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功能性蛋白质组学的化学策略*

  • Gregory C. Adam.
    隶属关系
    Scrapgs Chemicalia和Chemistry系,Scripts Research Institute,La Jolla,California 92037
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  • Erik J. Sorensen.
    隶属关系
    Scrapgs Chemicalia和Chemistry系,Scripts Research Institute,La Jolla,California 92037
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  • 本杰明F. Cravatt.
    一致
    应讨论对应的通信:Cell Biology,Scripps Inst。,10550 N.Torrey Pines Rd。,La Jolla,CA 92037。电话。:858-784-8633;传真:858-784-2798;
    隶属关系
    Scrapgs Chemicalia和Chemistry系,Scripts Research Institute,La Jolla,California 92037

    Cellipps研究所,La Jolla,加利福尼亚州Scripts研究所92037
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了NCI,国家健康机构赠送CA87660,加州乳腺癌研究计划,ActivX Biosciences和Skaggs化学生物学研究所。
      具有现在可用于若干原核和真核生物的完整基因组序列,将生物研究人员负责将分子和细胞功能分配到数千个预测的基因产品的任务。为了解决这个问题,蛋白质组学领域寻求开发和应用蛋白质表达和蛋白质功能的全局分析方法。在这里,我们审查了一个有前途的新类蛋白质组学策略,它利用合成化学来制造工具和测定,以表征蛋白质样品的高复杂性。这些方法包括在细胞和组织蛋白质组中测量蛋白质的相对表达水平和翻译后改性状态的化学亲和力标记。此外,我们讨论了基于活性的蛋白质分析的新兴领域,其旨在合成和应用小分子探针,即在复杂蛋白质组中监测蛋白质功能中的动态。
      响应许多生物的完全基因组序列的可用性,蛋白质组学领域出现了开发和应用方法的目标,从而加速蛋白质的功能分析(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      蛋白质组和蛋白质组学:新技术,新概念和新词。
      ,
      • Pandey A.
      研究基因和基因组的蛋白质组学。
      )。蛋白质组学的策略通常可以分为两个类,具有互补目标:1)蛋白质表达的全局表征,以及2)蛋白质功能的全局表征。测量蛋白质表达的大规模努力通常依赖于二维凝胶电泳(2DE)的组合,
      使用的缩写是:2DE,二维电泳; ABPP,基于活性的蛋白质分析; ESI,电喷雾电离; Fp,氟磷酸盐; Icat,同位素编码的亲和标签; IMAC,固定化金属亲和层析; LC,液相色谱; MS,质谱; Phiat,磷蛋白特异性同位素编码亲和标签; PTP,蛋白质酪氨酸磷酸酶;丹替酯,5-二甲基氨基萘-1-磺酰基。
      1使用的缩写是:2DE,二维电泳; ABPP,基于活性的蛋白质分析; ESI,电喷雾电离; Fp,氟磷酸盐; Icat,同位素编码的亲和标签; IMAC,固定化金属亲和层析; LC,液相色谱; MS,质谱; Phiat,磷蛋白特异性同位素编码亲和标签; PTP,蛋白质酪氨酸磷酸酶;丹替酯,5-二甲基氨基萘-1-磺酰基。
      蛋白质染色,分别用于蛋白质分离,检测和鉴定的质谱(MS)(
      • Corthals G.L.
      • Wasinger V.C.
      • Hochstrasser d.f.
      • 桑切斯J.C.
      蛋白质表达的动态范围:蛋白质组学研究的挑战。
      )。 2DE-MS方法能够同时评估来自内源源的许多蛋白质的相对丰度和修饰状态,从而允许鉴定与离散生理和/或病理状态相关的新蛋白质( 例如 核苷二磷酸激酶A作为人前列腺癌细胞系中降低转移性潜力的标志物(
      • 尼尔森第3升
      • 手。
      • Rochon Y.
      • Corthals G.L.
      • 林B.
      • 蒙森A.
      • nguyen V.
      • Franza B.R.
      • 百婚酸科。
      • Aeberberold R.
      • 引擎盖L.
      前列腺基因表达综合分析:表达序列标签数据库的收敛性,转录性分析和蛋白质组学。
      )))。然而,几种重要蛋白质类别,包括低丰度和膜相关蛋白,仍然难以通过当前的2DE方法分析(
      • Corthals G.L.
      • Wasinger V.C.
      • Hochstrasser d.f.
      • 桑切斯J.C.
      蛋白质表达的动态范围:蛋白质组学研究的挑战。
      ,
      • Santoni V.
      • 米尔合金M.
      • rabilloud t.
      膜蛋白质和蛋白质组学:联合国的可能是不可能的?
      ,
      • Gygi S.P.
      • Corthals G.L.
      • 张Y.
      • Rochon Y.
      • Aeberberold R.
      二维凝胶电泳的蛋白质组分析技术评价。
      )。另外,通过专注于蛋白质丰度的测量,2DE-MS方法仅提供蛋白质功能的间接评估,并且可能无法检测到蛋白质 - 蛋白和/或蛋白质小分子介导的那些蛋白质调节的重要翻译后形式互动(
      • 科比B.
      • Kemp B.E.
      有源点定向蛋白质调节。
      )。
      为了加快蛋白质的功能分析,还引入了方法以检查全球规模的蛋白质活性。这些技术包括大规模酵母双杂交屏(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      中国蛋白质 - 蛋白质相互作用的综合分析。
      ,
      • ITO T.
      • 千叶T.
      • ozawa R.
      • Yoshida M.
      • Hattori M.
      • Sakaki Y.
      全面的双杂化分析探索酵母蛋白蛋白酶。
      ),目的是构建细胞中发生的蛋白质 - 蛋白质相互作用的综合图,以及蛋白质微阵列(
      • Macbeath G.
      • 舍瑞斯S.L.
      将蛋白质作为微阵列进行高通量函数测定。
      ,
      • 朱H.
      • Bilgin M.
      • Bangham R.
      • 大厅D.
      • Casamayor A.
      • Bertone P.
      • LAN N.
      • Jansen R.
      • BidlingMaier S.
      • Houfek T.
      • 米切尔T.
      • 米勒P.
      • Dean R.A.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      蛋白质组芯片的全局分析蛋白质活性。
      ),提供迅速评估重组表达蛋白质的功能的平台。尽管能够将特定的分子活性归因于单个蛋白质产品,但这些方法需要在人工环境中研究蛋白质,因此不要直接评估这些生物分子的功能状态在其天然环境中。
      最近出现了一种化学策略,利用有机合成来创造新的工具和测定以推进蛋白质组学领域(
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      蛋白质功能全局分析的化学策略。
      ,
      • 格里芬T.J.
      • Aeberberold R.
      质谱法蛋白质组分析研究进展。
      )。在本文中,我们描述了基于丰富的基于活性的蛋白质组学的化学方法,重点是允许在高复杂性的样品中进行蛋白质的定量比较蛋白质,包括低丰度和膜相关蛋白质的方法。

