大的蛋白质组 假单胞菌 Myovirus 201φ2-1

描绘蛋白水解加工的病毒蛋白蛋白*
  • 朱莉A.托马斯
    脚注
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    德克萨斯州德克萨斯大学生物化学系,德克萨斯州圣安东尼奥德克萨斯州78229-3900
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  • 苏珊T. Weintraub.
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    德克萨斯州德克萨斯大学生物化学系,德克萨斯州圣安东尼奥德克萨斯州78229-3900
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  • 凯文哈卡拉
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  • 菲利普斯威尔
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    德克萨斯州德克萨斯大学生物化学系,德克萨斯州圣安东尼奥德克萨斯州78229-3900
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  • 斯蒂芬C. Hardies.
    一致
    应讨论谁的通信:德克萨斯大学圣安东尼奥大学德克萨斯州立大学生物化学部门,San Antonio 7703 Floyd Curl.,San Antonio,TX 78229-3900。电话:210-567-3735;传真:210-567-6595;
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    德克萨斯州德克萨斯大学生物化学系,德克萨斯州圣安东尼奥德克萨斯州78229-3900
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  • 作者脚注
    *全体健康机构Gran Gm24365的全部或部分支持这项工作。来自罗伯特J.Kleberg,Jr.和Helen C. Kleberg基金会,Welch Foundation(Grant AQ-764)和Uthscsa Research理事会试点授予,也支持这项工作。
    本文包含补充表1和2。
    ‡现代地址:马里兰大学医学院,MD 21201,MD 21201,MD 21201,马里兰大学生物化学与分子生物学和分子生物学。
      假单胞菌 allororaphis.噬菌体201φ2-1产生大型结构复杂的病毒藻,包括89个噬菌体基因的产物。许多这些蛋白质通过植物成熟期间通过蛋白水解来修饰。为了描绘蛋白水解成熟过程,对来自SDS-聚丙烯酰胺凝胶的46个切片进行胰蛋白酶消化,然后进行HPLC-电喷雾电离 - 串联质谱分析。实验的规模允许高序列覆盖和检测分配给肽的肽的质谱,并通过胰蛋白酶产生的一端,另一端衍生自成熟切割(半型肽)。以这种方式检测到19种裂解位点。从这些位点,定义了裂解基序并用于预测解释加工后多肽物种的凝胶迁移率所需的剩余切割。发现凝胶具有特异性多肽区域的光谱计数,有助于推导蛋白水解模式。因此,在成熟的201φ2-1的病毒中检测到总共29种来自19个基因产物的裂解多肽。当与生物信息学分析结合时,这些结果显示出头部蛋白质编码基因模块的存在。在加工后从病毒丝中除去的大部分肽是酸性的,而在病毒粒中剩余的成熟结构域几乎是充电中性的。对于这些加工的病毒虫蛋白中的四个,剩余的植物中剩余的部分是相互同源的。发现光谱计数以估计病毒中次要多肽物种的相对量。由此产生的次要物种的敏感性使得可以观察少量的常规蛋白水解,这也影响了病毒粒子。
      由于其在噬菌体疗法中使用的可能性,对噬菌体有兴趣的重新疗效(
      • Skurnik M.
      • Strauch E.
      噬菌体疗法:事实和虚构。
      ,
      • Hanlon G.W.
      噬菌体:对其在治疗细菌感染中的作用评估。
      ),它们在食物链的基础上的作用(
      • Wilhelm S.W.
      • Suttle C.A.
      海洋病毒中的病毒和营养循环在水生食品网的结构和功能中起重要作用。
      ,
      • Chibani-Chennoufi S.
      • Bruttin A.
      • 迪尔曼M.L.
      • BrüssowH.
      噬菌体宿主互动:生态观点。
      ,
      • Kimura M.
      • 贾Z.J.
      • nakayama n。
      • 旭川S.
      土壤中病毒的生态学:过去,现在和未来的观点。
      ),它们在雌噬菌素数据中的丰富(
      • 威廉姆森S.J.
      • rusch d.b.
      • yooseph s.
      • Halpern A.L.
      • 海德堡K.B.
      • 玻璃J.I.
      • 安德鲁斯-Pfannkoch C.
      • Fadrosh D.
      • 米勒C.S.
      • 萨顿G.
      • Frazier M.
      • venter J.C.
      巫师II全球海洋抽样探险:水生微生物样品中病毒的均衡特征。
      ),他们的遗传多样性最后一个未开发的遗传多样性储存库的内容(
      • Schoenfeld T.
      • Liles M.
      • Wommack K.E.
      • Polson S.W.
      • Godiska R.
      • 我加。
      功能性病毒性偏心组合和下一代分子工具。
      )作为复杂大分子组件的模型(
      • Kostyuchenko V.A.
      • 莱曼P.G.
      • Chipman P.R.
      • Kanamaru S.
      • van raij m.j.
      • arisaka f.
      • Mesyanzhinov V.v.
      • Rossmann M.G.
      噬菌体T4底板的三维结构。
      ,
      • Fokine A.
      • Kostyuchenko V.A.
      • efimov a.v.
      • Kurochkina L.P.
      • Sykilinda N.N.
      • 罗本J.
      • Volckaert G.
      • 亨孟A.
      • Chipman P.R.
      • Battisti A.J.
      • Rossmann M.G.
      • Mesyanzhinov V.v.
      噬菌体φKz头的三维冷冻电子显微镜结构。
      )。在噬菌体基因组学中,存在一种令人困惑的不同基因组的特征。生物化学或遗传数据仅适用于几个原型噬菌体。新噬菌体基因组的大部分表征是通过与其他噬菌体的序列比较来源的。这一事实使得噬菌体分配成十几个或更多群体的噬菌体基因的杂交差异大于细胞基因的差异(
      • Server P.
      • Hayes S.J.
      • Zaman S.
      • 避免K.
      • Rolando M.
      • Hardies S.C.
      改善了欠采样噬菌体的分离:寻找远处末端酶基因。
      )。因此,噬菌体到噬菌体序列比较通常在最先进的配置方法的限制之外或超出。然而,仍然可以通过观察结构同源性和寻求新噬菌体形式和建立原型之间类似的特征来建立新病毒的生物学来实现进展。最丰富的噬菌体是尾噬菌体,以及它们在序列层面表征的最分歧和挑战是巨大的噬菌体 假单胞菌 (φKZ (
      • Mesyanzhinov V.v.
      • 罗本J.
      • Grymonprez B.
      • Kostyuchenko V.A.
