蛋白质组学分析 S - 亚硝基化蛋白在Mesangial细胞中*

  • Teresa Kuncewicz.
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    内科部门和德克萨斯大学休斯顿,休斯顿,德克萨斯州的德克萨斯大学医学院综合生物学和药理学介绍77030
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  • Essam A. Sheta.
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  • IRA L. Goldknopf.
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  • Bruce C. Kone.
    一致
    应该解决对应的通信:部门。休斯顿德克萨斯州医学院大学内科和综合生物学和药理学学报,6431,MSB 4.148,休斯顿,TX 77030.电话号码:713-500-6873;传真:713-500-6890或6882
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    内科部门和德克萨斯大学休斯顿,休斯顿,德克萨斯州的德克萨斯大学医学院综合生物学和药理学介绍77030
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生研究院资助的支持RO1 DK-50745和P50 GM-20529(对BCK),“梦想”中心授予辩护部(BCK),以及詹姆斯T.和捐赠基金Nancy B. Willerson主席(到BCK)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      不参与多种细胞类型中的许多生物事件,包括活性肾小球纱线细胞。许多这些事件似乎与可溶性观音环酶的已知效果无关。没有来自任何没有合成酶的主要同种型可以S - 靶蛋白中的赤膜酸酯氨基残基,可能改变其功能性活性。最近的证据表明S - 硝基化是特异性的,受到调节,并且可能发挥类似于磷酸化的重要调节作用。在本研究中,“biotin-switch”隔离方法S - 硝基化蛋白与二维页蛋白分离偶联,然后进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱和肽质量指纹识别以鉴定靶蛋白S - 鼠髓细胞中的赤硝基化,没有供体或适当的对照。这种方法解决了790个蛋白质点。我们分析了最丰富的斑点并确定了34种已知的蛋白质。其中,31是独一无二的S预先鉴定的 - 硝基吡咯化蛋白,包括信号蛋白,受体和膜蛋白,细胞骨骼或细胞基质蛋白,以及细胞质蛋白质。这些中突出的过氧化物酶体增殖物激活受体γ,尿胍,GTP结合蛋白α,蛋白质14-3-3,NADPH-细胞色素P450氧化还原酶,转录因子IIA,MELUSIN,MITOSIN,磷脂酶A2 - 活化蛋白质和蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶。这体内归纳S通过用白细胞介素-1β处理乳腺细胞,然后进行生物素 - 开关和蛋白质印迹来测定 - 硝基化。这些结果拓宽了我们对潜在信号转导途径和介导的其他细胞功能的知识S - 硝基化。
      没有合成 l - 氧化物合成酶(NOS)的碱度
      使用的缩写是:No,氧化氮合酶; Inos,诱导的号码; MALDI-TOF,矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间; MS,质谱; GSNO, S-nitrosoglutathione; PPAR,过氧化物激素增殖剂活化受体;生物素-HPDP, N - [6-(Biotinamido)己基] -3“ - (2'-吡啶二硫代噻嗪)丙酰胺; DM,染源肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌2D,二维; IL,白细胞介素; CHAPS,3 - [(3-胆氨基甲基丙基)二甲基氨基嘧啶] -1-丙二磺酸; SHP-2,SRC同源2含有磷酸酪氨酸磷酸酶-2; TF,转录因子; RFG,RET融合基因;亚当,解毒素和金属蛋白酶; MBL,甘露糖结合章; MASP,MBL相关的丝氨酸蛋白酶。
      1使用的缩写是:No,氧化氮合酶; Inos,诱导的号码; MALDI-TOF,矩阵辅助激光解吸/电离飞行时间; MS,质谱; GSNO, S-nitrosoglutathione; PPAR,过氧化物激素增殖剂活化受体;生物素-HPDP, N - [6-(Biotinamido)己基] -3“ - (2'-吡啶二硫代噻嗪)丙酰胺; DM,染源肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌肌2D,二维; IL,白细胞介素; CHAPS,3 - [(3-胆氨基甲基丙基)二甲基氨基嘧啶] -1-丙二磺酸; SHP-2,SRC同源2含有磷酸酪氨酸磷酸酶-2; TF,转录因子; RFG,RET融合基因;亚当,解毒素和金属蛋白酶; MBL,甘露糖结合章; MASP,MBL相关的丝氨酸蛋白酶。
      同学。神经元NoS和内皮NoS同工酶具有受影响的组织分布,并由细胞内Ca分开调节2+ 瞬态。诱导型硝基氧化物合成酶(InOS)在细胞因子和/或脂多糖诱导后在哺乳动物中的许多细胞类型中表达,并且一旦表达,它在细胞内Ca的静息水平时活跃2+ (
      • kone b.c。
      • Baylis C.
      一氧化氮在正常肾中的生物合成和稳态作用。
      )。在肾脏中,没有在肾小球,血管和管状功能的稳态调节以及各种基本细胞功能中发挥着突出的作用,包括DNA复制,转录,能量代谢和细胞凋亡(
      • kone b.c。
      • Baylis C.
      一氧化氮在正常肾中的生物合成和稳态作用。
      ,
      • 梁马
      • knox f.g.
      一氧化氮在近端小管中的生产和功能作用。
      ,
      • Wilcox C.S.
      • 邓X.
      • 韦尔奇w.j.
      在盐摄入量的变化中没有一代和动作:NNOS和MACULA DENSA的角色。
      )。最近的研究提供了明确的证据,用于在诱导,进展或保护若干类型的实验和人肾小球肾炎中参与INOS产生的否。在人肾小球肾炎中,已在肾小球纱线细胞以及局部和浸润的巨噬细胞中描述了INOS基因表达(
      • Furusu A.
      • Miyazaki M.
      • 阿布克。
      • Tsukasaki S.
      • Shioshita K.
      • Sasaki O.
      • Miyazaki K.
      • Ozono Y.
      • Koji T.
      • Harada T.
      • Sakai H.
      • Kohno S.
      人肾小球肾炎中内皮和诱导型一氧化氮合酶的表达。
      )。肾小球纱线细胞在维持肾小球毛细管超滤装置的结构和功能以及在生理或病理条件下调节周围细胞外基质的量和组成来起到核心作用。尽管在肾小球肾炎中具有突出的作用和无介导的损伤的证据,但在细胞因子激活时,这些细胞中NO的蛋白质靶标很少。
      不施加其靶的化学改性,优先与硫醇基,过渡金属和自由基相互作用。 S靶蛋白中的半胱氨酸残基的 - 赤膜化是NO和几种NO和几种的主要反应。这种基于氧化还原的后翻译改性已涉及CGMP无关控制各种细胞类型中的广谱蜂窝功能(
      • Stamler J.s.
      • 拉马斯斯。
      • 芳芬
      亚硝基化。基于原型的氧化还原信号机构。
      )。已发现越来越多的蛋白质 S - 硝基化 体内,包括血红蛋白(
      • 贾尔。
      • Bonaventura C.
      • Bonaventura J.
      • Stamler J.s.
      S-硝基霍昔氯博林:血管控制中血液的动态活性。
      ),肌酸激酶(
      • Wolosker H.
      • Panizzutti R.
      • Engelenter S.
      S-Nitrosogluthione的肌酸激酶抑制抑制作用。
      ),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(
      • Mohr S.
      • Stamler J.s.
      • 古文B.
      S-亚硝基化和随后的NADH附着的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的发生后改变。
      ), 这 N-甲基-d - 海地受体(
      • Choi Y.B.
      • Tenneti L.
      • Le D.A.
      • ortiz J.
      • 白盖
      • 陈H.S.
      • Lipton S.A.
      S-亚硝基化的NMDA受体偶联离子通道调节的分子基础。
      )和ryanodine受体(
      • 徐L.
      • 欧盟J.P.
      • Meissner G.
      • Stamler J.s.
      用聚-S亚硝基化激活心脏钙释放通道(ryanodine受体)。
      )和几个胱天件(
      • Mannick J.B.
      • Hausladen A.
      • 刘L.
      • HESS D.T.
      • 曾玉
      • 苗q.x.
      • Kane L.S.
      • gow a.j.
      • Stamler J.s.
      Fas诱导的胱天蛋白酶二氮化剂。
      ),导致功能改变。此外, S - 硝基化似乎是用于细胞中信号转导的机制。例如 SNF-κBP50的赤膜化改变其在培养靶基因表达的变化中的功能(
      • 马歇尔H.E.
      • Stamler J.s.
      通过S-亚硝基化抑制NF-κB。
      )。赠送给 等等。 (
      • gow a.j.
      • 陈问:
      • HESS D.T.
      • 天B.J.
      • ischiropoulos H.
      • Stamler J.s.
      多种细胞类型和组织中的基础和刺激蛋白S-亚硝基化。
      )提供了CA的证据2+,生长因素和发展转型调节 S - 在多种组织中的硝基化化。识别完整的补充 S - 赤胞嘧啶化蛋白和这种修改的功能后果对于了解否的行为机制和从其释放产生的信令事件是必不可少的。
      最近jaffrey 等等。 (
      • jaffrey s.r.
      • Erdjument-Bromage H.
      • Ferris C.D.
      • Tempst P.
      • 斯奈德S.H.
      蛋白质S-亚硝基化:神经元一氧化氮的生理信号。
      )报道了一种蛋白质组学方法,称为“生物素 - 开关”方法,检测蛋白质 S - 赤膜化 体外体内。该方法涉及在通过亚硝基化改性的每个Cys硫中取代生物素基团。然后通过抗生物素蛋白 - 亲和层析纯化生物素化蛋白质或通过免疫印迹鉴定。在小鼠中使用这种方法,这些作者确定了16个蛋白质 S - 硝基吡咯,NO源自神经元NOS(
      • jaffrey s.r.
      • Erdjument-Bromage H.
      • Ferris C.D.
      • Tempst P.
      • 斯奈德S.H.
      蛋白质S-亚硝基化:神经元一氧化氮的生理信号。
      )。在本研究中,我们确定了31种新型蛋白质目标 S使用生物素 - 开关方法与二维(2D)凝胶电泳和MALDI-TOF MS结合的无处理和细胞因子活化鼠梭菌细胞的 - 核糖化,并且在这里,我们讨论了与INOS生物学和髓鞘功能的潜在相关性。

