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大规模鉴定蛋白质精氨酸甲基化的方法*

  • 托马斯Uhlmann.
    脚注
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    T细胞信号传导实验室
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  • Vincent L. Geoghegan
    脚注
    隶属关系
    T细胞信号传导实验室
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  • 本杰明托马斯
    隶属关系
    俄罗斯威廉邓恩大学牛津大学病理学博物馆设施,南公园路,牛津大学,牛津,牛津,英国
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  • Gabriela Ridlova.
    隶属关系
    T细胞信号传导实验室

    俄罗斯威廉邓恩大学牛津大学病理学博物馆设施,南公园路,牛津大学,牛津,牛津,英国
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  • David C. Trudgian.
    脚注
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    俄罗斯威廉邓恩大学牛津大学病理学博物馆设施,南公园路,牛津大学,牛津,牛津,英国
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  • Oreste Acuuto.
    一致
    应该解决对应的通信:T Cell Signaling实验室,威廉·邓恩大学牛津大学病理学学院,牛津大学,牛津,牛津,奥克福德,英国。 Tel.:++44 1865 275615;传真:++ 44 1865 275515; Osteste.
    隶属关系
    T细胞信号传导实验室
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了Wellcome Trust Grant Gr076558ma至O.a的支持。 V.G.由BBSRC,T.U的博士学位支持博士学位支持。由瑞士国家科学基金会奖学金和罗氏研究基金会奖学金支持。
    本文包含补充图。 S1至S7和表S1至S5。
    ¶T.U.和五。对这项工作同样贡献。
    ‖当前地址:Dualsystems Biotech AG,Grabenstrasse 11a,8952 Schlieren,瑞士。
    **当前地址:达拉斯6001森林公园Rd,达拉斯,美国达拉斯6001森林公园Rd西南医疗中心的生物化学部门和蛋白质组学核心。
      精氨酸甲基化缺乏蛋白质组规模检测方法限制了我们对生理和病理过程中其相关性的知识。在这里,我们表明,含有甲基化精氨酸的大多数胰蛋白酶肽是高碱性和亲水的。因此,通过使用强阳离子交换色谱法,等电聚焦或亲水相互作用液相色谱法,可以通过简单的方案从总细胞提取物中得到大量富集的总细胞提取物,所以后者是最有效的。这些方法,通过细胞培养和质谱中的氨基酸与氨基酸的重甲基稳定同位素标记相结合,在T细胞中鉴定了131个蛋白中的249个精氨酸甲基化位点,包括190个新的位点和93蛋白未知是精氨酸甲基化的。通过相当延伸已知的精氨酸甲基化位点的数量,我们的数据揭示了一种新的富含脯氨酸丰富的共识基序,并鉴定了在免疫突触和内体贩运中参与细胞骨架重排的蛋白质中的第一次精氨酸甲基化。
      了解翻译后修改的类型,范围和动态(PTM)
      使用的缩写是:
      PTMS.
      翻译后修改
      meth-R.
      甲基化精氨酸
      ADMA.
      不对称Dimethyl族
      甘氨酸 - 精氨酸丰富
      SDMA.
      对称的dimethyl族
      MMA
      单体虫草珍珠
      蛋白质精氨酸甲基转移酶
      HILIC.
      亲水性相互作用液相色谱
      SCX.
      强阳离子交换
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      摇篮
      富含脯氨酸的精氨酸甲基化
      FDR.
      虚假发现率。
      1使用的缩写是: PTMS.
      翻译后修改
      meth-R.
      甲基化精氨酸
      ADMA.
      不对称Dimethyl族
      甘氨酸 - 精氨酸丰富
      SDMA.
      对称的dimethyl族
      MMA
      单体虫草珍珠
      蛋白质精氨酸甲基转移酶
      HILIC.
      亲水性相互作用液相色谱
      SCX.
      强阳离子交换
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      摇篮
      富含脯氨酸的精氨酸甲基化
      FDR.
      虚假发现率。
      揭示蛋白质相互作用的变化和细胞功能的调节。甲基化的精氨酸(甲基-R)在细胞蛋白中相对频繁( 例如 总精氨酸的0.7-1%(
      • Bulau P.
      • Zakrzewicz D.
      • Kitowska K.
      • Wardega B.
      • KREUDER J.
      • Eickelberg O.
      使用蛋白质水解和高性能液相色谱法在体外和体内掺入蛋白质掺入的氨基酸中的真精氨酸甲基化的定量评估。
      )这项工作)并具有非常缓慢的营业额(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      ),可能赋予蛋白质持续功能性质。通过降低氢键和局部亲水性(,常见于甘氨酸 - 精氨酸富含(GAR)序列并调节蛋白质 - 蛋白和蛋白质 - 核酸相互作用(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      )。精氨酸的甲基化可以削弱相互作用,但也可以增强称为束瘤的适配器与含甲基-R序列的结合(
      • 克兰德尔r.
      • Groves M.R.
      • 罪的I.
      • Sattler M.
      SMN Tudor结构域的高分辨率X射线和NMR结构:对称二甲基化精氨酸残基的结合位点的构象变化。
      ,
      • 杨Y.
      • 卢y.
      • Espejo A.
      • 吴j.
      • 徐W.
      • 梁S.
      • Bedford M.T.
      TDRD3是精氨酸 - 甲基化组蛋白标记的效应分子。
      )。
      meth-R. 以三种形式发生:不对称二甲基碱(ADMA),携带两种甲基的胍基团的氮气;对称的二甲基尿苷(SDMA),其中氮在其中单独甲基化且单甲基喹(MMA),反应中间体。在人类中,这些反应被一家蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)催化,PRMT1,3,4,6和8形成ADMA和PRMT5和7产生SDMA。在小鼠中,PRMT1和PRMT4缺乏导致胚胎(
      • yu z.
      • 陈T.
      • HébertJ.
      • 说谎。
      • 理查德S.
      小鼠PRMT1 NULL等位基因限定了基因组维持和细胞增殖中的精氨酸甲基化的基本作用。
      )或围产期(
      • kim J.
      • 李杰。
      • Yadav N.
      • 吴Q.
      • 卡特C.
      • 理查德S.
      • Richie E.
      • Bedford M.T.
      损失的CARM1导致胸腺细胞循环型磷蛋白的低甲基化和Dereculated早期T细胞发育。
      )致命性,而缺乏PRMT3导致生长缺陷(
      • Swiercz R.
      • 人M.D.
      • Bedford M.T.
      核糖体蛋白S2是哺乳动物PRMT3(蛋白质精氨酸甲基转移酶3)的基材。
      )。已经研究了精氨酸甲基化以在多水平和DNA修复中调节基因表达的作用(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      )。 PRMT1,4,5,6和7通过甲基化组蛋白N-末端尾部(H1,H2A,3和4)控制外观遗传码(
      • 杨Y.
      • 卢y.
      • Espejo A.
      • 吴j.
      • 徐W.
      • 梁S.
      • Bedford M.T.
      TDRD3是精氨酸 - 甲基化组蛋白标记的效应分子。
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      • ancelin k。
      • Lange U.C.
      • Hajkova P.
      • Schneider R.
      • 班闲信徒A.J.
      • KouzaridesT.
      • Surani M.A.
      Blimp1与PRMT5相关联,并在小鼠胚芽细胞中引导组蛋白精氨酸甲基化。
      ,
      • Guccione E.
      • 巴西C.
      • Casadio F.
      • 马丁岛F.
      • Cesaroni M.
      • Schuchlautz H.
      • LüscherB.
      • Amati B.
      通过MLL复合物通过PRMT6和H3K4对组蛋白H3R2的甲基化是互斥的。
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      • Iberg A.N.
      • Espejo A.
      • 诚变。
      • 金D.
      • michaud-levesque J.
      • 理查德S.
      • Bedford M.T.
      组蛋白H3尾部的精氨酸甲基化阻抗效应器结合。
      ,
      • 鸡蛋蛋白
      • 斯图勒J.C.
      • sh
