(TRP)(切割事件;时间依赖)产生的肽或单独的胰蛋白酶(非切割事件;时间无关)。 AC:乙酰化。 C,模糊C意味着Neo-N Termini的丰度谱的聚类,可量化的内部胰蛋白酶肽和天然N末端。 MMP10孵育(簇M.1)后具有时间依赖性丰度的肽与具有相对恒定的丰度(簇M.2)的肽分离。从随后的分析中省略了群体M.1中具有高于最大丰度(灰色)的25%的丰度的肽。 ColorKey表示会员值α。 Ctrl:16 H控制。 D,分别对应于簇M.1和簇M.2肽对应的切割位点的icelogo分析。 P3中p3和/或L / I中P的高患病率为簇M.1(Neo-N末端;时间依赖性)与MMP切割特异性相关。分配给簇M.2(时间无关)的肽大多是内部胰蛋白酶肽(在P1中的r)。

       通过动力学子弹分类MMP10依赖性切割事件

      接下来,我们将38个过滤肽中的33种,其中38个过滤肽中的23个慢速(亚簇M.1.1; 13肽)或快速(亚簇M.1.2; 10肽)随时间增加(Fig. 5A; 补充表S9)。在响应于MMP10介导的处理时产生的α值为0.8的严格阈值进一步缩小了响应于MMP10介导的处理而产生的。 Icelogo分析iceLogo确定每个子簇中的不同类型的基材(Fig. 5B)。虽然亚簇中的大多数乳沟M.1.1(慢)在胶原α链中表现出典型的GPXG.L / I裂解基序(
      • 拍摄时间。
      • Quigley J.P.
      基质金属蛋白酶-2是间质性胶原酶。无抑制剂酶催化胶原纤维和可溶性天然型I胶原的切割,产生特异性的3 / 4-和1/4长片段。
      ),子簇中的底物M.1.2(快)在P1和/或L / I中的P1'中的P1'粘合,但几乎是所有非胶原蛋白(Fig. 5C)。有趣的是,分配给SubclusterM.1.2的唯一胶原蛋白裂解,因此对位于位置871的胶原α2(i)链中的规范MMP处理位点对应于胶原α2(i)链中的规范MMP处理部位,这导致典型的¾和¼的产生碎片(
      • 拍摄时间。
      • Quigley J.P.
      基质金属蛋白酶-2是间质性胶原酶。无抑制剂酶催化胶原纤维和可溶性天然型I胶原的切割,产生特异性的3 / 4-和1/4长片段。
      )。由于分配了同一蛋白质内的裂解,因此我们可以在结构上可访问的网站处区分已知的有效处理事件,并且通过时间解决的ITRAQ-TATE分析在更闭塞的地点进行额外效率的效率裂解(Fig. 5D)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5依赖于MMP10依赖性切割事件的子分类。 A,MMP10生成的NEO-N Termini的子群。分配给群体M.1的肽具有≥0.9的蛋白质值≥0.9分配给两个子平整型,对MMP10孵育的丰富缓慢而快速增加。 ColorKey表示会员值α。 Ctrl:16 H控制。 B,分别对应于分配给亚聚簇M.1.1和亚簇M.1.1.2的肽的切割位点的icelogo分析。 Subcluster M.1.1中的低效乳化物类似于胶原蛋白的典型MMP切割基序GPXG.L / I。 P1'中的P1和/或L / I中的p1'中的亚簇M.1.2中的切割表明MMP依赖性切割事件。 C,蛋白质和MMP10依赖性裂解在每个子簇中的实例。将胶原蛋白的主要分配给亚聚蛋白M.1.1表明这些结构闭塞裂解位点的缓慢处理。只有通过分配给亚群M.1.2的分配所示,只有高效率处理I型胶原α2链中的规范MMP切割位点。看 对于MMP10依赖性裂缝的完整列表。 D,胶原蛋白α2(i)链中切割的动力学谱。时间分辨沉积沉积区分解了同一胶原链内的额外MMP10依赖性切割的规范MMP切割位点(红色)。 E,验证I型胶原蛋白的多种加工,以及伴随的活性MMP2的丰度增加。 小组:MMP10的免疫印迹分析来自 Mmp10 - / - 使用抗胶原I抗体的MEFS显示出具有不同动力学曲线的切割片段(箭头)的外观。 中间 面板:明胶酶素揭示了MMP10依赖性增加,符合MMP10培养的秘密中活化MMP2(箭头)大小的频段。 降低 面板:使用针对MMP2的抗体的抗体的免疫印迹分析确认MMP2(箭头)的时间依赖性激活MMP10孵育。
      确认这些数据免疫斑分析MMP10治疗的Xchancomes Mmp10 - / - MEFS在不同时间孵化时揭示了I型胶原蛋白裂解片段的外观(Fig. 5E)。虽然MMP10可以切割III型III,IV和V胶原蛋白,但从未显示过I型胶原蛋白的直接活动(
      • Nicholson R.
      • 墨菲G.
      • 呼吸r.
      人和大鼠恶性肿瘤相关的MRNA编码基质氏素状金属蛋白酶。
      )。通过外源MMP10通过内源性胶原溶解MMP通过内源性胶原溶解MMP的这种建议的胶原α2(I)链处理。实际上,Gelatin Zymocraphy分析MMP10-孵育的分泌物 Mmp10 - / - MEFS鉴定了随着孵育时间而增加的频带,与活性MMP2的分子量相关。通过使用MMP2特异性抗体的相同样品的免疫斑分析可以进一步验证该结果(Fig. 5E)。

