蛋白质变异性的动态,蛋白质组学中缺失的尺寸*

      功能基因组实验经常涉及两种或更多种遗传,发育或生理状态之间基因表达水平的比较。这些比较可以在RNA(转录组)或蛋白质(蛋白质组)水平上进行,但是使用这两种方法通常缺乏平行分析之间的一致性。为了完全解释来自蛋白质组学实验的蛋白质丰富数据,有必要了解由相比综合的合成过程和劣化的贡献。因此,需要可靠的方法来确定与在蛋白质组学实验中获得的量相当的相当的单个蛋白质的速度率。在这里,我们表明稳定的同位素标记的氨基酸可用于通过检查胰蛋白酶碎片中的质量偏移来定义各种蛋白质的分解速率。该方法已应用于在稳态化化疗培养中生长的葡萄糖 - 限量酵母细胞中丰富蛋白质的分析。 50蛋白的平均降解率为2.2%/ h,尽管在难以察觉的速率下翻过一些蛋白质,其他蛋白质具有近10%/ h的降解率。这种值范围表明,蛋白质的周转是蛋白质组学实验中的显着缺失的尺寸,并且在评估蛋白质丰度数据并将其与同源mRNA种类的相对丰度进行比较时需要考虑。
      功能基因组学中共同利用四种分析:基因组,转录组,蛋白质组和代谢物。最后三个级别都依赖于上下文; mRNA分子,蛋白质分子和代谢物的补充均随生理细胞的生理,发育或病理状态而变化。蛋白质组的变化可能是这三个最重要的是分析基因作用和相互作用,但它也是以真正的全面的方式研究(
      • Miklos G.L.
      • Maleszka R.
      蛋白质功能和生物学背景。
      )。
      “经典”蛋白质组学仅比较两种不同状态或条件中细胞中蛋白质的量;它没有解决正在比较的不同生物状态中蛋白质组的动态,也不提供关于系统从一个状态变为另一个状态的机制的信息。与其降解速率的变化相比,收购任何蛋白质的任何蛋白质的任何蛋白质的稳态水平都是其合成率的变化结果(
      • Gottesman S.
      • Maurizi M.R.
      通过蛋白水解调节:能量依赖性蛋白酶及其靶标。
      ,
      • Hochstrasser M.
      • 约翰逊P.R.
      • Arendt C.S.
      • Amerik A.
      • Swaminathan S.
      • Swanson R.
      • 李S.J.
      • Laney J.
      • PALS-Rylaarsdam R.
      • Nowak J.
      • 合并P.L.
      酿酒酵母酿酒酵母 泛素 - 蛋白酶体系。
      )。在稳定状态下,这两个相对过程之间的平衡决定了任何蛋白质的浓度(
      • 贝纳罗德吉N.
      • Tarcsa E.
      • Cascio P.
      • Goldberg A.L.
      脱果和泛素无蛋白蛋白质的蛋白质脱落通过蛋白酶体降解。
      )。为了说明,可以通过增强的合成率或降低的降解速率来实现蛋白质表达水平的增加。尽管重要的重要性,但先前没有考虑蛋白质营业额的作用。然而,大量蛋白质组成分的半衰期可能会做出很多方法来解释有时会在转录组和蛋白质组数据之间看到的显着差异(
      • Gygi S.P.
      • Rochon Y.
      • Franza B.R.
      • Aeberberold R.
      酵母蛋白质与mRNA丰度之间的相关性。
      ,
      • IDEKER T.
      • Thorsson V.
      • ranish j.a.
      • 圣诞r.
      • 布勒J.
      • ENG J.K.
      • Bumgarner R.
      • Goodlett D.R.
      • Aeberberold R.
      • 引擎盖L.
      综合基因组和系统扰动代谢网络的蛋白质组学分析。
      ,
      • 格里芬T.J.
      • Gygi S.P.
      • IDEKER T.
      • rist b.
      • ENG J.
      • 引擎盖L.
      • Aeberberold R.
      转录组和蛋白质组水平的基因表达的互补分析 酿酒酵母酿酒酵母。.
      ,
      • 陈G.
      • gharib t.g.
      • 黄阁
      • 泰勒准。
      • Misek D.E.
      • Kardia S.L.
      • giordano t.j.
      • Iannettoni M.D.
      • orringer m.b.
      • 汉尚三
      • 啤酒D.G.
      肺腺癌中的不间断的蛋白质和mRNA表达。
      )。此外,可以在蛋白质基础上量化细胞中最具能量苛刻过程,蛋白质合成和降解,蛋白质周转的总过程之一的要求可以量化。在本文中,我们定义了一种实验策略,以分析蛋白质营运的动态,蛋白质组学的缺失维度。

