全亚基覆盖液相色谱电喷雾电离质谱(LCMS +)的低聚膜蛋白

细胞色素 b6f 来自菠菜和蓝色的复合物 Mastigocladus Laminosus.* S.
  • 朱利安P. Whitelegge.
    一致
    应讨论谁的通信:化学,UCLA,405 Hilgard Ave.,洛杉矶,加利福尼亚州90095。电话:310-794-5156;传真:310-206-2161;
    隶属关系
    PASAROM质谱实验室,精神病学和生物切生科学部门,化学和生物化学,以及加州加州大学的神经精神科学院,加利福尼亚州洛杉矶90095
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  • 华民张
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    普渡大学生物科学系,西拉斐特,印第安纳州47907
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  • Rodrigo Aguilera.
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    PASAROM质谱实验室,精神病学和生物切生科学部门,化学和生物化学,以及加州加州大学的神经精神科学院,加利福尼亚州洛杉矶90095
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  • 罗斯M. Taylor.
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    蒙大拿州立大学微生物学系,博兹曼,蒙大拿州59717
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  • 威廉A.克莱默
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    普渡大学生物科学系,西拉斐特,印第安纳州47907
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生学院的支持,AI-12601,AI-29733(JPW)和GM-38323(WAC),能源部赠款DE-FG03-01ER15251(对JPW)和亨利Koffler教授(WAC)。
    是本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)包含补充数据。
      高活性细胞学b6f来自菠菜和蓝色的复合物Mastigocladus Laminosus..已经通过液相色谱法分析了电喷雾电离质谱(LCMS +)。尺寸排除和反相分离均用于分离蛋白质亚基,允许将它们的分子量测量到超过0.01%(±3Da在30,000da)的精度。产品的产品佩塔, PETB., 宠物, 佩德, 佩特格, 佩尔, 宠物, 和佩特在菠菜和菠菜的复合物中检测到M. Laminosus.,而菠菜综合体也含有Ferredoxin-NADP+氧化还原酶(张,H.,Whitelegge,J.P.和Cramer,W​​. A.(2001)类黄酮类化合物:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基b6f复杂的。J. Biol。化学。276,38159-38165)。虽然来自菠菜的测量的PETC和PETD(分别为18935.8和17311.8DAD)与已发表的初级结构一致,但是细胞色素的测量质量f(31934.7 da,peta)和细胞色素b(24886.9 DA,PETB)适度地偏离基于基因组序列和已知的翻译后修改计算的值。使用串联质谱(MSM)对低分子量蛋白质亚单元进行测序,而无需先切割。将这些完整膜蛋白的MSMS光谱衍生的序列与3.2-4.2kDa的范围进行比较,在可用的基因组DNA序列的翻译。菠菜叶绿体基因组,PETG,PETL和PETN的产物,所有保留它们的引发甲酰甲基硫氨酸,而核编码的PETM从细胞质进口后裂解。虽然PETG和PETN的序列显示出与菠菜叶绿体基因组的翻译没有差异,但在PETL的位置检测pHE。菠菜叶绿体基因组报告用于SER处的SER的密码子,暗示存在DNA测序误差或先前未被发现的RNA编辑事件的存在。清楚地,基因组数据的完全注释需要通过质谱法进行初级结构的详细表达测量。通过LCMS +通过LCMS +寡核苷酸蛋白复合物的全亚基覆盖物呈现为完整的质量蛋白质组学的新方面。
      质谱(MS)
      使用的缩写是:MS,质谱;马尔迪,矩阵辅助激光解吸电离; ESI,电喷雾电离; FNR,Ferredoxin-NADP+ 氧化还原酶; LCMS +,液相色谱,质谱和馏分收集; MSM,串联质谱;秒,尺寸排阻色谱; PS,光系统; TOF,飞行时间; HPLC,高压液相色谱。
      1使用的缩写是:MS,质谱;马尔迪,矩阵辅助激光解吸电离; ESI,电喷雾电离; FNR,Ferredoxin-NADP+ 氧化还原酶; LCMS +,液相色谱,质谱和馏分收集; MSM,串联质谱;秒,尺寸排阻色谱; PS,光系统; TOF,飞行时间; HPLC,高压液相色谱。
      自基质辅助激光解吸离子化(MALDI)的发展以来彻底改变了生物科学(
      • Karas M.
      • Hillenkamp F.
      具有超过10,000道尔顿的分子量的蛋白质的激光解吸电离。
      )和电喷雾电离(ESI)(
      • Fenn J.B.
      • 萌C.K.
      • 黄S.F.
      • 怀特豪斯下午
      大量生物分子质谱的电喷雾电离。
      )在八十年代后期(
      • Chait B.T.
      • 肯特S.B.
      称重裸蛋白:实用,高精度的肽和蛋白质的质量测量。
      ),施肥施肥,称为蛋白质组学的新学科。生物大分子现在以极高的准确度质量测量,高度解决的光谱显示出细微的分子异质性。事实上,完整蛋白质的质谱是蛋白质组学信息的必要条件,其定义基因产物的天然共价谱及其相关的异质性(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )。对于完整蛋白质,ESI-MS提供卓越的精度(在0.01%的误差范围内)和分辨率,而MALDI更敏感,更容许极端异质性和复杂的混合物。虽然本征膜蛋白传统上被认为是有问题的,但已经开发了一套技术,其允许多种例子常规ESI-MS具有最多15个跨膜螺旋(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      ,
      • Whitelegge J.P.
      • le cout J.
      • 李约。
      • 恩格尔C.K.
      • 私人G.G.
      • faull k.f.
      • Kaback H.R.
      朝向双层蛋白质组,大型完整跨膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      ,
      • le cout J.
      • Whitelegge J.P.
      • gr
      • Turk E.
      • 赖特·赖
      • Kaback H.R.
      • faull k.f.
      全长膜蛋白质的蛋白质组学用质谱法。
      ,
      • Turk E.
      • kim o.
      • le cout J.
      • Whitelegge J.P.
      • eskandari s.
      • 林J.T.
      • Kreman M.
      • Zampighi G.
      • faull k.f.
      • 赖特·赖
      分子characterization of Vibrio Parahaemolyticus. vsglt。钠偶联糖分转力模型。
      ,
      • Gómezs。
      • Nishio J.
      • faull k.f.
      • Whitelegge J.P.
      通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
      )。虽然通过利用质谱来促进蛋白质组学。 确认 蛋白质,基于源自母体蛋白质的小肽的质量和序列分析,现在可以将完整的质量测量作为蛋白质组学的组成部分(完整的大规模蛋白质组学)。
      孤立的完全活性蛋白质复合物在蛋白质组学中特别有用,因为它定义了相互作用以提供该功能的功能单元和结构基因,尽管其他基因产品当然可以参与成功的组装和调节。因此,本型膜蛋白复合物先前已经靶向以质谱法分析的成功。马尔迪成功用于分析细胞色素 3 (4亚基)和细胞色素 BD. (2个亚基)来自 大肠杆菌 以及 公元前1 复合物(3亚基)和细胞色素 c 氧化酶(3亚基)来自 乳头杆菌sphaeroides. (