       MMP.10的PDGFRα的间接切割和AdamTSL1的直接处理

      在蛋白质中有效地加工疏胞菌的孵育 Mmp10 - / - 具有MMP10(Subcluster M.1.2)的MEFS,我们通过在细胞外结构域内的位置417开始的新N-末端肽鉴定了血小板衍生的生长因子受体α(PDGFRα)(Fig. 6A)。免疫印迹MMP10治疗 Mmp10 - / - Mef. X丙菌具有PDGFRα特异性抗体证实了这种切割和MMP10依赖性产生的〜80和〜40kDa的预期分子量的两个片段。然而,重组人PDGFRα蛋白(残留物24-524;细胞外结构域)未通过与重组人MMP10直接孵育来裂解 体外,表示通过MMP10激活的内源蛋白酶为胶原蛋白α2(i)的类似间接处理事件。有趣的是,重组MMP2也没有直接处理PDGFRα的细胞外结构域(补充图S4),表明朝向该蛋白质的不同蛋白酶的活性。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6MMP.10的PDGFRα的间接加工和AdamTSL1的直接切割。 A,PDGFRα的结构域结构,具有带注释的裂解位点,在细胞外结构域,产生的新N末端的时间依赖性丰富分布,以及通过孵育重组蛋白和MMP10-孵育的分泌物的免疫印迹分析来表征。通过MMP10缺乏重组PDGFRα的裂解表明在MMP10孵育的细胞上清液中间接切割。 B,AdamTSL1(同种型1)的结构域结构,在血小板素结构型突塔(TS)2和3,所产生的新N末端的时间依赖性谱系之间的延长环中的注释切割位点,以及通过孵育重组蛋白的处理。通过银色染色和免疫斑分析检测预期分子量的MMP10产生的片段鉴定了AdamTSL1作为直接MMP10基板。
      在相同的高效MMP10依赖性切割细胞外基质蛋白Adamts蛋白1(AdamTSL1)中,也称为punctin-1(
      • Hirohata S.
      • 王L.W.
      • Miyagi M.
      • 燕L.
      • seldin m.f.
      • 凯恩D.R.
      • Crabb J.W.
      • APTE S.S.
      punctin,一种新型的Adamts样分子,adamtsl-1,细胞外基质。
      )通过对应于血栓状蛋白结构型域2和3之间的切割位点对应的Neo-N末端鉴定(Fig. 6B)。 SDS-PAGE和银染色在与活性重组MMP10孵育的人重组AdaMTSL1的预期分子量(〜40和〜20kDA)的裂解片段揭示了与活性重组MMP10一起孵育,并因此将AdamTSL1鉴定为直接MMP10基板。通过使用针对检测到的〜40kDa n末端切割片段的Adamts11的血压出蛋白结构域2内的肽的抗体,可以通过免疫斑分分析进一步证实该切割。虽然更有效地,MMP2也将AdamTSL1切割成相同尺寸的碎片(补充图S4),建议通过MMP10和MMP2的AdamTSL1的协同处理。