      • Bourkaltseva M.V.
      • Sykilinda N.N.
      • Krylov V.N.
      • Volckaert G.
      噬菌体φKz的基因组。
      ),el(
      • Hertveldt K.
      • Lavigne R.
      • Pleteneva E.
      • Sernova N.
      • Kurochkina L.
      • Korchevskii R.
      • 罗本J.
      • Mesyanzhinov V.
      • Krylov V.N.
      • Volckaert G.
      基因组比较 假单胞菌铜绿假单胞菌 large phages.
      ),和201φ2-1(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )))。该组内的序列比较能够对准201φ2-1和φKz之间的许多基因,反映其分配给单独的噬菌体属(
      • Lavigne R.
      • 达斯佩
      • 夏天e.j.
      • Seto D.
      • Mahadevan P.
      • Nilsson A.S.
      • Ackermann H.W.
      • Kropinski上午
      分类 myoviridae. 使用蛋白质序列相似性的噬菌体。
      )。虽然第三噬菌体中的许多基因,EL是对φKZ状噬菌体的基因可检测到的同源,但其他其他具有低相似性,使得分配同源性可疑(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )。这一三个噬菌体组尚未给出分类名称,因此我们将它们称为“φKz相关”噬菌体。在该组的特征噬菌体中存在任何原型,主要由φKz病毒群岛的物理特征源于φKz病毒群岛的物理表征(
      • Fokine A.
      • Kostyuchenko V.A.
      • efimov a.v.
      • Kurochkina L.P.
      • Sykilinda N.N.
      • 罗本J.
      • Volckaert G.
      • 亨孟A.
      • Chipman P.R.
      • Battisti A.J.
      • Rossmann M.G.
      • Mesyanzhinov V.v.
      噬菌体φKz头的三维冷冻电子显微镜结构。
      )。
      冷冻电子显微镜(Cryo-EM)
      使用的缩写是:
      Cryo-Em.
      冷冻电子显微镜
      隐藏的马尔可夫模型
      SC.
      频谱计数
      多维蛋白质识别技术
      GP.
      基因产品
      SD.
      稳定域。
      1使用的缩写是:Cryo-Em.
      冷冻电子显微镜
      隐藏的马尔可夫模型
      SC.
      频谱计数
      多维蛋白质识别技术
      GP.
      基因产品
      SD.
      稳定域。
      对φKz病毒群岛的研究表明衣壳壳的远处结构相似性与原型肠杆菌噬菌体噬菌体T4(
      • Fokine A.
      • Kostyuchenko V.A.
      • efimov a.v.
      • Kurochkina L.P.
      • Sykilinda N.N.
      • 罗本J.
      • Volckaert G.
      • 亨孟A.
      • Chipman P.R.
      • Battisti A.J.
      • Rossmann M.G.
      • Mesyanzhinov V.v.
      噬菌体φKz头的三维冷冻电子显微镜结构。
      )和所有三个φKz相关噬菌体的电子显微镜研究显示了一种复杂的收缩尾,T4也是结构范式。然而,φKz相关噬菌体比T4或任何其他特征噬菌体具有更复杂的病毒群。在φKz的无尾突突突突突中,30个蛋白已编目(
      • LECOUTERE E.
      • Ceyssens P.J.
      • Miroshnikov K.A.
      • Mesyanzhinov V.v.
      • Krylov V.N.
      • Noben J.P.
      • 罗本J.
      • Hertveldt K.
      • Volckaert G.
      • Lavigne R.
      φKz和埃尔,两个巨型结构蛋白质的鉴定与比较分析 假单胞菌铜绿假单胞菌 bacteriophages.
      )与形成T4头的13个蛋白质相反(
      • 黑色L.W.
      • 表演e M.K.
      T4头的形态发生。
      )。我们以前的噬菌体MS研究噬菌体201φ2-1鉴定了至少九个蛋白质,其显然被从其初始翻译产品中切割成较小尺寸。这也类似于T4,表达噬菌体蛋白质,支架蛋白质,顶点蛋白和七种其他蛋白质,包括本身,包括本身,包括本身的蛋白酶(
      • 黑色L.W.
      • 表演e M.K.
      T4头的形态发生。
      )。在感染过程中注入四种加工的T4蛋白质(
      • 黑色L.W.
      • 表演e M.K.
      T4头的形态发生。
      ,
      • 黑色L.W.
      • 表演e M.K.
      • 史蒂文A.C.
      T4头的形态发生。
      )。 201φ2-1的病毒蛋白蛋白包括RNA聚合酶的亚基(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )。因此,似乎也可能注入φKZ相关噬菌体的至少一些加工蛋白质中。但是,我们的初始MS调查(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )不足以建立加工蛋白的成熟端,这是关键信息,例如,将蛋白质拟合到Cryo-Em电子密度图中,或用于定义蛋白质系列结构的畴边界,并且我们怀疑有额外的处理尚未被发现。因此,我们安装了对201φ2-1病毒赛的更广泛的研究,以完全定义其中存在的蛋白质。
      使病毒素蛋白的成熟端的任务复杂化是实现敌对环境中充满宿主细胞表达的其他蛋白酶的噬菌体成熟的噬菌体。与重组蛋白质制剂不同,噬菌体在缺乏细胞质应激响应蛋白酶的基因工程细菌中不产生噬菌体。此外,在细胞裂解之前不能添加蛋白酶抑制剂以保护病毒蛋白酶免受周质空间的许多蛋白酶,因为细胞内噬菌体成熟取决于蛋白酶作用。噬菌体已经进化以抵抗通用蛋白酶攻击,大多数病毒学家完全忽略了它们的噬菌体制剂的一般蛋白水解的可能性。例如,蛋白酶抑制剂永远不会包括在噬菌体制剂中,因为它们对细菌有毒,因此可能干扰噬菌体感染性。然而,当在此处进行了大量的质谱时,将一般蛋白水解的证据具有通过Prohead蛋白酶切割的证据。为了分离这些不同种类的切割,我们使用序列简谱方法来推断出每个切片中的每种蛋白质片段的PREAPHEAD蛋白酶和绘制的光谱计数(SCS)的切割位点特异性,以便在完全切割的位点和仅切割的位置来观察区分一小部分蛋白质。最后,gbrowse(
      • Stein L.D.
      • Mungall C.
      • 舒S.
      • ca
      • MANGONE M.
      • 答:
      • Nickerson E.
      • Stajich J.E.
      • 哈里斯T.W.
      • ARVA A.
      • 刘易斯S.
      通用基因组浏览器:模型生物系统数据库的构建块。
      )用于可视化序列覆盖并在关于相应基因的其他信息的上下文中沿着基因组坐标系绘制切割的段。通过这种组合方法,观察到的裂解图案提供了对这些噬菌体中的头部蛋白的可能功能的额外洞察。