      • GHAIM J.B.
      • Tsatsos p.h.
      • katsonouri A.
      • 米切尔下午
      • Salcedo-Hernandez R.
      • Gennis R.B.
      膜蛋白的基质辅助激光解吸电离质谱:证明一种确定疏水亚基的亚基分子量的简单方法。
      )。然而,与ESI相比,较大蛋白质的MALDI的较低精度和分辨率减少了这些分析的价值,尽管有人指出,最近已经通过MALDI改善了一些膜蛋白质以提高精度(
      • Cadene M.
      • Chait B.T.
      整体膜蛋白质质谱分析的一种鲁棒,洗涤剂友好型方法。
      )。将ESI与HPLC(LCMS)嵌入到牛细胞色素中 公元前1 复杂,但并非所有亚基被检测到(
      • Musatov A.
      • 罗宾逊N.C.
      反相HPLC对牛细胞色素BC1的亚基分析和电喷雾电离质谱法测定亚基分子量。
      )。通过ESI成功分析了光系统2(PS2)反应中心子拷贝单簧(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      ),(
      • Whitelegge J.P.
      • gómezs.m.
      • 史蒂文斯r.l.
      • MastrogiaComo A.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      脂质固有膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      ,
      • Sharma J.
      • Panico M.
      • 理发师J.
      • 莫里斯H.R.
      低分子量光照系统II反应中心亚基及其光谱诱导的质谱法的表征。
      ,
      • Sharma J.
      • Panico M.
      • 理发师J.
      • 莫里斯H.R.
      电喷雾电离质谱法纯化和测定光照电离质谱法的光系统II反应中心亚基。
      )具有包括PS2二聚体和相关的光收获复合多肽(
      • Gómezs。
      • Nishio J.
      • faull k.f.
      • Whitelegge J.P.
      通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
      ),但尚未描述对天然PS2二聚体的系统性综合检查。朝着寡聚内膜蛋白复合物的完整描述的目标,使用许多技术来完全表征高活性制剂的细胞色素 b6f 复杂,包括细胞色素 b6 (PETB)和亚基IV(PETD)亚基,其共有七个跨膜螺旋。
      细胞色素 b6f 复合物提供了两种反应中心,光学系统2和1之间的电子连接,含氧光合作用,并且通过氧化亲脂素喹诺醇并将所得质子转移到膜的电化学正侧,也有助于产生跨膜质子电化学的产生推动ATP合成的潜力(
      • 克莱默w.a.
      • 索里亚诺泳装
      • PONONAREV M.
      • 黄D.
      • 张H.
      • 马丁内斯S.E.
      • 史密斯J.L.
      关于细胞色素的一些新的结构方面和旧争论 b6f 含氧光合作用的复合物。
      )。该功能类似于细胞色素进行的 公元前1 细菌光合作用和呼吸链的复合物,其中有许多密切相似的特征,包括氧化还原辅因子和细胞色素 b 多肽在复合物的膜核心中(
      • wivger w.r.
      • 克莱默w.a.
      • Herrmann r.g.
      • Trebst A.
      线粒体综合体III和叶绿体B6-F复合物细胞色素B与叶绿体B6-F复合物的序列同源性和结构相似性:膜中细胞色素B血液的位置。
      )。这 b6f 复合物包含至少四个氧化还原辅因子,两者 b 血糖,细胞色素的血红素 f, 和the high potential [2Fe-2S] cluster of the Rieske iron-sulfur protein and a fifth, the FAD moiety of the ferredoxin:NADP+ 还原酶 b6f 复杂的菠菜(
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      据推测,其他植物来源。后一舒接机在细胞色素中没有类似物 公元前1复杂的。The b6f 复杂已被净化为非常活跃(>300电子/细胞色素 f/ s)二聚体分别在八分之一和九个多肽亚基,分子量分别为210,000和280,000,在蓝杆菌中 Mastigocladus Laminosus.. 和菠菜叶绿体(用FNR)(
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )。在二聚体复合物中预测了二十六种跨膜螺旋。
      二维晶体的 b6f 来自绿藻的复合物 衣原体 Reinhardtii. 已获得将地图提供给8-9的(
      • 船只G.
      • Breyton C.
      • olofsson a。
      • POPOT J.L.
      • RIGAUD J.L.
      细胞色素的投影贴图 b6f 复杂8Å分辨率。
      ,
      • Breyton C.
      细胞色素 b6f复杂的。Structural studies and comparison with the 公元前1 complex.
      )和来自嗜热性蓝杆菌的复合物的三维晶体 M. Laminosus. (
      • 黄D.
      • 张H.
      • 索里亚诺泳装
      • dahms t.e.s.s.
      • Krahn J.M.
      • 史密斯J.L.
      • 克莱默w.a.
      已经获得了衍射的<4Å。已经确定了空间组和单元单元尺寸。
      H. Zhang,G. Kurisu和W. A. Cramer,准备稿件。
      2H. Zhang,G. Kurisu和W. A. Cramer,准备稿件。
      高分辨率(~1.8-1.9埃)结构,其将促进求解复合物的结构,先前已经获得了细胞色素的腔侧可溶性结构域 f (
      • 马丁内斯S.E.
      • 黄D.
      • szczepaniak A.
      • 克莱默w.a.
      • 史密斯J.L.
      叶绿体晶体结构细胞色素 f 揭示了一种新型细胞色素折叠和意外的血红音连接。
      )和rieske铁 - 硫蛋白(
      • 张H.
      • Carrell C.J.
      • 黄D.
      • 雪橇五。
      • ohnishi t.
      • 史密斯J.L.
      • 克莱默w.a.
      叶绿体Rieske铁 - 硫蛋白腔侧结构域的表征和结晶。
      ,
      • Carrell C.J.
      • 张H.
      • 克莱默w.a.
      • 史密斯J.L.
      光合作用和呼吸中的生物学特性和多样性:叶绿体Rieske蛋白的腔侧结构域的结构。
      )构成其总质量的〜40%。细胞色素可溶形式的高分辨率结构 F, 结果结果与细胞色素完全不同 c1 和一个独特的 c-type细胞色素(
      • 索里亚诺泳装
      • 史密斯J.L.
      • 克莱默w.a.
      ),已从植物叶绿体中获得(
      • 马丁内斯S.E.
      • 黄D.
      • szczepaniak A.
      • 克莱默w.a.
      • 史密斯J.L.
      叶绿体晶体结构细胞色素 f 揭示了一种新型细胞色素折叠和意外的血红音连接。
      cyanobacteria(
      • Carrell C.J.
      • 张H.
      • 克莱默w.a.
      • 史密斯J.L.
      光合作用和呼吸中的生物学特性和多样性:叶绿体Rieske蛋白的腔侧结构域的结构。
      )和绿藻(
      • Sainz G.
      • Carrell C.J.
      • Ponamarev M.v.
      • 索里亚诺泳装
      • 克莱默w.a.
      • 史密斯J.L.
      细胞色素内部水链的中断 f 损害光合功能。
      )。
      作为更好地理解结构和演变的努力的一部分 b6f 复杂的完整质谱表征 b6f 复杂从菠菜上紫花板和 M. Laminosus. 已经进行了。这是来自多于一个字段的活性,乘法,整体膜蛋白复合物的第一个完全质谱表征,提供关于复合物的详细性质的精确信息,这有助于催化成功结晶 b6f complex.