      实验步骤

       试剂 -

      S-nitrosogluthione(GSNO), S-nitroso-N - 乙酰戊酰胺,GSSG和GSH来自Sigma。 IL-1β来自r&D系统。中留素 - 琼脂糖,生物素-HPDP,聚丙烯酰胺6000脱盐柱,山羊抗生物素来自皮尔斯。 Hybond-P膜和ECL试剂来自Amersham Biosciences。生物孢子-6柱和BCA蛋白浓度测定来自Bio-rad。针对PPARγ的抗体来自生物摩尔研究实验室(Plymouth会议,PA)。抗NADPH-细胞色素P450氧化还原酶抗体来自精确的化学品&科学公司(韦斯特伯里,纽约州)。抗尿胍基抗体来自Calbiochem。

       细胞培养-

      小鼠Mesangial细胞(ATCC CLR-1927)在完整培养基中在37℃下培养(Dulbecco的改良Eagle的介质补充有2米m l-Glutamine,100个单位/ ml青霉素,100μg/ ml链霉素和5%胎牛血清)。在某些情况下,如文中所示,用IL-1β(10ng / ml)处理细胞24小时以诱导InOS表达。

       蛋白质组学分析的样品制备 -

      为了制备细胞溶质和膜相关蛋白的提取物,通过刮擦收获细胞,重悬于20体积的母鸡缓冲液(25米m HEPES, pH 7.9, 1 mm EDTA, 0.1 mm Neocuproine)含有0.4%的液体,并在4℃下溶胀15分钟。细胞以2000×离心 g 在4℃下5分钟,在母猪缓冲液中洗涤颗粒。回收上清液,通过在4℃下离心沉淀颗粒级分。将得到的样品立即使用或储存在-80℃直至使用。

