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用于电子转移解离的锻造型锻体质谱仪的高通量蛋白质组学的副部分前体和产品质量精度。

      我们展示了一种新的电子转移解离的线性离子阱 - 横梁混合质谱仪的内部质量校准方法。荧蒽阳离子,用于产生电子转移解离试剂阴离子的反应的副产物,在所有orbitrap批量分析事件中与分析物阳离子共注出。荧光阳离子用作稳健的内部校准物,对扫描时间的影响最小(<20毫秒)或光谱质量。在外部质量校准之后,在~136h(近6天)的过程中收集60个复制的LC-MS / MS在〜136小时(近6天)的过程中。仅使用标准外部质量校准,典型分析的质量精度为-3.31±0.93ppm(σ),用于产品的-2.32±0.89ppm。施加内部重新校准后,质量精度改善至+ 0.77±0.71ppm的前体,产品+0.17±0.67ppm。当所有60个复制运行在没有内部质量重新校准的情况下一起分析时,对产品的前体和-1.23±1.54ppm为-1.23±1.54ppm,对于产品而言,相对于单独的运行,精确度几乎2倍。内部质量重新校准后,适用于+ 0.80±0.70ppm,产​​品+0.16±0.67ppm,大致相当于单一运行中获得的,展示了近乎完全消除质量校准漂移。
      质量准确度是质谱仪性能最基本的参数之一(
      • Zubarev R.
      论蛋白质组学中的大规模准确性的正确使用。
      )。 Hybrid Linear离子陷阱变换质谱仪的首次亮相(
      • Syka J.E.
      • 玛托J.A.
      • 白D.L.
      • 角horn
      • Senko M.W.
      • Schwartz J.C.
      • Ueberheide B.
      • 加西亚B.
      • 母猪S.
      • 默特雷特T.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      新型线性四极离子阱/ FT质谱仪:性能表征和在组蛋白H3后翻译后修饰的比较分析。
      ,
      • Makarov A.
      • Denisov E.
      • KHOLOMEEV A.
      • Balschun W.
      • lange O.
      • strupat K.
      • 角horn
      混合线性离子阱/绕组质谱仪的性能评价。
      )2004年是该领域的主要进步,因为肽前体群体可以常规地以低零件的准确性测量。这种介绍与自动增益控制不巧合配对,能够大致控制质量分析仪中的离子电荷的数量,这最大限度地减少了空间电荷效应(
      • Jeffries J.B.
      • Barlow S.E.
      • 邓恩G.H.
      离子 - 回旋谐振频率的空间电荷偏移理论。
      ,
      • Francl T.J.
      • 谢尔曼米。
      • 猎人R.L.
      • Locke M.J.
      • 鞠躬w.d.
      • Mciver R.T.
      实验测定空间电荷对离子回旋谐振频率的影响。
      ,
      • Ledford Jr.,E.B.
      • Rempel D.L.
      • 毛利。
      傅立叶变换质谱中的空间电荷效应。质量校准。
      ,
      • Easterling M.L.
      • mize t.h.
      • Amster I.J.
      常规部分的高群IONS每百万质量准确度:MALDI FT-ICR中的空间电荷效应。
      )并且允许傅里叶变换质谱仪以其全部电位执行(
      • Syka J.E.
      • 玛托J.A.
      • 白D.L.
      • 角horn
      • Senko M.W.
      • Schwartz J.C.
      • Ueberheide B.
      • 加西亚B.
      • 母猪S.
      • 默特雷特T.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      新型线性四极离子阱/ FT质谱仪:性能表征和在组蛋白H3后翻译后修饰的比较分析。
      ,
      • Belov M.E.
      • Rakov V.S.
      • nikolaev e.n.
      • Goshe M.B.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      初始实施,外部累积液相色谱/电喷雾电离傅里叶变换离子回旋与自动化增益控制。
      ,
      • Belov M.E.
      • 张R.
      • strittmatter e.f.
      • 之前的D.C.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      自动化增益控制和内部校准,外离子累积毛细管液相色谱 - 电喷雾电离 - 傅里叶变换离子回旋谐振。
      )。这种测量能力可以大大提高识别的特异性,而不会显着减少产量。蛋白质组学中的质量准确度的另一个这样的转折点可能接近较高的FTMS仪器的速度,灵敏度和效率
      • 第二个T.P.
      • Blethrow J.D.
      • Schwartz J.C.
      • Merrihew G.E.
      • maccoss m.j.
      • Swaney D.L.
      • 罗素J.D.
      • Coon J.J.
      • Zabrouskov V.
      双压线性离子阱质谱仪改善复合蛋白混合物分析。
      ,

      Damoc,E.,DeNisov,E.,Blethrow,J.,第二,TP,Zabrouskov,V.,Griep-Craming,J.,Makarov,A.,Mohring,T.,(2009)克服蛋白质组学实验中的缺乏采样。新型混合线性陷阱 - 轨道轨迹谱仪,在第57届大众光谱和盟国会议上,费城,2009年5月4日,2009年6月4日,美国质谱,圣达菲,纳米州的美国质谱。