      实验步骤

       酵母菌株和生长条件 -

      二倍体酵母菌株BY4743(Euroscarf登录号Y23935, www.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html.)(
      • Brachmann C.B.
      • 戴维斯A.
      • 成本G.J.
      • Caputo E.
      • 李杰。
      • Hieter P.
      • Boeke J.D.
      设计师删除菌株来自 酿酒酵母酿酒酵母 S288C:一种有用的PCR介导的基因破坏和其他应用的菌株和质粒。
      ),亮氨酸滋巢疗法。如前所述,在葡萄糖有限的化学蛋白培养物中生长酵母(
      • Baganz F.
      • Hayes A.
      • Farquhar R.
      • 巴特勒P.R.
      • 加德纳D.C.
      • 奥利弗S.G.
      连续培养中竞争实验的酵母基因函数的定量分析。
      )在媒体中(表I.)含有100毫克/升 DL. - [2H10]亮氨酸(98.5原子%过量),稀释率为0.1小时−1。经过至少七次七次,足以确保细胞完全标记,未标记 l - 加入 - 葡萄糖(50mL中的1g),并将进入培养基改变为含有未标记的一个 l - 50毫克/升的葡萄糖。取样为0,0.167,0.667,1,2,4,6,8,10,12,24.5和51小时进入追逐。该采样频率用于将追踪阶段的真正稀释率从标称0.1小时降低−1 to an actual 0.086 h−1。在每个时间点,将细胞直接收集到含环己酰亚胺(终浓度为100μg/ ml)的冰冷管中。细胞(40毫升) A600 收获~1.6)并在4℃下以5000rpm以5000rpm离心5分钟。将颗粒重悬于1ml冰冷的双蒸馏水中2o并转移到1.5ml微量离心管中。通过以10,000rpm离心抛出细胞,弃去上清液,将酵母沉淀在干冰中冷冻并储存在-80℃。细胞颗粒在冰上短暂地解冻,重新悬浮在300μl20米中m HEPES,pH7.5含有一种无核蛋白酶抑制剂混合物/ 10mL(Roche诊断),并通过涡旋珠(6×45s,冷却45秒)旋转。加入DNase(6μLLmg/ ml,sigma)和RNase(2μl1mg/ ml,sigma),裂解物在4℃下保持1小时。在4℃下以4000rpm离心裂解物10分钟,测定上清液用于蛋白质(Coomassie加蛋白质测定,皮尔斯)。
      表I.化疗培养的碳限量介质
      成分最终集中
      G /升
      kh. 242
      MGSO4·7H2O0.55
      NACL.0.1
      CACL.2·2H2O0.09
      葡萄糖2.5
      NH.4所以43.13
      尿嘧啶0.02
      组氨酸0.02
      DL. - 葡萄糖
      a DL. - [2H10]亮氨酸用于标记介质。
      0.1
      微量元素
      b 微量元素为两种10,000×股票解决方案:解决方案1,100,000×FECL 3·6H2O;解决方案2,10,000×ZnSO4·7H2o,Cuso.4·5H23博,ki。
       ZnSO4·7H2O
      c 维生素由600×储备溶液制成并储存在-20℃。
      0.00007
       CuSO4·5H2O0.00001
       H330.00001
       KI0.00001
       FeCl3·6H2O0.00005
      维生素
       Inositol0.062
       Thiamine/HCl0.014
       Pyridoxine0.004
       Calcium pantothenate0.004
       Biotin0.0003
      a DL. - [2H10]亮氨酸用于标记介质。
      b 微量元素为两种10,000×股票解决方案:解决方案1,100,000×FECL 3·6H2O;解决方案2,10,000×ZnSO4·7H2o,Cuso.4·5H23博,ki。
      c 维生素由600×储备溶液制成并储存在-20℃。

       蛋白质分离 -

      然后将来自12个时间点中的每一点的蛋白质(150μg可溶性蛋白质)在8中溶解 m 尿素,2%(w / v)乳液,20米m 在4℃下以10,000rpm离心10,000℃,在4℃下以10,000rpm离心10分钟,将二噻噻唑醇和0.5%3-10个IPG缓冲液(AP Biotech)以10,000rpm离心,并施加至13cm的固定性pH 3-10干条(AP生物技术)使用ICGphor等电聚焦系统(AP Biotech(AP Biotech)(AP Biotech )。第二维分析为12%(W ​​/ V)线性SDS-PAGE,然后是Coomassie蓝染色。目视检查凝胶,从每个凝胶中切除相同的点,肽通过凝胶还原,用碘乙酰胺烷基化,胰蛋白酶消化机器人(Micromass,Manchester,UK)萃取。

       质谱-

      使用MALDI-TOF质谱仪进行分析肽([电子邮件 protected]覆盖着的™,微扫描,曼彻斯特英国) m/z 范围为1000-4000。光谱彼此堆叠堆叠,鉴定了0小时(重标记)和51小时(光,完全未标记)之间的峰值差异。中间时间点显示携带重亮氨酸的肽的逐渐消失和携带未标记亮氨酸的肽的逐渐外观。取决于肽中的亮氨酸残基的数量,“重”和“光”肽以90分质量不同n da,哪里 n 是肽中的亮氨酸残基的数量。通过在51-H光谱(完全未标记的)中的肽(完全未标记)中的肽质量鉴定蛋白质,并在手动搜索酵母数据的手动搜索中基地使用吉祥物(www.matrixscience.co.uk.),它允许在其搜索中包含组成数据(
      • 普拉特准
      • 罗伯逊D.H.
      • Gaskell S.J.
      • Riba-garcia I.
      • 哈贝德S.J.
      • 侧湖K.
      • 奥利弗S.G.
      • 巴特勒P.
      • Hayes A.
      • 小J.
      • Beynon R.J.
      体内稳定同位素标记为肽质量指纹蛋白质鉴定的辅助。
      )。

       数据分析-

      重型和轻质胰蛋白酶肽的单同步觉峰强度(AHAL分别获得)并用于每次计算相对同位素丰度, t (ria.t),
      使用的缩写是: ria.,相对同位素丰富; 2dge,二维凝胶电泳; CHAPS,3 - [(3-胆氨基甲基丙基)二甲基氨基嘧啶] -1-丙二磺酸; MALDI-TOF,矩阵辅助激光解吸电离 - 飞行时间。
      as the ratio:
      RIAt= AH(AL+AH)
      (eq.1)


      的价值 ria.t 随着时间的变化随着蛋白质,预先生为重亮氨酸的蛋白质而被用亮亮亮氨酸所取代。这是两种过程的结果,即通过细胞内蛋白质周转损失的细胞丧失。指数方程的通用形式涉及 ria. 随时, t,值为 ria.t = 0 (ria.0) 和 t = ∞ (ria., 在实践中, t = 51 h):
      RIAt=RIA+(RIA0RIA) exp(kloss×t)
      (eq。2)


