用于监测信令网络中信息流的高通量定量多重激酶测定

应用于Sepsis-凋亡*
  • Kevin A. Janes.
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    生物工程部,剑桥400大街,MA 02139
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  • John G. Albeck.
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    剑桥,400大街,剑桥,MA 02139
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  • Lili X. Peng.
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  • 彼得K. acher
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    生物工程部,剑桥400大街,MA 02139

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    Massachusetts Tearch Cents Research中心,400大街,剑桥,MA 02139
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  • 道格拉斯A. Lauffenburger
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  • 迈克尔B. Yaffe
    一致
    应当解决对应的谁:癌症研究中心,马萨诸塞州理工学院,77 Massachusetts Ave.E18-580,剑桥,MA 02139。Tel.:617-452-2103,传真:617-452-4978;
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    生物工程部,剑桥400大街,MA 02139

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    Massachusetts Tearch Cents Research中心,400大街,剑桥,MA 02139
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国防高级研究计划机构生物信息微型计划,国家一般医学科学研究所(D. A. L.)和国家卫生学院授予Gm59281(对M. B. Y.)。惠特克基金会(K.A.J.)提供了额外的财政支持。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      为了有效治疗复杂的人类疾病,需要一种系统水平方法来了解疾病状态的环境提示,彩易福彩内信号和彩易福彩行为的相互作用。该方法需要高通量,多路复用技术,用于测量彩易福彩内信令网络中多种蛋白质活性的定量时间变化。在此,我们描述了一种基于微量滴定滴定的形式,同时量化磷脂酰肌醇3-激酶途径(AKT),核因子-κB途径(IKK)和三个核心丝裂剂活化蛋白激酶途径(ERK,JNK1, MK2)。与经典的低通量技术相比,这些平行的高通量测定是严格的线性的,冗余的,可重复的和敏感性。当应用于败血症诱导的结肠上皮彩易福彩凋亡的模型时,该方法将AKT活性的后期鉴定为彩易福彩存活的临界介质,其定量有助于胰岛素作为抗凋亡提示的疗效。因此,在彩易福彩内信号通信网络中的采样并联节点鉴定了胰岛素治疗人脓毒症中胰岛素疗效的分子机制的一部分。
      当彩易福彩暴露于出现,持续时间,起源和同步的彩易福彩外提示的组合时出现复杂的信号转导模式。彩易福彩通过互连的多功能,冗余分子网络来处理这些提示,以引出一组表型反应,随后在彩易福彩,组织和器官水平处影响功能。为了开发对患有人类疾病的复杂病理生理学的分子理解并利用该信息进行预后和治疗信息,系统级别,网络生物学方法应适用于相关彩易福彩应答的信令网络(
      • Nguyen A.
      • Yaffe M.B.
      蛋白质组学和系统生物学方法在败血症中信号转导的方法。
      )。这种方法需要在小区内的并行信号通路内的临界节点中频繁地对临界节点的蛋白质活性进行定量方式,以准确地表征信息流量。这种功能测量可能与简单蛋白质丰富的测量一样有价值或更有价值。通过定量探索信号通信网络的功能响应,并将这些分子事件与表型反应相关,可以构建提示信号的预测模型和信号响应关系。
      不断发展的网络生物学方法主要集中在仅在几个时间点或在有限数量的实验条件下测量许多蛋白质的丰度(
      • 泰尔斯米
      从基因组学到蛋白质组学。
      )。关于功能蛋白质特征的互补信息,例如酶活性,在这些系统分析中,大部分缺乏,因为不存在定量稳健的高通量技术,其同时测量彩易福彩中的多种蛋白质活性。最初,这种蛋白质功能状态的数据收集应专注于频繁采样有限数量的关键分子,其位于不同信令路径中的关键节点(图。1A)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1多源性激酶活动的高通量测定可以通过信令网络中的临界节点监控信息流。A,描述在TNF-α和胰岛素的下游激活的途径的广义网络图:激活相互作用(绿色箭头),抑制相互作用(红色箭头),转录相互作用(蓝箭头)。 灰色节点 突出显示通过高通量多重激酶活性测定测量的激酶。 红地区 表示凋亡途径, 绿色地区 表明存活途径,和 橙区 表明根据上下文,可以发挥能促进或抑制彩易福彩凋亡的应激途径。请注意网络中串扰的程度。图表不暗示全面( 例如 依赖于位置的互动已经抽象出来)。 B,高通量多重激酶活性测定法的一般示意图。将裂解物与抗激酶抗体精确孵育的蛋白A或G微量滴度孔温育。几次洗涤后,合适的基材和[γ-32P]将ATP添加到板上以启动 体外 磷酸化反应。反应用h终止34 (对于AKT和JNK1测定)或EDTA(对于IKK和MK2测定),将反应混合物的一部分转移到PC过滤器板上并洗涤以除去免费 32P.
      要开始解决这一点,我们已经开发了一种以96孔格式的多种蛋白激酶活性的多重分析的广义测定。该程序利用平行激酶特异性免疫耐压步骤,然后在每个激酶的线性速率制度内快速定量高通量活性测量。我们应用这种技术来测量五个激酶的活性(彩易福彩外调节激酶(ERK)
      使用的缩写是:ERK,彩易福彩外调节激酶; IKK,IκB激酶; JNK1,C-Jun N-末端激酶1; MK2,丝裂原活化蛋白激酶相关蛋白激酶2; PC,磷纤维素; PI 3-K,磷脂酰肌醇3-激酶; SIRS,全身炎症反应综合征; TNF-α,肿瘤坏死因子-α; dthiothreitol; IFN-γ,干扰素γ; GST,谷胱甘肽 S - 转移酶; CPM,每分钟计数。
      1使用的缩写是:ERK,彩易福彩外调节激酶; IKK,IκB激酶; JNK1,C-Jun N-末端激酶1; MK2,丝裂原活化蛋白激酶相关蛋白激酶2; PC,磷纤维素; PI 3-K,磷脂酰肌醇3-激酶; SIRS,全身炎症反应综合征; TNF-α,肿瘤坏死因子-α; dthiothreitol; IFN-γ,干扰素γ; GST,谷胱甘肽 S - 转移酶; CPM,每分钟计数。
      (
      • asthagiri a.r.
      • Horwitz a.f.
      • Lauffenburger D.A.