      )采购高分辨率串联质谱更实用(
      • Kelleher N.L.
      精密蛋白质组学:高分辨率和高质量精度的情况。
      ,
      • 公园B.A.
      • 姜L.
      • 托马斯下午
      • 温格C.D.
      • 罗斯M.J.
      • Boyne 2nd,M.T.
      • 伯克P.V.
      • Kwast K.E.
      • Kelleher N.L.
      使用线性离子阱傅里叶变换混合质谱仪的色谱时间刻度上的自上而下蛋白质组学。
      ,
      • 罗斯M.J.
      • 公园B.A.
      • 弗格森J.T.
      • Boyne 2nd,M.T.
      • Kelleher N.L.
      “蛋白质分析”:使用顶部压谱法的人白细胞种群蛋白质组学。
      ,
      • Scherl A.
      • Shaffer S.A.
      • 泰勒G.K.
      • Hernandez P.
      • Appel R.D.
      • binz p.a.
      • Goodlett D.R.
      以高测量的质量精度获得肽片段离子的益处。
      ,
      • 温格C.D.
      • Boyne 2nd,M.T.
      • 弗格森J.T.
      • 罗宾逊D.E.
      • Kelleher N.L.
      多功能在线离线引擎,用于自动采集高分辨率串联质谱。
      ,
      • Boyne M.T.
      • 加西亚B.A.
      • 李米
      • Zamdborg L.
      • 温格C.D.
      • Babai S.
      • Kelleher N.L.
      具有超高度质量精度的串联质谱法通过数据库检索阐明肽鉴定。
      ,
      • 弗格森J.T.
      • 温格C.D.
      • Metcalf W.W.
      • Kelleher N.L.
      自上而下的蛋白质组学揭示了在甲蛋白酶乙酰血管内表达的新型蛋白质形式。
      ,
      • 奥尔森J.V.
      • Schwartz J.C.
      • Griep-raming J.
      • Nielsen M.L.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • lange O.
      • 弥补P.
      • 泰勒D.
      • 灿烂的玉米
      • Wouters e.r.
      • Senko M.
      • Makarov A.
      • 角horn
      具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
      ,
      • Mcalister G.C.
      • Phanstiel D.
      • 温格C.D.
      • 李米夫。
      • Coon J.J.
      FTMS改善大规模蛋白质组学的串联质谱分析,具有卓越的蛋白质定量。
      )。
      实现较高的质量测量精度(
      • 克劳瑟K.R.
      • 贝克P.
      • 伯灵名A.L.
      准确的质量测量(+/- 10 ppm)在蛋白质识别策略中使用MS或MS MS和数据库搜索的作用。
      ,
      • 刘涛。
      • Belov M.E.
      • jaitly n ..
      • 钱W.J.
      • 史密斯r.d.
      蛋白质组学中的精确质量测量。
      )是为数据库搜索添加特异性的最直接方式之一(
      • Zubarev R.
      论蛋白质组学中的大规模准确性的正确使用。
      ,
      • 孟F.
      • Cargile B.J.
      • 米勒l.m.
      • Forbes A.J.
      • 约翰逊J.R.
      • Kelleher N.L.
      细菌和古代完整蛋白质鉴定的信息和复用。
      ,
      • bakalarski c.e.
      • 哈斯W.
      • dephoure n.e.
      • Gygi S.P.
      大规模准确度,数据采集速度和搜索算法选择对磷蛋白酶蛋白肽鉴定率的影响。
      ),允许更高效 德诺维 sequencing (
      • 喇叭d.m.
      • Zubarev R.A.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过串联高分辨率质谱自动化蛋白质的Novo测序。
      ,
      • Spengler B.
      DE Novo测序,肽组成分析和基于组成的测序:通过傅里叶变换离子回旋谐振质谱法采用精确质量测定的新策略。
      ,
      • 奥尔森M.T.
      • 爱普斯坦J.A.
      • yergey a.l.
      使用肽组合物详尽枚举进行脱肽测序。
      ,
      • hubler s.l.
      • 珏A.
      • 基思J.
      • Mcalister G.C.
      • Craciun G.
      • Coon J.J.
      价奇偶校验型Z(中心点) - 化学截然不同。
      ),也许可能促进替代数据采集和分析策略,例如那些不需要收集串联质谱的策略(
      • Whitelegge J.P.
      • gundersen c.b.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      ,
      • gómezs.m.
      • Nishio J.N.
      • faull k.f.
      • Whitelegge J.P.
      通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
      ,
      • Conrads T.P.
      • 安德森G.A.
      • veenstra t.d.
      • pasa-toliæl。
      • 史密斯r.d.
      精确质量标签的效用,用于蛋白质全组蛋白质鉴定。
      ,
      • 史密斯r.d.
      • 安德森G.A.
      • Lipton M.S.
      • PASA-TOLIC L.
      • 沉Y.
      • Conrads T.P.
      • veenstra t.d.
      • UDSeth H.R.
      用于定量和高通量蛋白质组测量的精​​确质量标签策略。
      ,
      • Cargile B.J.
      • Stephenson Jr.,J.L.
      串联质谱法的替代方案:等电点和精确的肽鉴定鉴定。
      )。此外,由于仪器的环境和电子产品的变化,质量校准漂移始终是必须占据的担忧,特别是在大规模实验中。
      到目前为止呈现的线性离子阱 - 傅立叶变换混合体质谱仪的大多数方法都集中于使用与分析物共同检测的内部校准,而不是在含有校准物中获取单独光谱的外部校准。内部质量校准产生更好的准确性(
      • Muddiman D.C.
      • oberg a.l.
      傅里叶变换离子回旋谐振质谱法利用内部和外部质量校准法的统计评估。
      ,
      • 张L.K.
      • Rempel D.
      • Pramanik B.N.
      • 毛利。
      通过傅里叶变换质谱法精确测量。
      )但往往更具实验要求。两者之间的折衷方体是用单个内部校准或“锁定质量”配对的外部质量校准,以提供轻微的调整。
      描述色谱条件下的内部校准的几个报告利用双ESI源同时将校准剂和分析物引入质谱仪(
      • Hannis J.C.
      • Muddiman D.C.
      一种双电喷雾电离源联合六哌克累积,以实现傅里叶变换离子回旋谐振质谱法中的生物聚合物的高质量精度。
      ,
      • 炉子C.
      • Wolff J.C.
      • 哈斯金斯N.J.
      • SAGE A.B.
      • 吉尔斯克。
      • Bateman R.
      在正交加速时间内分析器的精确质量液相色谱/质谱使用在单独的样品和参考喷雾之间切换。 1.概念证明。
      ,
      • nepomuceno a.i.
      • Muddiman D.C.
      • 卑尔根第3号,H.R.
      • Craigead J.R.
      • Burke M.J.
      • Caskey P.E.
      • Allan J.A.
      双电喷雾电离源采用液相色谱傅里叶变换离子回旋谐振质谱法自信地生成精确的质量标签。
      ,
      • 李S.W.
      • Berger S.J.
      • Martinoviæs。
      • pasa-toliæl。
      • 安德森G.A.
      • 沉Y.
      • 赵立
      • 史密斯r.d.
      毛细管LC / FTICR直接质谱分析酵母大核糖体亚基的完整蛋白质。
      ,
      • 年轻的N.L.
      • SISTO M.C.
      • 年轻的M.N.
      • 格兰特P.G.
      • Killilea D.W.
      • 晶圆萝卜L.
      • 吴k.j.
      • lebrilla c.b.
      用于在色谱分离中精确测定的稳态不对称纳米涂布双离子源。
      ),但是至少有一个报告利用流动喷射方法,其中校准剂在电离之前与色谱流出物结合(
      • 查尔斯L.
      电流喷射锁定质量标准,用于电气喷雾电离电离中的电离电离时间质谱法与液相色谱相连。
      )。这些方法产生可靠的校准离子通量,但需要改进的离子源或色谱设施。根据安排,分析物和校准物之间的电离竞争可能是令人担忧的。已经描述了其他内部校准技术,其中利用有关某些条件下可用的分析物的信息,而不是校准物,例如在不同电荷状态下存在的相同物种(
      • 布鲁斯J.E.
      • 安德森G.A.
      • 品牌M.D.
      • PASA-TOLIC L.
      • 史密斯r.d.
      获得更精确的傅立叶变换离子回旋谐振质量,无需使用倍增离子的内部标准。
      ,
      • Cox J.
      术治疗蛋白质组测量的综合精度和精度的测定和提高综合精度的计算原理。
      )。
      迄今为止表演的霰弹枪蛋白质组学中的大规模准确性最广泛的批量准确性之一是HAAS 等等。 (
      • 哈斯W.
      • Faherty B.K.
      • 格柏S.A.
      • eliasj.e.
      • Beausoleil S.A.
      • bakalarski c.e.
      • 李X.
      • VillénJ.
      • Gygi S.P.
      霰弹枪蛋白质组学中肽质量测量精度的优化与应用。
      )使用线性离子阱 - 傅立叶变换ICR质谱仪,其中使用在LC-MS数据中通常观察到的环境实验室空气中的五种常见的聚二甲基环硅氧烷离子进行内部质量校准。另外,修改了标准的ICR校准方程,包括额外的术语,用于调整空间电荷效应的频谱的总离子电流。前体质量观察到的精度低于每百万(-0.25±1.46ppm),只能通过所选离子监测(SIM)而差的几次更糟
      使用的缩写是:
      SIM
      选择离子监测
      ETD.
      电子转移解离
      CI.
      化学电离
      Etnod.
      电子转移没有解离
      S / N.
      信噪比
      FDR.
      假发现率
      Omssa.
      开放质谱搜索算法
      TH.
      汤姆森。
      1使用的缩写是:SIM
      选择离子监测
      ETD.
      电子转移解离
      CI.
      化学电离
      Etnod.
      电子转移没有解离
      S / N.
      信噪比
      FDR.
      假发现率
      Omssa.
      开放质谱搜索算法
      TH.
      汤姆森。
      扫描(-0.41±0.44 ppm)。
      Olsen进行了类似的研究 等等。 (
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )在线性离子阱 - 傅立叶变换露天度光谱仪上。在这项工作中,C-Trap,射频存储和注射四极针用于在正常分析物扫描序列之前分离在线性离子阱后储存校准物种。使用六残基聚二甲基环硅氧烷离子作为MS的内部校准剂1 光谱,而其甲烷中性损失离子用于MS2。进一步提高质量准确性,MS1 通过前体色谱洗脱谱进行平均光谱。在本研究中获得了低至每百万百万百万质量的质量,以及前体以及产品。
      这两种方法都遭受了背景离子的信号在分析过程中和实验室到实验室的过程中广泛波动。另外,在奥尔森的方法中 等等。 (
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      ),背景离子的隔离和转移显着增加到扫描持续时间。在这里,我们描述了一种简单,快速且坚固的替代方案,可在使能ETD的线性离子阱 - 横谱仪质谱仪上实现每百万百万万种质量。该方法利用ETD化学电离源中的高通量和周数产生的单个内部校准物,其在高通量和稳定信号中产生。使用简单的采集后质量重新校准,我们实现了与霰弹枪蛋白质组学实验的最佳报道的前体质量精度,其数据操纵大大减少,并对扫描时间产生影响。产品质量准确度也是百万分部分。