      而不是使用非线性曲线拟合来恢复三个参数的值(ria.0, ria., 和 k失利), ria.0 测量来自总共18种不同蛋白质的26个肽,得到0.985±0.001的值(平均值±S.E., n = 26)。该实验确定的参数的方差如此之低,使其固定为非线性曲线配件的平均值。同样,值为 ria. 自51小时后被设定为零,相当于七次倍数,超过99%的船舶中的重标记细胞 t = 0 H从船只丢失。通过修复这些参数,我们还删除了确定的一些固有的错误 ria. 在实验的开始和结束,其中重或光峰相对于另一个,因此数据有时被质谱中的化学噪声损害。安装方程简化为:
      RIAt=0.985 exp(kloss×t)
      (eq。3)


      这种形式的曲线适合(t, ria.t)使用非线性曲线配件获得的数据 k失利,参数估计中的错误和拟合曲线的置信限制。在单个时间点实验中, k失利 从价值计算 ria.t 一段时间确定, t,根据等式:
      kloss=ln(RIAt/0.985)/t
      (eq。4)


      最后,真正的退化率(kde通过从恒定稀释率D的简单减法来计算 k失利 (常量的减法不会影响参数估计的错误)。

      结果

      测定特定蛋白质的营数率充满困难,我们的策略旨在在精心控制的条件下产生周转率。我们的方法测量用稳定同位素标记的氨基酸标记蛋白质标记的动力学,并使用质谱法确定胰蛋白酶肽中标记氨基酸的存在。在这方面,它与其他研究不同,所述研究具有预先标记的蛋白质,其具有稳定同位素标记的氨基酸以比较表达水平(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      ,
      • 江j。
      • 英语上午
      掺入同位素标记的亮氨酸酵母蛋白质的定量分析。
      ),确定特定氨基酸的数量,以帮助肽质量指纹纹理蛋白质鉴定(
      • 普拉特准
      • 罗伯逊D.H.
      • Gaskell S.J.
      • Riba-garcia I.
      • 哈贝德S.J.
      • 侧湖K.
      • 奥利弗S.G.
      • 巴特勒P.
      • Hayes A.
      • 小J.
      • Beynon R.J.
      体内稳定同位素标记为肽质量指纹蛋白质鉴定的辅助。
      ,
      • Hirayama K.
      • Yuji R.
      • 山田N.
      • noguchi K.
      • yamaguchi y。
      • Enokizono J.
      • katao k。
      • Arata Y.
      • Shimada I.
      使用2H标记的亮氨酸通过质谱法通过质谱法与亮氨酸和异亮氨酸残留物的肽映射的方便肽测定。
      ,
      • 陈X.
      • 史密斯l.m.
      • 布拉德伯里尤。
      蛋白质中具有稳定同位素的位点特异性质量标记,用于精确高效的蛋白质鉴定。
      ,
      • 猎人T.C.
      • 杨L.
      • 朱H.
      • Majidi V.
      • 布拉德伯里尤。
      • 陈X.
      肽质量映射约束稳定同位素标记的肽,用于鉴定蛋白质混合物。
      ,
      • Engen J.R.
      • 布拉德伯里尤。
      • 陈X.
      使用稳定同位素标记的蛋白质,用于复合混合物中的氢交换研究。
      )或确定翻译后修改(
      • 朱H.
      • 猎人T.C.
      • 潘S.
      • yau p.m.
      • 布拉德伯里尤。
      • 陈X.
      残留物特异性质谱,用于通过质谱检测蛋白质修饰的蛋白质修饰。
      )。我们测量了几个营业额的速度 酿酒酵母酿酒酵母 葡萄糖的蛋白质有限的有氧连续培养处于稳态。在连续培养中,细胞保持在恒定的代谢状态下,并且通过细胞的物理损失通过细胞的物理损失来平衡生物质的增益,因为细胞悬浮液通过进入的新鲜培养基移位。在这方面,连续培养优于“批量”培养物中的生长,其中营养物质耗尽,细胞数增加,中期pH可以下降,并且生长速率下降。
      在固定稀释(倍增)速率下生长酵母细胞,蛋白质均匀地用在进入生长培养基中提供的氘代氨基酸标记。随后将大量过量的未标记的氨基酸瞬间向培养基中加入,同时,将培养基储存器切换到含有未标记的氨基酸的储存器。因为细胞是葡萄糖限制的,所以添加过量的未标记的氨基酸不会影响生长速率,但是标记的蛋白质降解和/或稀释到子细胞中。所选择的前体是在除α-氨基和α-羧基以外的所有位置标记的亮氨酸,因为亮氨酸存在于来自酵母蛋白质组的大多数胰蛋白酶中(
      • 普拉特准
      • 罗伯逊D.H.
      • Gaskell S.J.
      • Riba-garcia I.
      • 哈贝德S.J.
      • 侧湖K.
      • 奥利弗S.G.
      • 巴特勒P.
      • Hayes A.
      • 小J.
      • Beynon R.J.
      体内稳定同位素标记为肽质量指纹蛋白质鉴定的辅助。
      )。使用亮氨酸氛围突变体 S. Cerevisiae. 确保通过内源性亮氨酸稀释标签。最后,我们已经表明,与α-碳原子键合的氘原子是代谢不稳定的(可能是通过崩解),并且不良化或非化亮氨酸的相对掺入提供了对前体池的代谢宽度的有价值的见解,重要信息建立标签策略的有效性(
      • 普拉特准
      • 罗伯逊D.H.
      • Gaskell S.J.
      • Riba-garcia I.
      • 哈贝德S.J.
      • 侧湖K.
      • 奥利弗S.G.
      • 巴特勒P.
      • Hayes A.
      • 小J.
      • Beynon R.J.
      体内稳定同位素标记为肽质量指纹蛋白质鉴定的辅助。
      ,
      • Hirayama K.
      • Yuji R.
      • 山田N.
      • noguchi K.
      • yamaguchi y。
      • Enokizono J.
      • katao k。
      • Arata Y.
      • Shimada I.
      使用2H标记的亮氨酸通过质谱法通过质谱法与亮氨酸和异亮氨酸残留物的肽映射的方便肽测定。
      )。