      使用方便的96孔格式进行快速敏感的定量激酶活性测定。
      ),在败血症/全身炎症反应综合征(SIRS)中,AKT,Iκ-B激酶(IKK),C-JUN N-末端激酶1(JNK1)和丝裂剂活化的蛋白激酶相关蛋白激酶2(MK2))肿瘤坏死因子 - α(TNF-α)的模型系统 - 诱导结肠上皮彩易福彩死亡。
      我们选择了这种实验模型,因为,临床上,败血症是危重病患者中最常见的死亡原因,是由分子网络功能障碍介导的急性,全身疾病的主要例子(
      • Hotchkiss R.S.
      • Karl i.e.
      脓毒症的病理生理学和治疗方法。
      ,
      • strassheim d。
      • 公园J.S.
      • 亚伯拉罕E.
      败血症:彩易福彩内信号传导的当前概念。
      )。尽管败血症的多方面的病因,结肠上皮代表了常见的最终效应器官,并且是受伤后编程彩易福彩死亡的主要部位(
      • Hotchkiss R.S.
      • Schmieg Jr.,R.E.
      • Swanson P.E.
      • 弗里曼B.D.
      • Tinsley K.W.
      • Cobb J.P.
      • Karl i.e.
      • Buchman t.g.
      创伤患者肠上皮和淋巴彩易福彩凋亡彩易福彩死亡的快速发作。
      )。据信,上皮彩易福彩凋亡会导致肠道屏障功能障碍(
      • Bojarski C.
      • Bendfeldt K.
      • gitter a.h.
      • Mankertz J.
      • FROMM M.
      • 瓦格纳斯。
      • Riecken E.O.
      • Schulzke J.D.
      彩易福彩凋亡和肠道屏障功能。
      ),导致彩易福彩因子泄漏,可能是细菌进入全身循环,从而加剧炎症状态。因此,肠道已被假设为驱动化粪池的“电动机”(
      • Wattanasirichaigoon S.
      • Menconi M.J.
      • delude r.l.
      • Fink M.P.
      肠系膜缺血再灌注或出血冲击对大鼠肠粘膜渗透性和ATP含量的影响。
      )。 TNF-α水平以多种形式的人败血症急促升高,水平与增加的死亡率相关(
      • 哈蒂尔米
      • 蒂巴斯...
      • 特纳C.
      • 拉紧鼠。
      • 默多克i.a.
      ProCalcitonin和彩易福彩因子水平:与器官失败和儿科脓毒症休克死亡的关系。
      )。五种激酶,其在TNF-α的下游测量的五个激酶作为规范集线器,用于控制彩易福彩存活,应力响应和编程彩易福彩死亡的发出的信号通路(图。1A, 灰色节点)(
      • 劳拉米
      • Alessi D.R.
      PKB / AKT:彩易福彩增殖,生存和胰岛素反应的关键介质?
      ,
      • 戴维斯r.j.
      JNK地图激酶的信号转导。
      ,
      • 卡琳米
      • 本Neriah Y.
      磷酸化符合泛素:NF-κB活性的控制。
      ,
      • Stokoe D.
      • Engel K.
      • 坎贝尔D.G.
      • 科恩P.
      • Gaestel M.
      MapKap激酶2作为负责小哺乳动物热冲击蛋白的磷酸化的主要酶的鉴定。
      )。通过高通量多重测定的时间对这些激酶的活性的定量取样提供了一种窗口进入了这种彩易福彩因子诱导的人类疾病模型中的信令网络状态。
      由于疾病的复杂性,败血症的治疗已被证明是难以捉摸的,有某些单疗法(例如 TNF antagonists (
      • Fisher Jr.,C.J.
      • Agosti J.m.
      • 蛋白石。
      • Lowry S.F.
      • BALK R.A.
      • Sadoff J.C.
      • 亚伯拉罕E.
      • 谢谢德芬
      • 本杰明E.
      用肿瘤坏死因子受体治疗化脓性冲击:Fc融合蛋白。可溶性TNF受体败血症研究组。
      ))实际上恶化患者的生存。有趣的是,最近发现强烈的胰岛素治疗,显着降低了危重疾病的发病率(
      • van den berghe g.
      • 韦特斯P.
      • 周人员F.
      • verwaest c.
      • Bruyninckx F.
      • Schetz M.
      • vlasselaers d。
      • Ferdinande P.
      • Lauwers P.
      • 肉块R.
      危重病患者的密集胰岛素治疗。
      ),尽管这种效果的机制是未知的(
      • Hotchkiss R.S.
      • Karl i.e.
      脓毒症的病理生理学和治疗方法。
      )。已经提出了许多可能性,包括葡萄糖水平的紧张调节(
      • van den berghe g.
      • 韦特斯P.J.
      • 肉块R.
      • 周人员F.
      • verwaest c.
      • Schetz M.
      • vlasselaers d。
      • Ferdinande P.
      • Lauwers P.
      强化胰岛素治疗在危重病中的结果效益:胰岛素剂量与血糖控制。
      ),对促炎症分子的拮抗作用(
      • Hirsch I.B.
      • Coviello A.
      危重患者的密集胰岛素治疗。
      )和减少循环的C-反应蛋白水平(
      • Hansen T.K.
      • 泰尔斯。
      • 韦特斯P.J.
      • Christiansen J.s.
      • van den berghe g.
      强化胰岛素治疗在重症患者中施加抗炎作用,抵消低甘露糖结合凝集素水平的不良影响。
      )。
      在分子水平下,TNF-α和胰岛素激活许多高度互连的常见信号通路(图。1A),并且很难预测 先验 如何将这些突出的线索彩易福彩内加工以确定在生理相关彩易福彩类型中的彩易福彩命运。我们假设通过这些关键信令节点的信息流量的定量,动态测量可以阐明如何处理网络信息并揭示涉及胰岛素在败血症机制的新的信号响应关系。
      我们实施了一个 体外 TNF诱导的人性结肠上皮彩易福彩中的编程彩易福彩死亡模型在胰岛素常用时存活TNF-α治疗。然后通过用高通量测定进行超过400个独立激酶活性测量来探索对该模型系统中的组合系统的TNF-α和胰岛素的网络响应。在胰岛素治疗后观察到TNF诱导的结肠上皮死亡的显着降低。这与AKT激酶活性的模式的深刻变化相关,只有在测定的其他激酶的活动中观察到的微小扰动。我们能够将至少一半的胰岛素诱导的存活作用归因于晚期的AKT途径的特异性活化。重要的是,我们发现在TNF-α添加之后添加胰岛素4h提供足够的后期Akt活性,以引发与胰岛素与TNF-α同时加入胰岛素时相同的存活效果,表明胰岛素如何改善患者存活的分子机制在败血症中,即使在初始侮辱后的时数。我们在此报告的测定格式和方法提供了一个公共平台,现在可以在广泛的科学和医学利益的不同实验条件下系统地探测适量的采样率。

