映射网站 O-GLCNAC使用亲和标签进行丝氨酸和苏氨酸的翻译后修改*

  • Lance Wells.
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  • 珍妮特M. Cronshaw.
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生研究院的支持CA43486和DK61671(对GWH),美国癌症协会授予RSG-01-064-01-CSM(至MJM),国家研究服务奖学金奖学金CA83261(对LW)和GM20528 (到kv)。 MALDI分析是在约翰霍普金斯医学院进行的应用生物系统的质谱设施,部分由约翰霍普金斯医学发现基金,细胞工程研究所和国家研究资源中心共享仪器授予1S10-RR14702 (到gwh)。在Covance Research产品之间的许可协议下,Hoffman Laroche和Johns Hopkins University,HART博士获得了大学销售CTD 110.6抗体的份额。该安排的条款是由约翰霍普金斯大学根据其利益冲突管理的管理。
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
      识别蛋白质翻译后修饰的网站是一个重大挑战 in proteomics. O- 链接β-N - 乙酰甘氨酸(O-GLCNAC)是一种动态核细胞质改性,更类似于磷酸化 比古典复杂 O- 糖基化。我们描述了一种基于质谱的识别方法 of sites modified by O- 依赖于轻度β-消除的Glcnac,然后用二硫代噻唑加入迈克尔 (Bemad)。使用合成肽,我们还表明生物素戊胺可以取代 Dithiothreitol作为亲核官。改性肽可以有效富集 通过亲和层析,并且可以使用串联质谱法映射位点。 这种相同的方法可以应用于丝氨酸和苏氨酸磷酸化的映射位点, 我们提供了一种使用修饰特异性抗体和酶的策略 区分两种翻译后修改。 Bemad方法 通过映射三个先前识别的验证了 O- GlcNAC位点以及三个新颖的网站,突出纯化来自大鼠大脑。 然后将Bemad用于纯化的核孔隙络合物制剂以映射新的网站 of O- Lamin B受体的GlcNAC改性和核致核苷酸NUP155。这种方法 适用于进行定量质谱,也可以调整 量化半胱氨酸残基。此外,我们的研究强调了重要性 区别 O- 磷酸盐与o-GLCNAC在翻译后修改后丝氨酸和苏氨酸的位置 使用β-消除/迈克尔添加方法。

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