      用重亮亮氨酸预先标记蛋白质约50小时,以0.1小时的稀释速率超过7个倍增倍数。−1。因此,细胞中超过99%的亮氨酸将是稳定的同位素标记的形式。以这种方式替换整个亮氨酸池对生长速率或二维凝胶中蛋白质的整体模式没有影响(结果未显示)。然后用大量(20倍)的未标记注射化学鼻部 l - 氟氨酸迅速降低前体池的同位素丰度。将原料切换到未标记的亮氨酸,并在接下来的51小时中从培养容器中取出细胞样品。添加到生长船上的未标记的亮氨酸脉冲对CO没有影响2 生产,证明亮氨酸未被用作替代碳源。此外,在追逐未标记的亮氨酸之前或之后的细胞中没有2dge模式的定量差异(结果未显示)。在追逐期间,所有新合成的蛋白质只能纳入未标记的亮氨酸。标记蛋白质的损失率(k失利)是一种复合术语,其通过稀释细胞稀释(合成) 德诺维)或通过降级(Fig. 1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1蛋白质周转率测定的总体策略。 在稳定的同位素标记的氨基酸存在下,在化学稳定蛋白培养物中生长酵母细胞在细胞是营养营养的存在下。在七次倍增时,所有蛋白质中超过99%的氨基酸均匀标记。随后将过量的未标记的氨基酸瞬间向培养容器中加入,并且原料中的氨基酸也改变为未标记的形式。这确保了同位素丰富的前体池快速且大幅下降。随后新合成的蛋白质将含有未标记的氨基酸;由未标记的氨基酸标记的替代速率由蛋白质周转率定义。可以测量的最低周转率相当于稀释率,因为这是细胞(因此蛋白质)离开培养容器的速率。因此,测量的蛋白质损失率与稀释率之间的差异是真正的细胞内降解速率。
      在每个追逐时期之前和整个追逐时期的采样时间,裂解细胞,通过2dge分离来自清除裂解物的蛋白质。凝胶上的斑点的图案非常一致(尽管这不是方法的先决条件),我们可以从每个凝胶中恢复相同的蛋白质,然后对其进行肠外胰蛋白酶消化,然后进行MALDI-TOF质谱法(
      • 舍甫琴科A.
      • Jensen O.N.
      • podtelejnikov a.v.
      • Sagliocco F.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      • Mortensen P.
      • Boucherie H.
      通过质谱将基因组和蛋白质组连接:来自二维凝胶的大规模鉴定酵母蛋白。
      )。胰蛋白酶肽质量指纹中单个峰的曲线跟踪通过未标记的蛋白质替换标记的蛋白,因为细胞继续在培养物中生长。一套超过51小时的MALDI-TOF数据,扩展以强调各种肽与一种或多个亮氨酸残基的行为,表明从完全标记为完全未标记的肽的转变显而易见(Fig. 2)。通过肽质量指纹识别蛋白质,其通过衍生自重和光峰之间的分离的每种肽的亮氨酸组合物的数据(参见“实验程序”)。顺便提及,如果前体池没有有效地“追逐”中间质量的肽,则会预期分布(
      • Papageorgopoulos C.
      • Caldwell K.
      • Shackleton C.
      • SchweingRubber H.
      • Hellersein M.K.
      测量蛋白质合成质量同位素分布分析(Mida)。
      )。然而,对于含有多于一个亮氨酸残基的肽,缺乏全标记和完全未标记的形式之间的质量值中间体的峰是令人信服的,证明前体池的相对同位素已经有效地减少到零,这是一个先决条件方法。当然,对中间质量肽的检测的下限受光谱中的背景噪声的影响。然而,噪声底板上方的任何这样的峰值都是有效追逐的好证据。标记肽的天然同位素丰富谱也证实,几乎所有的[2H10[培养基中供应的亮氨酸转化为[2H9亮氨酸 体内 (可能是通过崩溃)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2未标记追逐期间肽质量指纹的变化。 在未标记的亮氨酸存在过滤的亮氨酸存在下预先标记的酵母细胞在过量的亮氨酸存在下进行51小时追逐相。在不同的时间,通过2dge回收,裂解细胞悬浮液的样品并通过2dge解决。在用Coomassie蓝染色之后,从每个凝胶中回收相同点,并进行凝胶胰蛋白酶消化和MALDI-TOF质谱。光谱上 正确的 被扩增以显示单肽的行为(含有一个和三个亮氨酸残基)。光谱上 剩下 盖上 m/z 范围从1000到2500。这 表示不含亮氨酸残基的肽,因此在整个追踪中保持在相同的质量。
      测量呼应相中的每个采样时间点的重和轻胞片段的单同位素峰的强度。完全标记和完全未标记的含亮氨酸肽之间的强度的过渡最简单地由单指数曲线定义,其产生第一阶速率常数,用于从蛋白质中丧失标记物(k失利)。为了确定此速率常数,单个指数曲线安装在该组中 ria.t 含有含亮氨酸的胰蛋白肽的数据。由于预期单个肽质量指纹中的多种肽含有亮氨酸,因此每种肽应提供母体蛋白质溢出率的独立度量。对于每种蛋白质,无论衍生自肽残留物(Fig. 3)。拟合速率常数中的误差通常小于参数值的10%,并且通过衍生自单个蛋白质的多种肽定义的降解速率之间的一致性高。对于所有进一步的分析,我们汇集了来自不同肽的数据,基于多个测定产生单个拟合曲线 ria.t 在 each time point (表二,斑点1-31)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3非线性曲线配件确定周转率。 对于从一系列二维凝胶中取出的四个代表性蛋白质斑点,通过手动检查对应于单个胰蛋白肽的质谱来测量亮氨酸标记和未标记峰的峰强度。对于每种肽,所述 ria.t 计算标记的肽的计算并绘制时间。为了确定蛋白质的卷取率,使用非线性曲线配件(FIGIE,Biosoft,UK)安装单个指数曲线。不同 符号 表明 ria.t 针对衍生自相同蛋白质的肽的值,以及 实线 是这些不同数据集的最佳曲线。在大多数情况下,这些线条如此紧密叠加,即单个痕迹是不可辨别的。在里面 较低的面板,标签损失的测量率被绘制为个体肽。请注意,必须纠正真正的退化率,以便在0.086小时的化学稳定剂中校正蛋白质损失的基线速率−1.
      表二酵母蛋白质降解率
      现货没有。蛋白质ID肽(观察到[M + H]+)[Leu残留的数量]同位素去除(k失利) (H−1),曲线拟合分析(k失利 ± S.E. (n)))同位素去除(k失利)单点确定(平均值 k失利 ± S.E. (n)))
      1热休克蛋白SSA1(HS71)1552.98 [2]0.0972±0.0028(12)
      2130.22 [2]0.1035±0.0040(12)
      1199.94 [2]0.1117±0.0081(12)
      1431.01 [1]0.1012±0.0078(12)
      所有肽0.1032±0.0051(48)
      2丙酮酸脱羧酶1997.98 [1]0.0901±0.0021(10)
      1597.01 [1]0.0930±0.0029(10)
      1689.90 [1]0.0897±0.0035(10)
      所有肽0.0919±0.0024(30)0.0976±0.0062(10)
      3NADP特异性谷氨酸脱氢酶1188.80 [1]0.0717±0.0024(10)
      1605.14 [1]0.0688±0.0059(10)
      1468.86 [1]0.0721±0.0041(10)
      所有肽0.0709±0.0025(30)0.0633±0.0024(6)
      4热休克蛋白SSA1或-2(HS71 / 72)(片段)1552.98 [1]0.1033±0.0034(12)
      1675.90 [1]0.1100±0.0076(12)