      实验步骤

       彩易福彩培养,刺激和裂解 -

      根据制造商的建议生长HT-29和HELA彩易福彩(ATCC,Manassas,VA)。对于时间课程,HT-29彩易福彩在50,000个彩易福彩/厘米处接种2,生长24小时,然后用200 u / ml IFN-γ(Roche)处理另外24小时。敏化后,用PBS冲洗一次彩易福彩,并用50ng / ml TNF-α(PEPROTECH,岩石山,NJ)处理,有或没有100n m 胰岛素(Sigma)的指示时间。用冰冷的PBS洗涤一次彩易福彩并在1%Triton X-100,50米中裂解m Tris-HCl(pH7.5),150米m NaCl, 50 mm β-甘油磷酸盐,10米m 焦磷酸钠,30米m NaF, 1 mm benzamidine, 2 mm EGTA, 100 μm NaVO4, 1 mm 二硫醇(DTT),1米m 苯基甲基磺酰芳基,10μg/ ml抑肽蛋白,10μg/ ml菌蛋白,1μg/ ml胃蛋白酶,1μg/ ml微囊酰-1R。将全彩易福彩裂解物在冰上孵育15分钟,然后通过以16,000×离心澄清 g 在4°C下15分钟。用双循环酸测定法(Pierce)测定澄清提取物的蛋白质浓度。

       高通量激酶活性测定 -

      用以下抗体进行基于微量滴定滴定激酶活性测定:抗ERK1 / 2 CT(Upstate Biotechnology,Lake PlaId,NY),抗AKT pH结构域(Upstate Biotechnology),反JNK1(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz ,加利福尼亚州),抗IKKα/β(Santa Cruz Biotechnology)或抗MK2(Upstate Biotechnology)。用10μg/ ml抗激酶抗体涂覆蛋白A或G微量滴定条(Pierce)过夜,并用封闭缓冲液(1%牛血清白蛋白(Sigma)在50米中洗涤三次m Tris-HCl(pH7.5),150米m NaCl,0.05%Triton X-100)。在3小时(ERK,AKT,JNK1和MK2)中,加入彩易福彩裂解物(25μg的AKT,对于JNK1,200μg,对于IKK,200μg,600μg,对于Ikk,600μg)或夜间(IKK),然后用洗涤缓冲液洗两次(50米m Tris-HCl(pH7.5),150米m NaCl)和三次用激酶洗涤缓冲液(20米m Tris-HCl(pH 7.5),15米m MgCl2, 5 mm β-甘油磷酸盐,1米m EGTA, 0.2 mm Na3vo.4,0.2米m DTT)。将孔重悬于20μL激酶洗涤缓冲液中并温热至37℃。然后20μL激酶测定缓冲液(激酶洗涤缓冲液加0.4μm 蛋白激酶抑制剂,4μm 蛋白激酶C抑制剂,4μm 钙咪唑,0-25μm 冷ATP,1-5μCi[γ-32将P] ATP)加入到孔中,然后加入20μl底物(ERK的40μg髓鞘碱性蛋白,10μm aktide. (
      • obata t.
      • Yaffe M.B.
      • Leparc G.G.
      • Piro e.t.
      • 迈那瓦夫
      • kashiwagi a。
      • Kikkawa R.
      • 坎特利L.C.
      肽和蛋白质文库筛选为AKT / PKB定义了最佳基板图案。
      )对于Akt,3μg谷胱甘肽 S - 转移酶(GST)-ATF2(1-109)(
      • Gupta S.
      • 坎贝尔D.
      • 德拉德B.
      • 戴维斯r.j.
      JNK信号转导通路的转录因子ATF2调节。
      )对于JNK1,10μm MK2tide
      I. A. Manke和M. B. Yaffe,稿件准备。
      对于MK2,10μgGST-IκBα(1-62)(
      • Geleziunas R.
      • Ferrell S.
      • 林X.
      • mu y.
      • Cunningham Jr.,E.T.
      • 格兰特M.
      • connelly m.a.
      • Hambor J.E.
      • Marcu K.B.
      • Greene W.C.
      NF-Kappab的人T彩易福彩白血病病毒类型1税诱导涉及IKappab激酶α(Ikkalpha)和Ikkbeta彩易福彩激酶的激活。
      )对于ikk)启动反应。使激酶反应在37℃下进行15-120分钟,然后终止60μl75mm H34 or 20 mm EDTA。每个激酶测定的确切条件详述 表I.。对于EDTA封端的反应,将40μl封端的反应转移到含100μL75米的磷酸纤维素过滤板(Millipore,Bedford,MA)中m H34 和 mixed, whereas H34 - 将反应直接加入过滤板。将终止的反应物含有真空过滤并用75米洗涤五次 m H34 和70%EtOH的三次。将过滤器冲入小瓶中,并通过液体闪烁(彩易福彩科学术; ICN Pharmaceuticals,Costa Mesa,CA)测量放射性。除了免疫耐压步骤中仅含有裂解缓冲液的空白孔的结果,以除去非特异性贡献,除了AKT,其中没有必要。
      T有能力的 I个体体外激酶测定的实验条件
      激酶抗体基质ATP(μ.m)[γ-32P] ATP(μCI)反应时间(分钟)终止
      ERK.抗ERK1 / 2 CT髓鞘碱性蛋白质25160H34
      Akt.抗AKT pHOM。aktide.10530H34
      JNK1反JNK1GST-ATF2(1-109)10260H34
      IKK.抗IKKα/βGST-IκBα(1-62)05120EDTA.
      MK2Anti-Mapkap K2mk2tide.25215EDTA.