      实验步骤

       仪器

      所有数据都是使用ETD启用的LTQ Orbitrap XL质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)收集所有数据。产生荧光阳离子作为用于生产在ETD反应中使用的自由基氟阴离子的化学电离(CI)方法的副产物。为了通过分析物阳离子群体共注入氟蒽酸阳离子,仪器固件被修改。
      分析是否采取了一个ms的形式1 or MS2 在从线性离子阱中注射分析物离子后,将分析物离子注射到C阱中,Ci源和C-Trap之间的所有离子光学器件被设定为透射正离子。然后,使用作为栅极的CI源的第二透镜,离子从CI源传输到C-Trap中。分析物离子和内部校准离子都同时在C-Trap中储存。在注射荧腾阳离子之后,将所有离子光学器件恢复到它们的正常设置,并且扫描继续正常,随着从C-Trap注入离子群到绕道 m/z analysis.
      进行各种实验以优化氟蒽阳离子注射过程。通常,这些涉及斜坡特定电压( 例如 C-TRAP镜头直接电流偏移,试剂传递多极射频幅度等),同时跟踪氟蒽阳离子的强度。另外,测量诸如离子飞行时间的其他参数。只有绝对最低必要的时间分配给这些过程。结果,注射荧光阳离子从未花费超过20毫秒(实际时间根据源代理而略微不同),并且通常只是几毫秒。

       样品制备

      大约2×107 收获人胚胎干细胞(H9细胞系)并用PBS缓冲液洗涤。将细胞重悬于500μl裂解缓冲液(50μmm Tris, pH 7.8, 100 mm NACL和8 m 尿素)通过三个步骤(Misonix XL-2000,Farmingdale,NY)的三个步骤裂解,在每一步之后的90-s突破:30秒,7级30秒,30级,30秒。通过以14,000×离心除去细胞碎片 g 3分钟。然后将细胞裂解物与10米温育m 在室温下DTT 30分钟,然后是20米m 在室温下在黑暗中烷基化30分钟的碘乙酰胺烷基化。在酶:基材比为1:150的酶中加入内皮蛋白酶酶Lys-C(Wako,大阪,日本)。在30℃下,消化在黑暗中进行了8小时。在LC-MS / MS分析之前,样品由Seppak(水域,Milford,MA)脱盐。

       液相色谱 - 串联质谱法

      水域NanoAcquity UPLC系统(Framingham,MA)连接到ETD-Enabled的LTQ Orbitrap XL。将约1.5μg的H9总细胞裂解物肽混合物加载到预柱上(5μmc 18,5厘米,75μm内径)并在分析柱上分离(5μmc18,12厘米,50μm内径),在0.2%甲酸中的50分钟梯度,从5-40%乙腈(
      • 马丁斯。
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      • 玛托J.A.
      使用纳米HPLC微安微安傅里叶变换离子回旋谐振质谱法分析SubFemtomole MS和MS / MS肽序列分析。
      )。
      在数据收集开始之前,使用标准校准混合物(咖啡因,肽MRFA和UltraMark 1621),STQ Orbitrap XL两次校准两次。质谱仪以数据相关的双播模式操作,其中来自调查MS的六个最强烈的离子1 scan (m/z 在70毫秒的活化时间内选择150-1500)的ETD碎片。单独和双电荷的前体被排除在外,并且具有未分配的充电状态的前体。在一个碎片事件的一个碎片事件中激活动态排除,其中最大峰值列表为500.Atbitrap的自动增益控制目标值设置为1×106 for FT MS1 scans and 5 × 105 for FT MSn 扫描。所有扫描都设定了orbitrap的分辨力为60,000。氟烷阳离子内部校准峰值 m/z 在整个数据收集中引入了202.07770。