      讨论

      最近的位置蛋白质组学的进展使得复杂生物样品中的蛋白酶底物可靠地鉴定(
      • 罗杰斯L.
      • 总体上行
      蛋白质溶解后翻译改性蛋白质:蛋白质组学工具和方法。
      )。进一步发展这些强大的技术,我们通过利用最近推出的ITRAQ-TAIL分析平台的多路复用能力来提出蛋白质终端的时间分辨监测的工作流程(
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      ITRAQ尾部定量蛋白质组学的MMP-2和MMP-9衬底降解的多重N-末端分析。
      ,
      • Kleifeld O.
      • Doucet A.
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • Gioia M.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • 总体上行
      通过末端胺同位素标记鉴定和定量蛋白水解事件和天然n末端的基材。
      )。时间分辨的8plex-Itraq-tail显着提高了蛋白质N和C Termini的记录裂解事件的有效性的置信度,并通过序列序列的序列和结构可及性有效地分类切割。此外,我们通过伴随Neo-N末端,Neo-C末端和遍布切割位点的肽的定量,通过降低裂解肽和确定的靶蛋白的测定比率的降低和确定的靶蛋白的比率。最后,我们将这种方法应用于分析成纤维细胞分泌物中的MMP10底物降低组,并揭示了AdamTSL1的直接加工,以及MMP10依赖性突出的PDGFRα和I型胶原蛋白的顺序处理,其可能通过PROMMP2的激活介导(Fig. 7)。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7系统生物学图形符号据MMP10依赖处理事件映射。 活化的MMP10(除去除去;截短)激活未知的蛋白酶(反应(RE)8),其从细胞内(INT_Domain)域(RE6)与PDGFR信号传导相互作用地脱落PDGFRα细胞外(EX_Domain)。同时,MMP10激活替代蛋白酶(RE10),其蛋白水解激活MMP2(RE9),所述MMP2(RE9)导致I型胶原加工(RE11)。 AdamTsL1在N末端中的MMP10或MMP2(RE5)和包括血压主素域1和2(TS1_2)和3和4(TS3_4)的C末端部分切割。
      随着我们分辨的8plex-Itraq-tails分析,我们确定了复杂蛋白质组中多次切割事件的相对蛋白水解效率,目前基质降解中的主要挑战(
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • Gevaert K.
      当代位置蛋白质组学策略研究蛋白质加工。
      )。延长最近的研究,使用SRM记录预先确定的切割事件的催化效率(
      • agard n.j.
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 林恩A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      通过定量靶向蛋白质组学的蛋白质分解的全局动力学分析。
      ),我们利用N-末端肽的动力学谱,以显着增强与非切割事件的切割方面的敏感性。与先前的分析相比,这降低了所识别的切割位点的总数(
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      ITRAQ尾部定量蛋白质组学的MMP-2和MMP-9衬底降解的多重N-末端分析。
      ,
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      )并伴随着许多旁观者事件,这是可能在将用单个蛋白酶与对照样品进行处理的实验中获得的实验中获得的数据集(
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • Kaiserman D.
      • 赋予F.
      • Demeyer K.
      • 赫尔森K.
      • 潮气米
      • 鸟p.i.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      探讨蛋白质组学蛋白质组学蛋白质溶解事件的效率。
      )。在原始的生物信息学分析管道中用于尾部数据('剪辑'),在数据集中仅包括N-末端肽,而在N-末端富集之前的样品分析主要用于增加蛋白质鉴定的置信度(
      • auf dem keller u.
      • 总体上行
      Clipper-and-ind-ind-indeomic管道用于自动分析尾部N-轨道组数据。