      实验步骤

      如上所述产生噬菌体201φ2-1病毒酮制剂(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      ),包括在CSCL中使用步骤和浮力密度离心。 SDS-PAGE如上所述执行(
      • 托马斯J.A.
      • Hardies S.C.
      • Rolando M.
      • Hayes S.J.
      • 避免K.
      • 卡罗尔C.A.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      完全基因组序列和质谱分析高度多样化,非典型 Bacillus thuringiensis. phage 0305φ8–36.
      )除了噬菌体首先将噬菌体加热至75℃,然后用0.1μg/ ml dNase处理。进行初步实验以确定没有公开涂抹条纹图案的最大SDS凝胶蛋白负荷。噬菌体蛋白(离~1×10分离11 颗粒通过一维SDS-PAGE分馏,然后用Coomassie蓝色染色。用小心地手动将凝胶通道解剖到46片,以避免横切可见的Coomassie染色带。消化后 原位 通过胰蛋白酶(Promega),通过HPLC-ESI-TANDEM MS在Thermo Fisher LTQ上分析摘要,装有新的物镜PicoView 550纳米Pray界面。用Eksigent Nanolc Micro-HPLC系统完成消化的在线HPLC分离:柱,PicofritTM值 (新目标; 75-μm内径)用C包装至11厘米 18 吸附剂(Vydac 218ms;5μm,300埃);流动相A,0.5%乙酸(HAC),0.005%TFA;流动相B,90%乙腈,0.5%HAC,0.005%TFA;梯度,30分钟内2-42%B;流速,0.4μL/ min。 MS条件如下:ESI电压,2.9 kV; MS / MS,3的隔离窗口;相对碰撞能量,35%;扫描策略,调查扫描,然后获取测量扫描中七个最强烈离子的数据相关的CID光谱,以上设定阈值。动态排除用于重复计数为3和30秒的持续时间。吉祥物(Matrix Science,伦敦,英国)用于针对局部生成的201φ2-1蛋白质数据库搜索未解释的CID光谱(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )已与Swiss-Prot(51.6版)数据库连接,总计216,849个序列。将甲硫氨酸被认为是可变改性,选择Semitrypsin作为蛋白水解特异性。吉祥物搜索的质量公差为前体离子的1.0Da和片段离子的0.8Da。测定蛋白质识别的概率和X X的吉祥物结果的互相关性!串联由脚手架(Proteome Software,Inc.,Portland Or)完成。除非另有说明,否则95%的置信限制用于分配肽。
      从每个凝胶切片的摘要获得的串联MS结果被单独使用吉祥物搜索,并且数据文件被单独评估或组合成数据集以通过脚手架处理(“Mudpit”)。使用DNA Proteoiq(BioInquire,Athens,Ga)进行匹配的群众谱系匹配的质谱。 Spectrum Count配置文件由Microsoft Excel从从脚手架导出的频谱计数数据文件产生。对于更详细的SC凝胶分析,写入Perl脚本以处理脚手架编写的频谱报告,并产生类似格式的谱数数据文件,其特征在于属于基因产物的特定子区域的肽。该程序可以从S. C. Hardies获得。使用WebLogo生产裂解网站主题徽标(
      • 骗子G.E.
      • hon
      • Chandonia J.M.
      • Brenner S.E.
      WebLogo:序列徽标生成器。
      )。使用序列分析和建模系统的本地实现,准备了对应于徽标对齐的隐马尔可夫模型(HMM)(
      • Hughey R.
      • Krogh A.
      隐马尔可夫序列分析模型:基本方法的扩展与分析。
      ,
      • Karplus K.
      • 巴雷特C.
      • Hughey R.
      隐藏的马尔可夫模型检测远程蛋白质同源物。
      )使用先前信息来设置在关联的W0.5模型构建脚本中规定的图案中发生的新型残留的概率。由此产生的HMM被手动编辑以将移动概率设定为零,并且基于该残余物的观察到的不变性,将谷氨酸谷氨酸谷氨酸制成1。随着差距不允许,HMM评分算法基本上成为一个简单的简单匹配引擎,其分数与徽标可视化的配置文件的一致性。 gbrowse被描述如上所述(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      ,
      • Stein L.D.
      • Mungall C.
      • 舒S.
      • ca
      • MANGONE M.
      • 答:
      • Nickerson E.
      • Stajich J.E.
      • 哈里斯T.W.
      • ARVA A.
      • 刘易斯S.
      通用基因组浏览器:模型生物系统数据库的构建块。
      )。编写Perl脚本以读取脚手架频谱报告和序列分析和建模系统输出文件,并在Gbrowse内的肽覆盖和裂解图案作为序列特征。
      计算每个观察到的基因产物(GP)的SC /分子量,并按照描述的粗糙度指示剂(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )。在病毒夫中已知丰度的蛋白质表现出SC /分子量,如下:GP200(Capsid蛋白,1,570拷贝/病毒粒),31.4; GP30(护套,264份/病毒群岛),16.5;和卷尺/手机刺穿装置(三个拷贝/病毒群岛),1.2。假设来自不同蛋白质的SC的检测效率范围差异很大;因此,仅使用SC /分子量以推断,在1或更低的范围内具有SC /分子量的蛋白质可能出现在很少的拷贝中或甚至每维病中的一份拷贝中,以及具有SC /分子量的蛋白质超过10个可能存在于每个病毒中超过100份。结果通常与我们以前的研究一致(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )仅具有一项以前认为丰富的GP146的蛋白质,在目前的研究中明显低于该阈值。

      结果

      根据HPLC-ESI-MS / MS数据的分析,将14,643个质谱分配给1,567-2012-1胰蛋白胨。可以找到通过切片进行数据的分解 补充表1。从先前报告的那些中检测到13种额外的病毒蛋白相关蛋白质中的肽(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )。新观察到的病毒藻相关蛋白包括以下内容:GP4,GP71,GP118,GP122,GP127,GP161,GP249,GP270,GP272,GP355,GP383,GP406和GP429。这为201φ2-1至89提供了编码病毒素相关蛋白的基因总数。在与其未加工的分子量一致的切片中观察到所有先前未检测到的病毒蛋白,并且均发现相对低的SC /分子量,表明每个病毒群岛的低拷贝数。用于这些和其他未加工的病毒蛋白蛋白的标记为SC /分子量 补充表2。观察这些额外的低丰度蛋白是与允许检测更宽的蛋白质量的较宽动态范围的凝胶切片一致。因为这些新观察到的蛋白质显然存在于低丰度中,所以不能排除它们可能非特异性地吸收到病毒中。

       半型光谱和SC凝胶谱

      除了检测新的病毒蛋白外,还回收了大量额外的证据,以澄清已知病毒蛋白蛋白的切割模式。 Fig. 1 在MS分析之前,用标记在切片中的多肽物种在它们具有最大SC的情况下,显示凝胶的Coomassie染色的图像。每种多肽物种都表明 红色的 得出结论是根据下面讨论的分析进行后期裂解。 Fig. 2 说明了用于确定一种基因产物GP455已被裂解至三种成熟多肽的方法。在我们之前报道的实验中(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      ),GP455在SDS-PAGE凝胶上迁移,好像它只是其预测尺寸的一半,但在大部分蛋白质序列上都有肽的覆盖率。在此描述的实验中,鉴定了来自GP455的三种半型肽(Fig. 2B, 红色的),揭示GP455并不简单地切成两半。包括在处理模式中是从初始翻译产物中切割的小的N-末端片段(对应于残基20-151),并且两侧的小肽显然已经从病毒中除去。然而,有必要使用下面描述的方法来阐明该蛋白质的处理模式的其余部分。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1SD.S-Page 201φ2-1天病蛋白。 被MS消化和分析的切片的边界立即显示给 正确的 凝胶。每个病毒素蛋白在含有其最大SC的切片旁边列出。用于中列出的病毒蛋白蛋白 红色的,通过Prohead蛋白酶通过蛋白水解裂解改变多肽。在留在病毒群中的多个多肽段的情况下,这些细分已被注释 N, M, 或者 C 表示N末端,中间(如果存在)和C末端段。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2GP455蛋白水解加工分析。 A,sc凝胶概况。检测到的肽已被细分为覆盖所指示的残余物范围的N末端,中间和C末端区域。在其他切片或所示范围的其他切片中检测肽。 B,肽覆盖率。半型肽肽已显示 红色的。以上 绘图,前瞻性裂解位点的比特评分由 高度 A. 垂直箭头。一种 水平线 被绘制,划分被认为高得分的裂解图案,如文中所述,那些被认为是低得分的。两个裂解网站表示为“复制“通过域复制来源。 水平箭头 表示推断的GP455N,-M和-C多肽段。 C,φKZ同源物GP303的对应关系。 黑匣子 表示按爆炸检测到的相似性区域。 垂直箭头 表示前瞻性裂解图案的位数。这 细线 到了 剩下 是201φ2-1GP455中不存在的扩展N末端区域。这 连接器 两者之间 盒子 表示该区域相对于201φ2-1GP455删除。
      与我们之前的报告相比,当前研究中,从较大数量的噬菌体颗粒中分离蛋白质(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )允许自信地分配大量串联质谱。这使得可以将分配给凝胶切片上的每种蛋白质(SC)分配给肽的质谱数以形成稳健的凝胶曲线,揭示多肽的分布(Fig. 2A)。在较少的光谱或没有尝试计算每片的光谱数量的实验中,基因产品通常似乎在广泛的切片上涂抹。在这些情况下,很容易被愚弄,相信蛋白质的主要峰在与其全长翻译产品相对应的切片中迁移,当它实际上已经像较短的多肽一样迁移。结果,如上所述的N末端GP455片段,可以忽略内部切割。然而,通过在SC尺寸中检查具有显着深度的SC型材,对于每种多肽物种出现明显的峰值位置。具有从GP455的残留物20-151包含单独的多肽片段,因此从该范围绘制得如此 Fig. 2 (品红)。残留物20-151峰的分配的肽的数量与该N-末端区段(GP455N)的计算尺寸一致。来自GP455的另一个半结晶片段定义了在残余物180中开始的额外成熟多肽的末端。但是从180到C末端的多肽太大,不能在序列中该区域的GP455肽中迁移和下方。成立。将大致分为一半的区域并单独绘制相应的肽显示凝胶已解析中间(GP45M)和C末端(GP45C)段(Fig. 2A)。然而,没有分配半型肽以确切地指示哪些切割位点定义这两个段。