      确定复合蛋白质蛋白蛋白质丰度和翻译后改性的化学方法

      蛋白质组学中目前用于监测蛋白质丰度的变化的最常见方法是2DE-MS,其中蛋白质通常通过染色来定现和量化。包括Coomassie Blue和Silver染色的传统染色方法是具有成本效益,但提供有限的动态范围和灵敏度(
      • 帕顿W.F.
      千光点:荧光检测技术在二维凝胶电泳和蛋白质组学中的应用。
      )。为了改善这些特征,最近开发了Sypro-Ruby等荧光染料(
      • Lopez M.F.
      • Berggren K.
      • Chernokalskaya E.
      • 拉撒塞夫A.
      • 罗宾逊M.
      • 帕顿W.F.
      银染料和Sypro Ruby蛋白凝胶染色在二维凝胶中的蛋白质检测及肽质量分析鉴定的比较。
      )。尽管如此,独立于所采用的染色方法,2DE方法缺乏缺乏阻碍若干重要蛋白质的检测的解决能力,包括膜相关的蛋白质(
      • Santoni V.
      • 米尔合金M.
      • rabilloud t.
      膜蛋白质和蛋白质组学:联合国的可能是不可能的?
      )和低丰度蛋白质(
      • Corthals G.L.
      • Wasinger V.C.
      • Hochstrasser d.f.
      • 桑切斯J.C.
      蛋白质表达的动态范围:蛋白质组学研究的挑战。
      )。

       同位素编码的亲和标签(ICAT)方法,一种量化复杂蛋白质素中蛋白质丰度的化学方法 -

      作为2DE-MS的替代方案,已经引入了一种无凝胶定量蛋白质组学方法的方法,依赖于称为ICATS的化学标记试剂(
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
      )。这些化学探针由三个一般元素组成:一种能够标记定义的氨基酸侧链的反应性基团( 例如 碘乙酰胺改性半胱氨酸残基),同位素编码的接头和标签( 例如 Biotin)用于标记蛋白/肽的亲和分离(图。1A)。为了定量比较两种蛋白质,用同位素光标记一个样品( d0)探测器和其他同位素重的(d8) 版本。为了最小化误差,然后将两种样品组合,用蛋白酶消化( IE。 胰蛋白酶),并进行抗生物素蛋白亲和层析,分离用同位素编码标记试剂标记的肽。然后通过液相色谱 - 质谱(LC-MS)分析这些肽。量化差异标记肽对的信号强度的比率被定量以确定两个样品中蛋白质的相对水平。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1用于定量蛋白质组学的ICAT方法。 解决方案阶段(A;见参考。
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
      )和固相(B;见参考。
      • 周H.
      • ranish j.a.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      通过固相同位素标记和质谱法进行定量蛋白质组分析。
      )概述了ICAT方法。有关详细信息,请参阅文本。
      ICAT绕过凝胶基方法的几个先前描述的局限性,从而提供了对蛋白酶相关和低丰度蛋白的重要部分的进入。例如,ICAT已用于比较人HL-60白血病细胞系的正常和12-Phorbol 13-Myristerate酸处理样品的微观体变量分数(
      • 韩D.K.
      • ENG J.
      • 周H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码的亲和标签和质谱法定量分析分化诱导的微粒体蛋白。
      )。在这方面 体外 细胞分化模型,ICAT方法能够测量491蛋白的相对水平,其中许多是膜相关蛋白和/或中等至低丰度的蛋白质。值得注意的是,该研究鉴定了在12-Phorbol 13-Myristerate酸诱导的分化期间发生的蛋白激酶C的先前未知的同种型变化。
      最近,ICAT技术转化为固相捕获和释放化学标记肽的格式(
      • 周H.
      • ranish j.a.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      通过固相同位素标记和质谱法进行定量蛋白质组分析。
      )。在该研究中,固相同位素标记试剂由通过同位素改性的氨基酸连接的硫醇特异性反应基团组成(一种 d0 或者 d7 亮氨酸)到一个 O- 基于硝基苄基的光纤维可去移与氨基丙基涂层玻璃珠(图。1B)。通过胰蛋白酶消化相比的两种蛋白质部分中的每一个,并用固相试剂的光或重形式捕获其半胱氨酸的肽。然后将光和重珠组合,洗涤并暴露于UV光以诱导接头的光荧光。然后通过LC-ESI-MS / MS分析现在存在于溶液中的同位素标记的肽。与原始溶液相位ICAT方法相比,固相策略需要更少的样品处理,并提供更大的定量蛋白质分析的灵敏度。另一方面,因为固相Imat涉及在探针标记之前蛋白分解,所以在需要分离标记的蛋白质的情况下仍然是优选的溶液相位ICAT方法。例如,溶液相位ICAT方法已与2DE组合使用以同时量化酵母蛋白质组中发生的蛋白质表达和修饰状态的变化,以响应代谢偏移(
      • Smolka M.
      • 周H.
      • Aeberberold R.
      使用二维凝胶电泳,同位素编码的亲和标记标记和质谱法进行定量蛋白质分析。
      )。