      1431.03 [1]0.1074±0.0057(12)
      1816.07 [2]0.1167±0.0083(11)
      所有肽0.1092±0.0049(47)0.1221±0.0033(10)
      5Enolase II1876.14 [1]0.0865±0.0038(12)
      1431.03 [2] 0.0906±0.0069(12)
      2741.17 [2]0.0909±0.0023(12)
      所有肽0.0893±0.0041(36)0.0851±0.0019(10)
      6enolase i pi ~7.51876.11 [1]0.0933±0.0027(12)
      1856.98 [1]0.0993±0.0103(12)
      2441.11 [2]0.1048±0.0075(11)
      所有肽0.0950±0.0058(35)
      7enolase i pi ~7.71822.08 [2]0.1130±0.0077(11)
      2441.47 [2]0.0987±0.0024(11)
      1578.98 [2]0.1190±0.0128(11)
      1373.87 [1]0.0998±0.0025(11)
      所有肽0.1034±0.0029(44)0.0952±0.0036(10)
      8磷酸甘油激酶1440.00 [3]0.1145±0.0025(11)
      1768.14 [3]0.1079±0.0026(11)
      1668.04 [2]0.1058±0.0025(11)
      2327.27 [1]0.1005±0.0042(11)
      2039.14 [2]0.1005±0.0051(11)
      所有肽0.1058±0.0027(55)0.1085±0.0045(10)
      9YOL 154WP.1617.94 [2]0.1273±0.0050(12)
      1961.58 [1]0.1155±0.0111(11)
      1228.75 [1]0.1202±0.0027(10)
      所有肽0.1224±0.0048(33)0.1241±0.0026(8)
      10果糖 - 双磷酸醛磷酸酶2160.21 [1]0.1209±0.0073(12)
      1794.99 [1]0.1157±0.0053(12)
      1863.04 [1]0.1273±0.0069(12)
      2035.05 [1]0.1178±0.0039(12)
      所有肽0.1203±0.0054(48)0.1270±0.0035(8)
      11酮酸异构酶1355.99 [1]0.0760±0.0019(11)
      1170.06 [1]0.0790±0.0039(12)
      1181.94 [1]0.0834±0.0068(12)
      1306.09 [1]0.0781±0.0024(11)
      1530.13 [1]0.0772±0.0020(11)
      1753.27 [2]0.0857±0.0041(11)
      2099.52 [3]0.0902±0.0068(11)
      2145.45 [1]0.0801±0.0057(11)
      所有肽0.0805±0.0033(90)0.0680±0.0021(14)
      12enolase i片段1159.82 [1]0.1091±0.0174(9)
      1856.97 [1]0.1029±0.0036(10)
      1578.91 [2]0.1149±0.0128(9)
      1373.78 [1]0.1053±0.0077(9)
      1756.03 [1]0.1084±0.0056(9)
      所有肽0.1075±0.0042(37)
      13磷酸甘油激酶片段1440.01 [3]0.1113±0.0035(9)
      1668.06 [2]0.1034±0.0037(9)
      所有肽0.1073±0.0034(18)
      14甘油醛-3-磷酸脱氢酶31752.78 [1]0.0891±0.0021(8)
      2591.20 [2]0.0938±0.0078(9)
      所有肽0.0908±0.0045(17)
      15enolase i片段1856.96 [1]0.1003±0.0063(12)
      1578.89 [2]0.1164±0.0150(11)
      1373.78 [1]0.1061±0.0112(11)
      所有肽0.1071±0.0100(34)
      15甘油醛-3-磷酸酶脱氢酶21752.87 [1]0.0987±0.0028(12)
      16苹果酸脱氢酶1395.92 [1]0.1108±0.0030(11)
      1350.03 [2]0.1227±0.0039(11)
      1592.96 [1]0.0923±0.0086(10)
      1332.90 [1]0.1115±0.0058(10)
      1638.01 [1]0.1062±0.0086(11)
      所有肽0.1087±0.0043(53)0.1077±0.0166(8)
      17甘油醛-3-磷酸脱氢酶31749.49 [1]0.0945±0.0017(7)
      18甘油醛-3-磷酸脱氢酶31750.67 [1]0.0933±0.0013(9)
      19热休克蛋白261806.21 [1]0.1262±0.0150(7)
      2040.57 [2]0.1265±0.0228(7)
      所有肽0.1263±0.0187(14)0.1260±0.0083(6)
      20果糖 - 双磷酸醛磷酸酶2390.20 [1]0.0998±0.0085(6)
      1863.07 [1]0.0958±0.0066(6)
      2035.13 [1]0.0936±0.0024(6)
      所有肽0.0964±0.0044(18)
      21腺苷酸激酶1456.01 [2]0.1146±0.0021(7)
      1994.30 [2]0.1166±0.0080(8)
      所有肽0.1152±0.0055(15)0.1299±0.0139(10)
      22Triosephosphate异构酶1096.83 [1]0.1019±0.0017(12)
      1252.86 [1]0.0932±0.0042(12)
      2763.38 [2]0.0954±0.0038(8)
      所有肽0.0966±0.0019(32)0.1035±0.0039(10)
      23甘油醛-3-磷酸脱氢酶3片段1753.06 [1]0.0928±0.0038(10)0.1046±0.0066(3)
      25甘油醛-3-磷酸脱氢酶3片段1820.08 [2]0.0991±0.0043(10)