       裂解图案

      为了更恰好地理解GP455M和GP455C的末端和加工蛋白的其他其他情况以及类似的情况,有必要设计一种识别切割基质的方法。在GP455中检测到的三种半型肽在谷氨酸后表现出裂解。噬菌体T4序列蛋白酶在谷氨酸后切割主要的T4衣壳蛋白和其他蛋白质(
      • Schoenfeld T.
      • Liles M.
      • Wommack K.E.
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      功能性病毒性偏心组合和下一代分子工具。
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      通用基因组浏览器:模型生物系统数据库的构建块。
      )。相关噬菌体φKZ和EL的主要衣壳蛋白也在谷氨酸后裂解(
      • Mesyanzhinov V.v.
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      基因组比较 假单胞菌铜绿假单胞菌 large phages.
      )。在201φ2-1中检测到196°MATION蛋白(包括GP455)在谷氨酸后发出切割(表I.)。然而,由于201φ2-1蛋白质组中的谷氨酸残留物的丰富,仅考虑每种谷氨酸作为前瞻性蛋白酶切割位点,在进一步定义切割物种的末端并没有帮助。因此,通过检查建立的201φ2-1切割位点的对准来寻求更严格的促进蛋白酶基质。
      表I.通过检测半型肽测定的201φ2-1蛋白的切割位点
      GP.
      a 紧邻裂解前的保守谷氨酸的坐标。
      地点
      b 在半型片段中鉴定的序列下划线。
      148113isqe. 阿特拉
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      151166as 达格拉德
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      15513vste. DFAD.
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      155327空闲 ATAV.
      15860LSLE. atdq.
      193139格列勒 g
      23864iste. alsi
      24616IANE. SVSH.
      246128TSVE. EHSD
      246203asie. RYIE
      246258vsle. atgv.
      24750故事 nidp.
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      27161赶热 DHFD.
      274/3275vtfe. TYQD
      28015kgle. 萨达尔
      28072vsae. SATV.
      45520vsne. 达菲
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      455151PGME. HYNP
      455179伊恩岛 峡谷
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      a 紧邻裂解前的保守谷氨酸的坐标。
      b 在半型片段中鉴定的序列下划线。
      c 肽分配了最低肽识别概率<根据脚手架95%。
      由19个半型肽定义的切割基序由序列标识表示 Fig. 3。缩放标识以揭示各个残基出现超出相同组成的随机序列的频率(
      • 骗子G.E.
      • hon
      • Chandonia J.M.
      • Brenner S.E.
      WebLogo:序列徽标生成器。
      )。 Fig. 3 表明除了在-1谷氨酸的要求之外,裂解位点的残基存在几种其他偏好。最突出的是,在-3的偏心侧链氨基酸偏好。除了给予蛋白酶的偏好的视觉印象之外,徽标也承担定量信息。根据定义,缩放徽标使得以随机序列中的一个列出的字母匹配的可能性是2的堆栈高度的功率(
      • Schneider T.D.
      • 斯蒂芬斯下午
      序列徽标:一种显示共识序列的新方法。
      )。将LOGO的高度从-5到+7求和给出总比特得分为11.5,在-1或7.7处计算谷氨酸,而不计算谷氨酸。这对应于每〜3,500个残基或每〜200个谷氨酸残留物的一个误报。这些数字表明有足够的信息可用于使用序列识别来帮助找到裂缝网站。实际搜索策略可以预期生产比这种理论极限更有误报,但理论限制为搜索策略设计提供了性能目标。我们能够实施下面描述的搜索策略,该搜索策略对于在训练集中不在训练集中的主题中的残留物具有一些灵活性,并且仍然限制为每1,200个残留物的误报。因为噬菌体蛋白质组中有大量谷氨酸,所以这种特异性仍然会产生许多假匹配。单独的主题匹配可能永远不会消除误报,因为在蛋白质的三级结构中获得前瞻性切割位点必须是一个因素。然而,通过将搜索限制在适当的位置,以解释各个多肽物种的SDS凝胶迁移率和与胰蛋白酶肽覆盖一致的区域,徽标中所体现的特异性足以让识别可能的裂解位点每种情况。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3代表通过检测半型肽证实的序列徽标,证实了通过检测肽的裂解位点.
      为了建立前瞻性裂解位点的概率评分策略,将徽标与位置-5至+7的对齐的裂解位点转化为HMM。 HMM用于搜索201φ2-1蛋白序列以与徽标的一致性。 GP455中的匹配站点的位数由 高度垂直箭头Fig. 2B。绘制了阈值(Fig. 2B, 水平线)将高分位点分开的位置,以解释来自较低评分位点的检测到的多肽,所述较低的分布位于随机分布。为了估计在高分度点的信心,确定由非病毒素201φ2-1蛋白的随机机会引起的高分位点的频率是确定已知处理的蛋白质中的高分位点的频率。高分位点在加工蛋白质(每200个残基)中往往呈6倍,而不是非病毒蛋白(每1,200个残基1)。从这些数字来看,序列的信心单独匹配,即高分度网站是正宗的裂解现场,可以设定为5/6或约80%。在GP455的情况下,两个站点所示 Fig. 2B 被称为成熟GP455M和GP455C多肽的界限。这表明这两个段之间存在内部肽,这些段也从病毒中取出。额外的高分性乳化术主题发生在该前瞻性铅化的中间。在前瞻性渗入肽中的高分分解位点的聚类是加工已经过的201φ2-1基因(未示出)中的常见发生。因此,我们假设这些网站也被切割。生物重要性可能是网站中的冗余确保发生重要的裂解或切割较小碎片的漏洞有助于他们清除病毒群岛。对于主要衣壳蛋白,给出了聚类裂解基序的非均相切割的证据。
      图形in. Fig. 2B 是来自动态Gbrowse显示的快照,我们能够通过MS结果将其他分析信息进行整理。 Fig. 2C 显示φKZ同源物KZ GP303和201φ2-1GP455的比较。这种比较以几种方式强化了切割网站预测。 φKZ有两个BLASTP相似性,到201φ2-1GP455( Fig. 3C, 黑匣子)对应于GP455的投影成熟N和M个段。预测高分切割基序是针对φKZGP303的N段和M段的开头的预测,尽管似乎已经删除了肽分离段N和M. φKzGP303读数框架在预计201φ2-1中投影的网站上投射的网站。这支持结论,GP455M的投影C末端在自包含蛋白质结构域的末尾。即使它包含在训练集中不存在的位置-2中含有残留物(Gly),则投射的切割网站也均得出良好的速度。概率评分方法可以允许匹配位置的累积比特评分以通过这种方式抑制不匹配的位置。在没有这种特性的情况下,不可能将弱优选的残基纳入图案描述中。使用PSI-BlastφKzGP303 C末端段与GP455M和GP455C段匹配。这表明GP455的M和C段由域重复导出。因此,由HMM搜索GP45C段开始的网站对GP455M段开始通过半型肽数据确认的网站同源。
      在某些情况下,与已建立的201φ2-1切割对准的φKz序列并不符合裂解图案,而是附近有一个新的高分辨率图案。两个分解GP455N的切割和φKZGP303中的同源区域是这种效果的例子。我们怀疑冗余的裂解网站经常在进化期间进入并允许在确切的裂解位置漂移,同时节省整个处理模式。