       定制的软件

      使用Microsoft .NET Framework 2.0和/或3.5,使用Microsoft Visual Studio 2005和/或2008在C#中开发了自定义软件。使用Xcalibur提供的XRAWFILE COM库(XRAWFILE2.DLL)用于访问专有的Thermo Scientific .RAW数据文件格式。

       数据减少

      数据库搜索的输入文件由先前描述的DTA生成器软件生成(
      • 好D.M.
      • 温格C.D.
      • Mcalister G.C.
      • 白D.L.
      • 狩猎d.f.
      • Coon J.J.
      采集后ETD光谱处理,用于增加肽鉴定。
      ),修改以允许内部质量重新校准。对所有MS / MS光谱进行ETD光谱预处理以除去来自未反应的前体,电荷减少的前体(ETNOD)的干扰峰,以及来自ETNOD的中性损耗。也除去了校准峰。向所有MS / MS峰施加1.5的信噪比(S / N)阈值。 S / N从FT扫描标签数据计算,如下所示。
      SN=强度 - 噪声基线噪音水平
      (eq.1)


      在DTA发电机中进行内部质量重新校准,用于两个MS1 and MS2 基于氟基自由基阳离子内部校准的光谱在理论上 m/z 202.07770使用线性或比例 m/z 更正。用于一个内部校准物的线性质量重新校准方程如下。
      m/z重新校准=m/z原来的[m/z原来的(校准)m/zrecalibrated(校准)
      (eq。2)


      使用的一个内部校准物的比例质量重新校准等式如下。
      m/z重新校准=m/z原来的m/z重新校准(校准)m/z原来的(校准)
      (eq。2)


       数据库搜索

      通过使用开放质谱搜索算法搜索鉴定肽(
      • geer l.y.
      • 马克S.P.
      • Kowalak J.A.
      • 瓦格纳L.
      • 徐M.
      • Maynard D.M.
      • 杨X.
      • 施W.
      • 布莱恩特S.H.
      开放质谱搜索算法。
      )(Omssa,2.1.4版)平均前体质量耐受±5.0da,单异点产物质量耐受±0.01 da,半胱氨酸氨基甲酰化(+ 57.02146Da)作为固定改性,甲硫氨酸氧化(+15.99491Da)作为可变修改。谱进行搜查的人类国际蛋白质指数(
      • kersey p.j.
      • Duarte J.
      • 威廉姆斯A.
      • 卡拉维多奥鲁Y.
      • Birney E.
      • APWEILER R.
      国际蛋白质指数:蛋白质组学实验的集成数据库。
      )Fasta数据库(版本3.57)与目标诱饵搜索的所有蛋白质序列的逆转版本连接(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。

       虚假发现率优化

      用自定义软件对每个LC-MS / MS复制进行优化以大约1%的假发现速率(FDR)识别的独特肽数。期望值(e-value)得分阈值和最大前体质量误差被迭代地测试以确定满足允许的FDR的最大目标命中数。在找到最佳参数之后,仅使用具有最佳肽序列的最佳E值分数的光谱用于下一个分析阶段,以防止多种光谱识别相同的肽序列偏置结果。

       大规模准确性分析

      通过定制应用分析光谱以评估质量准确性。该软件评估了在每个复制LC-MS / MS运行的1%FDR中为OMSSA识别的每个独特的肽序列。首先,程序从相应的MS中检索数据 1 and MS2 光谱。选择隔离的峰位于MS中1 使用已知的前体电荷状态,光谱和转化为中性物质。然后通过减去1.003355Da的整数倍数(13c - 12c)产生最接近理论中性单同步体质量的质量。这之间的区别 一个后念 实验单同间位质质量和理论单位素缺失是预防体质量误差。
      形式2 光谱,在FT扫描标签数据中记录的充电状态考虑每个质心峰值。跳过带电荷状态的峰值,其中无法自信地分配充电状态。每个峰值需要1.5或更高的S / N(如在数据库搜索之前应用)。不考虑校准和同位素峰以及ETD光谱预处理除去的峰。在理论片段峰的±100ppm的非常宽的耐受性内的任何峰被计算为匹配。
      质量误差是直方图,距离宽度为0.25ppm。然后使用Levenberg-Marquardt算法适用于非线性最小二乘曲线配件的直方图,以及平均值和S.D。报告正常分布作为质量准确性。这些用于分布的中心和宽度的参数可以分别认为质量测量的精度和精度。

      结果

       内部校准源

      内部校准扫描序列被描绘 Fig. 1。产生ETD的自由基氟阴离子的CI反应同时产生荧光阳离子的稳健通量。这些阳离子可以快速转移到储存的C-Trap上,并且分析物扫描序列正常进行。在orbitrap中的转移和检测也像往常一样随之而来。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1氟蒽阳离子内部校准扫描事件的示意图。 首先,分析物阳离子(蓝色)通过源区注射到线性离子阱中,分离和碎片(在MS / MS的情况下),然后转移到C-Trap。接下来,将来自CI源的校准荧光阳离子(红色)通过多极和碰撞细胞转移到C-Trap中。最后,将所有离子一起转移到壁图中以进行高分辨率和高质量的精度分析。

       内部校准鲁棒性

      为了研究内部质量重新校准在长时间内的效果,获取60重复的LC-MS / MS与用Lys-C产生的肽的未分压复杂混合物运行。用Ft ms鉴定大约2000个独特的肽1 and MS2 在60个分析中的每一个中检测。为了评估荧蒽阳离子信号的稳健性,对分析物和校准剂提取质量色谱图。 Fig. 2a shows a typical MS1 基峰色谱图。注意,尽管分析物信号在整个LC梯度溶液中溶液的波动,但校准信号保持基本恒定。 Fig. 2b 显示一个例子ms1 带有内部校准峰的光谱突出显示。在〜202 th,峰值以足够低的质量与电荷比以避免干扰大多数感兴趣的分析。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2来自复制LC-MS / MS运行30的质量色谱图和单扫描光谱。 虽然分析物信号在两个MS的色谱梯度上变化很大1 (a)和女士2 (c)扫描事件,内部校准信号在两个MS中保持一致和稳健1 (b)和女士2 (d)光谱。
      典型的女士2 提供总离子电流色谱图 Fig. 2c。分析物和校准色谱图都显示出比它们的MS更多的变化1 同行;但是,校准信号仍然非常强烈,并且相当独立于分析物信号。校准信号中添加波动的主要原因是变化 m/z 扫描范围,其取决于前体充电状态。源业绩和电子产品的稳定性起着次要作用。 Fig. 2d 呈现典型的MS2 光谱。这种频谱被自信地匹配(E值得分为6.2×10−15)与序列Aqlrelnitaak的肽。同样,校准信号在202℃下最小地干扰产物离子峰,因为它是较低的 m/z 价值比大多数含有两个氨基酸残基的片段, IE。 c2 and z2· 碎片。该特定示例还示出了高分辨率MS的好处2 在该光谱中分析为两对片段离子,C4/ Z. 5· and c7/ Z. 8·,仅在0.018分中分离的同位素峰,只能分别为≥27,000和≥47,000个分辨率(假设等峰强度)分化,显着阐明肽鉴定。