      睾丸特异性因子CTCFL与蛋白质甲基转移酶PRMT7在H19印记控制区域甲基化中配合。
      ,
      • 赵Q.
      • 排名G.
      • tany.t.
      • 李H.
      • 莫里茨R.L.
      • SIMPSON R.J.
      • Cerruti L.
      • 柯蒂斯D.J.
      • patel d.j.
      • Allis C.D.
      • Cunningham J.M.
      • 简三。
      PRMT5介导的组蛋白H4R3甲基化募集基因沉默中的DNMT3A,偶联组蛋白和DNA甲基化。
      )并调整转录因子的活动(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      ,
      • 赵X.
      • jankovic v.
      • 螺射A.
      • 黄阁
      • Pardanani A.
      • 梅伦德斯S.
      • 张继夫
      • 邓恩·雷恩
      • 小A.
      • Erdjument-Bromage H.
      • Allis C.D.
      • Tempst P.
      • 尼默尔斯。
      PRMT1 runx1的甲基化废除SIN3A结合并增强其转录活性。
      ,
      • jansson m.
      • 杜兰特S.T.
      • CHO eC.
      • 切汉S.
      • 伊德曼米
      • Kessler B.
      • la rangue n.b.
      精氨酸甲基化调节p53的反应。
      ,
      • 科维奇
      • 哈萨P.O.
      • Saccani S.
      • Buerki C.
      • 梅尔N.I.
      • Lombardi C.
      • imhof r.
      • Bedford M.T.
      • Natoli G.
      • Hottiger M.O.
      精氨酸甲基转移酶CARM1是NF-Kappab依赖性基因表达的特异性调节剂。
      ),共同派生者(
      • 陈德。
      • 马蹄
      • 洪H.
      • Koh S.S.
      • 黄三。
      • Schurter B.T.
      • aswad d.w.
      • stallcup m.r.
      蛋白质甲基转移酶转录调节。
      ,
      • Fathman J.W.
      • 麦克风M.F.
      • Hemmers S.
      • Bonham K.
      • 朋友D.S.
      • 格鲁比M.J.
      • 粘合剂L.H.
      • Mowen K.A.
      nip45控制2 T型辅助电池响应的幅度。
      )和核心投票机(
      • ancelin k。
      • Lange U.C.
      • Hajkova P.
      • Schneider R.
      • 班闲信徒A.J.
      • KouzaridesT.
      • Surani M.A.
      Blimp1与PRMT5相关联,并在小鼠胚芽细胞中引导组蛋白精氨酸甲基化。
      ,
      • 鸡蛋蛋白
      • 斯图勒J.C.
      • sh
      睾丸特异性因子CTCFL与蛋白质甲基转移酶PRMT7在H19印记控制区域甲基化中配合。
      )。涉及mRNA剪接的因素(
      • 刘Q.
      • 德雷福斯G.
      体内和体外精氨酸的RNA结合蛋白的甲基化。
      ,
      • ohkura n。
      • Takahashi M.
      • yaguchi h.
      • Nagamura Y.
      • Tsukada T.
      CaCtivator相关的精氨酸甲基转移酶1,CARM1以同种型特异性方式影响MRNA剪接。
      ),伸长(
      • Kwak Y.T.
      • 郭杰。
      • Prajapati S.
      • 公园K.J.
      • 泗水下午
      • 米勒B.
      • Gehrig P.
      • Gaynor R.B.
      SPT5的甲基化调节其与RNA聚合酶II和转录伸长性能的相互作用。
      ),运输和翻译(
      • ohkura n。
      • Takahashi M.
      • yaguchi h.
      • Nagamura Y.
      • Tsukada T.
      CaCtivator相关的精氨酸甲基转移酶1,CARM1以同种型特异性方式影响MRNA剪接。
      ,
      • 诚变。
      • 海尔斯J.
      • 沙班班S.
      • Bedford M.T.
      精氨酸甲基转移酶CARM1调节转录和mRNA加工的偶联。
      )通常含有Meth-R,可疑涉及蛋白质RNA相互作用(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      )。此外,T细胞CD28共刺激(
      • 布兰特F.
      • Cardona A.
      • leimier f.a.
      • Hershfield M.S.
      • Acuto O.
      光盘 28共刺激信号在T细胞中诱导蛋白质精氨酸甲基化。
      ),tnfα(
      • 科维奇
      • 哈萨P.O.
      • Saccani S.
      • Buerki C.
      • 梅尔N.I.
      • Lombardi C.
      • imhof r.
      • Bedford M.T.
      • Natoli G.
      • Hottiger M.O.
      精氨酸甲基转移酶CARM1是NF-Kappab依赖性基因表达的特异性调节剂。
      ),TLR4(
      • 科维奇
      • 哈萨P.O.
      • Saccani S.
      • Buerki C.
      • 梅尔N.I.
      • Lombardi C.
      • imhof r.
      • Bedford M.T.
      • Natoli G.
      • Hottiger M.O.
      精氨酸甲基转移酶CARM1是NF-Kappab依赖性基因表达的特异性调节剂。
      ),NGF(
      • CIMATO T.R.
      • 唐杰。
      • 徐Y.
      • Guarnaccia C.
      • Herschman H.R.
      • Pongor S.
      • 阿丽塔准噶。
      神经生长因子介导的蛋白质甲基化的增加主要在I型精氨酸甲基化位点发生并且涉及蛋白质精氨酸甲基转移酶1。
      )和nfkb(
      • 科维奇
      • 哈萨P.O.
      • Saccani S.
      • Buerki C.
      • 梅尔N.I.
      • Lombardi C.
      • imhof r.
      • Bedford M.T.
      • Natoli G.
      • Hottiger M.O.
      精氨酸甲基转移酶CARM1是NF-Kappab依赖性基因表达的特异性调节剂。
      )信号传导途径可以由PRMTS调节。蛋白质精氨酸甲基化与致病方法牵连,包括肿瘤发生(
      • 张力
      • Chan L.C.
      • 汤普森A.
      • 清除M.L.
      • 所以C.W.
      蛋白质精氨酸 - 甲基转移酶依赖性肿瘤发生。
      ), 心血管疾病 (
      • 王Z.
      • 唐W.H.
      • CHO L.
      • Brennan d.m.
      • Hazen S.L.
      针对精氨酸甲基化和心血管风险的有针对性的代谢组合评估:潜在机制超出了一氧化氮合酶抑制作用。
      ),自身免疫和病毒感染(
      • Bedford M.T.
      • 理查德S.
      精氨酸甲基化蛋白质功能的新出现调节剂。
      ),提高异常甲基化蛋白质可以是疾病标志物和PRMTS潜在治疗靶标的可能性(
      • COPELAND R.A.
      • 所罗门M.E.
      • Richon V.M.
      蛋白质甲基转移酶作为药物发现的目标类。
      )。
      仅迄今为止肯定地确定了非常有限数量的精氨酸甲基化蛋白和位点(见UNIPROTKB)。 体外 开发出优雅的放映,用于寻找PRMT基板(
      • 诚变。
      • 海尔斯J.
      • 沙班班S.
      • Bedford M.T.
      精氨酸甲基转移酶CARM1调节转录和mRNA加工的偶联。
      )但鉴定有关的Meth-R通常是麻烦的。 Meth-R网站的存在是在许多情况下仅被蛋白质相似性(例如GAR主题的存在),其是一些但不是全部突出的基板(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      )。这些烦恼的局限性妨碍了生物学中非常有前途的领域的进展。以前的工作开发了一种强大的方法,使用重甲基-Silac耦合到MS,以鉴定含有Meth-R的高确定性肽(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )。使用抗ADMA抗体来富含含甲基丙烯蛋白,但仅鉴定有限数量的甲基r(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )。因此,对其富集的含量含甲蛋白和肽的相对低丰度以及缺乏足够的方法仍然是Meth-R网站的大小和小型发现的主要障碍,留下重质甲基 - 氧化铝方法,基本上是未批准的。在这里,我们发现了含甲基-R的胰蛋白肽的不同的物理化学性质,并显示亲水性相互作用液相色谱(HILIC)是提供优异的含甲肽肽的简单方法。当通过基于细胞培养(Silac)的氨基酸(Silac)MS中的重甲基稳定同位素标记时,HILIC允许我们鉴定数百种甲基r位点,为“甲基族”的“甲基族”的方式提供大大优于卓越的方法使用抗ADMA抗体。