       程序处理中的异质性

      主要的衣壳GP200,GP200是201φ2-1蛋白,具有关于蛋白水解加工的最先进的知识。 GP200是φKZ的主要衣壳蛋白的同源蛋白,Edman降解已识别出何首的蛋白酶加工位点(
      • Mesyanzhinov V.v.
      • 罗本J.
      • Grymonprez B.
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      噬菌体φKz的基因组。
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      • Hertveldt K.
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      • Volckaert G.
      基因组比较 假单胞菌铜绿假单胞菌 large phages.
      )。观察到没有半结晶光谱,以指示Prohead蛋白酶切割位点位于201φ2-1GP200中的位置。通常与φKZ和EL一致,高SC的GP200胰蛋白肽位于同源前瞻性裂解位点下游。例如,在组合的Mudpit数据集中检测到在残留物质161处定位在残留物161的前瞻性裂解下游的第一肽45次(Fig. 4)。然而,在残留物161的上游存在两种分配的肽(检测到一次),其将肽覆盖范围延伸至残留物135.这些结果将是一致的,其中大多数成熟GP200分子在162处开始的情况,类似于案例φKz和el,具有延伸上游的一小部分成熟衣壳多肽。通过裂解基序嗯,通过识别尺寸131和161来支持该假设作为裂解基术肝脏的高分性切割基序。同样,这两个站点被保守为φKZ的高分位点。尽管在该区域中,EL序列不客观地进行,但是在已建立的成熟端的上游序列也是高分性切割基序。我们提出该职位131和161是冗余的解理站点,以确保此关键成熟事件完成。在少数少数少数分子中,序列蛋白酶错过161的切割,导致延伸到残余物132的多肽。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4主要胶囊蛋白的异质加工。 给出了切片10内分配的胰蛋白肽的谱计数 以上 GP200序列。对于VVTVGYNLAAS列出的45计数包括具有额外残留物的肽的20个光谱 剩下 或者 正确的 由于错过了胰蛋白酶裂解。残留号码是指GP200。高评分乳沟主题是 红色的。残留物之后,胰蛋白酶应该在GP200中切割 蓝色的。 Edman Ligradation建立了φKZGP120和EL GP78的指示位置的裂解(
      • Mesyanzhinov V.v.
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      基因组比较 假单胞菌铜绿假单胞菌 large phages.
      )。
      通过终止剂抑制产生的C末端延伸形式的主要衣壳蛋白的C末端发现了二均匀性的第二个元素。虽然初始基因预测未指示该地区的阅读框架(
      • 托马斯J.A.
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      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      ),Tblastn检测到与φKZ基因组的序列相似度超过GP200和φKZGP120 C Termini并进入没有其他分配的功能的基因组区域。要寻求任何错过的翻译区域,搜索所有获得的质量谱 相对 所有六个框架中的所有201φ2-1序列都翻译。这导致检测分配给衣壳止芯下游编码的三种肽的10个光谱。通过切片的那些10光谱的图揭示了主要衣壳蛋白(未示出)上方的一切片上方的一切片。在这种凝胶位置表明肽属于GP200的扩展版本,并且不是独立的翻译启动的产物。通过框架的C末端延伸是一种已知的策略,用于用额外的外部领域装饰一分的主要衣壳蛋白(
      • 露关灯B.G.
      • 阿特金斯J.F.
      • 格言r.f.
      在噬菌体T7的基因10中越来越粉碎。
      )。在GP200中,扩展由29个残差组成,由终结器读取而不是编程的框架生成。

       主要胶囊蛋白暴露区域中的部分裂解

      主要衣壳蛋白的Sc凝胶谱(Fig. 5A)揭示了比与Prohead蛋白酶相互作用的更大的异质性。预计GP200将以1,560份/病毒赛(
      • 托马斯J.A.
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      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
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      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )远高于任何其他201φ2-1蛋白,并且是切片10中强带的主要组成部分(Fig. 1)。然而,在凝胶的所有切片中发现分配给GP200的光谱。 GP200的下凝胶SC型材表现出几个主要肩部,并且将许多质谱分配给半型肽肽。在HPLC中的携带不是对这些下凝胶涂片的解释,因为从凝胶的底部分析了切片消化。在除了除去N末端区域之外的主要毛囊蛋白没有蛋白质解冻蛋白质的先例,但是肩部是类似于在GP455中的单独峰值的单独峰值。如下所述,我们已经得出结论,这些肩部是由蛋白酶以外的蛋白酶切割GP200分子的分数而引起的。大多数病毒蛋白蛋白表达了SC的下凝胶涂片,许多呈现出不符合上面讨论的标准的半化谱,以进行促进蛋白酶加工。我们仔细探讨了所有蛋白质的所有模式,以区分这些其他种类的蛋白水解攻击从Prohead蛋白酶的作用。 GP200的结果在下面进一步讨论。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5加工GP200(主要衣壳蛋白)。 A,sc凝胶概况。蛋白质序列已被细分为以下区域:N(在稳定结构域之前),M(稳定结构域包括接头区域),C(稳定结构域之后)。 B,肽的序列覆盖率达到≥95%的置信度。半型肽显示在 红色的粉色的。这 粉色的 在切片10中迁移的肽,其将表明来自完整的GP200分子而不是来自切割物种的衍生。指出了各自切割产生的物种的片数 以下 序列覆盖图。 S17和S44是发现所示的半型肽的切片。对于每种裂解,可以推断出的GP200的剩余部分的切片数在旁边指示 虚线。如果完整的话,预计S17物种的推断伙伴将在切片30中,但其组分散落在切片37以下。S10仅由Prohead蛋白酶切割的GP200的切片数量。 C,GP200域的位置。核心结构域是与T4和HK97主要衣壳蛋白共同的那些,而SD结构域与T4共同,但不是HK97主要衣壳蛋白(
      • Fokine A.
      • 莱曼P.G.
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      噬菌体T4和HK97的衣壳蛋白胶囊蛋白之间的结构和功能相似度指向一个共同的祖先。
      )。 endo. 是指φKZ相关噬菌体特有的内窦癫痫域(
      • Fokine A.
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      • efimov a.v.
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      噬菌体φKz头的三维冷冻电子显微镜结构。
      )。 D,在GP200序列内的非ProShead蛋白酶切割的位置。
      GP200半型肽肽所示 Fig. 5B 可分为两类。第一类的半型肽(Fig. 5B, 粉色的)在完整蛋白迁移的切片10中被发现,其与在SDS-PAGE之前发生的推定裂解不一致。这些被认为是错误分配的光谱或非特异性胰蛋白酶裂解。这些都被信心分配了>脚手架95%。很明显,依赖于半结合光谱的高置信率分配,表明没有其他形式的粗化的裂解可能是误导性的。
      其他GP200半型肽(Fig. 5B, 红色的)各自出现在较低的切片中,与在推断的非胰蛋白酶切割位点结束的多肽的预期迁移一致。这些裂解发生在残留物79和位置201,205和217的簇中。这些位点处于称为稳定结构域的域的界限(SD; Fig. 5C)通过序列相似度识别到T4主要衣壳蛋白(
      • Fokine A.
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      • Rossmann M.G.
      噬菌体T4和HK97的衣壳蛋白胶囊蛋白之间的结构和功能相似度指向一个共同的祖先。
      )。 SD是与相邻衣壳蛋白接触的小型结构域,并通过长长的连接链条连接到其亲本衣壳蛋白,其在衣壳的外表面上悬垂。这些半型肽的存在表明在这些暴露的接头区域内发生了切割。残留物79的裂解似乎产生了切片44中发现的半型肽,并且在切片13中发现的主要肩部( Fig. 5A)。 201-217区域中的裂解似乎在切片17中产生峰值。如果完整的话,将在切片17中的物种中的n末端伴侣片段应出现在切片30中。相反,几乎完全来自n末端的肽区域散落在切片37以下,并且来自SD结构域本身的肽在切片10中的主峰之外相对稀缺。这导致了在SD区域中裂解一次的GP200分子再次裂解,然后一些GP200分子的分数完全丧失了SD域。为了从样品中物理丢失,SD域必须在CSCL梯度之前被移除,这意味着病毒赛可以在不释放其DNA的情况下维持一定程度的蛋白水解损伤。
      上面讨论的GP200中的裂解是在天冬氨酸(Fig. 5D),这些切割位点和序列之间的序列与Prohead蛋白酶基质之间没有关系。这表明另一种蛋白酶,可能是由宿主产生并且可能在裂解后作用,从外部袭击了病毒群。下凝胶“涂抹”表明,在异质的网站上存在裂解,而不仅仅在分配的半型肽所指示的那些位点。在将该分析扩展到丰富的病毒蛋白蛋白的其他分析中,天冬氨酸后裂解的偏好不是普遍的。然而,在其他蛋白质(未示出)中观察到在畴边界聚集在畴边界的异质位点处的倾向。非ProShead蛋白酶切割的定义性质是它们总是部分。在所有情况下,来自所有次区域的SC的主要峰位于完整的主要多肽的切片中。因此,每种病毒素蛋白的大部分根本不会通过非序列蛋白酶切割。我们认为,非先进的蛋白酶切割代表在其微环境中遇到蛋白酶对病毒群体造成的蛋白水解损伤。如“讨论”下扩大,我们认为,SC夸大了非序列蛋白酶裂解量,并且病毒中的大多数蛋白质以未损坏的形式存活。