       Western Blotting-

      为了测定靶捕获,在激酶反应步骤之前停止测定并重新悬浮在40μl样品缓冲液中(62.5米m Tris-HCl(pH6.8),2%SDS,10%甘油,100米m DTT,0.01%溴酚蓝)。孔煮沸5分钟,并将样品溶于10%聚丙烯酰胺凝胶上并转移到聚偏二氟化乙烯(Millipore)中。膜被20米的5%非脱脂牛奶封闭m Tris-HCl(pH7.5),137米m NaCl,0.1%Tween-20,并用以下一抗抑制1:1000稀释:抗AKT(Upstate Biotechnology),抗JNK1(Santa Cruz Biotechnology),反玛卡克(Santa Cruz Biotechnology),Anti-Mapkapk2(resorceben Biotechnologies,Victoria,不列颠哥伦比亚省,加拿大),抗IKKα/β(Santa Cruz Biotechnology)。然后用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或抗兔第二抗体(Amersham Pharmacia Biotech)探测膜,在1:10,000稀释,并通过增强的化学发光(Amersham Pharmacia Biotech)在氟(Bio-rad)或柯达图像站上可视化(Perkin Elmer)。根据制造商的建议选择和量化频段。

       autoradoography-

      将30微升的终止激酶反应与10μl4×样品缓冲液混合,并在10%聚丙烯酰胺甘氨酸凝胶上用于蛋白质基材或肽基材的16%聚丙烯酰胺三甘油凝胶(
      • Judd R.C.
      )。染料前部被切除,凝胶过夜暴露于多敏感的BAFBR:欧盟2+ 屏幕(Perkin Elmer)。使用旋风储存磷光体系(Perkin Elmer)可视化屏幕。

       彩易福彩成像 -

      将HT-29彩易福彩播种在Delta T玻璃培养皿中(Bioptechs)。 30小时后,如上所述用IFN-γ预处理彩易福彩,然后用50ng / ml TNF-α或50ng / ml TNF-α+ 100n进行冲洗并处理m 胰岛素18小时。然后将6μg/ ml Hoechst 33342(分子探针,丁烯或)加入培养基中,收集相位和荧光图像。然后用100%MeOH固定彩易福彩并在-20℃下储存过夜。用抗切割的胱天悬浮酶3(彩易福彩信号传导,贝弗利,MA)和用Alexa 594-缀合的抗兔IgG(分子探针)进行二次染色后,收集荧光图像。

       彩易福彩凋亡测定 -

      将HT-29彩易福彩接种在96孔板中,并如上所述用IFN-γ敏化。对于抑制剂研究,20μm 在彩易福彩因子刺激后,将Ly294002添加到培养基1小时内或3小时。在冲洗实验期间,除去培养基,孔用PBS洗涤一次。然后将培养基用含有相同彩易福彩因子浓度的彩易福彩的培养基替换,没有抑制剂。 18小时后,用PBS和胰蛋白酶漂洗彩易福彩。保存上清液和漂洗并将其与胰蛋白酶化彩易福彩结合,以确保捕获浮动和粘附彩易福彩。用PBS洗涤彩易福彩,然后固定在100%MeOH中并储存在-20℃。用荧光素标记的单克隆抗体染色固定彩易福彩,该荧光素标记的含有含有抗切割 - caspase-3(ASP 175;彩易福彩信号传导)的氨基酶 - 切割的彩易福彩角蛋白酶(M30; rocke),用alexa 647-缀合的抗兔二次(分子探针),根据制造商的说明。染色后洗涤一次彩易福彩,然后通过流式彩易福彩术分析(FacScalibur; Becton-Dickinson,山景,CA)分析。彩易福彩阳性裂解彩易福彩角蛋白,切割的Caspase-3或两者的凋亡。针对每种治疗条件分析三个单独的生物样品。根据下式计算存活率增加的百分比:[1 - (在胰岛素存在下的%凋亡彩易福彩)/(在相同预处理条件下没有胰岛素的凋亡彩易福彩)]×100%。

