量化同源蛋白和蛋白质ort * [S]

      来自替代剪接,翻译后修饰(PTM)或副偶基因的许多蛋白质ort - 具有不同的生物学功能,例如组蛋白PTM蛋白质常规。然而,其通过现有的自下而上质谱(MS)方法的定量由肽特异性偏置而破坏。为了避免这些偏见,我们开发并实施了一个第一个原则模型(嗨 Quan. )用于量化蛋白质形式的化学物质测定。当MS数据允许推断蛋白质Thichiometries时,我们的特征在于HI Quan. 并派生了一种最佳推理算法。我们将该算法应用于推断出两个实验系统中的蛋白质Oform的化学方法,其支持严格的台阶标记:烷基化蛋白质型在已知比率和内源组蛋白3 PTM蛋白质常规上相对于内部重标准进行量化。与基准相比时,蛋白质形式化学素受到干扰的 Quan. 不使用外部标准的相对误差为5-15%,对于简单的蛋白质ort,对于复杂的蛋白质ortmorms的20-30%。一个嗨 Quan. 服务器已实现: //web.northeastern.edu/slavov/2014_HIquant/
      替代MRNA拼接和翻译后修改(PTM)

      使用的缩写是:

      PTM.
      翻译后修改
      PSM
      肽光谱比赛
      FDR.
      假发现率
      PRM.
      平行反应监测。
      每种基因产生多种蛋白质同种型,由史密斯称为蛋白质ortm 等等。 (
      • 史密斯l.m.
      • Kelleher N.L.
      • 等等。
      蛋白质Oform:一个描述蛋白质复杂性的单一术语。
      )。此外,蛋白质同种型可以通过独特但高度同源的开放阅读框架产生, IE。 寄生基因。尽管具有相似的序列,蛋白质ort和蛋白质同种型通常具有不同的,即使是相反的生物学功能(
      • 索里亚P.S.
      • 麦格里K.L.
      • Rokas A.
      每个副病的功能分歧。
      ,
      • Aeberberold R.
      • 琼脂J.N.
      • Amster I.J.
      • 面包师M.S.
      • Bertozzi C.R.
      • 等等。
      有多少人蛋白质?
      )。例如:(1)一些Bcl-x同种型促进细胞凋亡,而其他Bcl-x同种型抑制细胞凋亡(
      • Schwerk C.
      • Schulze-osthoff K.
      替代前先生剪接调节细胞凋亡。
      ); (2)组蛋白3的甲基化可取决于改性赖氨酸的转录激活(赖氨酸4)或抑制(赖氨酸9)(
      • Berger S.L.
      转录过程中染色质调控的复杂语言。
      ); (3)丙酮酸激酶同种型具有不同的代谢调节,活动和有氧糖醇的作用(
      • Tanaka T.
      • Harano Y.
      • 苏F.
      • Morimura H.
      两种丙酮酸激酶从大鼠组织中分离的结晶,表征和代谢调节。
      ,
      • Christofk H.R.
      • vander heiden m.g.
      • 哈里斯M.H.
      • ramanathan A.
      • Gerszten r.e.
      • 魏R.
      • 弗莱明M.D.
      • 舍瑞斯S.L.
      • 坎特利L.C.
      丙酮酸激酶的M2接头同种型对于癌症代谢和肿瘤生长是重要的。
      ,
      • Slavov N.
      • Budnik B.
      • 施瓦布D.
      • Airoldi E.
      • 范欧雅纳州A.
      通过降低能量通量和增加需氧糖醇,可以支持恒定的生长速率。
      ); (4)肌动蛋白和冠状阴性异紫外线之间的次要氨基酸差异改变了actin上的原始肌蛋白位置(
      • 雷曼W.
      • 孵化V.
      • Korman V.
      • 玫瑰罗m.
      • 托马斯L.
      • maytum r.
      • Geeves M.A.
      • 范艾克J.E.
      • 托巴克曼L.S.
      • 克雷格r.
      Tropomyosin和Actin同种型调节Tropomyosin股在肌动蛋白长丝上的定位。
      )。
      了解此类系统要求准确的方法来区分和量化植物丰富(
      • Aeberberold R.
      • 琼脂J.N.
      • Amster I.J.
      • 面包师M.S.
      • Bertozzi C.R.
      • 等等。
      有多少人蛋白质?
      ,
      • Toby T.K.
      • Fornelli L.
      • Kelleher N.L.
      自上而下蛋白质组学的进展及蛋白质形式分析。
      )。然而,蛋白质ort中的高序列同源性通过自下而上的LC-MS / MC使其量化非常具有挑战性,因为蛋白酶消化(这是高通量自下而上蛋白质组学的重要组成部分)可能产生主要是共享的肽倍数蛋白质ort(
      • DOST B.
      • Bandeira N.
      • 李X.
      • Briggs S.P.
      • BAFNA V.
      基于精确的质谱基蛋白质量化通过共用肽。
      ,
      • Startna M.
      • 范艾克J.E.
      蛋白质同种型分析:我们可以更好吗?
      ,
      • 格尔特S.
      • kwon t.
      • Ludwig C.
      • Matondo M.
      • Vogel C.
      • 等等。
      蛋白质量化的统计方法。
      )。克服共用肽挑战并区分蛋白质形式的一种方法是分析没有蛋白酶消化的完整蛋白质常规,称为自上而下的蛋白质组学(