      )。在我们改进的方法中,我们在富集蛋白质n末端之前和之后组成了所有肽的一体化数据集。因此,数据集通过量化的内胰蛋白酶肽大大扩增,该蛋白质可以通过工作蛋白酶(胰蛋白酶)从蛋白质(胰蛋白酶)从蛋白质中释放,并且在每次温育蛋白酶(Gluc)的每次孵育时的丰富变异性。这给出了蛋白质组的相对稳定性随时间的一些指示,因为多个未特异性的切割将导致大量内部胰蛋白肽的丰富降低。此外,通过监测可量化的N-末端胰蛋白酶和C型末端非对肽和C-inally非毒品肽和C末期非植物肽和通过加工肽的降低,通过监测可量化的N-末端胰蛋白酶和C型末端非植物肽和鉴定的分数来允许识别Neo-C Termini的可靠鉴定。如果除了Neo-N和/或Neo-C Termini之外,这些肽遍布裂解位点,甚至可以确定全长和截短形式的底物蛋白的相对丰度。
      最重要的是,通过催化效率允许蛋白酶切割事件的蛋白酶裂解事件分类。我们通过模糊C表示聚类获得的结果与Agard的数据相媲美 等等。,主要在下面和高于可测量范围内产生裂解事件的簇(
      • agard n.j.
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 林恩A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      通过定量靶向蛋白质组学的蛋白质分解的全局动力学分析。
      )。在可衡量的范围内,我们确定了一个明显的范围 kcat / km. Gluc的价值为4-8 * 102 m−1s−1,这是比发发子肽基质的发布值低的两个数量级(
      • 公园J.W.
      • 公园J.E.
      • 公园J.K.
      • 李继夫
      用金黄色葡萄球菌的临床分离物分泌的新型谷氨酸内肽酶的纯化和生化表征。
      )。这是预期的,因为在我们的实验装置中,Gluc在复合物和天然蛋白质组内的蛋白质基质作用,导致催化效率大得多,并且大量的错过裂解。因此,时间分辨的8plex-Itraq-teats提供了一种强大的方法,以确定络合物蛋白质组中的多种切割事件的内在催化效率平行。
      因为Gluc内蛋白酶的处理几乎没有或根本不受特异性非催化蛋白酶衬底相互作用的影响,所以催化效率的差异由切割位点的序列或结构约束介导。由此,在天冬氨酸比谷氨酸残留物中,Gluc裂解两种数量级较低的效率(
      • Wehofsky N.
      • Wissmann J.
      • alisch m.
      • 波尔萨F.
      基材的工程模拟物作为谷氨酸特异性内肽酶的新型型底物:设计,合成和应用。
      )。时间分辨的8plex-Itraq-tails分析通过将P1中的P1中的天冬氨酸分解为类似于最低效率的切割事件的群体来解决这种特异性。使用n-tomininomics timmer 等等。 鉴定的延伸环和螺旋作为Gluc(
      • Timmer J.C.
      • 朱W.
      • 流行c.
      • Regan T.
      • Snipas S.J.
      • eroshkin上午
      • Riedl S.J.
      • Salvesen G.S.
      蛋白酶基材的结构和动力学决定簇。
      )。我们的时间解决分析证实了这一发现,并通过预期的观察扩展,即Gluc切割延伸的循环,其效率高于螺旋和板材,这也是同一蛋白质内的多种切割的情况。尖锐的,动力学8plex-Itraq-teats将三螺母MMP加工部位区分开于三螺旋胶原蛋白,从蛋白质的结构较不可接近的区域中的额外切割(
      • Salsas-Escat R.
      • Nerenberg P.S.
      • Stultz C.M.
      I型胶原蛋白降解中的裂解位点特异性和构象选择。
      )。因此,将时间分辨的定量信息添加到N-术语分析,​​为探针提供了用于裂解位点特异性和天然蛋白质底物中结构可接近的数据。
      为了验证和证明我们工作流程的扩展能力,以便在复杂蛋白质组中的蛋白水解事件中的时间分辨监测,我们分析了MMP10衬底降低组。 MMP10是一种重要的伤口和肿瘤蛋白酶,其在迁移角质形成细胞中高度表达,并据信通过控制愈合皮肤伤口中的表皮 - 皮肤界面的过程和调节致癌肿瘤 - 基质相互作用的过程介导上皮细胞迁移(
      • Krampert M.
      • 布洛赫W.
      • Sasaki T.
      • bug
      • 鲁西克T.
      • 狼E.
      • Aumailley M.
      • 公园W.C.
      • Werner S.
      基质石化酶 - 2(MMP-10)在受伤皮肤中基质降解和角质形成细胞组织中的基质金属蛋白酶-2(MMP-10)的活性。
      ,
      • 范kempen L.C.L.
      • Rhee J.-S.
      • Dehne K.
      • 李杰。
      • Edwards D.r.
      • 表达L.M.
      上皮致癌:肿瘤细胞与其微环境之间的动态相互作用。
      ,
      • p o.c.
      • rhys-evans p.h.
      • Eccles S.A.