      26没有id ..1752.47 [1]0.1055±0.0084(6)
      27甘油醛-3-磷酸脱氢酶2片段1752.94 [1]0.1046±0.0067(11)
      27没有id ..1785.86 [2]0.1098±0.0090(5)
      28没有id ..1737.86 [2]0.1130±0.0550(5)
      29Cpn101591.96 [1]0.1087±0.0078(7)
      1525.93 [2]0.1112±0.0078(7)
      所有肽0.0978±0.0110(14)
      30肽基脯氨基顺式 - 反式异构酶2098.05 [1]0.1155±0.0112(7)0.089(1)
      31热休克蛋白121437.80 [1]0.1126±0.0076(7)
      1745.84 [1]0.1094±0.0092(8)
      所有肽0.1111±0.0080(15)0.1037±0.0222(4)
      现货没有。蛋白质ID肽(观察到[M + H]+)降解率(h−1),单点(4小时,8小时)降解率(h−1),单点测定,所有肽(平均值±S.E.(n)))
      33CDC48 / PAS1 / SEC18 ARPASE系列的微粒体蛋白1756.11 [3]0.1612,0.1462
      1246.84 [2]0.1276,0.1457
      1578.04 [2]0.1274,0.1229
      所有肽0.1385±0.0061(6)
      34actin结合蛋白; ABP1P.1583.22 [1]0.0859,0.0921
      2133.39 [1]0.0730,0.0907
      2662.76 [1]0.0719,0.0936.
      1715.25 [1]0.1161,0.1074
      3035.64 [1]0.0855,0.1027
      所有肽0.0902±0.0035(10)
      35Kar 2p1199.88 [2]0.0773,0.08187
      1197.87 [1]0.0985,0.0805
      1316.99 [2]0.1046,0.0894
      1346.01 [1]0.0877,0.0771.
      1555.17 [2]0.1176,0.0909
      1952.36 [3]0.1437,0.1039.
      1244.83 [1]0.1007,0.0838.
      1646.23 [1]0.0771,0.0973
      所有肽0.0945±0.0058(16)
      36链蛋白酶A或真空蛋白酶A PEP 4P1700.05 [1]0.1036,0.1193
      1212.85 [1]0.0890,0.0972
      1571.98 [1]0.1013,0.1415
      1889.17 [2]0.0874,0.1045
      1916.12 [1]0.1181,0.1379
      所有肽0.1100±0.0006(10)
      37SSE1P; HSP70系列(SSA1P和SSE2P的同源物)1377.88 [1]0.1216,0.1253
      1543.02 [2]0.1515,0.1169
      1836.14 [1]0.1267,0.0998
      1513.99 [1]0.1182,0.1181
      1744.08 [2]0.1411,0.1211
      1471.88 [1]0.1128,0.1163
      1270.81 [1]0.1077,0.1271
      所有肽0.1217±0.0020(14)
      38核编码线粒体蛋白; HSP70家庭成员,最相似 大肠杆菌 DnaK1537.94 [1]0.0943,0.1036
      1688.13 [1]0.1118,0.1150
      1509.06 [2]0.1024,0.0918
      1317.89 [2]0.1642,0.1656
      所有肽0.1186±0.0123(8)
      39YDL184W-B.1307.90 [1]0.1083,0.1009
      1647.98 [1]0.1040,0.1018
      1521.97 [1]0.0901,0.0913
      1865.17 [1]0.0815,0.1135
      所有肽0.0989±0.0026(8)
      40SSB2P;压力 - 七十个子家族B / SSB1P;压力 - 七十个子家族B,参与翻译1459.95 [1]0.1123,0.1163
      1394.86 [2]0.1364,0.1288
      1185.79 [1]0.1545,0.1348
      1242.76 [2]0.1567,0.1002
      1730.07 [1]0.0917,0.1347
      2071.14 [1]0.1145
      所有肽0.1255±0.0062(11)
      41甲硫氨酸合成酶1710.14 [1]0.2059,0.1525
      1517.83 [1]0.1859,0.1633
      所有肽0.1769±0.0119(4)
      42tkl1p; Transketolase 1 /酵母转铁糖醇酶1230.81 [2]0.1331,0.1172
      1094.74 [1]0.1105,0.1016
      1485.93 [2]0.1209,0.1206.
      1708.10 [1]0.1372,0.1004
      1869.00 [1]0.1092,0.1023
      2315.33 [1]0.1107,0.1004
      所有肽0.1137±0.0034(10)
      43乙酰-CoA脱酰基酶,含甘露糖糖蛋白结合Concanavalin A; ACH1P.1259.89 [1]0.0996,0.1111.
      1608.03 [1]0.0996,0.1122
      1409.00 [1]0.1132,0.1059
      1424.94 [1]0.1082,0.0977
      1769.12 [1]0.0754,0.1145
      所有肽0.1037±0.0020(10)
      44丙酮酸激酶CDC19P;开始细胞周期所需的1501.98 [1]0.0876,0.0879
      1315.89 [1]0.0973,0.0959
      1227.75 [2]0.0981,0.1041
      2001.22 [3]0.0867,0.1024
      1761.03 [1]0.0893,0.0781
      所有肽0.0927±0.0020(10)
      45Lipoamide脱氢酶,链A,FAD FlavoProtein1174.67 [1]0.1147,0.1102
      1564.48 [1]0.1115,0.1172
      1496.43 [1]0.1284,0.1094