      • Toby T.K.
      • Fornelli L.
      • Kelleher N.L.
      自上而下蛋白质组学的进展及蛋白质形式分析。
      ,
      • Kelleher N.L.
      自上而下的蛋白质组学。
      ,
      • GE Y.
      • rybakova i.n.
      • 徐Q.
      • 苔藓r.l.
      心肌肌蛋白结合蛋白C的自上而下的高分辨率质谱显示截短改变蛋白质磷酸化状态。
      ,
      • Siuti N.
      • Kelleher N.L.
      使用自上向下质谱法解码蛋白质修饰。
      )。将蛋白质的色谱分离的进步与自上而下的蛋白质组学相结合,使能量上不同的骨骼和心肌蛋白的同种型(
      • 雷曼W.
      • 孵化V.
      • Korman V.
      • 玫瑰罗m.
      • 托马斯L.
      • maytum r.
      • Geeves M.A.
      • 范艾克J.E.
      • 托巴克曼L.S.
      • 克雷格r.
      Tropomyosin和Actin同种型调节Tropomyosin股在肌动蛋白长丝上的定位。
      ,
      • 盛S.
      • 陈德。
      • 范艾克J.E.
      通过色谱聚焦和人血清蛋白质优化和蛋白质数据库的色谱聚焦和逆相分离完整蛋白质的多维液相色谱分离。
      ),组合组蛋白修饰(
      • 年轻的N.L.
      • Dimaggio p.a.
      • Plazas-Mayorca M.D.
      • 巴利亚尔r.c..
      • floudas c.a.
      • 加西亚B.A.
      组合组态代码的高吞吐量表征。
      ,
      • 田Z.
      • 托利ć
      • 赵立
      • 摩尔r.j.
      • HENGEL S.M.
      • 罗宾逊e.w.
      • Stenoien D.L.
      • 吴S.
      • 史密斯r.d.
      • Paša-toliæl.
      增强了组蛋白翻译后修改的自上而下表征。
      )对数千人的蛋白质形式进行发现分析(
      • Toby T.K.
      • Fornelli L.
      • Kelleher N.L.
      自上而下蛋白质组学的进展及蛋白质形式分析。
      ,
      • Tran J.C.
      • Zamdborg L.
      • ahlf d.r.
      • 李准
      • 凯瑟曼A.D.
      • durbin k.r.
      • Tipton J.D.
      • Vellaichamy A.
      • Kellie J.F.
      • 李米
      • 吴C.
      • 甜蜜的三个
      • 早期B.。
      • Siuti N.
      • LEDUC R.D.
      • 康普顿P.D.
      • 托马斯下午
      • Kelleher N.L.
      使用自上而下的蛋白质组学在发现模式下映射完整的蛋白质同种型。
      )。区分蛋白质形式已经通过有效的碎片方法提供动力,例如电子捕获解离(ECD)(
      • Zubarev R.A.
      • Kelleher N.L.
      • MLEFFERTY F.W.
      电子捕获乘法蛋白阳离子的捕获解离。一个非精通过程。
      )电子转移解离(ETD)(
      • Syka J.E.
      • Coon J.J.
      • Schroeder M.J.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      )。将这些方法与红外线照相相结合(
      • 莱利n.m.
      • Sikora J.W.
      • Seckler H.S.
      • Greer J.B.
      • 倒立者R.T.
      • LEDUC R.D.
      • Westphall M.S.
      • 托马斯下午
      • Kelleher N.L.
      • Coon J.J.
      活性离子电子转移解离的价值,用于完整蛋白质的高通量自上而下表征。
      )并且具有巧妙的算法使得甚至可以本地化PTM并鉴定序列和改性位点,甚至对于具有多元共价修改的肽(
      • Dimaggio p.a.
      • 年轻的N.L.
      • 巴利亚尔r.c..
      • 加西亚B.A.
      • floudas c.a.
      一种混合整数线性优化框架,用于使用多路复用电子转移解离串联质谱法鉴定和定量高度改性蛋白的靶向翻译后修饰的鉴定和定量。
      ,
      • 关斯。
      • 伯灵名A.L.
      具有复杂的后翻译修饰肽高分辨率MSMS光谱的数据处理算法。
      )。这些方法允许定量在同一肽上发生的修饰之间的比率。
      虽然蛋白质分离和自上而下的方法的进展越来越强大(
      • Toby T.K.
      • Fornelli L.
      • Kelleher N.L.
      自上而下蛋白质组学的进展及蛋白质形式分析。
      ,
      • Siuti N.
      • Kelleher N.L.
      使用自上向下质谱法解码蛋白质修饰。
      ,
      • Tran J.C.
      • Zamdborg L.
      • ahlf d.r.
      • 李准
      • 凯瑟曼A.D.
      • durbin k.r.
      • Tipton J.D.
      • Vellaichamy A.
      • Kellie J.F.