      实验步骤

       MS分析的Silac标记和细胞裂解

      定制的RPMI 1640缺乏 l - 甲硫是, l-Arginine和 l-Lysine(Invitrogen,Carlsbad,CA)补充有10%透析的胎牛血清(Invitrogen), l-Arginine和 l-LYSINE和A) l - 甲基硫氨酸(CK煤气产品有限公司),或B) l - 甲基硫氨酸 - 甲基 - 13C-甲基-D3 (Sigma, ISOTEC TM值 )最终浓度为0.1米 M L. -methionine,0.29米 M L. -Arginine和0.219米 M L. -Lysine和过滤灭菌(0.22μm孔径,Millipore,Billerica,MA)。 Jurkat细胞在37℃下在潮湿的5%CO中生长2 - 在标签介质中达到5-7个细胞倍增的气氛。根据制造商的协议,使用染额分离试剂盒(Invitrogen)的阴性选择,从健康供体的全血中分离出人的原发性CD4 +淋巴细胞。 1×106 to 2 × 106 然后通过在10μg/ ml的抗CD3和可溶性CD28.2(Biolegend,San Diego,Ca)下以1μg/ ml可溶的CD4 +淋巴细胞刺激10ml光或重度培养基中的CD4 +淋巴细胞。将IL-2(ABDSerotec)加入到50ng / ml的浓度。将细胞在37℃下在潮湿的5%CO中生长2 - 达到气氛7-9天。在冰冷裂解缓冲液中收获细胞并裂解A)10分钟(20米m Tris pH 7.5, 150 mm NaCl, 0.1 mm EDTA,1%Nonidet P-40,0.5%脱氧酸盐,蛋白酶抑制剂混合物(Roche),或B)8分钟内20分钟 m Urea in 25 mm TRIS pH 8.通过以14,000×离心清除裂解物 g 20分钟并在1:1的蛋白质含量的比例中混合(通过Bradford方法测量和280nm处的吸光度)。裂解物用于A)免疫沉淀,或B)强阳离子交换(SCX)色谱,HILIC和EFFGEL等电聚焦。

       免疫沉淀和凝胶消化

      在与抗DMA MAB 7E6(ABCAM,Cambridge,UK)预孵育的Sepharose蛋白G珠粒(GE Healthcare)上,在4℃下对混合细胞裂解物进行免疫沉淀过夜。用新鲜的冰冷裂解缓冲液洗涤珠子四次,用100米洗脱m 三乙胺pH 11.5在室温下10分钟。 eluates被中和 1/20 体积为1 m 磷酸盐缓冲液pH 6.8,在还原SDS NUPAGE样品缓冲液(Invitrogen)中煮沸,用55米烷基化m 碘酰胺(Sigma)并在4-12%梯度BIS-TRIS NUPAGE凝胶(Invitrogen)上分离。用蒸馏水洗涤凝胶,用胶体蓝(Invitrogen)轻微染色。将凝胶通道分成15个切片并受到GELCMS / MS的影响。