      1801.00 [1]0.1077,0.1145
      所有肽0.1142±0.0025(8)
      46ATPASE1αSU.1553.84 [1]0.1037,0.1160
      1325.80 [2]0.1166,0.1267
      1350.83 [1]0.1103,0.1114
      1458.84 [1]0.1016,0.1108
      1438.93 [1]0.1077,0.1150
      1273.75 [2]0.1032,0.1176
      1602.91 [1]0.1155,0.1131
      1935.08 [1]0.1037,0.1153
      所有肽0.1117±0.0020(16)
      47SHM2P丝氨酸羟甲基转移酶1196.70 [1]0.1607,0.1305
      1168.69 [1]0.1471,0.1126
      1572.99 [1]0.1646,0.1318
      1728.05 [3]0.1305,0.1163
      1690.00 [1]0.1545,0.1147
      1707.02 [1]0.1501
      所有肽0.1376±0.0060(11)
      48g4p1±arc1p;与TRNA和氨基酰基-TRNA合成酶相关联1259.64 [1]0.1049,0.1067
      1243.64 [1]0.1155,0.1082
      1706.61 [1]0.0929,0.1048
      1574.52 [1]0.0936,0.0952
      1690.63 [1]0.0907,0.1128
      所有肽0.1025±0.0026(10)
      49IDH2P NAD.+ - 依赖异偶酯脱氢酶1435.73 [2]0.1113,0.1241
      1448.78 [1]0.1017,0.0991
      1320.74 [1]0.1024,0.1035
      所有肽0.1070±0.0038(6)
      50TPM1P; Tropomyosin I.1644.89 [1]0.1013,0.1440
      1800.99 [1]0.1230,0.1411.
      1958.02 [1]0.0965,0.1418
      2039.06 [2]0.1186
      所有肽0.1246±0.0087(7)
      51BMH2P;来自家庭的脑模喹啉同源物/蛋白质14.3.31215.59 [1]0.0954,0.1042
      1110.62 [1]0.1000,0.1066
      1834.04 [1]0.0992,0.1028
      1461.79 [1]0.1090,0.1016
      1367.77 [1]0.1187,0.1048
      2001.93 [1]0.1093,0.1039
      1969.90 [1]0.1277,0.0894
      1985.98 [1]0.1450,0.1010
      所有肽0.1074±0.0020(16)
      52脑模喹啉同源物或bmhi1834.04 [1]0.1008,0.1043
      1491.78 [1]0.1015,0.1119
      1215.39 [1]0.1037,0.0953
      所有肽0.1029±0.0022(6)
      精确测量单个蛋白质的降解速率特别值在于决定细胞内稳定性的结构参数的阐释中。然而,当在蛋白质组中应用到全球蛋白质群体时,多点测定退化率为极为费力。较高的吞吐量方法,更适合于全局蛋白质组学调查,可以通过分析追逐时期的单个时间点来源。对于每种蛋白质,对几种(含亮氨酸)肽的分析仍然会产生统计估计 ria.t 在一个价值 t,这与估计有关 k失利 通过简单的关系 k失利 = −ln(ria.t/ria.0/t.
      我们衡量 k失利 对于从2dge恢复的几种蛋白质( Fig. 4表二)。对于几乎所有蛋白质,我们能够使用来自含有一个和三个亮氨酸残基之间的多种肽的数据。对于33上的蛋白质点,值 k失利 通过在两个时间点(4和8小时)上进行对细胞进行回收,直接计算降解速率,并将来自多种肽的数据组合,得到速率常数确定的统计估计。对于斑点1-31,预先通过非线性曲线配件评估了降解速率常数,以及这些特定蛋白质的亚组, k失利 使用多种肽的数据重新定义,但在单个时间点(Fig. 5, 面板A.)。值之间的相关性 k失利 通过两种方法测量,高(r2 = 0.87, n = 25, p <0.001)。单点法,其中从同一蛋白质的几种肽获取流量率,可以产生可靠的估计作为更复杂的曲线配合方法。为了测试分析方法的再现性,我们重复了从细胞破裂的成交率的测定,用于有限数量的蛋白质(n = 15)。同样,相关的相关性 k失利 在每个实验中计算得非常高(r2 = 0.86, p < 0.001; Fig. 5, 面板B.)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4测量酵母蛋白的周转率。 通过2dge(第一维PI 3-10,第二尺寸12%线性凝胶)分离酵母蛋白质,并用Coomassie蓝色染色。选择的,从对应于多个时间点的凝胶(10和12之间,曲线拟合方法,单点确定的一个或两个时间点)从对应的凝胶中恢复高丰度点,并且如文本中所述确定劣化率。在凝胶上表明特定蛋白质的位置,并提出了降解速率 。斑点28和32未被分析,并且已省略 。斑点15和27含有来自多种蛋白质的肽。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5曲线拟合与单点分析之间的相关性。面板A.,25个蛋白质,值 k失利 通过使用MALDI-TOF光谱中的多个肽在单点分析中获得的价值绘制非线性曲线拟合的值,但在8小时的单一时间点。 面板B.,评估分析的再现性,用于蛋白质的子集(n = 15)我们使用单点方法重复从细胞破裂的营业速率的确定。对于两个绘图,回归线叠加在数据上。
      因为细胞在化学仓中处于真正的稳态,所以标签损失率通过以0.086小时的真实速率从系统出口来包括不可逆损失−1 (纠正抽样)。因此,应通过简单减去稀释率的减少来校正蛋白质的细胞内降解速率(Fig. 6)。在本研究中分析的〜50个蛋白质中,单季度降低了小于0.01小时的速率−1。其中两种(斑点3和11,谷氨酸脱氢酶和酮酸异构酶)根本没有显着降解,并且仅通过稀释到子细胞中损失。在另一个极端,一个蛋白质(点41,甲硫氨酸合酶)以超过9%/ h的速率降解细胞内。甚至允许警告我们选择了高丰度蛋白,降解速率范围在平衡指数增长的细胞中超过9倍。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6真正的可溶性酵母蛋白的降解率。 对于在二维凝胶上指示的每种蛋白质(),通过对细胞稀释率的校正来计算真正的细胞内降解速率。数据显示出误差所示(斑点1-31,s.e.对于参数估计的拟合值,向上33,平均±s.e.对于多种肽)。对于价值观 n, 看 。这 插入 显示这些〜50相对高丰度酵母蛋白的降解速率的分布谱。