       在复合蛋白质组中测量蛋白质磷酸化的化学方法 -

      建立了ICAT成功,已经引入了相关化学蛋白质组学策略来评估蛋白质的翻译后修饰状态。特别地,已经开发了几种化学试剂以测量复杂蛋白质蛋白中蛋白质的磷酸化状态(
      • ahn n.g.
      • resing K.A.
      朝向磷脂蛋白酶。
      )。检测蛋白质磷酸化的传统方法包括与无机的代谢放射性标记[32p]磷酸盐(
      • 康S.
      • 廖P.
      • Gage D.A.
      • esselman w.j.
      鉴定 体内 在70z / 3.12细胞中CD45蛋白 - 酪氨酸磷酸酶的磷酸化位点。
      ,
      • 入射物D.
      • 格雷米D.
      • Kirsch D.
      • Spengler B.
      • Presek P.
      • Meyer H.E.
      通过电喷雾电离 - 串联质谱(ESI-MS / MS)和液相色谱 - 电喷雾电离质谱(LC-ESI-MS)通过二维凝胶电泳由二维凝胶电泳分离的凝胶激活人血小板中磷酸化蛋白质的鉴定用二维凝胶电泳分离。
      )和具有固定化金属亲和色谱(IMAC)的亲和层析(
      • 安德森L.
      • Porath J.
      通过固定化金属分离磷蛋白(Fe3+)亲和层析。
      )或磷脂特异性抗体(
      • Blaydes J.P.
      • vojtesek b.
      • 彭博G.B.
      • hupp t.r.
      磷脂特异性抗体研究和使用研究蛋白质磷酸化。
      )。然而,这些技术中的每一种都表现出定量蛋白质组分析的缺点(表I.)。例如,代谢标签 32P需要一种活细胞来源,因此不适用于人体组织标本的蛋白质组学分析。另外,从检测到转换 32在2DE凝胶上标记的蛋白质对这些蛋白质的分子鉴定可能是挑战的,而无需靶标特异性富集试剂( 例如 抗体)。亲和层析等IMac和磷酸特异性抗体通常患有高磷酸化肽的高水平的背景结合,但定量差(特别是IMAC方法的最新进展可能有助于克服这些缺陷(
      • Ficarro S.B.
      • 麦克兰M.L.
      • stukenberg p.t.
      • Burke D.J.
      • 罗斯m.m.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      • 白色。
      质谱法分析及其应用 酿酒酵母酿酒酵母。.
      )))。
      表I.不同蛋白质组学磷酸化的不同蛋白质组学策略的比较
      分析方法检测到磷酸化的氨基酸定量鉴定磷酸化遗址普通的留言
      传统方法
      32P放射性标记Ser,Thr,Tyr难的需要生活样本
       磷脂特异性抗体Ser,Thr,Tyr难的高非特点绑定
       IMACSer,Thr,Tyr 是的 ( d0 或者 d3 methanol)难的羧酸的甲基化减少了背景
      a 见参考。
      • Ficarro S.B.
      • 麦克兰M.L.
      • stukenberg p.t.
      • Burke D.J.
      • 罗斯m.m.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      • 白色。
      质谱法分析及其应用 酿酒酵母酿酒酵母。.
      .
      化学方法
       β-Elimination
      b 请参阅refs。
      • 奥达Y.
      • nagasu t.
      • Chait B.T.
      磷酸化蛋白作为探测磷蛋白酶体的工具的富集分析。
      • Goshe M.B.
      • Conrads T.P.
      • Panisko E.A.
      • 安妮尔N.H.
      • veenstra t.d.
      • 史密斯r.d.
      磷蛋白同位素编码的亲和解性标签方法,用于分离和定量蛋白质型分析中的磷酸肽。
      .
      Ser,Thr. 是的 ( d0 或者 d4 ethanedithiol)是(标签幸存MS / MS)β-消除的可能性 O - 链接的碳水化合物
       Phosphoramidate
      c 见参考。
      • 周H.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      蛋白质磷酸化分析的系统方法。
      .
      Ser,Thr,Tyr 是的 ( d0 或者 d4 ethanolamine)难的冗长的协议
      a 见参考。
      • Ficarro S.B.
      • 麦克兰M.L.
      • stukenberg p.t.
      • Burke D.J.
      • 罗斯m.m.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      • 白色。
      质谱法分析及其应用 酿酒酵母酿酒酵母。.
      .
      b 请参阅refs。
      • 奥达Y.
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      磷酸化蛋白作为探测磷蛋白酶体的工具的富集分析。
      • Goshe M.B.
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      • Panisko E.A.
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      磷蛋白同位素编码的亲和解性标签方法,用于分离和定量蛋白质型分析中的磷酸肽。
      .
      c 见参考。
      • 周H.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      蛋白质磷酸化分析的系统方法。
      .
      最近描述了用于定量磷脂蛋白酶体分析的两种化学标记策略。第一种方法,由两个独立的研究组同时提出(
      • 奥达Y.
      • nagasu t.
      • Chait B.T.
      磷酸化蛋白作为探测磷蛋白酶体的工具的富集分析。
      ,
      • Goshe M.B.
      • Conrads T.P.
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      • 安妮尔N.H.
      • veenstra t.d.
      • 史密斯r.d.
      磷蛋白同位素编码的亲和解性标签方法,用于分离和定量蛋白质型分析中的磷酸肽。
      ),涉及顺序碱催化的β-消除磷酸基团和亲和标记的亲和向所得的脱氢残留物(Fig. 2)。在这两种方法中,首先用性酸氧化蛋白质上的半胱氨酸残基以防止后续步骤中的交叉反应性。然后用基础转化的磷素和磷酸胆碱残留物处理易于与乙基二醇的亲核侵袭的迈克尔受体。然后将反应性生物素试剂偶联到乙酸二硫醇改性位点的游离硫醇端,允许通过抗生物素蛋白亲和层析(富含整个蛋白质或肽)纯化最初磷酸化的蛋白质,如果先前通过用胰蛋白酶消化之前)。然后通过ESI-LC-MS / MS分析亲和力分离的生物素化肽,允许鉴定相应的蛋白质以及这些蛋白质上的特定磷酸化位点。在古斯和同事的研究中(
      • Goshe M.B.
      • Conrads T.P.
      • Panisko E.A.
      • 安妮尔N.H.
      • veenstra t.d.
      • 史密斯r.d.
      磷蛋白同位素编码的亲和解性标签方法,用于分离和定量蛋白质型分析中的磷酸肽。
      ),通过掺入磷蛋白特异性同位素编码的亲和标签(相位)来调整该方法的定量分析磷蛋白蛋白酶。这些Phiat试剂由乙亚二醇的两种同位素衍生物组成(一光(d0)沉重(d4)版本),其每一个都用作在比较下的两种蛋白质蛋白之一的亲核operoople(Fig. 2)。然后将光和重的phiat改性蛋白质蛋白组合,加工,并通过ESI-LC-MS / MS进行分析,如前所述用于ICAT。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2用于测量复合蛋白质蛋白蛋白磷酸化状态的化学方法。 碱催化的磷酸盐消除方法(左流程图;请参阅refs。 26和27)和磷酸氨基酯修饰方法(右流程图;见参考。
      • 周H.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      蛋白质磷酸化分析的系统方法。
      )概述了。有关详细信息,请参阅文本。 TFA. ,三氟乙酸; TBOC. , 塔特 - 丁氧基羰基; DTT. ,Dithiothreitol; EDC ,1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
      因为上面详述的策略需要β-消除磷酸盐基团以暴露一个用于亲和力标记的部位,因此不能监测蛋白质酪氨酸残基的磷酸化状态。相比之下,由周和同事开发的磷脂蛋白酶分析的第二种化学方法(
      • 周H.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      蛋白质磷酸化分析的系统方法。
      )适用于磷酸盐,-threonyl和替摩洛糖基残基。在这种方法中,首先用碘乙酰胺烷基化蛋白质以阻断半胱氨酸残基,然后用胰蛋白酶酶促消化(Fig. 2)。在保护所得肽混合物的氨基保护后 塔特 - 丁氧基羰基化学,用乙醇胺在碳二亚胺催化的反应中改性羧基/磷酰基。用酸治疗促进较稳定的氨基甲酰胺键的水解,从而重整磷酸盐,然后再与胱胺二硫键二聚体的反应进行反应。减少胱胺取代基使得在肽样品中的每个磷酸化位点处暴露于自由硫醇基。然后通过与固定在玻璃珠上固定的碘乙酰基的反应在固相上捕获硫醇改性的磷酸肽。经过严格的洗涤后,通过用三氟乙酸氨基甲酸键切割从固相释放磷肽,并通过ESI-LC-MS / MS分析。
      磷酸盐消除和磷酸氨基甲酸酯改性方法的比较表明,这些方法提供了磷蛋白酶体分析的互补优点。磷酸盐消除方法需要更少的修饰步骤,并导致适于串联MS分析的化学改性肽以鉴定磷酸化特异性位点(表I.)。然而,这种策略仅适用于磷素和磷酸肽肽。相反,可逆磷酸氨基甲酸酯修饰方案可以分析任何类型的磷酸化肽,但涉及许多衍生化步骤,并导致恢复未改性的磷酸酯基团,其通常在串联MS分析期间脱离,以确定磷酸化位点的核心。然而,重要的是,两种方法两种方法都会降低样品复杂性,同时富集磷酸化蛋白,因此应提供对磷蛋白质的低丰度成分的访问。另外,由于这些化学策略提供了通过同位素标记量化磷蛋白酶物的变化的方法,因此它们应该促进与特定生理和/或病理过程相关的信号转导级联的分子变化。