      结果和讨论

       高通量激酶活性测定发育 -

      广义测定格式涉及四个步骤,如图所示 图。1B:i)通过免疫沉淀到全彩易福彩裂解物的内源激酶的平行纯化通过免疫沉淀到已经预先用激酶特异性抗体,II)低严格洗涤以除去非纯化的裂解物组分,III)加入[γ-]的蛋白质A或G微量滴定物。添加[γ-32p] ATP和激酶特异性底物引发 体外 激酶反应和iv)终止 体外 reaction either by H34 或EDTA和液体转移到96孔磷酸纤溶酶(PC)过滤板以分离磷蛋白并除去游离[γ-32p] ATP。我们为ERK开发了测定(
      • asthagiri a.r.
      • Horwitz a.f.
      • Lauffenburger D.A.
      使用方便的96孔格式进行快速敏感的定量激酶活性测定。
      在严格优化和定量验证之后,彩易福彩提取物中的AKT,JNK1,IKK和MK2活性。
      为了开发并行免疫纯化步骤,我们通过实验筛选多个市售产品,并针对每个激酶鉴定为保留酶活性的单个高亲和力抗体。单独优化蛋白A / G微量滴定板上的每种抗激酶抗体的涂覆条件,揭示当施加50μl10μg/ ml抗体时,抗体最大限度地结合其预期靶标(Fig. 2, 广告, 左侧面板),与我们对板表面上的抗体结合位点的数量的估计一致。多克隆抗体(抗JNK1,抗IKKα/β和抗MK2)的较高涂层浓度降低了激酶的固相无脂,并导致净化效率的净降低(Fig. 2, B-D., 左侧面板)。在优化的涂层浓度下(Fig. 2, 广告, 左侧面板,箭头),免疫纯化在通过大量裂解物浓度上纯化的激酶量(Fig. 3, 广告)。这表明抗体捕获步骤线性地反映了裂解物中的激酶丰度。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2高通量多重激酶活性测定是最佳敏感的,定量的线性,并且对靶激酶特异性。A, 左侧面板,AKT在蛋白G微量滴定板上的500μgHT-29裂解物免疫纯化,涂覆有50μl抗AKT的各种涂料浓度。通过蛋白质印迹分析板式AKT,如“实验过程”所描述的,并通过带强度的密度测定来计算归一化体积。 中间伙计,由1μ处理的HT-29彩易福彩50-600μg裂解物m 使用10μ的高通量Akt活性测定测量5分钟的胰岛素5分钟测量m 如“实验程序”所描述的那样为基板。刺激的裂解物()与500μg未处理的对照裂解物进行比较(坚固的酒吧)。 右侧面板,HT-29彩易福彩用各种浓度的Wortmannin(Sigma)预处理1小时,然后用1μ刺激m 胰岛素5分钟并裂解。如“实验程序”下所述量化AKT活动。 B, 左侧面板,JNK1从200μg的蛋白质A的HT-29裂解物免疫纯化,MICRITITER板在各种涂料浓度下涂有50μl抗-JNK1并如下所述分析 A. 中间伙计,用30J / m处理后,来自HT-29彩易福彩的25-500μg裂解物收获30分钟2 使用3μgGST-ATF2(1-109)作为基质的高通量JNK1活性测定测量UV-C,如“实验程序”所描述的。刺激的裂解物()与200μg未处理的对照裂解物进行比较(坚固的酒吧)。 右侧面板从UV刺激的HT-29彩易福彩中孵育的板式JNK1具有各种浓度的SP600125(CalBioChem),并如“实验程序”下所述量化JNK1活性。 C, 左侧面板,IKK在蛋白质A的蛋白质A蛋白质中的800μgHT-29裂解物免疫,以各种涂料浓度涂覆有50μl抗IKKα/β并如下所述分析 A. 中间伙计,用100ng / ml TNF-α处理的来自100ng / ml TNF-α处理的50-800μg裂解物,使用10μggst-iκBα(1-62)作为基质,如“实验步骤。”刺激的裂解物()与600μg未处理的对照裂解物进行比较(坚固的酒吧)。 右侧面板,将来自TNF刺激的Hela彩易福彩的板式Ikk孵育1小时,各种浓度为15-脱氧-δ12,14 - Prostaglandin J.2 (15d-pgj.2; CALBIOCHEM)和IKK活动量如“实验程序”所描述的。 D, 左侧面板,MK2在200μg的HT-29裂解物上免疫纯化在蛋白G微量滴定板上,在各种涂料浓度下涂有50μl抗MK2并如所述分析 A. 中间伙计,来自HT-29彩易福彩的10-400μg裂解物,用500米处理m 使用10μ的高通量MK2活性测定测量NaCl 30分钟m 如“实验程序”下所述,如底物为基板。刺激的裂解物()与200μg未处理的对照裂解物进行比较(坚固的酒吧)。 右侧面板,用各种浓度的Sb202190(Calbiochem)预处理HT-29彩易福彩1小时,然后用500米刺激m NaCl 30分钟并裂解。如“实验程序”下所述量化MK2活性。所有激酶活动均报告为平均值±S.E.一式三份样品(MK2测定的误差杆小于标记的尺寸)。用类似结果重复两次蛋白质印迹;显示代表性图像。 箭头 表示相邻实验的固定实验条件。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3内源性激酶的纯化在抗体涂覆的微量滴定板上是线性的。A,将300-700μg的HT-29裂解物在涂有10μg/ ml抗AKT的蛋白G微量滴定板上孵育3小时。通过蛋白质印迹分析板式AKT,如“实验过程”所描述的,并通过带强度的密度测定来计算归一化体积。 B,将100-250μg的HT-29裂解物孵育3小时,蛋白质涂有10μg/ ml抗JNK1的微量滴定板,并如所述分析 A. C,将400-900μg的HT-29裂解物在蛋白质A涂覆有10μg/ mL抗IKKα/β的微量滴定板上孵育过夜,并如下所述分析 A. D,将50-200μg的HT-29裂解物在涂有10μg/ ml抗MK2的蛋白G微量滴定板上温育3小时,并如所述分析 A。蛋白质印迹至少进行两次,结果;显示代表性图像。
      接下来,通过改变以下内容来优化每个测定的激酶反应条件 体外 参数:基材的选择,底物浓度,放射性到非酰基活性ATP比和反应持续时间(参见“实验程序”)。当确定单个激酶有效地磷酸化多个基质时(Fig. 4, A, B, 和 D 和数据未示出),选择基板显示最高的比活性(每分钟计数(CPM)/μmol)以最大化敏感性。其他反应参数,例如缓冲剂组合物和反应温度,有意地保持恒定,以使不同激酶的测定能够在单个步骤中在同一微量滴定板上并联进行。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4终止 体外 反应产物特异性含有磷酸化基材。A,高通量akt测定,使用10μm 通过SDS-PAGE和终止后,通过SDS-PAGE和Autoradopraphy分析αktide或40μg部分纯化的组蛋白(Sigma)作为底物分析 体外 “实验程序”下描述的反应。注意,磷肽已经脱掉凝胶,并且没有其他磷酸化带是明显的。 B,使用3μgATF-2或2μgC-JUM(Upstate Biotechnology)作为衬底的高通量JNK1测定作为底物进行分析,如下所述 A. 单个星号 表明 32P掺入部分切割的基板。 C,如下所述分析使用10μgIκBα作为衬底的高通量IKK测定法 A. 双星号 表明非特异性 32P Goncoration(注意,这些带在空白样本中具有相等强度,使得背景减法将消除它们的贡献)。 D,高通量MK2测定,使用10μm 如下所述分析MK2TAIDE或5μgHSP27(UPSTATE BIOTECHNOLOGY)作为衬底进行分析 A。注意,磷肽已经脱掉凝胶,并且没有其他磷酸化带是明显的。 E,肽基材(10μm Akt测定的Aktide和10μm MK2测定的MK2氧化物)在16%三甘氨酸 - 聚丙烯酰胺凝胶上进行分析,并在终止后进行放射造影 体外 “实验程序”下描述的反应。指示5-KDA标记的迁移位置。