      讨论

      我们故意专注于更丰富的蛋白质来开发方法,并评估指数生长细胞中散装蛋白的动态。尽管可能预期这种丰富的蛋白质是长期存在的,但降解率是非常异构的,这提高了这类蛋白质的降解选择性的重要问题。例如,真空内化的简单方法不能对降解速率施加任何异质性,无论细胞内蛋白分解机制,选择性机制都必须运行。先前对选定的酵母蛋白(包括此处分析的几种)研究暗示它们在指数增长中没有降解(
      • Futcher B.
      • 后者G.I.
      • 蒙丁子
      • McLaughlin C.S.
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      酵母蛋白质组的采样。
      )但是标签/追逐时间段短,这是强调扩展标签/追逐协议在访问下层速率方面的重要性。此外,先前使用的放射性标记方法(
      • Futcher B.
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      细菌细胞周期的蛋白质组学分析。
      )不能容易地与鉴定步骤组合,整个蛋白质点的放射自显影意味着从多种肽的增强统计确定性无法进入。
      通过高精度和精确度确定各种蛋白质的降解率的能力在蛋白质组学中开辟了额外的尺寸。 “单点”方法产生可靠的参数估计和高质量的统计确定性,并特别适合于研究蛋白质降解的相对率。为了更详细地分析单个蛋白质的途径和降解劣化,同位素丰度的串行采样和多个时间点测定产生了一种可用于非线性曲线配件的数据集。这里使用的标记策略在细胞保持在稳态培养物中,但是将存在其他标记方案,这些方案更适合分批培养,器官培养物或完整的动物。例如,通过暂时暴露于前体标记来测量每种蛋白质的合成速率是可行的,尽管这将需要了解前体同位素丰度,并且与放射性同位素标记不同,稳定同位素标签的掺入程度必须实质上(>20%)可靠地估计大量偏移肽的丰富。
      通常与所有其他方法测量蛋白质周转率的方法,有限的能力定义高端蛋白质的速率。但高端营业额通过非常快速的重型损失表现出来,即使不量化降解的精确率,蛋白质仍将被归类为“高营业额”。通过相同的争论,标记损失率等于稀释率的蛋白质可以被归类为“极低的周转”,并且在该组中已经鉴定了两种这样的蛋白质。蛋白质避毒细胞的降解机制的机制可以在分子识别和过程的分子识别和酶的研究中施放的那样,这是高端营养素的研究。
      虽然从源自切除的斑点获得多种成交率的多种措施是最简单的,但没有理由将该方法不能应用于液相色谱分离的肽。液相色谱/质谱实验将产生 ria.t,但这将是一个价值。衡量标准的统计确定性的进一步改善是从使用多个时间点的,或者可以应用曲线配合方法的多个时间点,或者通过足够详尽的液相色谱分布覆盖,以从多个独特的肽获得的恢复周转率来自一种蛋白质。在这方面,亮氨酸的选择是重要的,因为它是蛋白质组中最丰富的氨基酸(
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      )。
      我们计划将该分析扩展到蛋​​白质中常见于超分子复合物的蛋白质的研究,其组装和构象对功能和稳定性具有深远的影响。在这项研究中,我们测量了迁移到单一斑点的蛋白质物种的周转率。然而,这些蛋白质分子可以是与其他蛋白质广泛不同的官能复合物的一部分,并且周转率可能是在超分子复合物的水平下运行的许多不同速率的平均值。包括在分析之前保留蛋白质 - 蛋白质相互作用的分馏步骤将分离涉及多项任务的蛋白质进入不同的级分。随后的周转分析可以揭示相同的蛋白质,这取决于其衍生的复杂的功能。
      尽管蛋白质降解在蛋白质组的维持中的重要性,但该过程仍然很大程度上是难以捉摸的。泛素缀合和蛋白酶体系的发现已经确定了标记和蛋白水解机制,其负责许多细胞内蛋白质的降解(
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      )。理解不良的关键区域是该方法的选择性的选择性,其中不同的蛋白质致力于以大幅不同的速率降解。准确测定降解率是研究蛋白质营业素调节和操纵研究的基本参数,例如在重组蛋白的工业生产中。此外,单一肽方法可以提供蛋白质组成分的蛋白质降解的范围和范围的快速概述。随着这种方法的发展,蛋白质组的动态不再被认为是无法进入的,并且应该更好地理解转录组和蛋白质组之间的关系。

      致谢

      我们感谢苏·弗朗西斯和Joanne Connolly提供技术援助。

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