      测定复合蛋白质蛋白蛋白活性的化学方法

      常规蛋白质组学方法记录蛋白质丰度的变化,因此仅提供蛋白质活性变化的间接估计。因此,这些方法可能无法检测到蛋白质 - 蛋白和/或蛋白质 - 小分子相互作用介导的重要翻译后形式的蛋白质调节(
      • 科比B.
      • Kemp B.E.
      有源点定向蛋白质调节。
      )。为了解决这些限制,已经开发了用于基于活性的蛋白质分析(ABPP)的化学策略,该蛋白质分析(ABPP)利用有源部位定向探针来确定复杂蛋白质蛋白酶中的酶功能状态(
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      蛋白质功能全局分析的化学策略。
      )。 ABPP的化学探针由至少两个分子元素组成:1)用于结合并共价修饰给定酶类(或类别)和2)的许多成员的活性位点的反应性基团进行快速检测和分离的化学标签反应性酶(图3A)。因为这些探针具有适度的反应性亲电子基团,所以它们是选择性地改性酶活性部位,其通常富含催碱的氨基酸残基,这对于催化很重要。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3ABPP与化学蛋白质组学探针。A,基于活性的探针标记靶向酶的活性位点的一般机制 nu. =亲核氨基酸残基, rg. =反应组, L =链接器,和 标签 =检测/关联标记。 B,针对特定酶类的代表性ABPP探针。有关详细信息,请参阅文本。
      迄今为止,已经设计了两种ABPP的一般策略:1)靶向特异性酶类别的定向方法和2)来自几种不同类别的简义酶的非定向方法。下面综述了这些方法中的每种方法的化学基础,以及其生物应用的实例。

       针对ABPP:靶向特异性酶类别的基于活性的化学探针的设计和应用

      指导的ABPP方法利用与特定类别的酶相关的机械研究历史历史,以创造具有可预测的蛋白质组反应性的化学探针。通过作为探针反应性群公知的亲和标记试剂,研究人员成功地创建了靶向例如丝氨酸水解酶的ABPP探针(
      • 刘Y.
      • Patricelli M.P.
      • Cravatt B.f.
      基于活性的蛋白质分析:丝氨酸水解酶。
      ,
      • 基德D.
      • 刘Y.
      • Cravatt B.f.
      复杂蛋白质粒中的分析丝氨酸水解酶活性。
      )半胱氨酸蛋白酶的亚类(
      • Faleiro L.
      • Kobayashi R.
      • fearnhead h.
      • Lazebnik Y.A.
      多种CPP32和MCH2是凋亡细胞中存在的主要活性胱天冬酶。
      ,
      • Greenbaum D.
      • Medzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )。