      实验步骤

      细胞色素的制备 b6f 菠菜叶绿体和嗜热性蓝杆菌复合物 M. Laminosus. 已经描述了多肽的定量,血红素含量和复合物的活性(
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )。从两种来源分离的复合物中分离的复合物中氧化的还原癸基喹啉与吡啶鎓氧化的复合物中的电子转移活性在实验误差中相同,250-350电子/细胞色素 f/ s,与测量的活动相同 原位 或者 体内 (
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )。如前所述,在蓝藻复合物中没有FNR的情况不会影响线性电子转移(
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )。
      孤立的细胞色素样本 b6f 用质谱和馏分收集(LCMS +)液相色谱分析复合物。用氯仿/甲醇或冷丙酮沉淀蛋白质(200μg)。氯仿水溶液/甲醇相分离界面处的沉淀(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )如前所述(
      • Whitelegge J.P.
      • le cout J.
      • 李约。
      • 恩格尔C.K.
      • 私人G.G.
      • faull k.f.
      • Kaback H.R.
      朝向双层蛋白质组,大型完整跨膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )。除去水相并加入甲醇后回收沉淀的蛋白质。通过回收下阶段分离蛋白质(具有脂质样性能)的蛋白质。将沉淀的样品在大气压下在大气压下干燥2分钟(25℃)并在HPLC之前立即溶于60%甲酸(100μl)。通过加入1ml 80%丙酮(-20℃),剧烈混合1分钟,并孵育30分钟(-20℃)来实现丙酮沉淀。通过离心回收材料(30秒,以10,000× g 在微量电容中)。

       尺寸排除色谱 -

      如前所述,在氯仿/甲醇/ 1%甲酸(4:4:1,v / v)中进行秒(
      • Whitelegge J.P.
      • le cout J.
      • 李约。
      • 恩格尔C.K.
      • 私人G.G.
      • faull k.f.
      • Kaback H.R.
      朝向双层蛋白质组,大型完整跨膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )使用250μl/ min(40°C)的超SW2000柱(4.6×300mm,Tosoh Biosep)。将沉淀的蛋白质溶于60%甲酸(或70%乙酸)中,或使用100μl环加载下阶段的蛋白质。

       反相色谱 -

      如前所述进行完整内膜蛋白的反相色谱法(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )在100μL/ min(40℃)下,使用大孔聚合物载体(PLRP / S,300埃,5μm,2×150mm,聚合物实验室)。或者,柱预先在95%A,5%B(A,0.1%三氟乙酸中)在水中平衡; B,0.05%三氟乙酸中的乙腈/异丙醇(1:1)),并用5的复合线性梯度洗脱在注射后5分钟的%B,在30分钟后通过40%B,并在150分钟的100%B.洗脱液通过UV探测器(280nm)。

       LCMS + -

      使用插入HPLC检测器和质谱仪之间的液体流分离器伴随ESI-MS来收集级分。熔融石英毛细管用于将液体转移到ESI源(50cm)或馏分收集器(25cm)中。将级分以1分钟的间隔收集到微量离心管中。对于氰化物(CNBR)裂解(CNBR)裂解,将10体积的CNBR溶液(1g / ml在乙腈中)加入到各部分中,并在室温下在黑暗中温育3小时后,将样品通过离心蒸发干燥(SpeedVac,救助)。将肽溶于MALDI-TOF的70%乙酸的小体积(5μl)中。

       电喷雾电离质谱 -

      ESI-MS如前所述进行(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )使用三重QuadRupole仪器(API III,应用生物系统)。使用Macspec 3.3,Hypermass或BioMultiview 1.3.1软件(应用生物系统)进行处理。在具有孔电压和碰撞气体(99.999%氩气)厚度的标准条件下进行串联质谱(MSM),以实现母离子20-90%的颗粒。菠菜宠物和 M. Laminosus. 通过在Quadrupole飞行时间质谱仪(Q-STAR Pulsar,施用的生物系统,配备Protana Source)上使用纳米粥ESI-MSMS在逆相LCMS +期间收集的级分来分析PETG和PETL序列。
      使用高性能UV激光运动时间质谱仪(Voyager de-str,Applied Biosystems)在反射器模式下运行的高性能UV激光运动时间(Voyager de-str,Applied Biosystems)进行了飞行时间(Maldi-Tof)。将0.5μL基质溶液(10mg / mlα-氰基-4-羟基氨基酸,在0.1%三氟乙酸中,70%乙腈)与在LCMS +期间收集的0.3μl的HPLC级分混合(储存在-20℃)中。