        SCX. ,HILIC和EFFGEL分级

      清除尿素裂解物是丙酮沉淀并重新悬浮于1.6 m Urea in 25 mm TRIS PH8。用12.5ng /μl胰蛋白酶(蛋白质组学等级,σ)或胰凝乳蛋白酶(测序等级,Promega,Madison,Wi)进行过夜消化。对于SCX,用0.1%三氟乙酸(Sigma)酸化4-6mg肽,并通过以20,000×离心清除清除 g 10分钟。使用缓冲液A(50米,将肽施加至1ml SCX柱(资源S,GE Healthcare)(50米m KH24 20%乙腈,pH2.7)。用增加的缓冲液B洗脱结合的肽(50米m KH24, 20%乙腈,1 m KCL,PH2.7)。在第一分离区域中,梯度升高至7%缓冲液B,以洗脱1+和大部分2+带电肽。浅梯度至35%缓冲液B分离3+和更高的带电肽的剩余2+。在最后阶段,缓冲剂B改变为pH7,并且陡峭的梯度至100%缓冲液B确保完全洗脱结合肽。在C18脱盐之后(eMPORE十八C18,Sigma),通过LC-MS / MS分析级分。
      对于HILIC 1mg肽用0.1%三氟乙酸(TFA)酸化,并通过以20,000g离心10分钟清除。将肽加载到反相C2 / C18柱(GE HealthCare)上,用缓冲液(0.1%甲酸,pH2.7)。用陡峭的梯度洗脱肽至100%缓冲液B(0.1%甲酸,95%乙腈,pH2.7)进行。然后在真空下干燥脱盐肽,再悬浮在缓冲液B中并施加到HILIC柱(MERCK)上。用高达80%的缓冲液梯度洗脱结合的肽。
      对于Effgel的IEF,根据制造商的说明,将1mg肽装入IPG缓冲区(PH7-11,GE Healthcare)上的IPG条带(PH7-11,GE Healthcare)上。用Agilent 3100 Elecgel分馏器(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)的溶液中的溶液聚焦为20kVH,最大电压为8000 V.用C18除去聚焦肽,并用C18(eMPORE十八C18,Sigma)除去。还通过将纸芯浸入0.1%TFA的阴极端浸入1-2小时,然后简要超声处理来提取肽。收集来自各个级分的肽并将其调节至0.1%TFA,5%乙腈,并施加到自制C18级尖端以进行脱盐。用0.1%TFA,2%乙腈洗涤结合的肽并在0.1%TFA,60%乙腈中洗脱。将洗脱的肽干燥并送到剑桥的PNAC设施(http://www.bioc.cam.ac.uk/pnac/aaa.hml用于生物色调30分析仪的氨基酸分析。

       质谱数据采集

      在直接喷射模式下在直接喷射模式下进行分析样品,以直接喷射模式运行,耦合到LTQ XL轨道质谱仪或Q辐射质谱仪(Thermo Electron,Hemel Hempstead,UK)。将样品在15厘米的内径上分解在175μm内直径的Picotip分析柱(新物镜,Woburn,MA)上,其用Reprosil-pur C18-AQ相包装,3μm珠(Maisch博士,德国)。使用120分钟的梯度来分离肽,并且通常喷射每个样品三次并合并数据以增加样品覆盖率。 LTQ XL Orbitrap质谱仪在“前5”数据相关的采集模式下操作,并且在“前10”数据相关采集模式下操作Q辐射质谱仪。前体扫描以60,000的分辨率进行,选择5个前体离子(LTQ XL orbitrap)或10个前体离子(Q辐射)和碎片。充电状态+1离子被拒绝。

       质谱数据分析

      使用Proteowizard MSCONVERT 3.0.3535(Q助行数据),使用READW版本4.4.1(LTQ XL Orbitrap数据)或MGF格式转换为MZXML格式的MS / MS峰值列表。两种工具都与默认参数一起使用,但ZLIB压缩频谱数据已启用。数据上传到中央蛋白质组学设施管道(CPFP: //cpfp-master.molbiol.ox.ac.uk/cpfp_demo/auth/login )(
      • 特鲁德D.C.
      • 托马斯B.
      • 麦克湾S.J.
      • 凯斯勒光明
      • Salek M.
      • Acuto O.
      CPFP:中央蛋白质组学设施管道。
      )。使用吉祥物版本2.3.01(Matrix Science),X!串联版本2008.12.01.1(
      • 克雷格r.
      • Beavis R.C.
      串联:匹配具有串联质谱的蛋白质。
      )和omssa版本2.1.8(
      • geer l.y.
      • 马克S.P.
      • Kowalak J.A.
      • 瓦格纳L.
      • 徐M.
      • Maynard D.M.
      • 杨X.
      • 施W.
      • 布莱恩特S.H.
      开放质谱搜索算法。
      )针对IPI人序列数据库(EBI)的倾斜目标和逆转诱饵版,版本3.78和3.79分别含有86,702和86,635个靶蛋白序列。将酶设定为胰蛋白酶(或胰凝乳蛋白酶,用于一些实验),允许最多3个错过的切割。氨基甲酰甲基半胱氨酸被设定为固定改性。为了分析精氨酸甲基化氧化甲硫氨酸,重氧化甲硫氨酸,单甲基喹啉,重型单甲基喹,二甲基喹和重度二甲基尿苷被设定为可变改性。为了分析赖氨酸甲基化,氧化甲硫氨酸,重氧化甲硫氨酸,单甲基甘氨酸,重单甲基氰基,二甲基甘氨酸,重甲基氰基,三甲基氰基和重亚甲基氰基,重甲酰基甘氨酸和重甲基乙基含量为可变修饰。 MS和MS / MS峰鉴定的质量公差分别为10ppm和0.5Da(LTQ XL orbitrap)或20ppm和0.1Da(q辐射)。质谱数据可供选择 http://www.peptideatlas.org/PASS/PASS00081。在中央蛋白质组学设施管道(CPFP)中以1%FDR搜索所需鉴定的鉴定,并在通过光/重甲基引入的质量差异分离的相等强度的前体光谱中的确认肽( s)。使用重甲基氧化物标准的实际假鉴定率(1.2%, 补充图S5通过分析对精氨酸甲基化的所有假阳性次数来计算用于确认重甲基硅胶对的情况下的所有假阳性次数计算。然后将该数量加倍并除以精氨酸甲基化的总数。对甲基血清对的要求进行证实的要求增加了置信度,使得能够考虑甚至考虑低分肽(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )。使用ModLS算法执行修改定位评分(未发布
      David C. Trudgian.,Rachelle Singleton,Matthew E. Cockman,Peter J. Ratcliffe和Benedikt M. Kessler,Modls:翻译后修改本地化评分与自动特异性扩展2012(已提交)。
      )扩展了PTMSCORE方法以结合自动特异性扩展。对于为数据库选择的每个可变修改搜索UNIMOD数据库中定义的所有氨基酸特异性(www.unimod.org.)在本地化期间被考虑。这允许正确的本地化 例如 赖氨酸的二甲基化,即使仅选择精氨酸甲基化用于搜索。模糊修改本地化是如此注释 补充表S5。在CPFP中,使用蛋白质分子(肽)进行肽序列的蛋白质鉴定的推理(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )。默认参数用于蛋白质分组和同种型标识的分配。前兆 m/z列出,收费,对甲基化肽的所有甲基化肽的概率概率列于 补充表S4.