       靶向丝氨酸水解酶超家族的ABPP探针 -

      丝氨酸水解酶是较高真核生物中最大和最多样化的酶之一,代表了人类基因组编码的预测蛋白质产品的约1%(
      • 着陆器E.S.
      • 林顿黎各。
      • Birren B.
      • nu. SBAUM C.
      • zody m.c.
      • Baldwin J.
      • 德文克。
      • 杜瓦尔K.
      • Doyle M.
      • Fitzhugh W.
      • Funke R.
      • Gage D.
      • 哈里斯克。
      • HEAOR A.
      • 豪兰德J.
      • 等等。
      人类基因组的初始测序与分析。
      ,
      • venter J.C.
      • 亚当斯M.D.
      • 迈尔斯。
      • 李P.W.
      • 壁画r.j.
      • 萨顿G.G.
      • 史密斯H.O.
      • Yandell M.
      • 埃文斯C.A.
      • HOLT R.A.
      • Gocayne J.D.
      • 氨基肽P.
      • Ballew r.m.
      • Huson D.H.H.
      • Wortman J.R.
      • 等等。
      人类基因组的序列。
      )。代表性的丝氨酸水解酶包括凝血酶等蛋白酶(
      • Goldsack N.R.
      • 钱伯斯r.c..
      • dabbagh k。
      • Laurent G.J.
      凝血酶。
      ),胰蛋白酶(
      • kraut j.
      丝氨酸蛋白酶:催化的结构和机制。
      )和尿激酶纤溶酶原激活剂(
      • 和 reasen p.a.
      • KJOLLER L.
      • Christensen L.
      • 达菲M.J.
      癌症转移中尿激酶型纤溶酶原激活体系:综述。
      );脂质水解酶如磷脂酶a2 (
      • Dessen A.
      人胞嘧啶磷脂酶A(2)的结构和机制。
      );酯酶如乙酰胆碱酯酶(
      • 舒马赫姆
      • 营地S.
      • Maulet Y.
      • 牛顿M.
      • Macphee-Quigley K.
      • 泰勒斯。
      • Friedmann T.
      • 泰勒P.
      乙酰胆碱酯酶的主要结构:对调控和功能的影响。
      );酰胺酶如脂肪酸酰胺水解酶(
      • Cravatt B.f.
      • Giang D.K.
      • Mayfield S.P.
      • Boger D.L.
      • lerner r.a.
      • 吉拉杜
      酶的分子表征降解神经调节脂肪酸酰胺。
      )。由于其催化机理的共同特征,几乎所有丝氨酸水解酶超家族的成员都是不可逆转地灭活的氟膦酸盐试剂(
      • 沃尔斯C.T.
      )。因此,用于设计靶向丝氨酸水解酶,刘和同事的ABPP探针(
      • 刘Y.
      • Patricelli M.P.
      • Cravatt B.f.
      基于活性的蛋白质分析:丝氨酸水解酶。
      ,
      • 基德D.
      • 刘Y.
      • Cravatt B.f.
      复杂蛋白质粒中的分析丝氨酸水解酶活性。
      由:1)组成的合成化合物:1)氟膦酸盐(Fp)反应基团,2)烷基或聚乙二醇链接头,3)Biotin标签(图3B.)。发现这些FP探针将丝氨酸水解酶的许多成员直接标记在复杂的蛋白质粒中。另外,显示FP探针读出丝氨酸水解酶的功能状态,例如,活性蛋白酶,但不是它们的无活性酶原和/或抑制剂结合的形式。基德和同事(
      • 基德D.
      • 刘Y.
      • Cravatt B.f.
      复杂蛋白质粒中的分析丝氨酸水解酶活性。
      )利用基于活性的FP蛋白酶组反应的性质,以检测对脂肪酸酰胺水解酶的三氟甲基酮抑制剂敏感的多脑丝氨酸水解酶,表明ABPP可以用作评估酶抑制剂的效力和选择性的筛选。值得注意的是,这些抑制剂选择性筛选直接在复杂的蛋白质蛋白中进行,从而减轻了在调查中重组显着表达或纯化酶的需要。最后,通过在标记的酶和生物素标签之间建立共价联系,FP探针分别为分别通过抗生物素蛋白色谱法和质谱方法进行亲和力纯化和靶向蛋白的分子鉴定的直接途径
      • 基德D.
      • 刘Y.
      • Cravatt B.f.
      复杂蛋白质粒中的分析丝氨酸水解酶活性。
      )。
      虽然对探针反应蛋白的亲和纯化有价值,但生物素 - 缀合的ABPP探针展示了若干缺点,用于系统检测复合蛋白质蛋白酶的酶活性。特别地,必须间接地观察生物素标记事件,通常用抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶复合物和化学发光底物。这些测定的灵敏度,产量和动态范围有限,从而妨碍快速和定量地比较大量蛋白质组学样品的努力。为了解决这些限制,FP活性组已与荧光标签缀合(罗丹明(
      • Patricelli M.P.
      • Giang D.K.
      • 邮票l.m.
      • Burbaum J.J.
      使用荧光活性位点定向探针直接可视化复合蛋白质谱系中的丝氨酸水解酶活性。
      )或荧光素(
      • 刘Y.
      • Patricelli M.P.
      • Cravatt B.f.
      基于活性的蛋白质分析:丝氨酸水解酶。
      )),允许使用直接凝胶荧光扫描作为快速,敏感的和定量筛选的基于活性的蛋白质标记事件(
      • Patricelli M.P.
      • Giang D.K.
      • 邮票l.m.
      • Burbaum J.J.
      使用荧光活性位点定向探针直接可视化复合蛋白质谱系中的丝氨酸水解酶活性。
      )。值得注意的是,atricelli和同事(
      • Patricelli M.P.
      • Giang D.K.
      • 邮票l.m.
      • Burbaum J.J.
      使用荧光活性位点定向探针直接可视化复合蛋白质谱系中的丝氨酸水解酶活性。
      )估计凝胶荧光扫描可以检测100 AMOL的FP-罗丹明标记的酶的阶数,检测极限比生物素缀合探针更敏感的近2个数量级(
      • 刘Y.
      • Patricelli M.P.
      • Cravatt B.f.
      基于活性的蛋白质分析:丝氨酸水解酶。
      )。因此,采用了双层ABPP策略,其中首先,首先,荧光探针用于快速和定量的比较蛋白质组分析,第二种,将生物素探针应用于亲和力富集并鉴定差异表达的酶活性。
      利用荧光和生物素-伊维蛋白ABPP方法,Jessani及其同事提供的技术优势
      • Jessani N.
      • 刘Y.
      • Humphrey M.
      • Cravatt B.
      分泌和膜蛋白质组的酶活性,描绘癌细胞侵袭性。
      )列出了相对剖便的人类癌细胞系,以确定丝氨酸水解酶活性的全局分析是否会产生足够的数量和质量的蛋白质组学信息,以描述更高阶的细胞性能。在本研究中,在表征之前将癌细胞蛋白质部分分成三个级分:分泌的膜和细胞溶质级分。从11个乳腺癌和黑色素瘤癌细的这些蛋白质组学级分的分析鉴定了一种基于原产地组织的这些线的丝氨酸水解酶活性簇。然而,有趣的是,几乎所有这些酶都在检查的最多侵入性癌细中被下调,这使得uplumpute含有蛋白酶尿激酶和新型膜相关酶KiaA1363的不同丝氨酸水解酶活性。更详细的分析表明,大多数丝氨酸水解酶活性,其基于分泌和膜蛋白组的侵袭性的起源组织和/或侵袭性状态的组织将癌细胞分类为亚型,这表明这些蛋白质组学级分特别富集为酶标记物细胞行为。总而言之,这些研究表明,ABPP可以产生精确地描绘高阶细胞性质的分子谱,并且在该过程中鉴定了KIAA1363,如KIAA1363,其可以代表新的生物标志物和/或治疗目标用于诊断和治疗人类疾病的新生物标志物和/或治疗靶标。