       体外s-亚硝基化 -

      jaffrey详述的程序 等等。 (
      • jaffrey s.r.
      • Erdjument-Bromage H.
      • Ferris C.D.
      • Tempst P.
      • 斯奈德S.H.
      蛋白质S-亚硝基化:神经元一氧化氮的生理信号。
      )随着一些修改,详细阐述。将细胞溶胶和膜相关蛋白质(12mg)与NO供体GSNO一起温育(40μm)或控制GSH(40μm)或GSSG(40μm)在室温下在黑暗中,恒定旋转20分钟。为了制备蛋白质组学鉴定的蛋白质,使用60mg蛋白质样品。将处理的蛋白质与20米温育m 甲基甲基磺酸甲酯和2.5%SDS在50℃下涡旋20分钟。通过沉淀用2体积的-20℃丙酮或通过脱盐塔除去甲基甲基磺酸甲酯。在将含有1%SDS的母鸡缓冲液中重新悬浮蛋白质后,抗坏血酸钠溶液(1米 m 最终浓度)和生物素-HPDP(最多10米m 加入最终浓度)。用间歇性涡旋在黑暗中在25℃下将混合物在25℃下孵育1.5小时。然后用2体积的-20℃丙酮致丙酮沉淀的生物素化的亚硝硫醇,通过脱盐塔除去生物素-HPDP。离心后,将沉淀重悬于初始蛋白样品中含有1%SDS / Mg蛋白质的0.1ml母鸡缓冲液中。两体积的中和缓冲液(20米m HEPES, pH 7.7, 100 mm NaCl, 1 mm 加入EDTA和0.5%Triton X-100),加入15μL中使用初始蛋白质样品中使用的中药素 - 琼脂糖/镁蛋白。将生物素化的蛋白质在室温下与树脂一起温育1小时。在含有600米的10体积的中和缓冲液中广泛洗涤树脂m NACL。然后在含20米的溶液中洗脱结合的蛋白质m HEPES, pH 7.7, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, and 100 mm 2-巯基乙醇。然后将样品混合在SDS样品缓冲液中。

       二维凝胶电泳和凝胶图像分析 -

      通过生物素开关法分离亲和分离后,将纯化的蛋白质悬浮在含8的缓冲液中 m 尿素,2 m Thiourea,1%Triton X-100,1%二硫醇,1%两晶体pH 3-10(
      • rabilloud t.
      硫脲利用膜蛋白在二维电泳中​​的溶解度。
      )。将Biotin-Switch方法分离的100μg蛋白质的等分试样加载到11cm等电聚焦条,pH4-7上。在250V的等电聚焦单元上进行聚焦20分钟,然后线性增加到8000V,2小时。聚焦以20,000V-H终止。然后在375米处平衡条带m TRIS缓冲液,pH 8.8,包含6 m 尿素,20%甘油和2%SDS(
      • Gorg A.
      • 帖子
      • Gunther S.
      具有固定的pH梯度的二维电泳的当前状态。
      )。以30mg / ml的浓度加入新鲜的二硫噻吩并加入缓冲液中。十五分钟后,加入新鲜缓冲液,含有40mg / ml碘乙酰胺。使用标准梯度凝胶(Bio-rad)向第二尺寸平衡15分钟,然后丙烯酰胺梯度为10-20%。然后使用Syprony荧光染料染色凝胶(
      • Berggren K.N.
      • Schulenberg B.
      • Lopez M.F.
      • Steinberg T.H.
      • Bogdanova A.
      • Smejkal G.
      • 王A.
      • 帕顿W.F.
      一种改进的Sypro Ruby蛋白凝胶染色剂的制剂:与原始配方和钌II三(银酚蒽二磺酸盐)制剂进行比较。
      )。使用PDQUEST软件(Bio-rad)与没有供体处理的样品的凝胶图像的数字荧光图像分析结果与其各自的对照样品进行比较。分析包括使用内部蛋白质标准作为地标的蛋白质模式的发现和比较。

       胰蛋白酶消化,MALDI-TOF MS和肽质量指纹识别 -

      对于蛋白质点切割和MS鉴定,用200μg通过生物素开关法分离的蛋白质加载凝胶。在软件分析之后,使用Proteomeworks机器人斑点切割器(Bio-rad)从凝胶中切除独特的斑点。凝胶斑件在多级纤维II(Packard仪器公司)上是如下的机器人消化。凝胶斑在100米中洗涤两次m NH4HCO3 缓冲剂,然后浸泡在100%乙腈中5分钟,吸入乙腈,并干燥凝胶30分钟。使用20μg/ ml胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)在25米中再水化凝胶 m NH4HCO3 然后在37℃下孵育缓冲液14-20小时。使用50%乙腈和5%三氟乙酸的溶液将消化的肽萃取两次40分钟。使用Zip-tips(Millipore,Bedford,Ma)脱盐萃取物并浓缩,并使用Symbiot I(应用生物系统,福斯特城,加利福尼亚州),机器人置于Maldi芯片上。在MALDI-TOF Voyager de Pro质谱仪(应用生物系统)上进行质谱分析。数据搜索是使用国家生物技术信息中心(NCBI)蛋白质数据库中的最小匹配肽设置为4,大规模耐受设置为50-200ppm,以及单个胰蛋白酶脱落设置。

       西方分析 -

      由Biotin-Switch方法分离的蛋白质也通过SDS-PAGE来解决,被电解于丙基-P膜,并用诸如文本和图例中所示的主要抗体免疫抗体。用过氧化物酶 - 缀合的绵羊抗小鼠或山羊抗兔IgG,通过ECL化学发光检测系统(Amersham Biosciences)可视化结合的抗体。