      结果

       富含含有肽的肽的理由和方法

      生物合成标记用甲硫氨酸(M0)和[13 光盘 3] - 甲基硫氨酸(M4)(重甲基硅胶)(Fig. 1A)能够通过LC-MS / MS检测蛋白质甲基化位点,具有高置信度(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )。在这项研究中,通过重甲基 - 硅胶标记Jurkat T细胞,并通过显示抗原受体刺激的T细胞的有效氧化硅酸盐标记来延伸到原发性细胞的方法(补充图S1,S2)。在先前的研究中,通过用单克隆抗体(MAb)7E6至MMA和ADMA的Hela细胞中富集含甲基蛋白的蛋白质,导致鉴定59个甲基-R位点(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )。通过类似的方法(参见方法),我们鉴定了Jurkat T细胞中的41个Met-R网站,其中只有6个是新的( 例如 未在Uniprotkb数据库中注释)(补充表S1)。然而,细胞蛋白质蛋白质应包括较高数量的含甲基丙氨酸,因为从细胞系或组织中提取的蛋白质中的0.7-1.0%的精氨酸是甲基化的(
      • Bulau P.
      • Zakrzewicz D.
      • Kitowska K.
      • Wardega B.
      • KREUDER J.
      • Eickelberg O.
      使用蛋白质水解和高性能液相色谱法在体外和体内掺入蛋白质掺入的氨基酸中的真精氨酸甲基化的定量评估。
      )(以及我们未发表的数据)。而且,类似于先前的调查(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      ),我们几乎在RG网站上识别Meth-R网站(补充表S1),再次指向7e6 mAb用于蛋白质组学规模研究的有限有用性。这些限制和少量的meth-r站点(137),已知日期( 例如 在UniProtkb)中,刺激我们开发有效的无偏见方法,以富含含甲基-R含甲酸的肽,用于使用LC-MS / MS分析进行大规模鉴定甲基-R位点(Fig. 1A )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1A,我们工作流程的示意图。用光或重甲硫氨酸标记细胞,裂解并组合在1:1蛋白比中。 用胰蛋白酶消化蛋白质,或在一些实验中消化胰蛋白酶。精氨酸甲基化肽(描绘为 红线)通过使用SCX,IEF(在整形装置中)或HILIC并通过质谱分析。用于调用精氨酸的MS光谱甲基化肽被手动验证甲基 - 氧化硅对的存在。示出了示例甲基硅酸对。对于每种分离方法,指出了所识别的甲基-R位点的总数,以及新颖的网站; B,含甲基-R的胰蛋白肽具有不同的物理化学性质。该表指示用指定的富集方法鉴定的等电点(PI)和等电点(PI)和肉汁评分的最大,最小和中值值。示出了用于计算值的每个方法的独特肽(n)的数量。 C,33000个非甲基化胰蛋白肽的3D散点图(灰色圈子)从PH3-11 IPG条带和128个精氨酸甲基化胰蛋白肽鉴定(黄色圆圈)从防DMA-IP,HILIC,SCX和IEF中识别。显示了相同图的三个不同视图。根据pH 2.7的PI,肉汁评分和电荷状态绘制肽,代表富集方法利用的不同选择标准。 黄色的 代表一个低pi和 红色的 a high pI.

        SCX. 色谱法

      蛋白质谱中的大约70%的胰蛋白酶肽在pH 2.7处表现出+2净电荷,并且可以根据使用SCX色谱法根据单电荷差异与其他肽分离(
      • Beausoleil S.A.
      • jedrychowski m.
      • 施瓦茨D.
      • eliasj.e.
      • VillénJ.
      • 李杰。
      • COHN M.A.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。因为胰蛋白酶在meth-r处切割不良,所以错过的裂解在pH 2.7时产生充电≥+ 3的肽。因此,在SCX色谱法术后,大多数甲基肽应存在于≥3含肽的级分中。 SCX分数富集的胰蛋白酶肽<来自Jurkat细胞总蛋白的+3,表现出~1.0%的甲基-R(如氨基酸分析所揭示,见方法和 补充图S3A)但是通过LC-MS / MS可以识别出甲基-R肽(数据未显示)。相比,在≥+ 3的胰蛋白胨肽的Scx分数中,〜4.0%的精氨酸作为meth-r( 补充图S3A)允许我们在四个独立实验中鉴定来自Jurkat和初级人T细胞的39个Meth-R站点(Fig. 1A补充表S1)其中25个是新的,有趣的是,4不是在RG主题(补充表S1)。 SCX分馏使我们能够发现10个新的蛋白质和在序列内的蛋白质和Meth-R,而序列很少由7E6 mAb选择(补充表S1)。另外,如在甲基-K的差的胰蛋白酶切割所预测的那样,也发现了已知的甲基肽(组蛋白H4, 补充表S1 )。