      结果

      使用有机溶剂来提取脂质和颜料分子并沉淀复合物的多肽亚基。在氯仿/甲醇/水相分离的界面处沉淀(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )是有效的,尽管佩特和PETL被分配到富含氯仿的阶段,因此可以被视为蛋白质脂质。因此,最近分析在-20℃下使用80%丙酮中的沉淀。在用有机溶剂齐平后,使用高浓度的有机酸(70%乙酸或60%甲酸)来溶解蛋白质以立即HPLC分析。
      尺寸排阻色谱法质谱提供快速手段,用于分析纯化的膜蛋白,例如12个跨膜结构域乳糖允许(
      • Whitelegge J.P.
      • le cout J.
      • 李约。
      • 恩格尔C.K.
      • 私人G.G.
      • faull k.f.
      • Kaback H.R.
      朝向双层蛋白质组,大型完整跨膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )。 Fig. 1 当将该技术应用于细胞色素的组分时,描绘了结果 b6f复杂的。The absorbance and total ion chromatogram from mass spectrometry are shown for both spinach and M. Laminosus. (Fig. 1, AB, 分别)。该技术在从更高度保留的小分子污染物中分离蛋白质组分非常有效。因此,蛋白质首先洗脱,提供快速概述(<15分钟)复合物的组分。该技术的主要限制是色谱分辨率,使得较大的组分(15-35kDa)很大程度上是共同洗脱,产生复杂的重叠ESI光谱,必须通过适当的软件重建到零充电质量谱,有效地限制了个体的数量可以由SEC-MS解析的组件。产品的产品 佩塔-D以及在重建的零电荷光谱中检测到菠菜制剂中的FNR,并且通过鉴定原始质谱中的个体多肽的正品,其存在,确认它们的存在(Fig. 1C)。虽然仍然可以在质谱中仍然可以观察到较大的较大的亚基分解较大的小亚基图。1D)并且有助于零电荷重建中的噪声。然而,重建中的四个最突出的峰值对应于四个小亚基,通过仔细检查相应的乘法离子的质谱来证实(标记为 图。1Dm/z 频谱)和MALDI-TOF数据(未示出)。值得注意的是,相对峰值强度取决于丰富 除非已知后者,否则电离效率使得通过该测量的定量是不可靠的。细胞色素 b 具有相当低的电离效率,并且在基于SEC-MS的盲分析中,可能已经被认为是微不足道的。因此,通过第二种技术进行分析,具有更大的色谱分辨率,用于进一步定义复合物。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1电离子电离质谱尺寸排除色谱(LCMS +)在细胞色素的亚基水性有机溶剂中 b6f 复杂的菠菜(A) 和 M. Laminosus. (B)。用有机溶剂沉淀的亚基(100μg蛋白质)(参见“实验程序”)在以60%的甲酸中溶解在氯仿平衡的超SW2000尺寸排除柱(4.6×300mm,Tosoh Biosep)上。甲醇/ 1%甲酸水溶液(4:4:1,v / v)。两个都 A280 nm (上部面板)和总离子色谱图(较低的面板 )显示出满量程,表示每种情况下的100%相对强度。峰值吸光度 A 是750毫克里的氮素单位,B为630毫克。完全质量范围(600-2300)上的离子强度之和集成在每个扫描(6秒)中,并绘制了总离子色谱图的时间。蛋白质组分的洗脱完成15分钟,以及色谱图的后期部分 B 被省略了。 盒装C.,来自区域1的光谱对应于大亚基。 盒装D.,来自区域2的光谱由小亚基主导。这 y 所有情况下的轴都有任意单位。 C,大亚基。这 m/z 光谱由于较大亚基的共同洗脱是复杂的(上部面板)。解构的 m/z 频谱产生零充电的分子量谱(BioMultiview 1.3.1)允许鉴定五个大亚基,包括PETD,PETC,细胞色素 b,细胞色素 f, 和FNR (from 剩下正确的, 较低的面板 )。这 M. Laminosus. 制备显示仅存在前四个亚基(未示出)。应该注意的是,虽然观察到细胞色素的强信号 f,petc,petd和fnr,在现有的情况下,细胞色素的相对电离效率 b 低使得在所示的零电荷分子质量谱中,其具有细胞色素的强度的~1% f。区分真正的细胞色素 b 来自噪声的信号有必要用反相色谱法进行进一步的实验,以更彻底地解析细胞色素 b ()。 D,小亚基。 SEC分离确实允许将小亚基与仍然显示来自较大蛋白质的信号的光谱部分分离。虽然四个小亚基是重建零电荷谱中的四个最强的峰值(较低的面板 ),来自较大蛋白质的信号导致了一个相当嘈杂的基线,需要仔细检查质谱中的适当离子,标记为 上部面板 (这 信件 使用缩写亚基的名称,以及 数字 表示收费的数量)。
      反相色谱与MS与MS合并,以获得复杂的高分辨率分析(Fig. 2)。虽然色谱分离显着更长,但在实验中几乎所有亚基都会解决,允许考虑定量的吸光度测量,尽管应该指出色谱洗脱效率
      当梯度作为梯度时,特别是多肽群的百分比通过有利的有机溶剂浓度,用于将该多肽转移到流动相中。
      所有亚基不是100%。添加异丙醇至缓冲液B显着增强了原来报告的许多整体膜蛋白的洗脱效率(
      • Tarr G.E.
      • Crabb J.W.
      疏水蛋白的反相高效液相色谱及其片段。
      ),提供可行的替代方案,在此情况下 b6f 复合物,含有60%甲酸的溶剂系统(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )。最重要的是洗脱大量细胞色素的能力 b 在靠近Proteolipid PETN的较高有机溶剂浓度下转移到流动相的多肽。细胞色素的质谱 b 说明了噪声的信号(图2C.)。显示零电荷重建,用于所有菠菜亚基和存储用于存储的材料的典型异质性的水平 短的 periods at −80 °C (图2D)。 M. Laminosus. 材料还显示出类似的异质性水平(细胞色素 b 显示出),没有其他大量的亚基(参见所示的总离子色谱图 图。2B)。用ESI-MS测量的九个叶绿体和八个蓝藻亚基的质量显示在 表I.。在某些情况下,测量的质量非常适合基于注释的数据库条目(SWISS-PROM)计算的质量。在菠菜,FNR,PETC和Petd非常一致(<测量的0.015%偏差 相对 计算质量)与当前条目,而围绕细胞色素的更大的不确定性 f 和细胞色素 b 除了相对于基因组序列的表征不太表征的蓝细菌亚基。在两种物种中,细胞色素 b 即使在理论批量计算中包含血红素分子,也表现出最大的质量差异。因为据认为,两种与细胞色素相关的血液 b 是非共价结合的,是在ESI过程中仍然是非共价相关的可能性,尽管这种在所用样品制备/电离的条件下罕见的观察。或者,应考虑不稳定的共价修饰,我们注意到在原始的22kDa处存在血红色染色带的存在 b6f 制备在细胞色素上提供强烈血红素的先例 b 在SDS-PAGE(29)期间没有解离。当然,其他修改是可能的,并且存在大约一个叶绿素 a 每种细胞色素的一个海螺酮类胡萝卜素 b6 最近报道了亚基(
      • 博纳沃斯基U.
      • 温克斯。
      • 施耐德D.
      • jager c.
      • Rogner M.
      在本地状态下分离膜蛋白亚基:叶绿素和类胡萝卜素对B的选择性结合的证据6 细胞色素B的亚基6F复杂。
      )。虽然通过来自LCMS +的CNBR处理的级分的肽质量指纹识别确认了四个大亚基的身份(参见 补充数据),正在进行进一步分析以完全描述细胞变色的主要结构 fb.
      图缩略图GR2.
      Fig. 2逆相色谱 - 质谱(LCMS +)细胞色素 b6f 复杂的 subunits.A,总离子和 A280 nm 200μg菠菜复合物蛋白质的反相分离的色谱图,用80%丙酮沉淀,并在注射之前溶解在70%乙酸中。色谱法在0.1%三氟乙酸水溶液中用乙腈/ 2-丙醇洗脱(参见“实验程序”)。 B,总离子色谱图 M. Laminosus. 准备。 C,电喷雾电离质谱(m/z)和重建细胞色素的零电荷分子量谱 b from spinach (上部面板) 和 M. Laminosus. (较低的面板 )。共洗脱多肽的离子根据其缩写的身份和电荷状态标记(N*是指单氧化,较少保留的佩特形式)。 D,重建零电荷的零电荷分子量谱,剩余的菠菜大亚基,Petd,Petc,细胞色素 f, 和FNR, respectively. M. Laminosus. 亚基佩德,宠物和细胞色素 f 显示出类似的分子异质性水平。仅在菠菜制剂中观察到大量的FNR。与LCMS +的级分伴随的级分提供了每种多肽的高度富集的来源以进一步分析。 SM.,小分子; cyt.,细胞色素。
      表I.菠菜和m.薄层菌族细胞色素b6通过电喷雾电离质谱法复合亚基
      蛋白质测量质量
      a 平均质量,三次测量的平均值,±S.D。
      计算质量
      b 基于自然同位素丰富和可用序列/修改数据计算的平均质量。 na,不可用。这 M. Laminosus. PETC和PETD群众基于Nostoc序列,被认为是最同源的。
      修改
      c 修饰包括蛋白水解除去过境肽(36-320表示1-35)或引发蛋氨酸, N - N末端的甲醛(依赖于甲基甲基硫醚的保留),在公开的基因组翻译和实验确定的血红素序列和存在之间存在差异。
      Spinacea Oleracea
       FNR35,313.9±1.835,313.7
       Cytochrome f31,934.7±0.632,035.8.36-320,+血红
       Cytochrome b24,886.9±1.224,782.1.+血红素
       PetC18,935.8±0.318,938.6.69-247,+ 1二硫化物
       PetD17,311.8±0.517,313.6减去梅达1
       PetG4,197.5±0.24,198.0N - 甲醛
       PetM3,971.9±0.23,972.7
       PetL3,477.8±0.13,478.2.N - 甲醛,Ser-2→PHE
       PetN3,197.1±0.43,197.8.N - 甲醛
      M. Laminosus.