      讨论

      从GP455和GP200的研究中衍生的原理应用于所有201φ2-1病毒蛋白蛋白,揭示了来自19种不同的初始翻译产品的29种加工的多肽(Fig. 6表二)。如对于GP455的“结果”所示,处理后的多肽片段的分配基于两个标准的组合:1)来自基因产物的子区域的胰蛋白酶肽的SC凝胶谱曲线在基因产物的子区域中表现出与段一致的切片中的峰值较低的分子量小于全尺寸基因产物和2)所需的产生这样的段的裂解可以基于对半肽肽的观察或与Prohead蛋白酶切割基序的匹配进行匹配来合理。我们认为,这种切割作用的方法显着更准确,而不能与凝胶迁移的表观分子量的肽覆盖相关。主题匹配标准使我们在许多情况下拒绝处理假设,其中基因产物缺少末端缺乏肽覆盖率。这些地区通常缺乏或非常富含精氨酸和赖氨酸,解释为什么它们对胰蛋白酶生成的肽MS对其进行差。 46切片凝胶的较高的分子量分辨率比一个人对拒绝多肽被切割成较小物种的假设的预期较低。分子量的曲线 相对 所有未处理多肽的峰值切片数量显示出相对于回归线(未示出)的两片的可变性。因此,仅依赖于单独的凝胶迁移率以预测除去缺乏胰蛋白酶肽覆盖率的区域可以容易地产生许多不正确的蛋白水解加工指示。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6201φ2-1基因组编码加工病毒素蛋白的区域。 从201φ2-1的完整Gbrowse显示的基因组段被并置,蛋白质特征映射到相应的基因上。 绿色箭头,由质谱法检测的蛋白质; 深绿色箭头,测定的病毒蛋白蛋白质(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      ); 对角条纹绿色箭头,在本研究中新检测的病毒性相关蛋白质; 橙色概述箭头,发现φKZ同源物中的蛋白质存在于尾部突变体中(
      • LECOUTERE E.
      • Ceyssens P.J.
      • Miroshnikov K.A.
      • Mesyanzhinov V.v.
      • Krylov V.N.
      • Noben J.P.
      • 罗本J.
      • Hertveldt K.
      • Volckaert G.
      • Lavigne R.
      φKz和埃尔,两个巨型结构蛋白质的鉴定与比较分析 假单胞菌铜绿假单胞菌 bacteriophages.
      ); 灰色箭头,非病毒蛋白; 紫色水平栏,在几种201φ2-1蛋白中发现的序列同源区域; 红色水平栏,每10个残基具有大于一个净负电荷的区域; 粉红色的水平栏,每20个残基具有大于一个净负电荷的区域。肽覆盖率表示如下 盒装 地区 以下 每个基因术语: 绿色,胰蛋白肽覆盖率; 红色的,半型肽。 三角形上面 肽覆盖率 盒子 表明Prohead蛋白酶切割位点: 深蓝,由半型肽建立; 青色,由图案搜索预测。 薄黑色箭头下面 肽覆盖率 盒子 对应于成熟多肽和相应的切片数的位置。 GP155N显示了两个替代解释。 rnap.,RNA聚合酶。
      表二201φ2-1病毒蛋白的Prohead蛋白酶加工段
      GP.
      a 当在病毒粒中检测到基因产物的多于一个基因产物时,基因产物名称含有N(对于N-末端),M(对于中间),或C(对于C末端)。 GP155N和GP155NA是N-Terminal GP155段的替代解释(参见文本)。
      残余物分子mass
      b 从序列计算分子量。
      SC.
      c SC.总结了所有切片。 GP280n的峰可以脱落凝胶的底部。
      SC. /分子量
      d 根据REF计算SC /分子量值作为每维病毒素的丰度的粗糙指示剂。
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      。基于主要衣壳蛋白,鞘蛋白和卷尺蛋白的值的比较,SC /分子量超过10的值可能代表每维病的100多分子。
      开始停止
      kda.
      14825114
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      414(c)
      f 附加坐标(c),用于停止密码子定义的结尾。
      34.91343.8
      151N45111211.9917.6
      151C28167
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      400(c)26.42629.9
      1541780426(c)40.3461.1
      155N2714
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      27527.8672.4
      155Na2714
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      13913.1675.1
      155C25328
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      608(c)30.737812.3
      156N46861578.0232.9
      156C28158387(c)25.51355.3
      15724208489(c)31.42257.2
      1582461
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      378(c)34.9481.4
      15925631922(c)31.336911.8
      19328140
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      381(c)27.247217.4
      20010162746(c)65.1204531.4
      214N33120822.9231.0
      214C9217917(c)78.6640.8
      2382765
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      316(c)28.61655.8
      246N3217
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      128
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      11.7958.1
      246M43129203
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      7.8354.5
      246C17258
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      613(c)38.776119.7
      2472151
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      397(c)38.81914.9
      26829122524.7994.0
      2711061
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      629(c)63.63966.2
      274/3N251275
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      32.5351.1
      274/3C42761500(c)137.23272.4
      280N4616
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      726.1>7>1.1
      280C4073
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      199(c)13.51007.4
      455N40, 4121
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      151
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      15.0171.1
      455M26180
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      45330.7441.4
      455C28521768(c)28.51405.3
      a 当在病毒粒中检测到基因产物的多于一个基因产物时,基因产物名称含有N(对于N-末端),M(对于中间),或C(对于C末端)。 GP155N和GP155NA是N-Terminal GP155段的替代解释(参见文本)。
      b 从序列计算分子量。
      c SC.总结了所有切片。 GP280n的峰可以脱落凝胶的底部。
      d 根据REF计算SC /分子量值作为每维病毒素的丰度的粗糙指示剂。
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      。基于主要衣壳蛋白,鞘蛋白和卷尺蛋白的值的比较,SC /分子量超过10的值可能代表每维病的100多分子。
      e 通过半结晶谱证实。除表I中所述,半定义频谱分配高于95%的信心。
      f 附加坐标(c),用于停止密码子定义的结尾。
      因为我们使用SDS凝胶流动性来定义寻找前瞻性切割位点的地点,因此SDS凝胶迁移率的可变性是确定切割位点预测的置信度的因素。基于凝胶迁移和肽覆盖率的片段可能的端点的范围通常限于约30个残基。对于假阳性和假阴性预测的裂解预测模型的性质通常应该产生正确的预测,鉴于裂解位点在30个残留物中已知。然而,一些假预测是可能的,特别是,可能错过了小于30个残基的漏洞。裂解位点预测的强度主要来自由用于训练预测嗯的半编辑片段定义的大量站点。在具有较少加工蛋白质的噬菌体中,有必要在同源噬菌体中从蛋白质中汲取裂解位点以得出训练有素的模型。切割模型的最关键性质是假阳性预测的速率;因此,我们认为通过筛选噬菌体的所有非结构蛋白来表现的阴性对照,以确定该速率对于使用该策略至关重要。
      如GP200所示(参见“结果”),发现未发现非促进蛋白酶切割也产生下凝胶峰和肩部并产生半型肽肽。非序列蛋白酶切割容易与Prohead蛋白酶切割区分,因为它们是“部分”,其是来自整个蛋白质序列的大多数SC迁移,所述蛋白质序列与完整多肽迁移,而不是碎片化的多肽。此外,这些半晶体片段建议的切割不符合Prohead蛋白酶切割基序。我们认为一些主要的下凝胶峰和肩部可能是通过在低评分裂解基序的Prohead蛋白酶中衍生自部分切割的可能性。然而,我们可以发现由下凝胶峰和肩部表示的片段的表观尺寸与低得分图案的位置之间没有相关性。相反,如GP200详细描述的(参见“结果”),下凝胶材料似乎与可能由病毒不编码的其他蛋白酶的部分蛋白分解一致。一定程度的一般蛋白水解几乎没有令人惊讶,因为病毒在裂解中释放成周质蛋白酶的汤。 PELIPLASM是细菌的消化室,其中蛋白质降解到氨基酸中以输送到细胞中。
      在该研究中,广义蛋白水解的模式形成了必须区分序列蛋白酶切割的背景。对于主要衣壳蛋白,这些切割的图案与蛋白质的域结构和暴露表面相关。人们可以设计一个实验,以利用这些信息来阐明其构象不知道的病毒蛋白蛋白的结构;它也可以用于研究环境中病毒群的灭活。在这种研究中,应在病毒制剂的浮力密度步骤开始使用蛋白酶抑制剂。该步骤将完整的病毒与空头分开,这将逻辑上携带不同的裂解模式。蛋白酶抑制剂将防止随后的空头发育,其可以通过仍然来自细胞裂解物污染的蛋白酶作用。我们探讨了GP200 SC是否迁移其主峰的凝胶(Fig. 5A)可能对应于我们病毒制剂中降解病毒的一部分。低丰度切片中的Coomassie染色比例 相对 强烈染色的切片10(Fig. 1)远小于同一切片中的总SC的比例(未示出)。因此,我们认为纯化后,病毒制剂在纯化后没有显着降解,而是对采样低丰度多肽物种的谱计数不成比例地敏感。使用动态排除可能是这种效果的主要贡献者。
      除了SC凝胶谱和末端由半凝胶肽或匹配的术语分配,或者与Prohead蛋白酶切割基序的匹配的相关性出现明显的,除了在GP155和GP246的N-末端区域中映射的肽片段。 GP246N的两端由半型肽定义,但在与多肽具有更大的分子量的切片中发现了肽。这种差异的原因在使用肽覆盖率与肽覆盖率相关的其他性质(Fig. 6)。相关特征是高负电荷的内容(IE。 高浓度的酸性残基)表示 红色的 或者 粉红色的酒吧Fig. 6。搜索这种模式的激励是可能的机械蛋白质(见下文)。已知高负电荷的多肽在SDS-PAGE中表现出异常缓慢的迁移(
      • MATAGNE A.
      • 乔根里B.
      • 福雷赫..
      通过羧基化学改性校正SDS / PAGE期间蛋白质的异常行为。
      )。 GP264N每10个残留物的净负电荷大于一个,因此解释了其缓慢的迁移。通过认识到,201φ2-1病毒素蛋白内的许多其他区域是高度酸性的,我们检查了那些可能被类似的缓慢迁移现象误导的分配区域。 GP155N发生另一个可能的病例。肽覆盖范围仅限于一个小负电荷区域。存在具有与正常SDS凝胶迁移一致的GP155N多肽的蛋白酶基序。但是,如果片段大致迁移像GP246N一样,则存在不同的C末端蛋白酶基质,其可以产生较小的片段并且仍然包括所有观察到的肽。这两种可能性都在 Fig. 6.