       大规模准确性分析

      使用线性或比例校正的外部质量校准和内部质量重新校准的单个误差分布显示为前体 Fig. 3a 以及产品 Fig. 3b。该示例来自第60和最终复制LC-MS / MS分析,该分析在外部质量校准后开始~134小时(〜5.5天)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 31934个前体的质量错误分布(a)和~24,000个产品(b)在复制LC-MS / MS运行60期间在orbitrap中检测到。 通过标准外部质量校准分析数据(深灰色),线性内部质量重新校准(浅灰)和比例内部质量重新校准(中等灰色)。外部批量校准后,此运行大约在134小时(〜5天)。虽然成比例的内部质量重新校准是优越的,但内部质量重新校集策略均显示出分布的中心和宽度的改善。
      仅依赖于外部质量校准,1934个前体具有-3.31ppm和S.D的平均质量精度。 0.93 ppm。与ETD内部校准物的线性质量重新校准产生的分布中心更接近零,其平均值为-1.68ppm;但是,S.D.略微增加到0.98ppm。比例质量重新校准产生最佳效果,其平均值为+0.77ppm和S.D。 0.71 ppm,既有对外部质量校准和线性内部质量重新校准的改善。
      在与先前的工作中获得的质量准确度相比,确定具有至少三个质量误差标准偏差的质量耐受性是有效的。假设正常分布,该标准将包括真正正面和片段质量的~99.7%。这可能接近肽识别算法中使用的最佳质量耐受性,最终确定较高质量准确性的效用。
      以前的哈斯工作 等等。 (
      • 哈斯W.
      • Faherty B.K.
      • 格柏S.A.
      • eliasj.e.
      • Beausoleil S.A.
      • bakalarski c.e.
      • 李X.
      • VillénJ.
      • Gygi S.P.
      霰弹枪蛋白质组学中肽质量测量精度的优化与应用。
      )通过使用外部校准,可以使用在混合线性离子陷阱-ICR MS(LTQ FT)的ICR电池中检测到的SIM前体扫描来获得-0.41±0.44ppm的前体质量精度。 ±2.0 ppm的前体耐受性足以捕获质量偏差±3σ,而在此呈现的方法是必要的±3.0ppm。
      然而,更直接的比较是在同一研究中呈现的ICR小区中的非SIM扫描检测到的前体。该实验具有较高的产量,以与SIM前体扫描相比,不对肽鉴定的数量产生负面影响。采用这种方法实现的质量准确性,使用空间电荷校正的内部质量校准,在-0.25±1.46ppm处大大差。捕获±3.0ppm的质量耐受性才能捕获±3.σ的质量偏差。
      请注意,与HAA的工作相比,此处所呈现的方法所需的数据操作相对直观 等等。 (
      • 哈斯W.
      • Faherty B.K.
      • 格柏S.A.
      • eliasj.e.
      • Beausoleil S.A.
      • bakalarski c.e.
      • 李X.
      • VillénJ.
      • Gygi S.P.
      霰弹枪蛋白质组学中肽质量测量精度的优化与应用。
      )由于单个内部校准剂的校正的相对简单性。具有多个离子的质量校准需要重复校准方程的非线性曲线拟合的步骤,这在计算上比简单的调整更加密集。另一个重要考虑因素是该步骤需要频率数据而不是 m/z 通常不存储在原始数据中的值,因此必须从校准系数返回计算。
      此处呈现的方法确实为每个扫描添加了另外4-20毫秒,用于内部校准注入,这不是由HAAS策略产生的 等等。 (
      • 哈斯W.
      • Faherty B.K.
      • 格柏S.A.
      • eliasj.e.
      • Beausoleil S.A.
      • bakalarski c.e.
      • 李X.
      • VillénJ.
      • Gygi S.P.
      霰弹枪蛋白质组学中肽质量测量精度的优化与应用。
      )因为已经使用已经存在的背景离子。然而,为了换取吞吐量的次要罚款,CI源提供了更可靠的内部校准离子供应,不受环境实验室条件的影响。
      Olsen显示了另一种优化质量准确度的方法 等等。 (
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )例如,与本研究一起使用用于离子储存的混合线性离子阱轨道MS(LTQ orbitrap)的C-Trap。分析补充数据(
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      在此处描述的相同方法(略微超过200个独特肽提供质量测量误差),得到-0.26±1.06ppm的前体质量精度,在对肽的洗脱后平均后改善-0.24±0.57ppm。虽然这种质量准确度略有优于此处的内容(需要±2.0ppm的前体耐受捕获±3σ的质量偏差),但吞吐量是一个重要的考虑因素。对于氟蒽阳离子内部重新校准,时间损失很小,因为足够的校准离子群体可以非常迅速地转移到C-Trap。通过在-Fly锁定质量重新校准方法,在LTQ orbitrap固件中实现为选项,在注入C-Trap之前,校准离子在LTQ中被捕获并隔离。这些隔离和转移步骤导致另外的~50ms加入每次扫描相对于荧蒽内校准物。
      产品的质量误差分配显示在 Fig. 3b。如果没有内部质量重新校准,〜24,000个产品的平均误差为-2.32 ppm和s.d。 0.89 ppm。随着线性内部质量重新校准,两者均略微改进为-1.62ppm和S.D。 0.81 ppm。再一次,比例内部质量重新校准具有+0.17ppm和S.D的平均值的最佳性能。 0.67 ppm。
      对所有60重复的LC-MS / MS运行进行相同的分析。误差栏的平均值为±1 s.d.作为前体外部质量校准后的时间函数绘制 Fig. 4a 以及产品 Fig. 4b。在没有校正的情况下,漂移导致质量准确性分布,从零的理想中距离百万百万分之几,每天百万分之一的波动。奥尔森已经显示了类似的图 等等。 (
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )和年轻人 等等。 (
      • 年轻的N.L.
      • SISTO M.C.
      • 年轻的M.N.
      • 格兰特P.G.
      • Killilea D.W.
      • 晶圆萝卜L.
      • 吴k.j.
      • lebrilla c.b.
      用于在色谱分离中精确测定的稳态不对称纳米涂布双离子源。
      )。线性内部质量重新校准有助于缓和这些波动,但不会消除它们。另一方面,比例内部质量重新校准显示了虚拟完全消除质量校准漂移。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4前体的质量校准漂移(a)和产品(b)在外部批量校准后执行的60遍60复制LC-MS / MS运行。 将高斯拟合应用于每个运行之前的批量误差分布(红色的)和线性后(绿色)和比例(蓝色的)内部质量重新校准; 误差酒吧 代表±1 S.D.对于女士来说1 and MS2 扫描,比例内部质量重新校准几乎消除漂移并降低了分布的宽度。
      这些分析表明,由于前者消除漂移,因此优选对内部质量重新校准的线性校正来进行比例校正,而后者仅减少其。此外,比例调节可以显着降低质量误差分布的宽度(通常为约25%),而线性调节通常不会且有时实际恶化它。考虑到仅使用单个内部校准物,这并不令人惊讶,这主要可以校正系统但不是随机误差的影响。看到这种适度改进的主要原因可能在一次运行中减少质量校准漂移。
      展示了一个有趣的现象 Fig. 4 这是对于LC-MS / MS分析,即使在两个外部批量校准后直接执行,也有显着的系统误差。对于前体,该初始质量误差约为-2.6ppm与产品的-1.3ppm相比。这证明了使用内部校准的另一个重要原因,不仅可以漂移漂移,而且还要纠正外部校准中的误差。内部质量校准似乎不适用于这些初始不准确性。
      一个问题来自 Fig. 4 即使在比例内部质量重新校准之后,也是一个重要的,一致的系统误差。对于前体,所示 Fig. 4a,换档约为+ 0.8ppm,而对于产品,展示 Fig. 4b,它约为+0.2 ppm。努力确定这些系统错误的来源而无需成功。然而,我们注意到,由于偏差是相当可重复的,因此可以通过简单地从任何观察到的质量误差减去恒定来容易地校正,以产生零零中心的分布。
      然后通过构建批量误差分布来检查质量精度漂移的累积效应,用于同时从所有60重复的前体和产品的组合分析。显示~120,000个前体质量的分布 Fig. 5a 对于~160万产品质量显示 Fig. 5b.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5~120,000前体的质量误差分布(a)和160万产品(b)以60次重复的LC-MS / MS运行测量。 使用外部批量校准处理数据(深灰色),线性内部质量重新校准(浅灰)和比例内部质量重新校准(中等灰色)。虽然质量误差分布的中心在质量重新校准后没有提高大量,但漂移校正导致基本上更窄的峰值。
      尽管单个分析的质量误差分布具有大致相同的宽度,但漂移导致这些分布随时间的分散。这些分布总结在一起,以产生基本上扩大的整体分布。净结果是批量误差分布宽度的近似加倍,而无需重新校准,与比例内部质量重新校准相比,其中漂移最小化。相比之下,在比例内部质量重新校准之后,相对于单一分析,累积质量准确度分布不会扩大。对于前体质量误差,单个重复显示宽度为0.71与0.70ppm的累积分析;对于产品质量误差,两者都具有0.67ppm的宽度。总结了所有大规模准确度分析的结果 表I..
      表I.典型的单一LC-MS / MS运行(复制60)的质量精度分析概述,并且所有60重复的前体和产品的组合分析使用没有质量重新校准,线性质量重新校准和比例质量重新校准
      分析前体/产品质量重新校准类型数数吝啬的S.D.
      PPM.PPM.
      复制60.前体没有任何1,934−3.310.93
      复制60.前体线性1,934−1.680.98
      复制60.前体成比例的1,934+0.770.71
      复制60.产品没有任何23,988−2.320.89
      复制60.产品线性23,988−1.620.81
      复制60.产品成比例的23,990+0.170.67
      合并前体没有任何119,184−1.231.54
      合并前体线性119,184−0.351.09
      合并前体成比例的119,184+0.800.70
      合并产品没有任何1,622,070−0.181.42
      合并产品线性1,621,500.−0.101.10
      合并产品成比例的1,621,440+0.160.67