       Cytochrome f32,269.6±3.332,269.4.+血红素
       Cytochrome b24,709.6±1.024,884.2+血红素
       PetC19,294.8±1.619,202.8
       PetD17,528.4±0.517,521.9
       PetG4,057.4±0.2NA.N - 甲醛
       PetM3,841.0±0.33,841.7.
       PetL3,530.4±0.23,530.5.N - 甲醛
       PetN3,303.6±0.23,304.0N - 甲醛
      a 平均质量,三次测量的平均值,±S.D。
      b 基于自然同位素丰富和可用序列/修改数据计算的平均质量。 na,不可用。这 M. Laminosus. PETC和PETD群众基于Nostoc序列,被认为是最同源的。
      c 修饰包括蛋白水解除去过境肽(36-320表示1-35)或引发蛋氨酸, N - N末端的甲醛(依赖于甲基甲基硫醚的保留),在公开的基因组翻译和实验确定的血红素序列和存在之间存在差异。
      朝着细胞色素的亚基的完整描述 b6f 复杂,对MSM进行MSM以生成序列数据。 Fig. 3 描绘了在菠菜和PETG的PETL上选择的MSM实验的结果 M. Laminosus.。选择完整父母的MSMS是被选择的,因为裂解后跨膜结构域的恢复相关的困难。在菠菜petl的情况下(图3A)将双重电荷的父母分离以产生与Y3-Y20和B2-B13相对应的单电荷的女儿,提供与由菠菜氯体组合物基因组翻译的序列进行比较的重叠序列信息,在这种情况下易于同意PHE的存在。位置2(CNBR实验证实了在第1位的甲酰基 - 满足的存在(参见 Fig. 3 传奇)。)。如果是 M. Laminosus. 佩特格 (图3B.)三重带电的母离子是分散的,产生多种片段,一到三个电荷。这 插入 示出了从相同的质谱中放大的三个带电子离子,示出了利用允许分配充电状态的混合四极杆飞行时间仪器获得的分辨率,这是一种从较大的乘法的父子离子解释MSMS光谱的伟大资产。在没有基因组数据的情况下 M. Laminosus.,这种物种的小亚基的光谱被解释为 德诺维 与其他物种的可用序列相比。虽然可以完全分配PETN,PETL和PETM蛋白,但PETG序列可以仅读取到第29位。菠菜叶绿体基因组的产品, 佩特格, 佩尔, 和佩特,所有保留他们的发起甲酰甲硫氨酸,而核编码 宠物 从细胞质导入后裂解产物(表二)。有趣的是,宠物来自 M. Laminosus. 是虽然在与其他亚基相同的基因组中编码,但仍然是含有蓝藻的唯一小亚基,其N末端未含有茂化的蛋白质(表III)。将叶绿体编码的亚基的序列与菠菜叶绿体基因组的最近可用序列的翻译进行了比较(
      • Schmitz-Linnewebeber C.
      • 迈尔下午
      • Alcaraz J.P.
      • Cottet A.
      • Herrmann r.g.
      • Mache R.
      菠菜的塑性染色体(Spinacia oleracea):完全核苷酸序列和基因组织。
      )。虽然PETG和PETN的序列显示出没有差异,但在PETL的第2位(原始数据,MS-MACTERSFSF.EDU/)输出的第2位,对所有八个小亚基的输出和菠菜PETL数据的注释分配进行了检测到的pHE提供 补充数据)。菠菜叶绿体基因组在第2位报告偶数的密码子,暗示DNA测序误差或先前未被发现的RNA编辑事件的存在。与翻译相比,菠菜PETM序列显示了许多主要是保守的改变 拟南芥帕特兰 序列,并指出氯气(www.cbs.dtu.dk/services/chlorop/)正确鉴定了PETM的叶绿体位置,预测的N末端是不正确的。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3细胞色素小亚基的序列测定 b6f 来自菠菜和蓝色的复合物 M. Laminosus.。菠菜佩特,petl和petg的序列以及 M. Laminosus. 佩特和PETG使用三重四极杆质谱仪(API)由SEC-MSMS测定 III,应用生物系统)。 A,菠菜PETL的MSMS光谱双电荷父母(1740.2)显示Y3-Y20和B2-B13片段(B8-B13标记 b 为了清楚起见;提供完整的赋值表 )除了PHE存在之外的已发表的基因序列,除了报告的SER,还证实了N末端(未检测到B1片段的B1片段)的甲酰基的存在,其中来自LCMS +含有菠菜百分之一的样品用CNBR治疗。所得产物的测量质量(3317.9405)证实了甲醛的除去,从而证明了第2位的pHE存在(见 )。 B,进行纳米电喷雾MSM以完全测定菠菜和 M. Laminosus. PETM和N-末端29-氨基酸序列 M. Laminosus. PETG。所示的MSMS光谱是通过PETG的三个带电离子(1352.5)的MSM获得的 M. Laminosus. 在LCMS +期间收集的级分。使用Tripy和二次充电父离的MSMS光谱,可以解决主要结构 M. Laminosus. 从n末端到第29次残留物的petg。离子 插入 来自Triply电荷的父离子的MSMS光谱,示出了通过现代四极杆飞行时间(Q-STAR Pulsar,应用生物系统;纳米Pray源,Protana)实现的分辨率。这种离子对应于Y343+,假设蛋白质是37个氨基酸长。通过将实验数据与使用Clustalw(NPSA-PBIL.ibcp.fr/)对齐的所有公开的同源物的比较来手动解释MSMS光谱。
      表二菠菜细胞色素B的氨基酸序列6由MSMS确定的复杂的小亚基
      亚基
      a 将叶绿体编码的亚基与菠菜叶绿体基因组(
      • Schmitz-Linnewebeber C.
      • 迈尔下午
      • Alcaraz J.P.
      • Cottet A.
      • Herrmann r.g.
      • Mache R.
      菠菜的塑性染色体(Spinacia oleracea):完全核苷酸序列和基因组织。
      )。 Petm与其相比 A. Thaliana. 同源物。序列分歧是粗体的。 MSM不会区分ILE和LEU,因此可以在可能的情况下通过同源性分配。
      顺序
      b 单同质缺失没有 13C。
      质量(m + h+)(计算)
      b 单同质缺失没有 13C。
      质量(m + h+)(测量)
      c 第一同位素峰的高分辨率maldi-tof(零 13C)。
      Δ
      PPM.
      佩特格4formylmievflfgiv llipitlag lfvtaylqyr rgdqldl4196.32314196.32290.05
      NP05495. MieTflfgiv Llipitlag LFVTaylqyr RGDQLDL
      宠物naaaeifria avmngltlvg valgfvllri eatveeae3971.16803971.18033.10
      A. Thaliana.NA.vg.EIFKIA A.ImALTLVG VA.VGfvllri E.TS.Veeae.AE.
      佩尔formylmftltsyfgf llaaltitsa lfiglnkirl我3476.96353476.97272.65
      NP05495.3. nMStltsyfgf llaaltitsa lfiglnkirl我
      佩特formylmdivslawaa lmvvftfsls lvvwgrsgl.3196.69433196.67466.19
      NP054925 mdivslawaa lmvvftfsls lvvwgrsgl.
      a 将叶绿体编码的亚基与菠菜叶绿体基因组(
      • Schmitz-Linnewebeber C.
      • 迈尔下午
      • Alcaraz J.P.
      • Cottet A.
      • Herrmann r.g.
      • Mache R.
      菠菜的塑性染色体(Spinacia oleracea):完全核苷酸序列和基因组织。
      )。 Petm与其相比 A. Thaliana. 同源物。序列分歧是粗体的。 MSM不会区分ILE和LEU,因此可以在可能的情况下通过同源性分配。
      b 单同质缺失没有 13C。
      c 第一同位素峰的高分辨率maldi-tof(零 13C)。
      表IIIM.薄片细胞色素B的序列6由MSMS确定的复杂的小亚基
      亚基
      a 由质量和序列同源鉴定的亚基。 MSM不会区分ILE和LEU,因此可以在可能的情况下通过同源性分配。
      顺序质量(m + h+)(计算)
      b 单同质缺失没有 13C。
      质量(m + h+)(测量)
      c 第一同位素峰的高分辨率maldi-tof(零 13C)。
      Δ
      PPM.
      佩特格
      d na,不适用。 PETG无法在29号位置测序(见 补充数据)。
      formylmveplldglv lgvfatlgg lfyaayqqy ...NA.
      d na,不适用。 PETG无法在29号位置测序(见 补充数据)。
      4056.226NA.
      宠物mteemlyaal lsfglifvgw glgvlllkiq gaeke3840.0743839.98822.4
      佩尔Formylmilgavfyiv Fialffgiav Giifaiksik李3529.1083529.05614.7
      佩特Formylmeidvlgwva llvvftwsia mvvwgrngl 3302.7473302.48978.1
      a 由质量和序列同源鉴定的亚基。 MSM不会区分ILE和LEU,因此可以在可能的情况下通过同源性分配。
      b 单同质缺失没有 13C。
      c 第一同位素峰的高分辨率maldi-tof(零 13C)。
      d na,不适用。 PETG无法在29号位置测序(见 补充数据)。