       靶向半胱氨酸蛋白酶的ABPP探针 -

      为了设计基于活性的化学探针,所述化学探针标记半胱氨酸蛋白酶,研究人员还利用良好的具有良好的活性位点定向的共价抑制剂。例如,丁诺里和同事(
      • Thornberry N.A.
      • 彼得森e.p.
      • 赵j.j.
      • 霍华德A.D.
      • 格里芬P.R.
      • 查普曼K.T.
      肽(酰氧基)甲基酮灭活白细胞介素-1β转化酶的灭活。
      )附加(酰氧基)与生物素的胱蛋白酶的甲基酮抑制剂(图3B.),为该半胱氨酸蛋白酶的这种亚类产生第一代ABPP探针(〜15个预测的半胱天冬酶被人类基因组编码)。自胱天冬酶抑制剂的生物素化变体已经应用于若干模型系统以鉴定与细胞凋亡(如凋亡)相关的这种酶系列的成员(
      • Faleiro L.
      • Kobayashi R.
      • fearnhead h.
      • Lazebnik Y.A.
      多种CPP32和MCH2是凋亡细胞中存在的主要活性胱天冬酶。
      ,
      • 马丁斯L.M.
      • kottke t.
      • Mesner P.W.
      • Basi G.S.
      • sinha s.
      • Frigon Jr.,N.
      • 塔塔尔E.
      • Tung J.s.
      • 布莱恩特K.
      • Takahashi A.
      • 坐下P.A.
      • Madden B.J.
      • McCormick D.J.
      • expershaw w.c.
      • kaufmann s.h.
      依托皂苷诱导凋亡期间胞嘧啶和HL-60细胞细胞核中多种白细胞介素-1β转化酶同源物的激活。
      )。最近温斯宾和同事(
      • Winssinger N.
      • Ficarro S.
      • 舒尔茨P.G.
      • 哈里斯J.L.
      分析蛋白质功能与小分子微阵列。
      )偶联的胱天蛋白酶导向的反应基团到肽核酸,允许在玻璃载玻片微阵列轴承互补寡核苷酸序列上检测活化的Caspase-3。虽然这种方法可以提供更高的通量和小型化测定平台,用于检测探针标记的蛋白质,但仍然尚不清楚这种策略是否适用于大多数ABPP探针,每种靶向多种酶( 例如 给定微阵列点上的荧光信号的FP探针可能代表几种酶活性的复杂和水平)。
      为木瓜蛋白酶,Greenbaum和同事产生蛋白酶类的ABPP探针(
      • Greenbaum D.
      • Medzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )已经合成了肽环氧化物天然产物E-64的生物素化变体,这是几个木瓜家族成员的共价抑制剂(图3B.)。木瓜蛋白酶类蛋白酶包括组织蛋白酶,一系列溶酶体蛋白酶(由人类基因组编码的〜15个预测成员),以及Calpains,一组钙依赖性胞质蛋白酶(〜10例由人类基因组编码)。基于E-64的ABPP探针已用于鉴定与皮肤癌症进展相关的组织蛋白酶活动(
      • Greenbaum D.
      • Medzihradszky K.F.
      • 伯灵名A.
      • Bogyo M.
      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )和Calpain活动涉及白内障地层(
      • Baruch A.
      • Greenbaum D.
      • levy e.t.
      • 尼尔森P.A.
      • 吉拉杜
      • Kumar n.m.
      • Bogyo M.
      定义间隙结通信,蛋白水解和白内障地层之间的链接。
      )。最近的Greenbaum和同事(
      • Greenbaum D.
      • Baruch A.
      • Hayrapetian L.
      • Darula Z.
      • 伯灵名A.
      • Medzihradszky K.F.
      • Bogyo M.
      在功能上探测蛋白质组的化学方法。
      )基于E-64的ABPP探针的变体偶联至Bodipy染料,并显示出这些荧光试剂可用于通过荧光显微镜观察活细胞中的组织蛋白酶活性。另外,这些探针与肽环氧化物的文库组合施用,以鉴定组织蛋白酶B的选择性不可逆抑制剂(
      • Greenbaum D.
      • Baruch A.
      • Hayrapetian L.
      • Darula Z.
      • 伯灵名A.
      • Medzihradszky K.F.
      • Bogyo M.
      在功能上探测蛋白质组的化学方法。
      )。