      通过添加相同的75 mm H来终止ERK,AKT和JNK1测定34 对于微量滴定器反应,并将井内容物转移到平行的96孔PC过滤板以进行洗涤和定量。通过增加20卷来终止MK2和IKK测定m EDTA到微量滴定反应良好,并将内容物转移到96孔PC过滤器板上,以75米缩小m H34 在每个井里。转移到PC过滤器的终止反应混合物的SDS-PAGE分析证实磷酸化仅在添加的基材上发生(Fig. 4, A-E.)。因此,可以冲压PC板孔中的单个过滤器,用于闪烁计数以精确定量激酶活性,从而消除了经典免疫复合激酶测定中所需的低通量,SDS-PAP-AFRAPORAGE步骤。
      为了研究这些测定的灵敏度,动态范围和线性度,用每个激酶的已知活化剂处理HT-29和HeLa彩易福彩,以及作为不同稀释液的不同稀释液的函数测量的激酶活性(PC过滤器上的CPM)裂解物(Fig. 2, 广告, 中间板)。这 32P掺入在活性中的至少一个数量级,测定的绝对敏感性始终低于200μg,其测定能够测量从总裂解物的少于10-25μg的活性。该结果与通常需要数百微克裂解物的现有测定相当或更好地进行可比解(
      • whitmarsh a.j.
      • 戴维斯r.j.
      分析JNK和P38丝裂原活化蛋白激酶活性。
      ,
      • 山米。
      • HEMMINGS B.A.
      蛋白激酶B / Akt分析。
      ,
      • Kupfer R.
      • 施泰曼罗..
      原代大鼠T细​​胞IKK活性的测量:快速激活和失活。
      )。格式的总灵敏度超过足以从HT-29彩易福彩的单个10cm板同时测量ERK,AKT,JNK1,MK2和IKK活性。
      通过在每个测定的动态范围的中间选择单一浓度来检查每个激酶测定的信号对噪声和再现性特性(Fig. 2, 广告, 中间板,箭头)从刺激和未刺激的彩易福彩比较裂解物之间的激酶活性。对于每种激动剂,这揭示了每个内源性激酶的相对激活,其幅度与文献中报道的幅度相当,随着测定的变异系数总是≤10%。因此,测定清晰地反映了内源途径的激活,并且活性的终点测量值高度敏感和可再现。
      为了使这些测定反映信息流过信令网络的准确性,确认我们的终点CPM测量线性地反映了裂解物中的激酶活性至关重要。因此,动力学 体外 在线性范围内的选择固定裂解物浓度下详细检查反应(Fig. 2, 广告, 中间板,箭头)。如图所示 Fig. 5, 广告,每种磷酸化反应显示线性动力学直至终止的时间,表明既不是[γ-32在反应过程中,P] ATP也显着耗尽。因此,测定过程中每一步的线性度(激酶捕获, 体外 反应动力学和终点CPM测量)强烈表明这些测定是内源激酶活性的线性反射 体内.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5动力学的动力学 体外 激酶反应随时间线性。 将测定与用患病途径的已知活化剂处理的固定量的HT-29或HeLa裂解物一起温育(有关详细信息,请参阅 , 广告)。 体外 使反应进行指示时间并如“实验程序”下所述分析。 A,Akt测定动力学,具有500μg的HT-29裂解物。 B,JNK1测定动力学与JNK1的200μgHT-29裂解物。 C,IKK测定动力学,具有800μgHela裂解物的IKK。 D,MK2测定动力学和MK2的动力学从200μg的HT-29裂解物。
      作为测定特异性的最终确认,我们检查了据报道的各种小分子抑制剂对每个测量的激酶或直接上游激酶(
      • Arcaro A.
      • Wymann M.P.
      Wortmannin是一种有效的磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂:磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸在中性粒彩易福彩反应中的作用。
      ,
      • Bennett B.L.
      • Sasaki D.T.
      • 默里B.W.
      • o'leary e.c.
      • Sakata S.T.
      • 徐W.
      • Leisten J.C.
      • Motiwala A.
      • 皮尔斯。
      • 缎子Y.
      • Bhagwat S.S.
      • 曼宁上午
      • 安德森D.W.
      SP600125是Jun N-末端激酶的Anthrapyrazolone抑制剂。
      ,
      • 罗西A.
      • 哈帕皮P.
      • NA. toli G.
      • Takahashi T.
      • 陈Y.
      • 卡琳米
      • Santoro M.G.
      抗炎环戊酮前列腺素是Ikappab激酶的直接抑制剂。
      ,
      • 李约。
      • Laydon J.T.
      • 麦克唐纳P.C.
      • Gallagher T.F.
      • Kumar S.
      • 绿色D.
      • 麦利D.
      • Blumenthal M.J.
      • 嘿嘿
      • Landvatter S.W.
      • strickler J.E.
      • Mclaughlin m.m.
      • 西门子J.R.
      • 费舍尔小
      • Livi G.P.
      • 白色J.R.
      • 亚当斯J.L.
      • 年轻的p.r.
      涉及炎症彩易福彩因子生物合成调节的蛋白激酶。
      )。在固定裂解物浓度(Fig. 2, 广告, 中间板,箭头),测量活动中的剂量依赖性降低(Fig. 2, 广告, 右图)被观察到,与报告的IC一致50 靶激酶的值。与测量格式固有的冗余抗体 - 激酶和激酶底物特异性一起服用,这些结果强烈表明测定特异性量化了预期激酶的内源性活性。我们得出结论,高通量多重测定提供了可靠的定量测量,其直接反映彩易福彩提取物中的特定蛋白激酶活性。