      讨论

      获得所有蛋白质类别的全面覆盖是真正的蛋白质组学研究的重要要求,一些整体膜蛋白质,尤其是具有多种跨膜螺旋的较大蛋白质,在这方面具有独特的挑战。虽然二维凝胶技术的改进正在解决问题(
      • 米尔合金M.P.
      固定化pH梯度膜蛋白的二维电泳。
      ,
      • Santoni V.
      • 米尔合金M.
      • rabilloud t.
      膜蛋白质和蛋白质组学:联合国的可能是不可能的?
      ),SDS-PAGE确定的分子量的低精度和分辨率限制了这种技术在完整的质量蛋白质组学中的这种技术。通过ESI-MS完整的质量测量提供质量准确度,通常超过0.01%(100ppm),并且足以观察大约100kDa的蛋白质的第一氧化加合物(16Da)的分辨率,提供有吸引力的替代技术,用于监测经常伴随生理适应的微妙变化(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )。重要的是,已经开发了HPLC分离,包括反相和尺寸排除方案,其允许用于色谱法的大型完整膜蛋白和在线ESI-MS(
      • Whitelegge J.P.
      • Gundersen C.
      • faull k.f.
      完整的内在膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      ,
      • Whitelegge J.P.
      • le cout J.
      • 李约。
      • 恩格尔C.K.
      • 私人G.G.
      • faull k.f.
      • Kaback H.R.
      朝向双层蛋白质组,大型完整跨膜蛋白的电喷雾电离质谱。
      )。虽然早期的研究依赖于相当高度纯化的蛋白质制剂,但希望这些技术可以应用于更复杂的混合物,并且最近对紫花板巨大蛋白质组的分析证明了高性能反相分离可以在50和100个完整的蛋白质之间分解群众(完整质量标签)在单一尺寸分析中(
      • Gómezs。
      • Nishio J.
      • faull k.f.
      • Whitelegge J.P.
      通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
      )。同样的研究还强调,在增加混合物的复杂性提供更大的蛋白质组覆盖的同时,返回到简化的纯化的蛋白质复合物,得到了改善的检测与主要成分相关的轻微同种型。因此,为了详细分析功能复合物,将它们进行单独的分析是合理的。

       整体膜蛋白的尺寸排除和反相色谱

      尺寸排除和反相色谱分离的组合允许全亚基覆盖细胞色素分析 b6f 从真核生物和原核生物的光合膜复合,强调这些方法的优缺点。秒提供复杂组件的快速概述,尽管色谱分辨率有限。反相色谱法提供更详细的单个组分在较长时间内的分离过程中,尽管在这种情况下,通过在0.1%三氟乙酸缓冲液中的特定组分的洗脱效率降低,但在这种情况下是限制的细胞色素 b6。通过用60%的甲酸/异丙醇洗脱第二次,可以克服该问题,因为有效洗脱较大的PS2亚基PSBA-D所必需的(
      • Gómezs。
      • Nishio J.
      • faull k.f.
      • Whitelegge J.P.
      通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
      ),实际上这种分析证实细胞色素的不完全洗脱 b6 在初级分离(数据未显示)。后一点是注释在定量中使用紫外线测量值。