        IEF

      含组氨酸的胰蛋白酶肽(pH 2.7时的电荷≥+ 3)是SCX分数内的主要污染物(60-70%),其中检测到大多数甲基肽(未示出)。这可能导致分析物复杂性,限制了所鉴定的甲基肽的数量。然而,这些数据引起了我们的注意力蛋白化肽的主要物理化学性质。易于甲基化的精氨酸可能完全暴露于溶剂中,因此大多数均嵌入含有亲水和/或中性氨基酸残基的序列内。此外,我们注意到甲基-R位点(来自Uniprotkb的序列和由7e6 Ab和Scx富集的那些)不经常含有带负电荷的氨基酸。这表明携带一种或多种甲基-r的胰蛋白胨肽应该经常显示基本的等电点(PIS)。这确实是7E6 MAB和SCX富集发现的met-R肽的情况( Fig. 1B)有一个中位数pi>11.00。为了通过等电聚焦在IPG条上,对大型甲基 - 硅酸标记的Jurkat或原发性CD4 +淋巴细胞进行分级的胰蛋白酶消化的胰蛋白酶体消化的预测Fig. 1A,见方法)。四个独立实验的结果一直表明>90%的甲基肽显示出PI≥9,中值PI为11(图。 1B1C),表明Meth-R胰蛋白肽在很大程度上是高度基本的。有趣的是,在IEF梯度的基本末端,(pH 9-11和电极垫本身)的富集对于甲基-R肽的富集是显着的,达到≥5%含有甲基-r的肽的值,如LC-透露的MS / MS分析(未显示)。然而,缺乏具有合适pH范围的IPG条带释放出良好的大部分高碱性肽的恢复。使用IEF我们能够检测66个Meth-R站点,其中34个是新的(Fig. 1A补充表S1)发现20没有包含RG主题的20(补充表S1)。 IEF分馏允许鉴定预先未知的19个蛋白质以含有甲基-R和3个甲基-K位点。

        HILIC.

      HILIC. 最近被证明是补充反相分馏的优秀方法(
      • 剑W.
      • EDOM R.W.
      • 徐Y.
      • 翁恩。
      亲水性相互作用色谱法定量生物分析的最新进展。
      )通过富集高亲水性肽(
      • McNulty D.E.
      • 安南R.S.
      亲水性相互作用色谱法降低了磷蛋白酶组的复杂性,提高了全局磷酸肽分离和检测。
      )。由于7E6mab,SCX或IEF富集后鉴定了绝大多数含甲酸的胰蛋白胨,因此高亲水性,肉汁评分(
      • Kyte J.
      • doolittle r.f.
      显示蛋白质水蛭特性的简单方法。
      )-1.05(Fig. 1B),我们推理HILIC分馏还应为含甲酸的肽选择选择。将胰蛋白酶消化甲基 - 硅酸甲基jurkat或初级Cd4 +淋巴细胞在90%乙腈中加载到HILIC柱上。随着水性缓冲液的浓度的增加洗脱结合的肽(补充图。S3B)并进行氨基酸和LC-MS / MS分析。含有高亲水性肽的级分(参见 补充图。S3B与具有较少亲水性肽的级分相比,富含〜10倍的甲基-1,其中可以检测到没有含甲酸的肽(未示出)。 HILIC分离后鉴定的METH-R肽具有-0.84的中位数肉汁分数(Fig. 1B),一种类似于抗DMA,SCX和IEF的Meth-R肽的值。在五个独立的实验中,LC-MS / MS分析十二个最亲水性HILIC级分导致鉴定215个Meth-R网站(Fig. 1A补充表S1)。值得注意的是,HILIC也能够在胰蛋白酶消化后未发现的37种Meth-R网站的胰凝乳蛋白酶消化肽中的检测(补充表S1)。单独的HILIC单独鉴定了比7e6mAb,SCX和IEF更高的3至5倍,并覆盖了由其他三种方法识别的101个独特网站的约70%(补充表S1 )。 Fig. 2A 图为与SCX,7E6和IEF相比,HILIC方法的功率与SCX,7E6和IEF相比单独地发现Meth-R站点。重要的是,用HILIC发现的171(〜80%)的甲基-R位点是新的(Fig. 1A表S1),四种不同方法中的最高发现率。 87(〜50%)这些新网站是非RG主题。用肝脏比三种其他方法更常见的单甲基化-RS。单独的HILIC允许我们将215个Meth-R站点分配给115个蛋白,其中94个,其中94例以前未知为PRMTS的基材。总共,由7E6 MAB,SCX,IEF和HILIC识别的249个(77%)的249个独特的Meth-R站点是新的(Fig. 2B补充表S1)。独特的部位被分配到131种不同的蛋白质,93(72%),其先前未知在精氨酸上甲基化(Fig. 2C, 补充表S1Fig. 5)。我们的研究将人群蛋白质组中的Met-R网站和Meth-R蛋白总数带到327和149(Fig. 2C)分别在一项研究中,基本上扩大,在一项研究中,我们对PRMTS进行了对细胞功能调节的洞察。 HILIC独自或组合用于检测已知和新的METH-R位点的三种其他富集方法中的每一种。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2A,单独和组合的HILIC,IEF和SCX识别的METH-R网站的VENN图( 剩下 )在HILIC或7E6 MAB中或通过两种方法发现( 正确的 )在Jurkat细胞和原发性人CD4 +淋巴细胞组合。 B,Venn图显示在本研究中仅发现的Meth-R网站的数量,在Uniprotkb数据库中注释的Meth-R站点和共同之处。 C,本研究中鉴定的精氨酸甲基化蛋白数量的Venn图,先前在Uniprotkb数据库中报告的那些和共同的那些。相对于站点数量大致缩放圆圈。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5概述含有甲基化精氨酸/赖氨酸的蛋白质。 蛋白质根据Uniprotkb数据库中的注释功能进行分组。在该研究中新鉴定为PRMT基质的蛋白质 深蓝。以前已知的PRMT基板被着色 灰色的 。单个精氨酸甲基化位点标记为 小点 , 蓝色的 代表新型Meth-R网站和 灰色的 代表先前已知的Meth-R网站。绿色表示赖氨酸甲基化的蛋白质。