      讨论

      大规模准确性在霰弹枪蛋白质组学的早期初期是事后的东西。由于新的混合仪器和更先进的数据分析软件,这一观点在过去几年中一直在稳步变化,以准确的前体质量是当代霰弹枪蛋白质组学实验的关键组成部分。初步报告开始证明,准确的产品群众也非常有益,并且收购高分辨率串联质谱可能是在不久的将来的违约策略。
      随着MS的质量准确度的重要性越来越重要1 and MS2 蛋白质组学中的光谱,具有稳健的质量校准策略至关重要,易于实现,最小地干扰光谱质量和吞吐量,并一致地提供每百万百万质量精度。使用比例调节的氟托阳离子内部质量重新校准符合所有这些标准。荧蒽阳离子已经由CI源以非常高的源产生,因此可以快速积累足够的群体用于分析物阳离子的共同检测。因为离子由仪器的不同部位的单独源生产,因此没有竞争电离。采集后重新校准可以通过简单的软件来完成,该软件可以检测每个光谱中的内部校准峰值,并相应地调整其他峰值。由于这些原因,我们认为这种方法是在ETD的线性离子阱 - 横梁混合质谱仪上获得霰弹枪蛋白质组学中最佳质量准确性的理想选择。

      致谢

      我们感谢Ryan Lynch,Rachael Larson和A. J.Bureta为图形插图以及Jens Griep-Raming,Oliver Lange,Mike Senko,John Syka,Jae Schwarz,以及Thermo Fisher Scientific的George Stafford为有用的讨论。