       细胞色素B中的额外亚基ESI-MS的文档/发现6F复杂:FNR和小亚基

      在明确的质谱分析之前,存在第五“大亚基”的存在 b6f 复杂是有争议的。

       FNR.(Peth) -

      菠菜中额外的FNR亚基的可能性 b6f 复杂的是后勤和同事(
      • 克拉克R.D.
      • 后G.
      分离五种多肽细胞色素 b-f 来自菠菜氯骨质的复合物。
      )并由Hauska(
      • 伤害E.
      • Hauska G.
      细胞色素 f/b6 五种多肽复合物,具有菠菜叶绿体的塑料喹啉 - 增塑酶 - 氧化酶活性。
      )。然而,凝胶电泳为菠菜复合物中的活性FNR复合物的存在提供了明确的证据,其特化学计量水平具有重要意义,用于调节循环电子传输和NADP的活性位点的光合膜中的位置+ 减少由照相介导的(
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )。尚未在从蓝杆菌分离的复合物中检测到FNR M. Laminosus. (图。 12 以上;参考。
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )在正常存在下生长(~0.1 m)盐浓度。在这些条件下,具有9kDa N-末端延伸的FNR蛋白与植物硅胺结合(
      • Schluchter下午
      • Bryant D.A.
      Ferredoxin-NADP的分子表征+ 氧化还原酶在蓝藻中:SyneChoccus sp的Peth基因的克隆和序列。 PCC 7002和基因产物的研究。
      )。已经提出,响应高盐下的生长(〜0.55 m)条件,FNR与囊膜膜中的不同部位结合(
      • van thor J.J.
      • Jeanjean R.
      • Havaux M.
      • Sjollema K.A.
      • JOSET F.
      • hellingwerf k.j.
      • Matthijs H.C.
      SyseChocystis PCC 6803中的盐触可诱导光照电极系统I循环电子转移依赖于Ferredoxin的结合:NADP+ 通过其CPCD Phycobilisome-Linker同源N-末端结构域还原到囊体膜上。
      )。
      已经表明,FNR在功能上与纯化的菠菜细胞色素相关联 b6f 复杂的 体外 (
      • 张H.
      • Whitelegge J.P.
      • 克莱默w.a.
      黄酮核苷酸:Ferredoxin还原酶是植物细胞色素的亚基 b6f complex.
      )。
      H.张和W. A. A. Cramer,在准备中。
      Cytochrome f 通过减少的福兰辛/ NADPH减少2,5-二溴-6-异丙基-3-甲基-1,4-苯醌抑制,并且减少的半时间受到常规时间(1-2秒)的限制在光谱仪中混合。因此,在植物中存在FNR b6f 复杂意味着FNR在循环电子传输中的显着生理作用。的作用 b 这种途径中的细胞变色是不明确的,因为它们的NADPH / FERREDOXIN的减少远比细胞色素慢得多 f (
      • 令人毛骨悚然的p.n.
      • GIRVIN M.E.
      • 克莱默w.a.
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      )。这可能是使用不严格厌氧的条件的结果。目前尚不清楚FNR是否在所有叶绿体中化学计量 b6f preparations (
      • 伤害E.
      • Hauska G.
      细胞色素 f/b6 五种多肽复合物,具有菠菜叶绿体的塑料喹啉 - 增塑酶 - 氧化酶活性。
      )。由于在隔离或倒档期间,FNR的替代恢复可能导致来自复合物的亚基损失 体内。虽然FNR在循环电子传输中的作用是合理的 b6f 在基质薄片中,这不是这种情况 b6f 在膜上的膜区。
      更高植物的另一个方面 b6f 可能受到结合的FNR影响的功能是蛋白激酶调节的功能。激酶激活的当前模型涉及通过以二聚体形式的构象变换来传输关于复合物腔侧的脊髓侧面的脊髓侧面的构象状态的信息。 b6f 复杂的 (
      • Finazzi G.
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      细胞色素抑制剂的对比作用 b6f 在国家过渡的复杂 衣原体 Reinhardtii.。 Qo Site instancy在LHCII激酶激活中的作用。
      )。已经提出外周蛋白可以调节复杂的行为(
      • Wollman F.a.
      状态转换揭示了光合仪器的动态和灵活性。
      ),FNR肯定是候选人。值得讨论是FNR的潜力,以提供用于将基质还原剂状态通信的界面 b6f 复合物和激酶调制的监管系统。这种调节作用并不要求所有复合物都结合FNR,但只是基质福兰辛/ NADPH浓度在该对照点处发挥适当的调节压力。可以通过在不同生长条件下表达的FNR的量和其他亚基蛋白质的丰度或状态来调节该贡献。

       小亚基(Petg,Petl,Petm和Petn) -

      在原始报告1至三种酸性丙酮中可提取的小蛋白质<6 kDa (
      • 伤害E.
      • Hauska G.
      用氧化还原中心亚单元从菠菜叶绿体中鉴定细胞色素B6 / F复合物中的多肽。
      )和鉴定第一小疏水亚基 b6f 复杂的 maize (
      • Haley J.
      • Bogorad L.
      与细胞色素B6-F复合物相关的4-KDA玉米叶绿体多肽:亚基5,由叶绿体编码 皮特 gene.
      ),在高等植物的复合物中发现了四种如此小(分子量= 3.2-4.2kDa)多肽,PETG,PETM,PETN和PETL(

      Whitelegge,J.P.,Zhang,H和Cramer,W​​. A.(2001) 2001年8月18日至23日的第12届国际会议第12届国际会议议事诉讼,抽象。 S11-022,Csiro Publishing,Collingwood,维多利亚,澳大利亚

      )和蓝细菌来源(

      Whitelegge,J.P.,Zhang,H和Cramer,W​​. A.(2001) 2001年8月18日至23日的第12届国际会议第12届国际会议议事诉讼,抽象。 S11-022,Csiro Publishing,Collingwood,维多利亚,澳大利亚

      ,

      Schneider,D.,Berry,S.,Wenk S. O.,Boronowsky,U.,Jäger,C.,De Weer,F. L.,Dekker,J.P.,以及Rögner,M(2001) 2001年8月18日至23日的第12届国际会议第12届国际会议议事诉讼,抽象。 S11-012,Csiro Publishing,Collingwood,维多利亚,澳大利亚