       靶向酪氨酸磷酸酶的ABPP探针 -

      洛夫和同事(
      • lo l.-c.
      • pang t.-l.
      • kuo c.-h.
      • 蒋y.-l.
      • 王H.Y.
      • 林J.-J.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶蛋白选择性活性探针的设计与合成。
      )已经报道了第一代活性的探针对蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的概况成员的合成和应用。这些探针由机理的反应基团(4-氟甲基-1-磷苯基取代基(
      • 迈尔斯J.K.
      • Widlanski T.S.
      基于机制的前列腺酸性磷酸酶的灭活。
      )),二乙二醇接头和生物素或延丹曲线(图3B.)。作者假设磷酸盐基团的PTP催化水解将促进氟原子的1,6-消除以形成可能标记磷酸酶活性位点的高反应性醌氨基。与该观念一致,酪氨酸磷酸酶PTP-1b,但不是其他蛋白质如磷酸化酶 b 和白蛋白,通过这些机制的探针共价修饰。仍然,高探针浓度(1米m)被要求标记PTP-1B,并且需要进一步的研究以确定这些病症是否与复合蛋白质素中PTP系列的分析构件相容。

       非指导的ABPP:基于活性的化学探针文库的设计和应用,所述化学探针靶向多种酶

      如上所述,对一些酶类别的基于活性的探针,如丝氨酸和半胱氨酸水解酶,在概念上是简单的。由于这些酶已经已知有源点定向的亲和标签,所以化学蛋白质组学的研究人员可以将这些“反应性基团”元素耦合到适当的接头和检测/分离标签,以产生ABPP的探针。然而,对于许多酶类别,尚不存在同源亲和力标签,从而限制了这种指示的ABPP努力的范围。扩大ABPP方法,ADAM及其同事的酶类数量(
      • 亚当G.C.
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
      ,
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
      )引入了一种非定向或组合策略,其中合成了候选探针文库并筛选复合蛋白质蛋白蛋白质反应性。
      为了证明ABPP的未定向方法的可行性,合成了一种相对较小的候选探针文库,其掺入以下元素:1)可变烷基/芳基结合基,2)磺酸盐酯反应性基团,3)脂族接线物4)罗丹明或生物素标签(用于分别检测和亲和分离蛋白质靶标)(图4A)。通过选择碳电泳(磺酸酯)作为探针文库的反应性群元素,希望探针将标记来自几种不同机械类的酶的活性位点。为了支持这一假设,已经确定了含碳电泳的天然产物,其共价修饰了各种酶的活性位点,包括毒素(
      • Wymann M.P.
      • Bulgarelli-Leva G.
      • Zvelebil M.J.
      • Pirogra L.
      • vanhaesebroeck b.
      • 水田M.D.
      • Panayotou G.
      Wortmannin通过共价修饰通过Lys-802的共价修饰灭活磷酸阳性3-激活,磷酸盐转移反应中的残余物。
      ),靶向磷酸酶的微囊藻(
      • Runnegar M.
      • 伯尔尼特N.
      • kong s.-m.
      • 李e.y.c.
      • 张L.
      体内体外 微囊藻酸与蛋白质磷酸酶1和2A的结合。
      )和毒素,靶向金属蛋白酶(
      • 刘S.
      • WIDOM J.
      • Kemp C.W.
      • 船员C.M.
      • 克拉迪J.
      人甲硫氨酸氨基肽酶-2与富马肽络合。
      )。将磺胺酸探针文库的罗丹明标记的构件施用于组织和细胞系蛋白质蛋白质蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白质蛋白质反弹,其被定义为当地而不是热变性的蛋白质蛋白(相反,显示出绝隔不敏感反应性的蛋白质被认为是非特点的目标)(图4B.)。作者假设蛋白质以热敏方式与磺酸盐探针反应的蛋白质将具有用于小分子相互作用的结构化部位,并且这些部位通常会确定蛋白质的生物活性( 例如 酶的活性位点)。在这些初步研究中,在可溶性和膜蛋白质组中检测到几种热敏磺酸盐靶标(
      • 亚当G.C.
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
      ,
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
      )。有趣的是,大多数蛋白质显示出优先标记与磺酸盐文库的特定成员,表明不同的结合基团元素至少部分地指定探针的蛋白质组反应性。将生物素 - 缀合的磺酸盐探针用于亲和分离ate若干蛋白靶标,并通过质谱法将这些蛋白质作为来自九个机械图中的酶(表二)。将每种酶在COS-7细胞中重组表达,以证实其对磺酸盐标记的敏感性。对于几种酶,获得了额外的证据,即磺酸盐探针正在改性活性位点。例如,发现添加辅因子或底物以减少一些酶的标记(
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
      ,
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      ),虽然其他蛋白质的磺酸盐反应性被催化活性的已知变振调节剂增强或抑制(
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      )。对于一种酶,醛脱氢酶,还显示磺酸盐探针,以充当活性位点导向的不可逆抑制剂(
      • 亚当G.C.
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
      )。最后,值得注意的是,几种磺酸盐靶标,包括谷胱甘肽 S - 转移酶gsto1-1(
      • 亚当G.C.
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
      ),组织转谷氨酰胺酶(
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      )和血小板型磷蛋白酶(
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      ),被发现在侵袭性乳腺癌细胞中占据上调,表明ABPP的非定向方法可以识别离散病理状态的新蛋白质标志物。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4A,用于非定向ABPP的化学探针的代表性文库,其中可变烷基或芳基结合基团与磺酸盐酯反应性基团连接(参见参考文献51和52)。 B,用非指定的ABPP产生的蛋白质组学数据的示意图描绘,其中特异性和非特异性( ns. )靶标分别定义为分别显示热敏和隔热探针标记的靶标。
      表二通过使用磺酸盐酯探针文库通过非指导的ABPP方法从小鼠和人蛋白质中鉴定的代表性酶活性
      酶类蛋白质组来源
      乙酰CoA乙酰转移酶
      a 见参考。
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
      .
      硫醇酶鼠标心脏
      醛脱氢酶1
      b 见参考。
      • 亚当G.C.
      • Cravatt B.f.
      • sorensen e.j.
      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
      .
      醛脱氢酶小鼠心脏,大鼠肝脏
      醛脱氢酶7.
      a 见参考。
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
      .
      醛脱氢酶鼠标心脏
      二氢醇脱氢酶
      a 见参考。
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
      .
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      谷胱甘肽 S - 转移酶人乳腺癌线
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      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      .
      总之,通过开发和应用非针对ABPP的方法,ADAM及其同事表明,可以为许多酶类产生与全蛋白质组分析相容的基于活性的化学探针(
      • 亚当G.C.
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      分析蛋白质组的特定反应性,具有非定向活性的探针。
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      使用常见趋化型机械式不同酶类的蛋白质组学分析。
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      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      )。引人注目的是,磺酸盐文库标记的酶均未表示前述蛋白质组学探针的靶标。这一发现表明,蛋白质组学的研究人员仍远离饱和与化学探针可寻址的“有源部位空间”的量。尽管如此,进一步扩大ABPP的范围的成功尝试可能需要探针图书馆具有相当大的化学和结构多样性,以及筛选这些分析工具的目标的蛋白质谱的有效策略。 ABPP探针的未来设计也将受益于对推动迄今为止观察到的探针酶反应的参数的更深入理解。磺酸盐靶之间的不存在共同催化机制认为,其他特征是指示探针标记。识别目标酶对磺酸盐改性的特定位点的努力可能有助于确定支持活性位点定向标记事件的分子特性。最后,值得考虑使用“基于活动”事件的活动站点定向标签实际上等同的频率。对于某些酶,如组织转谷氨酰胺酶,磺酸盐标记似乎提供了催化活性的精致读数,因为这两种性质都表现出钙和抑制因变构调节器GTP(
      • 亚当G.C.
      • sorensen e.j.
      • Cravatt B.f.
      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      )。另一方面,对于某些酶,在非催化残基上可能发生活性位点改性,类似于微囊藻蛋白在丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的活性位点中标记非催化半胱氨酸残基的方式(
      • Runnegar M.
      • 伯尔尼特N.
      • kong s.-m.
      • 李e.y.c.
      • 张L.
      体内体外 微囊藻酸与蛋白质磷酸酶1和2A的结合。
      )。可以认为这类标签事件是基于活动的吗?从纯粹的机械角度来看,答案是否定的;然而,从更高的生物学的角度来看,如果常见的情况,酶活性被调节 体内 通过自动抑制的域,蛋白质合作伙伴和/或小分子阻碍活性位点(
      • 科比B.
      • Kemp B.E.
      有源点定向蛋白质调节。
      ),然后对这些分子相互敏感的任何探针将在蛋白质组细胞生物学的背景下提供酶的功能状态的有效读数。