       了解201φ2-1蛋白质处理的功能

      如果由Prohead蛋白酶加工的全部201φ2-1蛋白涉及头部成熟,则这些蛋白质与φKZ同源物之间的对应关系在无尾部突变体中检测到(Fig. 6,基因 橙色轮廓和参考。
      • LECOUTERE E.
      • Ceyssens P.J.
      • Miroshnikov K.A.
      • Mesyanzhinov V.v.
      • Krylov V.N.
      • Noben J.P.
      • 罗本J.
      • Hertveldt K.
      • Volckaert G.
      • Lavigne R.
      φKz和埃尔,两个巨型结构蛋白质的鉴定与比较分析 假单胞菌铜绿假单胞菌 bacteriophages.
      )。虽然没有完整,但这两套基因产品之间的协议存在合理。对于其中一个加工的201φ2-1蛋白,GP193,φKz根本没有类似的序列。然而,处理过的201φ2-1蛋白,具有φKZ同源物,其未出现在无尾部突变数据中。虽然除了尾巴蛋白外,无尾突变体缺少一些头部蛋白,但我们认为这不是这种情况。从φKZ尾部突变数据(GP154,GP158,GP214,GP238和GP280)中缺少其同源物的2010φ2-1蛋白在201φ2-1病毒中具有低丰度,并且它们的φKZ同源物的丰度可能如下摩西检测阈值在尾部突变体分析中。我们觉得在与其他φKz相关噬菌体中,头部蛋白质可能类似地加工。在检查同源φKZ蛋白的序列时,我们发现大约一半的裂解位点在同源位置具有高分性切割基序,而其他物质在附近(未示出)具有高分分解基序。因此,我们认为φKZ相关的噬菌体作为组具有前所未有的加工头蛋白,并且这遵循前所未有的头部蛋白总数。电子显微镜 (
      • Krylov V.N.
      • smirnova t.a.
      • Minenkova I.B.
      • Plotnikova t.g.
      • Zhazikov I.Z.
      • Khrenova E.A.
      假单胞菌 噬菌体φKz含有衣壳中的内体。
      )原子力显微镜(
      • Matsko N.
      • Klinov D.
      • Manykin A.
      • demin五。
      • Klimenko S.
      噬菌体φKZ和T4的原子力显微镜分析。
      )和cryo-em(
      • Fokine A.
      • Kostyuchenko V.A.
      • efimov a.v.
      • Kurochkina L.P.
      • Sykilinda N.N.
      • 罗本J.
      • Volckaert G.
      • 亨孟A.
      • Chipman P.R.
      • Battisti A.J.
      • Rossmann M.G.
      • Mesyanzhinov V.v.
      噬菌体φKz头的三维冷冻电子显微镜结构。
      )研究表明,φKZ状噬菌体具有内部头部主体,其应考虑至少一些头部蛋白质。目前尚不清楚内体是否在组织衣壳中起结构作用,或者代表制备用于注射到细胞中的蛋白质的推注。然而,曾经认为只有噬菌体DNA进入感染的细胞,现在据赞赏,许多噬菌体也引入蛋白质(
      • Molineux I.J.
      从Hershey和Chase以来五十三年;关于压力的大量ADO但它是哪种压力?
      )。
      在T4头蛋白的研究中(
      • Mullaney J.M.
      • 黑色L.W.
      衣壳靶向序列将异物靶向噬菌体T4并允许蛋白水解加工。
      )发现N-末端渗漏肽通常含有衣壳靶向序列,该序列负责将蛋白质组装成序列。随后的去除这些渗漏苷使蛋白质注射到细胞中。虽然我们尚未识别衣壳定位序列,但是具有铅化肽的头部蛋白质的丰度表明,类似的装配原理在φKZ相关噬菌体中工作。我们对噬菌体201φ2-1的初始表征表明,病毒赛含有RNA聚合酶的几个亚基(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
      • Belnap D.M.
      • Weintraub S.T.
      • Server P.
      • Hardies S.C.
      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      )。其中一个亚基(Fig. 6现在已经发现GP274 / 3)已经被发现处理,与使用允许达到内部头部位置的一致。然而,其他病毒型相关的201φ2-1RNA聚合酶亚基(GP139和GP275)似乎没有漏斗。因此,可能存在多种方式来将蛋白质组装成201φ2-1的头部及其相关噬菌体。