      参考

        • Zubarev R.
        论蛋白质组学中的大规模准确性的正确使用。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2007; 6: 377-381
        • Syka J.E.
        • 玛托J.A.
        • 白D.L.
        • 角horn
        • Senko M.W.
        • Schwartz J.C.
        • Ueberheide B.
        • 加西亚B.
        • 母猪S.
        • 默特雷特T.
        • Shabanowitz J.
        • 狩猎d.f.
        新型线性四极离子阱/ FT质谱仪:性能表征和在组蛋白H3后翻译后修饰的比较分析。
        J.蛋白质组。 2004; 3: 621-626
        • Makarov A.
        • Denisov E.
        • KHOLOMEEV A.
        • Balschun W.
        • lange O.
        • strupat K.
        • 角horn
        混合线性离子阱/绕组质谱仪的性能评价。
        肛门。化学。 2006; 78: 2113-2120
        • Jeffries J.B.
        • Barlow S.E.
        • 邓恩G.H.
        离子 - 回旋谐振频率的空间电荷偏移理论。
        int。 J.质谱。 1983; 54: 169-187
        • Francl T.J.
        • 谢尔曼米。
        • 猎人R.L.
        • Locke M.J.
        • 鞠躬w.d.
        • Mciver R.T.
        实验测定空间电荷对离子回旋谐振频率的影响。
        int。 J.质谱。 1983; 54: 189-199
        • Ledford Jr.,E.B.
        • Rempel D.L.
        • 毛利。
        傅立叶变换质谱中的空间电荷效应。质量校准。
        肛门。化学。 1984; 56: 2744-2748
        • Easterling M.L.
        • mize t.h.
        • Amster I.J.
        常规部分的高群IONS每百万质量准确度:MALDI FT-ICR中的空间电荷效应。
        肛门。化学。 1999; 71: 624-632
        • Belov M.E.
        • Rakov V.S.
        • nikolaev e.n.
        • Goshe M.B.
        • 安德森G.A.
        • 史密斯r.d.
        初始实施,外部累积液相色谱/电喷雾电离傅里叶变换离子回旋与自动化增益控制。
        迅速交流。质谱。 2003; 17: 627-636
        • Belov M.E.
        • 张R.
        • strittmatter e.f.
        • 之前的D.C.
        • 唐克。
        • 史密斯r.d.
        自动化增益控制和内部校准,外离子累积毛细管液相色谱 - 电喷雾电离 - 傅里叶变换离子回旋谐振。
        肛门。化学。 2003; 75: 4195-4205
        • 第二个T.P.
        • Blethrow J.D.
        • Schwartz J.C.
        • Merrihew G.E.
        • maccoss m.j.
        • Swaney D.L.
        • 罗素J.D.
        • Coon J.J.
        • Zabrouskov V.
        双压线性离子阱质谱仪改善复合蛋白混合物分析。
        肛门。化学。 2009; 81: 7757-7765
      1. Damoc,E.,DeNisov,E.,Blethrow,J.,第二,TP,Zabrouskov,V.,Griep-Craming,J.,Makarov,A.,Mohring,T.,(2009)克服蛋白质组学实验中的缺乏采样。新型混合线性陷阱 - 轨道轨迹谱仪,在第57届大众光谱和盟国会议上,费城,2009年5月4日,2009年6月4日,美国质谱,圣达菲,纳米州的美国质谱。