      结果

      了解功能后果 S - 硝基化需要了解修饰的蛋白质的身份。确定蛋白质组学概况 S - 中硝基化蛋白在乳腺细胞中,我们使用了生物素 - 开关方法与蛋白质组学方法结合。用没有供体或对照化学品GSH和GSSG进行细胞质提取物,并产生 S使用生物素开关法纯化 - 硝基化蛋白。通过2D凝胶电泳分离纯化的蛋白质(100μg)(等电聚焦加SDS-PAGE),用更高功率染色凝胶,并且进行数字荧光图像分析。然后通过计算机分析匹配所得凝胶的二维图案。在含有200μg的蛋白质的单独凝胶上,通过生物素 - 开关方法分离,用胰蛋白酶消化所选的蛋白质点,通过MALDI-TOF MS分析胰蛋白酶肽。然后用肽质量进行数据库查询,然后鉴定了特定的蛋白质。
      在基础条件下在没有任何供体的情况下,在生物素 - 开关蛋白分离株的2D凝胶上显而易见的肽斑点(图。1A)。类似地,在用GSH首先处理的阴性对照样品中只有几个肽斑点,然后进行生物素 - 开关测定(数据未显示)。在用GSNO处理的样品中,790个蛋白质斑点是明显的(图。1B)。 2D凝胶的蛋白质图案 图。1B 揭示了在pH梯度的酸性区域中检测到大多数这些蛋白质。在GSSG处理的样品(未示出)中鉴定了类似的蛋白质斑点的蛋白质点和数量,以便与生物素 - 开关方法的生物化学和公布的报告一起保持 S-Glutathiolation也是蛋白质中的靶半胱氨酸残基 S - 硝基硅烷化(
      • Mallis R.J.
      • 巴士J.E.
      • 托马斯J.A.
      H-Ras的氧化改性:反应性半胱氨酸的S-硫醇化和S-亚硝基化。
      ,
      • 太阳J.
      • 徐L.
      • 欧盟J.P.
      • Stamler J.s.
      • Meissner G.
      影响骨骼肌钙释放通道活性的硫醇类。
      ,
      • 罗密欧A.A.
      • Capobianco J.A.
      • 英语上午
      S-Nitrosogluthathione的脱氧杂蛋白的血红素亚硝基化需要铜。
      ,

      Starke,D. W. W.,Chock,P. B.和Mieyal,J. J.(2003年1月29日)人类谷氨酸(硫醇转移酶)的谷胱甘肽 - 硫基自由基清除和转移酶性能。氧化还原信号转导中的潜在作用。 J. Biol。化学。 10.1074 / JBC.M210434200