      • 李米
      • 吴C.
      • 甜蜜的三个
      • 早期B.。
      • Siuti N.
      • LEDUC R.D.
      • 康普顿P.D.
      • 托马斯下午
      • Kelleher N.L.
      使用自上而下的蛋白质组学在发现模式下映射完整的蛋白质同种型。
      ),自下而上的方法仍然更广泛使用,仍然有效吞吐量(
      • Gillet L.C.
      • 莱特纳A.
      • Aeberberold R.
      应用于自下而上的产品的质谱:进入高通量时代进行假设检测。
      ,
      • Sinitcyn P.
      • 鲁道夫J.D.
      • Cox J.
      理解质谱基霰弹​​枪蛋白质组学数据的计算方法。
      )。当通过自下而上的方法分析时,在相应蛋白质的远处部分上发生许多蛋白质常规修饰,并且在不同的肽上发现蛋白酶消化。此外,大多数肽可以在蛋白质形制中共享(
      • DOST B.
      • Bandeira N.
      • 李X.
      • Briggs S.P.
      • BAFNA V.
      基于精确的质谱基蛋白质量化通过共用肽。
      ,
      • Startna M.
      • 范艾克J.E.
      蛋白质同种型分析:我们可以更好吗?
      ,
      • 格尔特S.
      • kwon t.
      • Ludwig C.
      • Matondo M.
      • Vogel C.
      • 等等。
      蛋白质量化的统计方法。
      )。在这里,我们专注于量化来自在多个样品上通过自下而上的LC-MS / MS定量的肽的这种蛋白质ort中的化学计量。
      在这些蛋白质型中量化化学计量的一种验证方法依赖于外部标准(
      • ong s.e.
      基于质谱的蛋白质组学转变定量。
      ,
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      )。即使对于复杂的蛋白质orts,这种方法也可以高精度(
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      )。然而,他们更广泛的使用受到费用的限制,仅适用于允许细胞裂解物的化学改性的特殊情况, 例如 phosphorylation (
      • 吴R.
      • 哈斯W.
      • Dephoure N.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      一种测量绝对蛋白质磷酸化化学物质测定的大规模方法。
      )和乙酰化(
      • Weinert B.T.
      • Iesmantavicius V.
      • Moustafa T.
      • Scholz C.
      • 瓦格纳S.A.
      • Zechner R.
      • C.
      糖酵母腺炎中的乙酰化动力学和化学计量。
      ,
      • Baeza J.
      • dowell j.a.
      • smallegan m.j.
      • 风扇J.
      • Amador-Noguez D.
      • 汗Z.
      • 丹努准
      整个蛋白质组中位点特异性赖氨酸乙酰化的化学计量。
      )。在没有外部标准的情况下,复杂的蛋白质形式的定量仍然非常具有挑战性,因为蛋白质形式特异性肽之间的比率不一定反映相应的蛋白质常规之间的比率(
      • 奥尔森J.V.
      • vermeulen M.
      • 桑塔马里亚A.
      • Kumar C.
      • 米勒M.L.
      • Jensen L.J.
      • GNAD F.
      • Cox J.
      • Jensen T.S.
      • nigg e.a.
      • 布鲁纳克斯。
      定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
      );对应于同一样品中相同磷酸盐位点的前体离子区域可以根据蛋白酶的选择而在100倍以下(
      • Giansanti P.
      • Aye T.T.
      • van denorn h.
      • 彭米
      • van Breukelen B.
      • Heck A.J.
      一种基于多蛋白酶的人磷酸肽阿特拉斯。
      )。这种差异是因为测量的肽水平(前体离子区域)不仅取决于相应蛋白质的丰度,而且取决于不同的因素,还取决于包括蛋白质消化,肽电离效率,其他共洗脱肽的存在和色谱像差(
      • Giansanti P.
      • Aye T.T.
      • van denorn h.
      • 彭米
      • van Breukelen B.
      • Heck A.J.
      一种基于多蛋白酶的人磷酸肽阿特拉斯。
      ,
      • 鲁P.
      • Vogel C.
      • 王R.
      • 姚X.
      • Marcotte e.m.
      绝对蛋白表达分析估计转录和翻译规则的相对贡献。
      ,
      • 彭米
      • taouatas n。
      • 卡帕多娜S.
      • van Breukelen B.
      • 穆罕默德S.
      • Spolten A.
      • Heck A.J.
      绝对蛋白质定量的蛋白酶偏置。
      )。这些外来因子破坏了肽和前体离子区域的丰度之间的等效性,因此使蛋白质量化比通过测序的DNA定量更具挑战性。当PTM肽已富集,并且它们的强度依赖于未知的富集依赖性因子时,该问题复杂化。