        meth-R. 网站和Meth-R蛋白的生物信息分析

      重型甲基 - 硅胶验证(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )大大增加了对含有含有肽的甲脲(和甲基)的识别的置信度。不包括重型甲基 - 氧化铝验证,将含有含量肽的置信度降低至67%FDR(尽管为改性和未修饰的肽的整体数据集而言,FDR为1%)。然而,包含需要相应的光/重甲基 - 氧化铝伴侣的推定的甲基-R肽提高了鉴定甲基-R位点至〜1%FDR的置信度(补充图S5)。因此,我们对我们研究中确定的Meth-R站点感到非常有信心,这些网站都通过检查单个灯/厚对手动验证。这一事实进一步支持了我们的调查发现43%已知的Meth-R网站。
      在我们研究中发现的190个新的Meth-R站点中,在RG网站发生了57%,有时在GAR主题内(Fig. 3A补充表S1),被认为是PRMT1的基材(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      )。剩下的43%被发现在非RG基序。这是在迄今已知的137个位点内的25%的含量含量的非RG序列频率的相当大增加(补充图S6)。在此处发现的〜50%的非RG位点,脯氨酸在r之前和/或之后发生Fig. 3A)。这种特征也是可观察到的,但在先前鉴定的非含甲基化位点(未示出)中,虽然较少常见(32%)。检查一组非RG位点进行特定位置侧翼均甲基-R(参见方法)的脯氨酸(参见方法),显示脯氨酸在定位 - 1(R为0)和+4,含有脯氨酸的序列在这些位置中的任何一种或两个(x(p)rxxx(p))中占我们发现所有甲基化位点的33%( Fig. 3B)。我们临时将这种新的Meth-R共态部位的子集指定为富含脯氨酸的精氨酸甲基化(PRAM)基序。虽然甘氨酸和脯氨酸经常遵循Meth-R,但我们发现了许多网站,其中甲基-R亮氨酸和丙氨酸(Fig 3C)。显然,随着未来蛋白质组学研究中的越来越多的Meth-R站点,应该可以改进共识的网站集群并帮助分配PRMT特异性。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3A,序列标志(41)本研究中鉴定的所有精氨酸甲基化位点的表示。 甲基化的精氨酸,57%后面是甘氨酸,并且通常被富含甘氨酸富含序列侧翼。其余43%的网站揭示了先前未报告的富含脯氨酸的精氨酸甲基化(PRAM)基序。 B,相对于甲基化精氨酸的每个位置的脯氨酸频率。虚线表明脯氨酸的频率水平,偶可能发生概率0.05或0.01。 p 显示了-1和+4位的脯氨酸频率的值。 p 通过自动启动计算值。 C,在Meth-R网站发现的大多数常见图案。请注意,图案可以由列出的主题组合组成。
      新发现的meth-r蛋白似乎存在于细胞质和/或核中,没有偏好于任何一个隔间 Fig. 4A)。如前所述(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      ),已知高比例的甲基蛋白结合核酸并参与调节染色质结构,转录,RNA加工和翻译。我们的研究大大增加了PRMTS调节的这种蛋白质的数量,包括染色体结构中的五种,参照转录过程和21例RNA加工(见 图。 4.B5,蓝色圆圈)。最有趣的是,我们还发现涉及以前据报道的其他细胞功能的蛋白质被普及的调节。其中(见 Fig. 5)是两种核孔组分(RANBP2和TPR)和6个蛋白质(DNM2,麦克铁,SEC24C,GGA3,SNX3和CLINT1(参见,UNIPROTKB)涉及内体贩运和三种,WASP / WIP综合体(
      • 张继夫
      • 董B.
      • Siminovitch K.A.
      Wiskott-Aldrich综合征家族细胞骨骼调节剂对免疫调节的贡献。
      )和dnm2(
      • 戈麦斯T.S.
      • 哈曼M.J.
      • 麦卡齐S.
      • 萨沃伊D.N.
      • 润滑下午
      • 蜂巢师M.P.
      • Labno C.M.
      • McKean D.J.
      • mcniven m.a.
      • Burkhardt J.k.
      • Billadeau D.D.
      发动机2通过控制免疫突触的肌动蛋白聚合来调节T细胞活化。
      ),参与actin细胞骨骼重新安排在免疫突触(是)。在未知功能的蛋白质中发现了相当数量的Meth-R网站(Fig. 5 )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4精氨酸甲基化蛋白的分解根据细胞室中的分布(A)或通过分子功能(B)根据基因本体(GO)注释。
      虽然SCX和HILIC原则上富含Meth-K蛋白,但我们发现只发现了10个赖氨酸甲基化位点(补充表S1Fig. 5)。或许甲基-K比蛋白质中的甲基-K更频繁地发生,并且/或含甲基和甲基-R含甲酸的肽存在不同的物理化学性质,因此两者都不会通过这里使用的方法来富集。然而,我们发现以前未知的三种蛋白质是甲基-K,包括两个热休克蛋白,HSPA5和HspA8。
      总的来说,这里探索的方法,随着HILIC最有效的,使我们能够大大富集除规范RG / GAR主题之外的甲基-R肽,并揭示大量新蛋白质和可能受到调节的功能司机。