      )。识别 S - 赤膜化蛋白在不受供体处理的样品中,通过Biotin-Switch方法获得的相同细胞提取物制备另外的2D凝胶,并如“实验程序”所描述的那样染色。然后从凝胶中切除44个感兴趣的蛋白质斑点,用胰蛋白酶消化,随后通过MALDI-TOF质谱分析。得到的光谱用于鉴定胰蛋白酶肽质量指纹(图。1B表I.)。这44个斑点从凝胶中切除,35 S - 硝基化蛋白,其中34个是已知蛋白质,明确鉴定(表I.)。鉴定的蛋白质是特定官能系的成员,包括受体和膜蛋白,信号蛋白,细胞骨骼和细胞基质蛋白和细胞质蛋白(表I.)。其中三种,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,caspase-6和二甲基喹二甲基氨基酰氯酶,已经据报道 S - 其他系统中的赤胞嘧啶化(
      • Mohr S.
      • Stamler J.s.
      • 古文B.
      S-亚硝基化和随后的NADH附着的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的发生后改变。
      ,
      • knipp m.
      • 布劳恩O.
      • Gehrig下午
      • 袋子R.
      • Vaak M.
      Zn(II) - 从特定的Cys-S-亚硝基化物上抑制Zn(II)--FREE二甲基氨基酶-1(DDAH-1)。
      ,
      • 李杰。
      • Billiar T.R.
      • Talanian R.V.
      • kim y.m.
      通过S-亚硝基化,一氧化氮可逆地抑制了半胱天冬酶系列的7个成员。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1相对比 S - 乳糖细胞细胞质/膜提取物中的核糖化蛋白由2D页面提取物。 乳房细胞提取物被治疗而没有(A)或(B)根据“实验程序”,蛋白质(200μg)没有基于其等电点的差异pH值分离(PI., x )和分子量(y轴)。切除蛋白质斑点并进行胰蛋白酶消化,然后进行胰蛋白酶消化。进行肽质量指纹识别以使用整个NCBI蛋白质数据库的查询鉴定蛋白质。斑点的数字标记对应于分配的数字 .
      T有能力的 I通过蛋白质点的胰蛋白盐肽肽谱的MALDI-TOF MS分析,然后在NCBI数据库中搜索
      SSP.
      a 样本点。
      NCBI IDNCBI加入号码。分子massPI.
      kda.
      我:信号蛋白
      1乌朗瓜711061511.76.7
      414-3-3ε.580322529.24.63
      514-3-3ζ184138727.74.72
      6未知1502995224.74.81
      7过氧化合物异喹甲法呢呢蛋白1804390232.74.25
      9过氧化合物异喹甲法呢呢蛋白12746416米32.74.3
      12转琥酸β状11223071634.86.11
      14Caspase-61280512931.66.41
      15类似于胆碱激酶1343571131.86.68
      16磷脂酶A.2 - 激活蛋白质110808米35.86.4
      17mitosin1200298037.94.85
      20鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α-亚基Gαi2 (腺苷酸环化酶抑制Gα蛋白)173022940.55.28
      21GTP结合蛋白α-亚基(GαOA.)675401240.15.34
      26蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶,非受体型11(蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶SYP)46449566.86.52
      27凝血因子II675379870.36.04
      28凝血因子II675379870.36.04
      30细胞色素p450氧化还原酶667942177.05.34
      38河豚11387947272.44.4
      44泛素 - 蛋白质连接酶E3A(致癌蛋白相关蛋白E6-AP)6647866101.25
      II:细胞骨架和细胞基质蛋白
      8β-ropomoyosin34665532.84.64
      18melusin.730519138.84.79
      19Annexin A51327761235.74.83
      33otoconin-95前体417676452.44.76
      34α1(xi)胶原蛋白1208236550.14.46
      35α1(xi)胶原蛋白1208236550.14.46
      III:受体和膜蛋白
      2免疫球蛋白可变区重链329422114.97.67
      3IG重链VDJ区域19545612.78.04
      11钾通道相互作用蛋白4a1933868426.54.6
      25干扰素γ受体12447552.35.43
      29测试酶3.573127178.75.72
      36肌营养不良激酶,DM-kinase214350149.14.45
      37肌营养不良激酶,DM-kinase214350149.14.45
      39RFG.979019570.45.2
      40推定的LR11 / GP250受体蛋白311486166.74.72
      41MBL相关的丝氨酸蛋白酶-31604096282.45.25
      42MBL相关的丝氨酸蛋白酶-31604096282.45.25
      43非常低密度脂蛋白受体60953396.34.6
      IV:细胞质蛋白
      10甘油-3-磷酸脱氢酶1004829633.85.33
      13二甲基尿苷二甲基氨基酰氯酶1,推定1284586831.45.64
      31类似于αInternoxin神经元中间丝蛋白1739090055.45.35
      V:转录因子
      22过氧化物体增殖物激活受体γ 51430754.56.23
      23过氧化物体增殖物激活受体γ 51430754.56.23
      24锌指蛋白297b23397003米52.65.4
      32TFIIA-α/β状因子1296375951.54.56
      a 样本点。
      确定是否鉴定为易感的代表性蛋白质 S - 没有捐助者的 - 赤膜化 体外 (表I.) 是 善意 目标 S - 硝基化 体内,蛋白质提取物由已经用或没有IL-1β(10ng / ml)处理24小时的乳房细胞,已知诱导的刺激 德诺维 在这些细胞中的INOS表达和高输出不产生(
      • Gupta A.K.
      • kone b.c。
      USF-1和USF-2转体抑制IL-1β诱导的IL-1β诱导在梭菌细胞中的INOS转录。
      )。 Mesangial细胞不表达任何NOS,并且在基础条件下不会产生没有。将这些蛋白质提取物进行生物素 - 开关测定,该蛋白质提取物 S - 在中性杀虫素 - 琼脂糖上纯化 - 硝基化蛋白,纯化的蛋白质印迹 S制备 - 硝基化蛋白。用特定于由质量指纹识别的三种选定蛋白质的抗体探测斑点 体外 亚硝基化实验。如所示 Fig. 2,Mesangial细胞通过用IL-1β治疗而刺激以产生的证据表明 S - PPARγ,尿囊素和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的赤膜化。这些结果表明这些蛋白质,发现是 S - 赤膜化因外源添加到Mesangial细胞提取物,也是 S - 在完整细胞内通过Inos衍生的内源性内源性。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2一组内源的免疫斑分析 S - 活化的乳腺细胞中的核糖化蛋白。 细胞质/膜提取物由在没有或存在IL-1β的缺失或存在下治疗的Mesangial细胞制备,显示诱导INOS产生的没有生产。 S通过生物素 - 开关方法纯化 - 硝基化蛋白,并用针对所示蛋白的抗体制备并探测免疫印迹。 ECL方法(Amersham Biosciences)检测到信号。