       头部和尾部组件之间的连接

      201φ2-1和φKZ之间存在蛋白水解过程的一个主要差异。 Edman降解的结果表明,加工包括尾溶菌结构域的φKZGP181蛋白(
      • Mesyanzhinov V.v.
      • 罗本J.
      • Grymonprez B.
      • Kostyuchenko V.A.
      • Bourkaltseva M.V.
      • Sykilinda N.N.
      • Krylov V.N.
      • Volckaert G.
      噬菌体φKz的基因组。
      );然而,我们发现没有证据处理201φ2-1同源物(GP276)。尾部溶菌酶位于尾部的末端,其远离头部。在激活之前,促进蛋白酶被局限于头部,然后蛋白水解灭活本身,并且在成熟期间大部分留下头部(
      • 表演e M.K.
      • Isobe E.
      • Onorato L.
      噬菌体T4预热蛋白酶。 II它从基因21产物和页面感染细胞中的调节裂解。
      )。预测蛋白酶活性可能必须紧密限制在头部,因为泄漏到细胞质中并在组装之前切割其他头蛋白将停止组装过程。然而,我们发现尾蛋白φKZGP181的裂解位点是与Prohead蛋白酶加工基序(未示出)的高分匹配,这意味着它被Prohead蛋白酶切割。这似乎要求φkzgp181与头部粘定的关联。我们相信这正是发生的事情。两个噬菌体中尾蛋白的溶菌酶结构域只占极大蛋白质的一小部分C末端。我们将其余的KZ GP181和其同源物分配给卷尺,延伸尾部的长度。该任务不仅支持KZ GP181的大小,而且支持预测α螺旋和盘绕线圈结构的显着内容,卷尺蛋白的特征(
      • Katsura I.
      蛋白质尺寸测定蛋白质尺的抑菌λ尾长。
      ,
      • 卡尔干S.
      • Hendrix R.
      DSDNA噬菌体组件中的控制机制。
      )。据报道了几种其他噬菌体的尾溶滤网与卷尺(
      • Crutz-Le Coq A.M.
      • 鹿蛋白B.
      • Commissaire J.
      • ANBA J.
      乳球菌噬菌体Bil170的序列分析:乳制品中的结构蛋白和HNH内切核酸酶的见解。
      ,
      • Piuri M.
      • HATFULL G.F.
      肽聚糖水解酶MOTIF在皮杆菌中TM4卷尺蛋白质促进了静止相细胞的有效感染。
      )。 φKzGP181中的裂解位点靠近卷尺的N末端,该磁带测量域的N末端必须在组装的最后阶段接近头部。因此,我们提出φKz尾溶菌酶/卷尺蛋白的切割在尾部附件到柱头期间发生。

       头部结构基因的聚类

      表征具有许多新基因的新噬菌体基因组的一种策略是使用可用于将新基因组织成功能簇的任何线索。底层常见功能的基因经常在噬菌体基因组中簇簇。对聚类的通常解释是共同运作在一起的基因在一起以及在水平转移方案下聚集在一起以聚集在一起。 φKZ相关的噬菌体缺少许多尾部噬菌体的单一全球头结构基因组织(
      • 卡尔干S.
      前瞻性和细菌基因组:到目前为止,我们学到了什么?
      )。然而, Fig. 6 揭示了201φ2-1的头部结构基因,包括通过检测序列蛋白酶处理或通过在尾部突变体中存在φKZ同源物的检测来推断的那些。其中,在φKz中找不到GP193的同源物(
      • 托马斯J.A.
      • Rolando M.R.
      • 卡罗尔C.A.
      • 沉P.S.
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      表征 假单胞菌 allororaphis. MyoVirus201φ2-1通过基因组测序,质谱和电子显微镜。
      ),在相关噬菌体EL中没有发现含有GP243-249和GP452-456的簇。因此,这些区域内的基因可以被认为是编码辅助功能而不是参与φKZ相关噬菌体的保守头组件程序的蛋白质。在编码具有广泛带负电的N-末端肽的蛋白质的基因中富集最大剩余簇(GP154,GP155,GP156,GP157,GP158和GP159)。这种特性是典型的支架蛋白质。这些前肽还具有预测的卷线圈状结构的斑块,这也是支架蛋白的特征。因此,支架功能可以由这些蛋白质中的一种或多种进行。其中,GP155和GP159的部分仍然存在于衣壳中相对丰富(表二)。在Prohe头中存在的肽量也适合执行支架功能也是丰富的。

       概括

      目前的研究对推动201φ2-1头蛋白的功能进行了重要一步。仍有许多工作要做。定义成熟多肽辅助剂,使蛋白质谱和隐马尔可夫模型进行更好的蛋白质谱。预期几种已知蛋白质的同源物在φKZ相关的头部内,最终应通过这些方法确定可确定。这些包括鉴定门耳蛋白,其余的RNA聚合酶亚基,以及蛋白酶本身。 Cryo-EM估计了构成φKz衣壳顶点的几个域的群众(
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      )。已知这些蛋白质存在于55份/病毒中。因此,定义成熟多肽和更好的拷贝数估计的组合应允许分配顶点蛋白质。一组有趣的基因是GP154,GP155,GP156,GP157,GP246和GP247。这些基因的成熟段彼此同源,尽管需要型材方法来产生对准(Fig. 6, 紫色酒吧)。我们已经将这些域和他们的同源物与其他相关的噬菌体一致并将家族提交给PFAM蛋白质数据库(PF12699)。此时,该配置文件与任何其他序列不匹配。然而,随着额外的基因组和肌蛋白被测序并扫描PFAM,我们预计将发现额外的同源物有助于阐明这种新型基因家族的性质。最后,噬菌体噬菌体201φ2-1中的现在建立的处理模式可用于预测在与其他φKZ相关噬菌体中形成的成熟多肽。

      致谢

      MS分析是在San Antonio(Uthscsa)机构质谱实验室的德克萨斯州卫生科学中心大学进行。我们承认EFREM HOLLELE协助为GP155家族产生PFAM条目。我们感谢Uthscsa Bioinfinformatics Center协助项目的计算方面。

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