       在败血症诱导的结肠上皮彩易福彩凋亡的体外模型中的应用 -

      HT-29彩易福彩是一种人结肠癌彩易福彩系,其响应于TNF-α,与干扰素γ(IFN-γ)致敏之后(
      • Abreu-Martin M.T.
      • Vidrich A.
      • Lynch D.H.
      • targan s.r.
      HT-29彩易福彩中凋亡和IL-8分泌的发散诱导响应于TNF-α和Fas抗原的连接。
      )。我们证实,TNF处理的HT-29彩易福彩表现出许多彩易福彩凋亡的特征,例如彩易福彩收缩,膜膨胀,核凝结和Caspase 3活化(Fig. 6, 剩下)。有趣的是,如果HT-29彩易福彩与胰岛素共鸣(以下),我们发现TNF诱导的彩易福彩死亡可以减少〜30%(Fig. 6, 正确的),与以前的报告一致(
      • Remacle-Bonnet m.m.
      • Garrouste F.L.
      • 地狱家。
      • 安德福。
      • Marvaldi J.L.
      • Pommier G.J.
      胰岛素样生长因子-I通过增强肿瘤坏死因子α诱导的丝裂剂活化蛋白激酶和核因子κB信号传导途径来保护来自死亡因子诱导的彩易福彩凋亡的结肠癌彩易福彩。
      )。鉴于胰岛素(如TNF-α和IFN-γ)的重要性,在败血症中(
      • Hotchkiss R.S.
      • Karl i.e.
      脓毒症的病理生理学和治疗方法。
      )胰岛素作为危重病患者治疗的胰岛素的新兴作用(
      • van den berghe g.
      • 韦特斯P.
      • 周人员F.
      • verwaest c.
      • Bruyninckx F.
      • Schetz M.
      • vlasselaers d。
      • Ferdinande P.
      • Lauwers P.
      • 肉块R.
      危重病患者的密集胰岛素治疗。
      ),我们认为HT-29彩易福彩作为用于探索TNF-α和TNF-α+胰岛素激活的信号网络动态的适当模型系统,与相关彩易福彩表型:结肠上皮彩易福彩死亡,如败血症发作期间所观察到的(
      • Hotchkiss R.S.
      • Schmieg Jr.,R.E.
      • Swanson P.E.
      • 弗里曼B.D.
      • Tinsley K.W.
      • Cobb J.P.
      • Karl i.e.
      • Buchman t.g.
      创伤患者肠上皮和淋巴彩易福彩凋亡彩易福彩死亡的快速发作。
      )。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6IFN敏化的HT-29彩易福彩响应于TNF-α进行编程的彩易福彩死亡,并且可以通过与胰岛素的分配器来拯救。主板S,单独用100ng / ml TNF-α处理HT-29彩易福彩的相位对比图像(剩下)和100 ng / ml tnf-α+ 100 nm insulin (正确的)如“实验程序”所描述的。注意单独用TNF-α处理彩易福彩中具有浓缩核的缩小彩易福彩数量增加(箭头)。 插入,间接免疫荧光图像的切割的caspase 3( 红色的)单独用100ng / ml TNF-α处理的HT-29彩易福彩(剩下)和100 ng / ml tnf-α+ 100 nm insulin (正确的)。注意TNF-α单独图像中的切割的caspase 3阳性彩易福彩数增加。 Hoechst 33342(蓝色的)覆盖在所有图像中以显示核。
      IFN敏化的HT-29彩易福彩用50ng / ml TNF-α处理,存在或不存在100 n m 在24小时内,在13倍点,制备胰岛素和三份裂解物。由于这些提示诱导的大部分信号传导不久发生在彩易福彩因子加法后,在前4小时中更密集地采样时间点(Fig. 7, AB, 插入)。通过这些彩易福彩提取物,使用高通量多重激酶活性测定法进行ERK,AKT,JNK1,MK2和IKK激酶活性的定量测量(Fig. 7, AB)。据我们所知,这套时间课程由400多种独立活动测量组成,代表了迄今为止执行的功能信令动态的最全面的严格定量研究。为了实现这种深度的定量,传统技术的复制网络抽样将在非常费力和技术上是不切实际的。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7TNF-α和TNF-α+胰岛素处理在HT-29彩易福彩中引出定量不同的信号传导模式。 Endogenous ERK (绿色),akt(红色的),JNK1(蓝色的),IKK(紫色的)和mk2(橙子)HT-29彩易福彩中的活动是响应的: A,50ng / ml tnf-α(填充圈子) 和 B,50 ng / ml tnf-α+ 100 nm insulin (开放的圈子)。在0,5,15,30,60,90 min和2,4,8,12,16,20,24h中产生裂解物,然后用高通量多重激酶测定测量激酶活性。结果被绘制为三个独立彩易福彩提取物的平均折叠活化。为了清楚起见,省略误差栏,但在面板中显示 C. C,ERK,AKT,JNK1,IKK和MK2活动的比较响应TNF-α(填充圈子)和TNF-α+胰岛素(开放的圈子) 从 AB,绘制为平均折叠激活±S.E.三份样品。
      此外,为了在TNF-α信号传导的背景下解构胰岛素治疗对信令网络的影响,对TNF-α下的每个激酶进行成对比较,其具有胰岛素刺激。如图所示 图7C.,激活某些途径的动态,例如ERK途径(图7C., 绿色),基本上是叠加的。因此,在这些条件下,胰岛素不会影响通过TNF-α的ERK途径的激活。其他TNF诱导的激酶活性受到胰岛素的时间依赖性的方式影响。例如,JNK1活性在中间时间(8-16小时)较大,而IKK活性在16小时下较小,并且在晚期(16-24小时)下MK2活性较大。虽然潜在重要的是,这些瞬态信号传导差异没有明确反映在彩易福彩水平上观察到的胰岛素诱导的存活表型( Fig. 6)。