      基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达与头部鳞状细胞癌中的侵袭和转移相关。
      )。通过应用新设计的基于新N-末端肽的动力学谱之间的裂解和非切割事件之间的歧视策略,我们在MMP10依赖性加工事件中选择性地缩小。子类化不仅揭示了两个不同效率的裂解的两种不同的乳蛋白,而且还阐明了具有不同结构性质和功能的裂缝蛋白的类别。有趣的是,胶原蛋白的处理,典型的MMP底物,几乎完全分配给较低的效率裂解,而非胶原蛋白基底更有效地切碎。值得注意的是,仅将I型胶原蛋白α2链中的典型胶原酶切割位点分配给有效裂解簇。大多数鉴定的MMP10依赖性胶原裂解量可能是间接的,而不是直接,特别是因为这种MMP对工艺I胶原蛋白的无法无法无法实现(
      • Nicholson R.
      • 墨菲G.
      • 呼吸r.
      人和大鼠恶性肿瘤相关的MRNA编码基质氏素状金属蛋白酶。
      )。我们的数据表明,与MMP10孵育的成纤维细胞分泌物中的实际活性胶原酶是MMP2,其对I型胶原蛋白(
      • 拍摄时间。
      • Quigley J.P.
      基质金属蛋白酶-2是间质性胶原酶。无抑制剂酶催化胶原纤维和可溶性天然型I胶原的切割,产生特异性的3 / 4-和1/4长片段。
      ,
      • 帕特森M.L.
      • 阿特金森S.J.
      • knauper V.
      • 墨菲G.
      由明胶酶A,MMP-2的特异性胶原溶解由血红素素结构域而不是纤连蛋白样域。
      )。支持该假设,分别在MMP2降级研究中分别检测到I型胶原α1和α2链中鉴定的两个切割事件(
      • Prudova A.
      • auf dem keller u.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      ITRAQ尾部定量蛋白质组学的MMP-2和MMP-9衬底降解的多重N-末端分析。
      ,
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • Gioia M.
      • 巴特勒G.S.
      • 总体上行
      基于统计学的N-末端分析和蛋白酶切割产品的鉴定平台。
      )。但是,虽然描述为几个prommps的上游激活因子(
      • 巴克比赫。
      • Milner J.M.
      • 帕特森上午
      • Peake N.J.
      • 慧W.
      • 罗布森T.
      • Lakey R.
      • 中间ton J.
      • Cawston T.E.
      • 理查兹C.D.
      • 罗文A.D.
      基质金属蛋白酶10通过平胶原酶活化促进胶原溶解:关节炎中软骨降解的影响。
      ,
      • Nakamura H.
      • 富士Y.
      • OHUCHI E.
      • Yamamoto E.
      • 冈田Y.
      人对菌素2的前体及其与其他基质金属蛋白酶的相互作用。
      ),MMP10不直接激活MMP2(
      • Nakamura H.
      • 富士Y.
      • OHUCHI E.
      • Yamamoto E.
      • 冈田Y.
      人对菌素2的前体及其与其他基质金属蛋白酶的相互作用。
      )。这表明在与活性MMP10孵育的天然成纤维细胞沉淀中的中间蛋白酶的激活或调节辅因子,导致PROMMP2的蛋白水解转化为活性蛋白酶,这最终是I型胶原蛋白的方法。
      作为一种特别有趣的处理事件,时间分辨的8plex-Itraq-tails鉴定了靠近血浆膜的细胞外结构域内PDGFRα的切割,这是受体外胚层脱落的特征。虽然依赖于MMP10,但这种裂解既不被MMP10直接介导,也不是通过活化的MMP2介导的,表明另外的未知蛋白酶的活性。有趣的是,含有解毒素和金属蛋白酶域域10(ADAM10)可以脱落PDGFRβ的胞外域(
      • Mendelson K.
      • Swendeman S.
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      总之,随着时间分辨的8plex-Itraq-tail,我们引入了底物降级的工作流程,显着提高了基底鉴定的置信度,并通过初级序列和二级结构元素中的结构可访问性以及多聚体高阶结构进行分类,如胶原蛋白原纤维。此外,MMP10衬底可识别的新型候选底物的时间分辨分析,其处理可能介绍组织修复和致癌作用中的重要MMP10功能。

      致谢

      我们感谢S. Werner(Eth Zurich)持续支持,非常有用的建议,讨论和讨论,讨论和J.Marinho有助于ZyMocount。

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