      讨论

      迄今为止,存在富集蛋白质和/或含有Meth-R的富集富集的有效和非偏见的方法。在ADMA和MMA指导的MAB(7E6)允许鉴定仅少数Meth-R站点(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      )(和这项工作)几乎完全在RG网站。因为抗体不太可能有效地区分(并且具有高亲和力)甲基-R和未改性R之间的微妙化学差异,因此使用PAN Meth-R抗体可能不合适。通过使用重甲基 - 氧化铝方法,最近解决了识别基于MS的甲基-R的主要障碍,即被错误地误认为是对其他等异质化学修饰进行了解决(
      • ong s.e.
      • Mittler G.
      用重甲基硅胶鉴定和定量体内甲基化位点。
      ),提高准确对蛋白质精氨酸甲基化的大规模研究的可能性。尽管如此,对于有效富集的含甲基肽的富含甲基甲基化的富含甲基肽的富集,缺少简单且鲁棒的方法。本调查的探索阶段揭示了这一点>90%的含甲酸的胰蛋白胨显示出高碱性PI和高亲水性。使用IEF的富集被IPG条带有足够高pH范围的IPG条带。然而,我们发现,HILIC具有优异的能力,丰富甲脲肽。单独的Hilic允许我们从胰蛋白酶或胰蛋白酶蛋白酸裂解物中鉴定重甲基硅胶细胞裂解物Jurkat细胞和原发性CD4 +淋巴细胞,215个Meth-R站点,其中80%是新的,占190个新的Meth-R总数的近90%。所有四种方法都发现的网站。我们的研究多加倍迄今为止的137个Meth-R网站,并将含93个甲基-R蛋白质添加到59人以前在人类中已知的59种,在一次努力中显着增加了我们对精氨酸甲基化的程度和生物学意义的了解。虽然与其他PTM的报告的那些相比,这些数字似乎有限,但是可以在考虑到这项研究中,精氨酸甲基化是更受限制和选择性的,但我们探讨了T细胞蛋白质组。虽然HILIC性能黯然失色SCX和IEF,但它错过了后两种方法识别的40个Meth-R站点,尽管进行了类似的分析数量。然而,HILIC和SCX / IEF METH-R肽的PI和肉汁评分没有显着差异,表明HILIC错过的主要原因可能是肽混合物在HILIC级分中的持续复杂性。为了在HILIC浓缩后发现较高数量的METH-R站点,我们使用了一种Q辐射锻炼(参见方法),这是一种功能强大的新款MS / MS仪器,允许更快的碎片速率,因此鉴定了较高的肽数量(
      • Nagaraj N.
      • Kulak N.A.
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Mayr K.
      • HOERNING O.
      • vorm o.
      通过单次超高HPLC在台式壁图上运行酵母蛋白质的系统宽扰动分析。
      )。这使我们可以在单一的实验中确认约一半的Meth-R站点,通过LTQ XL orbitrap对HILIC级分的几个分析来确定,并导致我们发现11个新的Qual,表明Q辐射的Q致动力在很大程度上优于蛋白质组学规模发现meth-r。在Jurkat细胞中检测到Meth-R蛋白,初级CD4 +淋巴细胞仅部分( 补充图S4)。两种细胞类型中的蛋白质表达和/或PRMT水平可能的差异可以解释这种分歧,考虑到Jurkat是T细胞淋巴瘤,癌细胞可以表达Meth-R蛋白的修饰曲目(
      • 张力
      • Chan L.C.
      • 汤普森A.
      • 清除M.L.
      • 所以C.W.
      蛋白质精氨酸 - 甲基转移酶依赖性肿瘤发生。
      )。类似地,组织表达的差异可以解释为什么我们的数据在哺乳动物蛋白质组中错过了18个met-R蛋白。
      迄今为止迄今为止的25%的Meth-R站点位于非RG网站(补充表S2)。有些含有脯氨酸,可以是Carm1基材(
      • 诚变。
      • 海尔斯J.
      • 沙班班S.
      • Bedford M.T.
      精氨酸甲基转移酶CARM1调节转录和mRNA加工的偶联。
      )。与使用7e6 mab,hilic(以及scx和Ief)富集似乎是无偏见的,因为我们识别的几乎一半位点位于非RG位点(补充表S1Fig. 3A)。迄今已知的相对较少的Meth-R网站主要来自涉及RNA代谢的最丰富的蛋白质(补充表S3),因为RG位点倾向于在RNA结合蛋白的重复碱中发生。但是,只有7个这样的蛋白质(总共56个)覆盖迄今为止已知的137个Meth-R网站的一半(见 补充表S2和S3)。因此,单独的HILIC除去上述偏差,并揭示了PRMTS对照蛋白质涉及许多不同的蜂窝功能。
      在RNA结合蛋白的碱序列中发生的Meth-R可能导致蛋白质-RNA相互作用(
      • Bedford M.T.
      • 克拉克斯。
      哺乳动物中蛋白质精氨酸甲基化:谁,谁,以及为什么。
      )。在我们的研究中定义的PRAM序列可以是蛋白质 - 蛋白质相互作用位点的一部分,并且甲基-R可以调节这种相互作用(
      • Bedford M.T.
      • Frankel A.
      • Yaffe M.B.
      • 克拉特S.
      • leder p.
      • 理查德S.
      精氨酸甲基化抑制富含脯氨酸的配体与SRC同源性3的结合,但不是WW,结构域。
      )。预测PRXXXP基序是能够与SH3和其他蛋白质结构域相互作用的多脯氨酸II螺旋。检查甲基化的PRXXXP基序显示疏水性氨基酸通常在+4脯氨酸(PRXXφP)之前(补充图S7),与SH3结构域相互作用的聚 - 脯氨酸II螺旋的签名,并在调节蛋白质 - 蛋白质相互作用时支持PRMT的作用(
      • Bedford M.T.
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      精氨酸甲基化抑制富含脯氨酸的配体与SRC同源性3的结合,但不是WW,结构域。
      )。有趣的是,我们的数据显示,WASP / WIP综合体和DNM-2涉及TCR信号传导诱导的形成和维护,含有PRAM序列,该序列是几个结合伴侣的SH3结合位点的一部分(
      • 张继夫
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      )。这些数据,以及鉴定新的Meth-R蛋白,涉及内体贩运,转录,转录,RNA加工和翻译开放的新观点,进一步揭示了PRMTS在T细胞活化过程中的作用。
      虽然HILIC代表了丰富的富含METH-R肽的简单且稳健的方法,但常规的“甲基族” - SCALE研究提前一些技术改进。在MS分析之前的脱络合物进一步的肽混合物的立即可能性是根据本研究突出的含有含有甲基肽的肽的肽的物理化学特征的两种色谱方法的正交组合。大/高度充电的肽可能会被MS逃脱检测,这是可以部分地使用胰蛋白酶以外的蛋白酶克服的问题。实际上,Chymotrypsin使我们能够鉴定胰蛋白酶消化中未发现的含含量含量的含甲酸碱数量。此外,SCX,IEF和优选的HILIC可以容易地以小规模形式使用,以发现低复杂性肽混合物中的精氨酸甲基化位点,例如衍生自净化蛋白质复合物或单个蛋白质的消化,证明或怀疑以与PRMTS相互作用。
      对含有含甲基-R含量的富集的富集的方法,例如HILIC,也将允许我们询问为什么和在多大程度上和在多大程度上癌症异常的蛋白质精氨酸甲基化在致癌中起作用( 例如 前列腺癌和乳腺癌)和其他几种重要病例,包括心血管和传染病,也有助于打开新的治疗工具和药物的途径。

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