       后期akt活性作为关键的Pro-survival信号 -

      与胰岛素对ERK,JNK1,IKK和MK2信号传导的微妙影响,显而易见的是,胰岛素显着增加了AKT活性,诱导在5分钟内快速增加并持续24小时,而单独使用TNF-α ,AKT响应的幅度小得多(图7C., 红色的)。除了这些定量差异之外,我们注意到动态TNF诱导的AKT反应在没有胰岛素的情况下也定性不同,因为活化过程显然是双相的,并且短暂的初始峰,其次是小的(IE。 2倍),4小时后的活性持续增加。如果这些数据尚未严格定量,或者具有不经常进行的信号通信网络,则可能会错过这种活动的增加。然而,通过高通量活性测定,显然与基线活动相比,4小时后的AKT活性显着上调(p <4小时后始终0.05,学生 t test).
      这些发现表明,胰岛素诱导的抗凋亡效应的显着成分由高持续的AKT活性介导,并且该活性谱来自早期升高的活性阶段的叠加,即短暂的,持续的活性升高(图8A)。相反,在单独用TNF-α处理的彩易福彩中,在强度下减少这两相并及时分离。因为AKT被认为提供强大的Pro-Survival信号(
      • 劳拉米
      • Alessi D.R.
      PKB / AKT:彩易福彩增殖,生存和胰岛素反应的关键介质?
      ),我们假设AKT活化的这些时间成分中的一个或两个涉及控制HT-29彩易福彩对TNF-α和胰岛素的表型反应。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8胰岛素升高了AKT活性的两相,AKT活性的后期在HT-29彩易福彩中提供了临界抗凋亡信号。A,对在胰岛素的存在下观察到的持续的AKT活性的假设两相贡献(, BC)。 B,HT-29彩易福彩死亡响应无彩易福彩因子(▪),50ng / ml TNF-α(▪),或50ng / ml TNF-α+ 100 nm 胰岛素(▪)在20μ的存在下m LY294002 (l)在指示的时间。染色彩易福彩用于切割的彩易福彩角蛋白和切割的胱天蛋白3并通过“实验程序”下描述的流式彩易福彩仪分析。值表示凋亡彩易福彩±S.E.的百分比。三份样品。 C,HT-29彩易福彩存活响应定时组合为50ng / ml TNF-α,100 nm insulin, and 20 μm LY294002。值表示增加存活±s.e.的百分比。如“实验程序”下所述计算的三份样本。对对照实验保持恒定载体(0.1%DMSO)。
      为了研究这一点,我们使用可逆的选择性抑制剂(Ly294002(
      • vlahos c.j.
      • 问题W.F.
      • 慧克.Y.
      • 棕色r.f.
      磷脂酰肌醇3-激酶的特异性抑制剂,2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-一(LY294002)。
      ))磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-K),Akt的上游活化剂。在关键时期中加入或除去LY294002,以消除AKT活性的早期阶段,AKT活性的后期,或两者,通过流式彩易福彩术与抗切割的胱天蛋白3抗体和M30抗体量化(
      • leers m.p.
      • 加尔根W.
      • Bjorklund V.
      • 伯格曼T.
      • Tribbick G.
      • 波尔顿B.
      • Bjorklund P.
      • raamekers f.c.
      • Bjorklund B.
      • 午睡M.
      • Jornvall H.
      • Schutte B.
      早期凋亡期间暴露的彩易福彩角蛋白18新表位的免疫彩易福彩化学检测与映射。
      )针对半胱天冬酶切割的彩易福彩角蛋白。我们发现这种双重污染是HT-29彩易福彩中最敏感,定量可再现的彩易福彩凋亡的量度。
      J. G. Albeck,未发表的观察。
      当在彩易福彩因子加入1小时之前,在彩易福彩因子添加并在整个时间过程中保持AKT活性,观察到TNF诱导彩易福彩死亡的显着增加(图8B., 红色的)。令人惊讶的是,如果仅为TNF-α的前3小时存在Ly294002,因此仅允许AKT活性的后期,如果没有抑制剂的处理没有增加的彩易福彩死亡。相反,当在彩易福彩因子除了选择性地废除后期Akt活性的彩易福彩因子除了3小时后,我们观察到当抑制剂在整个24小时存在时观察到的彩易福彩死亡增加,观察到相当于观察到的彩易福彩死亡的增加。响应于TNF-α+胰岛素观察到相同的模式(图8B., 绿色),而Ly294002对基础凋亡仅为小效果(图8B., 蓝色的)。这些数据表明,延迟阶段AKT激活是必要的,以抑制在存在或不存在胰岛素的情况下响应于TNF-α进行编程的彩易福彩死亡的彩易福彩百分比。
      在胰岛素的存在下,在控制TNF诱导的彩易福彩死亡中,在控制TNF诱导的彩易福彩死亡中的重要性导致了胰岛素诱导的彩易福彩存活增加的假设,部分原因是这种延迟AKT信号传导的这种增加。如果是真,那么在预毒刺激应该引起TNF诱导的彩易福彩凋亡程度时应引起等效减少的胰岛素高达4小时。实际上,这是观察到的;在与TNF-α同时加入胰岛素时观察到的TNF-α之后的延迟添加胰岛素4小时,导致HT-29彩易福彩存活率相同的增加。图8C.)。此外,在胰岛素添加前的Ly294002 1小时的预处理显着降低了存活响应,无论是否在TNF-α处理后同时添加胰岛素或4小时(图8C.)。
      这些实验沿着PI 3-K依赖性/ AKT途径强烈地致癌后阶段信号传导,作为胰岛素在结肠上皮内胰岛素的关键前存活机制。彩易福彩肠道过度凋亡导致上皮渗透屏障的破坏(
      • Bojarski C.
      • Bendfeldt K.
      • gitter a.h.
      • Mankertz J.
      • FROMM M.
      • 瓦格纳斯。
      • Riecken E.O.
      • Schulzke J.D.
      彩易福彩凋亡和肠道屏障功能。
      )驱使脓毒状态的许多并发症(
      • Wattanasirichaigoon S.
      • Menconi M.J.
      • delude r.l.
      • Fink M.P.
      肠系膜缺血再灌注或出血冲击对大鼠肠粘膜渗透性和ATP含量的影响。
      )。我们的结果提供了局部分子解释为什么密集型胰岛素治疗,初始化粪池损伤后的时间施用,能够减少脓毒症诱导的胃肠上皮彩易福彩凋亡,并改善危重病患者的预后结果。
      我们强调了能够利用本文中描述的高通量多重激酶测定格式来强大地对信令网络中的多个节点的动态进行鲁布利地模拟,使得AKT作为用于调制单元响应的重要信号。其他胰岛素诱导的PI 3-K独立途径还必须衰减HT-29彩易福彩中的TNF诱导的凋亡表型,因为LY294002的PI 3-K / AKT的抑制并未完全消除胰岛素的救援响应(图8C.)。因此,i)可能存在我们的测量未捕获的额外响应确定途径,或ii)我们在JNK1,IKK和MK2路径中测量的微妙,时间相关的定量差异(图7C.)可以调节表型反应。我们目前正在调查这两种可能性。
      目前对彩易福彩内信号转导的知识是惊人的复杂性。为了识别影响单元功能的网络级属性,有必要在数学上模拟彩易福彩内信令蛋白的动态,多变量特征(
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      • 泰尔斯米
      从基因组学到蛋白质组学。
      )并找到广泛适用于涉及信号转导和人类疾病的生物学和临床问题。

      致谢

      我们感谢ISAAC Manke在出版物之前提供MK2TIDE序列,以及Roger Davis和Warner Greene提供各种质粒。

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