      )最近从 衣原体 (
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      • POPOT J.L.
      • Finazzi G.
      亚基IV和PETL的嵌合融合 b6f 复杂的 衣原体 Reinhardtii.。国家转型的结构影响和后果。
      )。这些小亚基的功能尚不清楚,尽管各的结构基序可能是单一跨膜跨越α-螺旋。这种性质的多肽亚基不存在于细胞色素中 公元前1复杂的。Many such subunits have been found in the reaction center complexes of PS1 and PS2, and they may serve as a unique kind of integral membrane “hydrophobic filler” in photosynthetic membrane protein complexes (
      • 克莱默w.a.
      • 索里亚诺泳装
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      关于细胞色素的一些新的结构方面和旧争论 b6f 含氧光合作用的复合物。
      )组装和/或复合物的稳定性的关键作用。据报道,在 C。 Reinhardtii. 删除突变体的光谱营养增长受损 佩特格 (
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      删除 佩特格衣原体 Reinhardtii. 扰乱细胞十字 BF. complex.
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      叶绿体YCF7(佩尔)开放阅读框架 衣原体 Reinhardtii. 编码细胞色素B的小功能重要亚基6F复杂。
      )由于细胞色素的显着降低 b6f 等级。在a中观察到类似的效果 佩特 在烟草中删除突变体(
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      目标灭活最小的体积基因组编码的开放阅读框芽揭示了细胞色素的新颖和必需的亚基 b6f complex.
      )。与其他三个小亚基不同, 宠物 对细胞色素的组装和功能不是必需的 b6f 复杂的 SyneChocystis. sp. PCC 6803 (
      • 施耐德D.
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      百分子亚基在蓝藻细胞色素中的调节作用 b6f complex.
      )。
      Petg,Petl和Petn是在高等植物和藻类中编码的叶绿体。然而,PETM是绿藻中的核编码基因产物 C. Reinhardtii. (
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      宠物亚基的表征 b6f 来自高等植物的复合物。
      )。序列比较显示PETG蛋白(基于29序列)的52%(30%同一性和22%伪识别)和56%(28%同一性和28%伪识别)(基于20个序列) 。 PETM保守的相似性为29%(基于12个序列的6%同一性和23%的伪鉴定)。在PETL序列中,未发现保守的残留物,并且只有19%的伪识别(基于22序列)。来自四个小亚基的序列 M. Laminosus. b6f 复杂与来自蓝色细菌的那些具有高相似性 nostoc sp。 PCC 7120。 Fig. 4 显示可用PETL序列的对齐,包括 M. Laminosus. 这里描述的序列。最保守的特征似乎是右侧位置6的酪氨酸残基,并且基本残余物​​来自C末端的约4个残基。应注意,两个序列显示在菠菜蛋白的第2位的对该残留物的观察中的位置2中的pHE。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4可用PETL序列的序列对准。 实验确定 M. Laminosus. 将PETL序列与来自国家生物技术信息中心(NCBI)(2002年7月4日)使用Clustalw(NPSA-PBIL.IBCP.FR/)的其他PETL序列进行比较。注意,菠菜基因序列在第2位报告丝氨酸,而我们实验确定的序列在该位置显示苯丙氨酸()。
      迄今累计没有足够的基因组数据,以允许涉及节约蓝藻的小多肽补体的结论 b6f复杂的。In the two cyanobacterial genomes completed thus far, nostoc sp。 PCC 7120和 SyneChocystis. sp。 PCC 6803仅包含三个小亚基的基因, 佩特格, 宠物, 和佩特 作为注释。但是,据报道,佩尔的存在 SyneChocystis.以及其他三个小亚基(

      Schneider,D.,Berry,S.,Wenk S. O.,Boronowsky,U.,Jäger,C.,De Weer,F. L.,Dekker,J.P.,以及Rögner,M(2001) 2001年8月18日至23日的第12届国际会议第12届国际会议议事诉讼,抽象。 S11-012,Csiro Publishing,Collingwood,维多利亚,澳大利亚

      )基于纯化复合物的质谱分析。爆炸搜查尚未允许我们识别 佩尔 同源物 SyneChocystis. sp。 PCC 6803.部分基因组数据 synechocccus. sp。 PCC 7002和7942显示存在 佩特格宠物,虽然存在 佩尔佩特 is not yet clear.
      质谱分析表明纯化的兴趣是重要的兴趣。纯化 b6f 来自菠菜和蓝色的复合物 M. Laminosus. 包含包括PETL在内的所有四个小亚基。人们可以推测宠物亚基的存在 M. Laminosus. 复杂是因此,它是迄今为止唯一可以净化活性二聚体的蓝藻 b6f复杂的。The basis for this speculation is the finding that the absence of the PetL subunit in a mutant of C。 Reinhardtii. 使复合物的活性二聚体形式稳定有利于无活性单体(
      • Breyton C.
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      • 橄榄j.
      • Dubacq J.P.
      • POPOT J.L.
      细胞色素的单体转化二聚体 b6f复杂的。Causes and consequences.
      )。据报道,磷酸化的15.2-KDA PETO亚基在“温和”的制剂中报道 C。 Reinhardtii B.6f 在纯化中不包括羟基磷灰石色谱(
      • 哈梅尔P.
      • 橄榄j.
      • 皮埃尔y.
      • Wollman F.a.
      • De Vitry C.
      细胞色素的新亚基 b6f 在状态过渡时,复杂经历可逆磷酸化。
      )。在另一个活跃的活性准备中没有看到Peto C。 Reinhardtii. 包含此步骤的复杂(
      • 皮埃尔y.
      • Breyton C.
      • 克拉姆斯D.
      • popot j.-l.
      细胞色素的纯化和表征 b6f 复杂的 衣原体 Reinhardtii。.
      )并且尚未在其他来源的任何制剂中看到,包括来自菠菜或蓝藻的其他来源。尚未识别的15.2kDa组分在胚泡囊压分数的LCMS分析中发现(
      • Gómezs。
      • Nishio J.
      • faull k.f.
      • Whitelegge J.P.
      通过来自液相色谱质谱法的完整质量测量来限定的叶绿体颗粒蛋白质。
      )但同源性搜索 A. Thaliana. 不提供更高植物同源物的证据 佩托。在这里研究的制剂中没有出现PETO的直接证据已经获得,但正在研究潜在代表弱束缚和非化学计量亚基的次要组分。蓝藻的第五个小亚基 b6f Petp,已基于对纯化复合物的MALDI-TOF分析来提出的 SyneChocystis. sp。 PCC 6803揭示了8-KDA组件(

      Schneider,D.,Berry,S.,Wenk S. O.,Boronowsky,U.,Jäger,C.,De Weer,F. L.,Dekker,J.P.,以及Rögner,M(2001) 2001年8月18日至23日的第12届国际会议第12届国际会议议事诉讼,抽象。 S11-012,Csiro Publishing,Collingwood,维多利亚,澳大利亚

      )。我们确实检测到我们的8,117 da的组成部分 M. Laminosus. 制剂,当通过反相LCMS +分析时,组分的化学计量尚不清楚; 8,117-DA组分与PETD否定使用当前可用的吸光度数据的使用。

       Rieske同种型(PETC) -

      存在三个 宠物 基因 SyneChocystis. sp. PCC 6803 (
      • 施耐德D.
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      细胞色素中的异质rieske蛋白 b6f 复杂的 SyneChocystis. PCC 6803.
      )产生18,996,18,685和13,720 da的潜在同种型,而唯一的 宠物 可用的序列 M. Laminosus. 具有19,203Da的理论分子量。我们已分配为PETC的主要成分具有19,295Da(保留时间,57.2分钟)的分子量; 18,909 da(54.4分钟)和14,800 da(52.6分钟)的次要组分可以代表 M. Laminosus. PETC同种型。虽然PETC在菠菜的二维凝胶分析表明存在第二个Rieske同种型,如烟草已知的(
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      两种不同的rieske铁 - 硫蛋白在细胞色素中的证据 b6f 菠菜叶绿体复合物。
      ),我们没有根据质量谱证据找到此类物种的任何证据。同种型在质量/保留中非常相似,或者第二同种型表示为低,不可检测的水平。进一步注意到天冬氨酸/异己酯转化的单个自发天使转化将显着改变PI,同时仅通过+1Da改变质量。
      上面讨论的困难突出了蛋白质组学中改善定量的需求。基于LCMS +期间收集的级分的下游分析更准确地识别和定量次要同种型的技术。

      致谢

      PASAROW家族和W.M.Keck Foundation感谢对仪器购买的贡献。我们感谢Joseph A. Loo(UCLA)和Christie Hunter(Applied Biosystems),用于救援Petg(M. Laminosus.)和PETG和PETM(菠菜)和K. F. Faull(UCLA)和J. Yan(Purdue)有用的讨论。

      补充材料

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