      讨论

      蛋白质组学研究代表了对转录组研究的强烈补充,因为它们允许评估表达的蛋白质和潜在的翻译后修饰。 S - 硝基化是如此的翻​​译后修饰,并且越来越多地被认为是可能与磷酸化或乙酰化相当的普遍存存,具体的和可逆调节反应(
      • Stamler J.s.
      • 拉马斯斯。
      • 芳芬
      亚硝基化。基于原型的氧化还原信号机构。
      ,
      • gow a.j.
      • 陈问:
      • HESS D.T.
      • 天B.J.
      • ischiropoulos H.
      • Stamler J.s.
      多种细胞类型和组织中的基础和刺激蛋白S-亚硝基化。
      )。自从 S - 硝基化蛋白通常用作不同细胞类型和组织中无关的生物活性的主要作用,鉴定可以以这种方式改性的蛋白质的全部补充是新兴的调查领域。
      在肾小球损伤过程中,乳房细胞暴露于内源性产生的NO,而不是来自局部吞噬细胞(
      • Furusu A.
      • Miyazaki M.
      • 阿布克。
      • Tsukasaki S.
      • Shioshita K.
      • Sasaki O.
      • Miyazaki K.
      • Ozono Y.
      • Koji T.
      • Harada T.
      • Sakai H.
      • Kohno S.
      人肾小球肾炎中内皮和诱导型一氧化氮合酶的表达。
      ,
      • Cattell V.
      一氧化氮和肾小球肾炎。
      )。因此,没有和衍生的物种可能在Mesangial Cell功能上发挥重要调节控制 S - 参与各种细胞过程的蛋白质的核化。鉴定蛋白质唯一敏感 S - 硝基化,我们用NO供体GSNO温育髓鞘裂解物。 GSNO存在于循环中,并且可以代表没有群体的内源性池 S - 蛋白质的硝基化酶(
      • Tsikas D.
      • Sandmann J.
      • Luessen P.
      • Savva A.
      • Rossa S.
      • Stichtopoth D.O.
      • 弗洛里奇J.C.
      大鼠人血浆和血液中白蛋白的S-跨铬酸盐化合物。
      )。孵育无助剂后,将提取物进行 S - 硝基化测定和蛋白质组学分析。该测定的有效性部分地涉及稳定性 S - 硝基硫醇键,其可能在蛋白质和特异性测定条件下变化,以及特定的脱氮活性的潜在作用(
      • Mannick J.B.
      • Hausladen A.
      • 刘L.
      • HESS D.T.
      • 曾玉
      • 苗q.x.
      • Kane L.S.
      • gow a.j.
      • Stamler J.s.
      Fas诱导的胱天蛋白酶二氮化剂。
      ,
      • 刘L.
      • Hausladen A.
      • 曾玉
      • que l.
      • Heitman J.
      • Stamler J.s.
      S-亚硝基硫醇的代谢酶免受细菌对人类的影响。
      )。一般来说 S - 硝基化蛋白可以分离成五组:信号传导蛋白,细胞骨骼和细胞基质蛋白,受体和膜蛋白,细胞质蛋白和转录因子。许多这些蛋白质可能会发生 S - 其他细胞类型中的硝基化化。确实我们识别出三种蛋白质 S据报道, - 甘氨基化细胞中的赤膜化,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,Caspase-6和二甲基喹二甲基氨基酰氯酶。 S - 其他组织和细胞类型中的赤藓溶胶化合物(
      • Mohr S.
      • Stamler J.s.
      • 古文B.
      S-亚硝基化和随后的NADH附着的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的发生后改变。
      ,
      • 李杰。
      • Billiar T.R.
      • Talanian R.V.
      • kim y.m.
      通过S-亚硝基化,一氧化氮可逆地抑制了半胱天冬酶系列的7个成员。
      )。我们证实PPARγ,尿囊黄和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶是 S - 在乳房细胞中没有内源性产生的赤藓膜化(Fig. 2)。
      发现了几种细胞信号蛋白 S - 硝基化物。瓜旺l环酶是无动作的经典靶标,以及其他GTP调节蛋白,如P21拉斯 (
      • 兰特H.M.
      • Ogiste J.S.
      • Pearce S.F.
      • Levi R.
      • NovoGrodsky A.
      一氧化氮刺激的鸟嘌呤核苷酸交换P21拉斯.
      ),已被举报是 S - 硝基化物。我们鉴定了GTP结合蛋白α-亚基Gαi2 作为一个新的目标 S - 硝基化。 Gαi2 参与不同的细胞信号传导事件。 Gα.i2 被发现由否(
      • Nishida M.
      • Schey K.L.
      • Takagahara S.
      • Kontani K.
      • 卡塔达T.
      • 乌拉诺Y.
      • 长野T.
      • Nagao T.
      • kureose h.
      G的激活机制i 和 Go 通过反应性氧。
      )强调不通过G蛋白偶联受体调节信号转导的作用。法呢基化在激活G-蛋白,Ras,Rho,Lamin和过氧化物酶法中蛋白质中起着基本作用(
      • Haluska P.
      • DY G.K.
      • adjei a.a.
      法呢基转移酶抑制剂作为抗癌剂。
      )。法金黑化的蛋白质介导IL-1β诱导INOS(
      • Haluska P.
      • DY G.K.
      • adjei a.a.
      法呢基转移酶抑制剂作为抗癌剂。
      )。似乎没有将这些法呢基化蛋白质中的一些似乎作为正反馈。尿瓜素属于利钠肽家族,存在于胃,肾,肺,胰腺和肠中。它与膜胍基环化酶C和通过CGMP作为第二个使者结合(
      • kone b.c。
      利钠肽和一氧化氮合酶的分子生物学。
      )。 Mesangial细胞是利钠肽的主要靶标,认为这些肽在调节肾小球过滤速率方面发挥作用。蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶,非受体型11或SHP-2,胞质蛋白 - 酪氨酸磷酸酶的小亚家族的成员也是 S - 硝基化物。 SHP-2普遍表达,并参与了对生长因子,激素,细胞因子和细胞粘附分子的细胞反应。最近的研究表明,Bradykinin通过一种涉及Bradykinin B2受体和SHP-2(
      • Duchene J.
      • Schanstra J.P.
      • PECHER C.
      • 玄柱A.
      • Susini C.
      • Esteve J.P.
      • Bascands J.L.
      • Girolami J.P.