      实验步骤

      我们使用了两种实验方法来衍生蛋白质染色物的基位标记估计:(1)将动态通用蛋白质组学标准(UPS2)的烷基化蛋白质混合成已知比例,并通过并联反应监测(PRM )相对于具有已知绝对丰富的肽标准。这些方法中的每一种在下面的子部分中描述,并使用蛋白质om模拟物的所得的基准标记估计来评估HI Quan. inferences.

       量化UPS2的烷基化蛋白质ort

      我们的第一次测试嗨 Quan. 在具有基准标记的蛋白质常规的实验数据中,基于UPS2的烷基化蛋白质,我们混入预定比率。为了实现这样的混合物,我们通过将UPS标准分成两个相等的部分,A和第B部分开始。然后:
      • A部分通过TCEP降低,并且Cys用碘乙酰胺烷基化。
      • B部分用TCEP降低,并且Cys用乙烯基吡啶烷基化。
      将来自A部分和B部分B的烷基化蛋白质常规稀释至总体积为320μL,并根据掺入酵母样品中 表I..
      表I.
      TMT-126. TMT-127.TMT-128 TMT-129 TMT-130. TMT-131.
      A部分(碘乙酰胺)1010505010080
      B部分(乙烯基吡啶)5010040501050
      选择跨越幅度的这种混合比范围,因为它包括通过质谱法通常可靠地测量的相对变化的范围。蛋白质om6之间的分数位点占用在每个方向上的10倍内,瓷刺可能产生最精确的结果。如下所述,蛋白质常规中的比率可以从其独特肽的前体离子区域更好地推断出许多数量级不同的蛋白质常规。
      在UPS烷基化蛋白染色型中的穗之后,通过胰蛋白酶消化每个样品过夜,并根据制造商的方案用相应的TMT标签标记。将标记的样品混合成如前所述(
      • Slavov N.
      • Budnik B.
      • 施瓦布D.
      • Airoldi E.
      • 范欧雅纳州A.
      通过降低能量通量和增加需氧糖醇,可以支持恒定的生长速率。
      )。简而言之,将设定样品从自动取样器注入到捕获柱中(75μm柱ID,5cm长,并用20nm孔的5μm珠子包装;来自Michrom Bioresources,Inc。)并洗涤15分钟;将样品洗脱成分析塔(用75μm的ID,15cm,长度的水柱,并用HSS T31.8μm珠粒包装,梯度在180分钟内以2至32%的缓冲液B(0.1%甲酸)(0.1%甲酸)。梯度和加入LTQ orbitrap Elite(Thermo Fisher,San Jose,CA)。该仪器设置为以动态排除在前20毫秒/ MS模式方法中运行。在具有60k分辨率的orbitrap中的MS1扫描到MS1扫描后,将每个离子提交到具有15k或30k的HCD MS / MS,随后进行CID MS / MS扫描。所有量化数据源自HCD谱。
      在UPS2的特定情况下,胰蛋白酶消化导致足够的肽约束嗨 Quan. model (Fig. 1)并支持准确推理(Fig. 2B, 2C)。更复杂的蛋白质ort可能需要比从胰蛋白酶消化中量化的肽更多的肽。在这种情况下,为了更好地限制推断,可以增加HI的肽数量 Quan. 通过从几种消化中编制量化的肽,每种使用不同的蛋白酶(
      • Giansanti P.
      • Aye T.T.
      • van denorn h.