      结论和未来方向

      在这篇综述中,我们强调了一个有前途的新类别的蛋白质组学方法,该方法已经联合了合成化学,蛋白质生物化学和细胞生物学领域,以创造强大的工具和测定,用于全球蛋白质表达和功能分析。 ICAT方法等化学方法为蛋白质组学提供了研究人员,有机会比较高复杂性样品中低丰度蛋白的表达水平(
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
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      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      通过固相同位素标记和质谱法进行定量蛋白质组分析。
      )。 ICAT方法对磷酸化肽特异的化学探针的延伸具有有利于对细胞和组织蛋白质组中蛋白质后翻译后修饰状态的变化的有利测定(
      • 奥达Y.
      • nagasu t.
      • Chait B.T.
      磷酸化蛋白作为探测磷蛋白酶体的工具的富集分析。
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      • Goshe M.B.
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      磷蛋白同位素编码的亲和解性标签方法,用于分离和定量蛋白质型分析中的磷酸肽。
      ,
      • 周H.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      蛋白质磷酸化分析的系统方法。
      )。最后,针对ABPP的指向和非定向策略都产生了一种化学探针的菜单,其可以单独使用或组合使用,以发现与离散生理和/或病理状态相关的酶活性(
      • 刘Y.
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      基于活性的蛋白质分析:丝氨酸水解酶。
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      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
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      分泌和膜蛋白质组的酶活性,描绘癌细胞侵袭性。
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      综合检测和鉴定复合蛋白质蛋白酶酶活性的三官能化学探针。
      )。 ABPP作为功能性蛋白酶分析方法的价值通过其应用作为一种筛选,以评估酶抑制剂的效力和选择性(
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      环氧化物电子单作为活性依赖性半胱氨酸蛋白酶分析和发现工具。
      )。尽管如此,尽管迄今为止对迄今为止的进展相当大,但蛋白质组分析的化学方法仍面临着显着的技术挑战。也许最值得注意的是,在对高样本吞吐量的需求之间存在不满意的权衡以及对个体蛋白质组的深入分析的需求。例如,具有一维凝胶格式,可以在特定的学术实验室在一天内容易地分析数百种探针探针的蛋白质组学样本(
      • Jessani N.
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      分泌和膜蛋白质组的酶活性,描绘癌细胞侵袭性。
      )。然而,一维凝胶提供的适度分辨率可能会导致一些低丰度和/或共同迁移的蛋白质靶向菌株检测。相反,利用LC作为分离方法的蛋白质组学研究可以实现化学标记肽的特殊分辨率,但是样品产量较低。最后,分析探针标记的蛋白质部分的最佳平台可能取决于所解决的生物问题。实际上,如果在选择的样本数量上寻求广泛的细节,则可能希望应用上述所有蛋白质组学方法,从而接近蛋白质丰度,修改状态和活动中的动态的完整图像。

      致谢

      我们感谢Cravatt和Sorensen Laboratories有用的讨论。

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