      G蛋白偶联受体和磷酸酶SHP-2之间的新型蛋白质 - 蛋白质相互作用参与了Bradykinin诱导的细胞增殖抑制。
      )。肌营养不良(DM-Kinase)的缺陷导致肌肌营养不良。转录因子MyOD不需要合酶活性诱导DM-Kinase(
      • 卡斯斯科米
      • Canicio J.
      • Palacin M.
      • Zorzano A.
      • 卡利曼P.
      鉴定肌细胞内信号途径诱导肌动生成过程中的肌肌营养不良蛋白激酶表达。
      )。由于该激酶是局部的间隙连接点(
      • Schiavon G.
      • 福尔兰S.
      • 马林o.
      • Salvatori S.
      心肌的肌肌营养不良蛋白激酶:使用免疫化学方法评估。
      ), SDM-激酶的赤膜化可能在细胞 - 细胞通信中发挥作用。
      释放似乎似乎保护了来自泛素连接酶A3介导的泛素化和降解的大量蛋白质(
      • Haluska P.
      • DY G.K.
      • adjei a.a.
      法呢基转移酶抑制剂作为抗癌剂。
      )。这种无介导保护的机制尚不清楚,但可能需要 S - 硝基化酶(
      • Palmer L.A.
      • 加斯顿B.
      • 约翰·罗..
      缺氧诱导因子-1表达和活性的常见稳定性:氮氧化物的氧化氧依赖性作用。
      )。我们的证据 S - 泛素连接酶A3的赤膜化可以解释这种保护作用。相反,Inos本身受到泛素相关的降解(
      • Kolodziejski P.J.
      • usial a。
      • Koo J.s.
      • eissa n.t.
      其降解需要诱导型一氧化氮合酶的泛素化。
      )。
      在本报告中,我们展示了一个k+ 通道相互作用蛋白kchip4a(
      • Holmqvist M.H.
      • Cao J.
      • Hernandez-Pineda R.
      • 雅各布森M.D.
      • Carroll K.I.
      • Sung M.A.
      • 贝蒂M.
      • GE P.
      • gilbride K.J.
      • 棕色M.E.
      • Jurman M.E.
      • 劳森D.
      • Silos-Santiago I.
      • 谢Y.
      • Covarrubias M.
      • 罗德K.J.
      • distefano p.s.
      • 一个w.f.
      通过辅助亚基结构域消除KV4 A型钾通道的快速失活。
      ) 是 S - 硝基化物。最近的报告表明K的激活+ channels by NO (
      • 韩伙子
      • 金恩。
      • Joo H.
      • 金E.
      • EARM Y.E.
      ATP敏感k+ 一氧化氮和蛋白激酶G在兔心室肌细胞中的沟道激活。
      )。三种蛋白质参与磷脂代谢和细胞信号传导,胆碱激酶,磷脂酶a2 - 也是活化的蛋白质和otoconin-95,也是 S - 赤膜化在Mesangial细胞中。早期报告表明IL-1部分抑制肿瘤中的胆碱激酶活性(
      • Belardelli F.
      • Proietti E.
      • Ciolli V.
      • SESTILI P.
      • Carpinelli G.
      • DI VITO M.
      • Ferretti A.
      • 伍德罗德D.
      • Boraschi D.
      • PODO F.
      白细胞介素-1β诱导可移植小鼠肿瘤的肿瘤坏死和早期形态学和代谢变化。肿瘤坏死因子α或β的抗肿瘤作用的相似之处。
      ),虽然它诱导磷脂酶A的合成2-Actiavting蛋白(
      • 同性恋F.R.
      • 赵L.
      • Burakoff R.
      IL-1β在兔远端结肠中诱导磷脂酶A2活化蛋白的合成。
      )。滴注液-95在肾脏中的作用尚未确定。蛋白质是磷解酶磷脂酶A的同源物2,构成提包性和囊状腺炎的主要蛋白质,并通过各种非感性细胞类型表达(
      • 莱比锡米
      • Petit C.
      卵仁耳菌卵黄素的主要蛋白质的表征,为这些内耳生物化的形成提供了见解。
      )。
      mitosin是一种核蛋白,其与有丝分裂装置,尤其是动脉溶解的核蛋白质,在有丝分裂期间(
      • 朱克。
      • Mancini M.A.
      • Chang K.H.
      • 刘C.Y.
      • 陈C.f.
      • 山B.
      • 琼斯D.
      • 杨峰T.L.
      • Lee W.H.
      一种新的350千杆耳顿核磷蛋白的表征,其特异性涉及有丝分裂阶段进展。
      )。 Mitosin的亚硝基化可以在无介导的细胞周期进展中解释其信号传导作用。发现蛋白质14-3-3,发现蛋白质和与丝氨酸/苏氨酸 - 磷酸化残基结合的蛋白质结构域的新出现的蛋白质结构域 S - 硝基化物。这些蛋白质调节涉及各种生理过程的关键蛋白,例如细胞内信号传导,细胞循环,细胞凋亡和转录调节(例如 FKHRL1,DAF-16,P53,TAZ,TLX-2和组蛋白脱乙酰酶)(
      • ferl r.j.
      • Manak M.S.
      • reyes m.f.
      14-3-3s。
      )。这些蛋白质也充当衔接子分子,刺激蛋白质 - 蛋白质相互作用,并调节蛋白质的亚细胞定位(
      • ferl r.j.
      • Manak M.S.
      • reyes m.f.
      14-3-3s。
      ,
      • Gerke V.
      • 苔藓s.e.
      annexins:从结构到功能。
      )。 Annexin V属于钙粘合和磷脂结合蛋白的系列,并参与多种生物学方法,例如调节钙浓度和某些内皮功能(
      • Gerke V.
      • 苔藓s.e.
      annexins:从结构到功能。
      )。该蛋白质也被鉴定为一个 S乳糖细胞中的核糖化蛋白。最近发现GSNO抑制相关蛋白质膜蛋白II四聚体的活性(
      • 刘L.
      • Enright E.
      • 太阳P.
      • 蔡S.Y.
      • Mehta P.
      • Beckman D.L.
      • Terrian D.M.
      S-Nitrosogluthathione的Annexin II四聚体的灭活。
      )。
      发现调节转录的几种蛋白质是 S - 硝基化物。人一般转录因子TFIIA是RNA聚合酶II的特定转录的几种蛋白质之一,可能通过调节TFIID的TATA结合亚基的活性(
      • 戴维森I.
      • romier c.
      • Lavigne A.C.
      • Birck C.
      • Mengus G.
      • 诗歌O.
      • 莫拉斯D.
      人转录因子TFIID亚基的功能和结构分析。