        • Kelleher N.L.
        精密蛋白质组学:高分辨率和高质量精度的情况。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2008; 105: 18132-18138
        • 公园B.A.
        • 姜L.
        • 托马斯下午
        • 温格C.D.
        • 罗斯M.J.
        • Boyne 2nd,M.T.
        • 伯克P.V.
        • Kwast K.E.
        • Kelleher N.L.
        使用线性离子阱傅里叶变换混合质谱仪的色谱时间刻度上的自上而下蛋白质组学。
        肛门。化学。 2007; 79: 7984-7991
        • 罗斯M.J.
        • 公园B.A.
        • 弗格森J.T.
        • Boyne 2nd,M.T.
        • Kelleher N.L.
        “蛋白质分析”:使用顶部压谱法的人白细胞种群蛋白质组学。
        肛门。化学。 2008; 80: 2857-2866
        • Scherl A.
        • Shaffer S.A.
        • 泰勒G.K.
        • Hernandez P.
        • Appel R.D.
        • binz p.a.
        • Goodlett D.R.
        以高测量的质量精度获得肽片段离子的益处。
        J.IM。 SOC。质谱。 2008; 19: 891-901
        • 温格C.D.
        • Boyne 2nd,M.T.
        • 弗格森J.T.
        • 罗宾逊D.E.
        • Kelleher N.L.
        多功能在线离线引擎,用于自动采集高分辨率串联质谱。
        肛门。化学。 2008; 80: 8055-8063
        • Boyne M.T.
        • 加西亚B.A.
        • 李米
        • Zamdborg L.
        • 温格C.D.
        • Babai S.
        • Kelleher N.L.
        具有超高度质量精度的串联质谱法通过数据库检索阐明肽鉴定。
        J.蛋白质组。 2009; 8: 374-379
        • 弗格森J.T.
        • 温格C.D.
        • Metcalf W.W.
        • Kelleher N.L.
        自上而下的蛋白质组学揭示了在甲蛋白酶乙酰血管内表达的新型蛋白质形式。
        J.IM。 SOC。质谱。 2009; 20: 1743-1750
        • 奥尔森J.V.
        • Schwartz J.C.
        • Griep-raming J.
        • Nielsen M.L.
        • 达莫e.
        • Denisov E.
        • lange O.
        • 弥补P.
        • 泰勒D.
        • 灿烂的玉米
        • Wouters e.r.
        • Senko M.
        • Makarov A.
        • 角horn
        具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 2759-2769
        • Mcalister G.C.
        • Phanstiel D.
        • 温格C.D.
        • 李米夫。
        • Coon J.J.
        FTMS改善大规模蛋白质组学的串联质谱分析,具有卓越的蛋白质定量。
        肛门。化学。 2010; 82: 316-322
        • 克劳瑟K.R.
        • 贝克P.
        • 伯灵名A.L.
        准确的质量测量(+/- 10 ppm)在蛋白质识别策略中使用MS或MS MS和数据库搜索的作用。
        肛门。化学。 1999; 71: 2871-2882
        • 刘涛。
        • Belov M.E.
        • jaitly n ..
        • 钱W.J.
        • 史密斯r.d.
        蛋白质组学中的精确质量测量。
        化学。录 2007; 107: 3621-3653
        • 孟F.
        • Cargile B.J.
        • 米勒l.m.
        • Forbes A.J.
        • 约翰逊J.R.
        • Kelleher N.L.
        细菌和古代完整蛋白质鉴定的信息和复用。
        NAT。 Biotechnol。 2001; 19: 952-957
        • bakalarski c.e.
        • 哈斯W.
        • dephoure n.e.
        • Gygi S.P.
        大规模准确度,数据采集速度和搜索算法选择对磷蛋白酶蛋白肽鉴定率的影响。
        肛门。生物丹纳尔。化学。 2007; 389: 1409-1419
        • 喇叭d.m.
        • Zubarev R.A.
        • MLEFFERTY F.W.
        通过串联高分辨率质谱自动化蛋白质的Novo测序。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2000; 97: 10313-10317
        • Spengler B.
        DE Novo测序,肽组成分析和基于组成的测序:通过傅里叶变换离子回旋谐振质谱法采用精确质量测定的新策略。
        J.IM。 SOC。质谱。 2004; 15: 703-714
        • 奥尔森M.T.
        • 爱普斯坦J.A.
        • yergey a.l.
        使用肽组合物详尽枚举进行脱肽测序。
        J.IM。 SOC。质谱。 2006; 17: 1041-1049
        • hubler s.l.
        • 珏A.
        • 基思J.
        • Mcalister G.C.
        • Craciun G.
        • Coon J.J.
        价奇偶校验型Z(中心点) - 化学截然不同。
        J.IM。化学。 SOC。 2008; 130: 6388-6394
        • Whitelegge J.P.
        • gundersen c.b.
        • faull k.f.
        完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
        蛋白质SCI。 1998; 7: 1423-1430
        • gómezs.m.
        • Nishio J.N.
        • faull k.f.
        • Whitelegge J.P.
        通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 46-59
        • Conrads T.P.
        • 安德森G.A.
        • veenstra t.d.
        • pasa-toliæl。
        • 史密斯r.d.
        精确质量标签的效用,用于蛋白质全组蛋白质鉴定。
        肛门。化学。 2000; 72: 3349-3354
        • 史密斯r.d.
        • 安德森G.A.
        • Lipton M.S.
        • PASA-TOLIC L.
        • 沉Y.
        • Conrads T.P.
        • veenstra t.d.
        • UDSeth H.R.
        用于定量和高通量蛋白质组测量的精​​确质量标签策略。
        蛋白质组学。 2002; 2: 513-523
        • Cargile B.J.
        • Stephenson Jr.,J.L.
        串联质谱法的替代方案:等电点和精确的肽鉴定鉴定。
        肛门。化学。 2004; 76: 267-275
        • Muddiman D.C.
        • oberg a.l.
        傅里叶变换离子回旋谐振质谱法利用内部和外部质量校准法的统计评估。
        肛门。化学。 2005; 77: 2406-2414
        • 张L.K.
        • Rempel D.
        • Pramanik B.N.
        • 毛利。
        通过傅里叶变换质谱法精确测量。
        质谱。录 2005; 24: 286-309
        • Hannis J.C.
        • Muddiman D.C.
        一种双电喷雾电离源联合六哌克累积,以实现傅里叶变换离子回旋谐振质谱法中的生物聚合物的高质量精度。
        J.IM。 SOC。质谱。 2000; 11: 876-883
        • 炉子C.
        • Wolff J.C.
        • 哈斯金斯N.J.
        • SAGE A.B.
        • 吉尔斯克。
        • Bateman R.
        在正交加速时间内分析器的精确质量液相色谱/质谱使用在单独的样品和参考喷雾之间切换。 1.概念证明。
        肛门。化学。 2000; 72: 3683-3688
        • nepomuceno a.i.
        • Muddiman D.C.
        • 卑尔根第3号,H.R.
        • Craigead J.R.
        • Burke M.J.
        • Caskey P.E.
        • Allan J.A.
        双电喷雾电离源采用液相色谱傅里叶变换离子回旋谐振质谱法自信地生成精确的质量标签。
        肛门。化学。 2003; 75: 3411-3418
        • 李S.W.
        • Berger S.J.
        • Martinoviæs。
        • pasa-toliæl。
        • 安德森G.A.
        • 沉Y.
        • 赵立
        • 史密斯r.d.
        毛细管LC / FTICR直接质谱分析酵母大核糖体亚基的完整蛋白质。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2002; 99: 5942-5947
        • 年轻的N.L.
        • SISTO M.C.
        • 年轻的M.N.
        • 格兰特P.G.
        • Killilea D.W.
        • 晶圆萝卜L.
        • 吴k.j.
        • lebrilla c.b.
        用于在色谱分离中精确测定的稳态不对称纳米涂布双离子源。
        肛门。化学。 2007; 79: 5711-5718
        • 查尔斯L.
        电流喷射锁定质量标准,用于电气喷雾电离电离中的电离电离时间质谱法与液相色谱相连。
        迅速交流。质谱。 2003; 17: 1383-1388
        • 布鲁斯J.E.
        • 安德森G.A.
        • 品牌M.D.
        • PASA-TOLIC L.
        • 史密斯r.d.
        获得更精确的傅立叶变换离子回旋谐振质量,无需使用倍增离子的内部标准。
        J.IM。 SOC。质谱。 2000; 11: 416-421
        • Cox J.
        术治疗蛋白质组测量的综合精度和精度的测定和提高综合精度的计算原理。
        J.IM。 SOC。质谱。 2009; 20: 1477-1485
        • 哈斯W.
        • Faherty B.K.
        • 格柏S.A.
        • eliasj.e.
        • Beausoleil S.A.
        • bakalarski c.e.
        • 李X.
        • VillénJ.
        • Gygi S.P.
        霰弹枪蛋白质组学中肽质量测量精度的优化与应用。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2006; 5: 1326-1337
        • 奥尔森J.V.
        • De Godoy L.M.
        • 李G.
        • MACEK B.
        • Mortensen P.
        • PESCH R.
        • Makarov A.
        • lange O.
        • 角horn
        通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2005; 4: 2010-2021
        • 马丁斯。
        • Shabanowitz J.
        • 狩猎d.f.
        • 玛托J.A.
        使用纳米HPLC微安微安傅里叶变换离子回旋谐振质谱法分析SubFemtomole MS和MS / MS肽序列分析。
        肛门。化学。 2000; 72: 4266-4274
        • 好D.M.
        • 温格C.D.
        • Mcalister G.C.
        • 白D.L.
        • 狩猎d.f.
        • Coon J.J.
        采集后ETD光谱处理,用于增加肽鉴定。
        J.IM。 SOC。质谱。 2009; 20: 1435-1440
        • geer l.y.
        • 马克S.P.
        • Kowalak J.A.
        • 瓦格纳L.
        • 徐M.
        • Maynard D.M.
        • 杨X.
        • 施W.
        • 布莱恩特S.H.
        开放质谱搜索算法。
        J.蛋白质组。 2004; 3: 958-964
        • kersey p.j.
        • Duarte J.
        • 威廉姆斯A.
        • 卡拉维多奥鲁Y.
        • Birney E.
        • APWEILER R.
        国际蛋白质指数:蛋白质组学实验的集成数据库。
        蛋白质组学。 2004; 4: 1985-1988
        • eliasj.e.
        • Gygi S.P.
        目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
        NAT。方法。 2007; 4: 207-214