      )。 PPARγ是核激素受体超家族的核心依赖性转录因子的成员。 PPAR在包括葡萄糖和脂质稳态的细胞的转录中发挥着重要作用,细胞周期进展,分化,炎症(
      • 克拉克R.B.
      PPAR在炎症和免疫中的作用。
      )和细胞外基质重塑。已知pPARγ在髓鞘细胞中表达(
      • 尼古拉斯S.B.
      • 卡瓦南Y.
      • Wakino S.
      • 柯林斯A.R.
      • hsueh w.a.
      梭菌细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的表达与功能。
      )在肾小球损伤存在下,包括糖尿病肾小球疾病(
      • Routh R.E.
      • 约翰逊J.H.
      • 麦卡锡k.j.
      Troglitazone抑制了体外Mesangial细胞I型胶原蛋白的分泌。
      )。 PPARγ也已被证明 trans - 在鼠巨噬细胞中的inos转录(
      • r
      • 韦尔奇J.s.
      • 玻璃C.K.
      过氧化物体增殖物激活受体-γ调节巨噬细胞基因表达。
      ,
      • 李米
      • Pascual G.
      • 玻璃C.K.
      过氧化物酶体增殖物激活受体γ依赖性抑制诱导的一氧化氮合酶基因。
      )。引导关于存在反馈抑制循环的存在,其中不衍生自激活的乳腺细胞中的InOS,也许是巨噬细胞 S - 硝基磺酸盐PPARγ,所以改进的,变得称赞 trans-repress Inos基因表达。否已显示灭活锌手指蛋白(
      • Berendji D.
      • Kolb-Bachofen V.
      • Zipfel P.F.
      • Skerka C.
      • 卡尔伯格C.
      • 克朗科克K.D.
      锌指转录因子作为一氧化氮介导的免疫抑制的分子靶标:抑制小鼠淋巴细胞中IL-2基因表达的抑制作用。
      ),很可能是 S锌 - 硫簇中硫醇的腈,导致锌指结构的可逆破坏。的证据 S这里呈现的锌指蛋白297b的赤锌化可以提供基因转录调节的添加分子机制。 RFG( 融合基因),一种嵌合的癌基因共同剂,其由结构重排之间产生的 ELE1基因也被发现是 S - 硝基化物。转霉素β样1蛋白,一种普遍地表达含WD-40重复的蛋白质,具有核受体的合作伙伴,具有核受体的副压制和组蛋白脱乙酰化酶,形成SMRT(沉默介质和甲状腺激素受体的沉默介质和甲状腺激素受体)的核心容体复合体,其指示各种抑制途径(
      • 李杰。
      • 王J.
      • Nawaz Z.
      • 刘准
      • 秦吉。
      • Wong J.
      核心投压蛋白SMRT和N-COR都存在于含有HDAC3的大蛋白质复合物中。
      )。据报道,RFG和转霉蛋白β样1蛋白均未在Mesangial细胞中表达。
      许多细胞基质和细胞骨骼蛋白是 S - 硝基化物。这些包括肌动蛋白结合蛋白β-冠状阴性蛋白,其被认为稳定肌动蛋白细丝并影响F-actin,α-Internexin,IV型中间长丝蛋白的各方面,这可能是用于形成神经元中间细丝的支架在早期发育期间,飞蛾,通常在神经元细胞中表达的F-actin结合蛋白(
      • KEON B.H.
      • jedrzejewski p.t.
      • 保罗D.L.
      • goodenough d.a.
      IsoForm F-Actin结合蛋白,蛇纹,在胃和肾上皮的专用细胞中的特异性表达。
      )和试验酶3,Adam(Disintegin和金属蛋白酶)的成员的金属蛋白酶(
      • 朱G.Z.
      • 林Y.
      • Myles D.G.
      • Primakoff P.
      鉴定精子发生和施肥的潜在作用的四种新亚当。
      )。 ADAM-15已被证明参与Mesangial Cell迁移(
      • 马丁J.
      • Eynstone L.V.
      • 戴维斯M.
      • 威廉姆斯J.D.
      • Steadman R.
      ADAM 15在肾小球髓质细胞迁移中的作用。
      )但尚未证明测试酶3的类似作用。虽然亚当家庭的成员以前尚未报告 S - 赤胞嘧啶化,最近显示了基质金属蛋白酶-9以激活 S - 硝基化,导致形成稳定的硫酸或磺酸,在神经元中具有病理活性(
      • 顾Z.
      • Kaul M.
      • 阎b.
      • Kridel S.J.
      • 崔J.
      • strongin A.
      • 史密斯J.W.
      • Liddington R.C.
      • Lipton S.A.
      基质金属蛋白酶的S-亚硝基化剂:神经细胞死亡的信号通路。
      )。 MELUSIN与β-整联蛋白相互作用,并且可能在蛋白质 - 蛋白质相互作用中发挥作用,并且具有富含半胱氨酸的结构域,它是一种强大的生物候选者 S - 硝基化由NO。 β-联合蛋白在髓鞘细胞粘附,迁移,存活和增殖中发挥作用(
      • 哈特纳A.
      • Schocklmann H.O.
      • Sterzel R.B.
      系膜细胞及其粘合性能。
      )。 Collagen Xi通过将与胶原II三聚体共聚来调节软骨素基质组件。通过与von Willebrand因子的互动提高血小板聚集,胶原蛋白在血栓形成中发挥着关键作用。 S - 胶原α1(Xi),凝血酶蛋白(凝血因子II)和膜蛋白V的赤膜化可能有助于NO抑制血小板聚集的能力。
      甘露糖结合凝集凝集素(MBL)是血清免疫系统的血清蛋白,其作为与MBL相关的丝氨酸蛋白酶(Masps)系列的复合物循环。 MBL·MASP-2的复合物激活补体系统。 masp-3,我们展示的 S - 赤胞嘧啶化,下调MASP-2的C4和C2切割活性(
      • dahl m.r.
      • 泰尔斯。
      • Matsushita M.
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      MASP-3及其与甘露结合凝集素补体活化途径不同复合物的关系。
      )。 NADPH-细胞色素P450氧化还原酶是微粒体P450混合功能氧化酶系统的必要组分,介导电子转移从NADPH到细胞色素P450s和几种其他受体。因此,否的能力 S - 赤硝基化该蛋白质可能会影响各种信号通路。
      有几个因素可以控制特殊性 S - 选择靶标的 - 赤硝化。富含半胱氨酸的蛋白质可能更容易受到影响 S - 硝基化,没有细胞内没有源和靶标的空间关系对于该翻译后修改的特异性是重要的(
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      我们的结果提供了蛋白质的机械和生物学方面的阶段 S - 硝基化可以检查。此类研究应提供全面的观点,如何不调节细胞过程。除了确定新的目标 S - 硝基化酶中的核糖化,我们的结果提供了这种修改的蛋白质目标的更完整的图片,应该促进未来的研究,以确定蛋白质目标的共同主题,特异性的决定因素和功能结果 S - 细胞和组织中的硝基化化。

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