      • 彭米
      • van Breukelen B.
      • Heck A.J.
      一种基于多蛋白酶的人磷酸肽阿特拉斯。
      ,
      • 彭米
      • taouatas n。
      • 卡帕多娜S.
      • van Breukelen B.
      • 穆罕默德S.
      • Spolten A.
      • Heck A.J.
      绝对蛋白质定量的蛋白酶偏置。
      )。因为嗨 Quan. 仅使用相对量化并且对系统偏差不敏感,包括蛋白质常规特异性消化效率,它可以容易地容纳从不同蛋白酶的消化中量化的肽或来自不同的富集方法。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1独立于肽特异性偏倚的蛋白质常规和副骨蛋白中地推断成分的模型。 一种, One shared (X2)和三个独特的(X1, X3 , 和 X4)H3蛋白质族的肽说明了一个非常简单的宿舍 Quan. 。 你好 Quan. 模型跨条件测量的肽水平(x)作为蛋白质水平的假设(p),由未知的肽特异性偏差/滋扰(z)。这些耦合方程可以用矩阵形式写入,其溶液中的甲基化化学计量独立于滋扰(z )。 B, 可以配制并解决与N条件上的M肽的K蛋白质常规(或同源蛋白)模型的一般形式可以配制并解决。在许多情况下,尽管不是全部,即使在没有独特的肽的情况下也可以找到最佳和独特的解决方案;看 和补充信息。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2 你好 Quan. 准确地定量掺入尖刺标准的烷基化蛋白质常规上的比率。 A,验证实验的示意图。我们制备了来自动态通用蛋白质组学标准(UPS2)的蛋白质常规的金标准,其半胱氨酸与碘乙酰胺或用乙烯基吡啶共价修饰。在消化后,这些改性UPS蛋白产生许多共用肽(肽不含半胱氨酸)和一些独特的肽(含有半胱氨酸的肽)。修饰的UPS2蛋白质以已知比例彼此混合(n),与酵母裂解物混合,用MS消化和量化。致孕态ratios Quan. 从MS数据推断( N )与混合比进行了比较。 B,比率 穿过 由HI推断UPS2的烷基化同种型 Quan. ( N , y 轴)精确反映混合比(n, x 轴)。 C,面板B中的混合和推断比例2 - 幅度的2级,其大于相对误差的动态范围。要放大相对错误,我们绘制了日志的分布2( N / N. )1,500嗨 Quan. 用来自所有UPS2蛋白质的替代肽抽样产生的问题。为嗨 Quan. ,此分布表示小错误,中值误差低于11%。然而,只有来自每个蛋白质型的独特肽的前体强度估计的比率显着提高了相对误差显着更高,主要是由于消化和电离中的肽特异性可变性。

       质谱分析分析

      MAXQUANT分析质量/充电光谱(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化PPB系列质量和蛋白质全组蛋白质量化。
      )(1.4.1.2版)或续集的HT通过蛋白质组发现(64位版本1.4.0.288,Thermo)运行。所有搜索都在Windows Server 2008 64位操作系统上运行,具有64个CPU刀片和256 GB的RAM,其中包含以下一般参数。母离子容差设定为20ppm,将MS / Ms离子的质量耐受设定为HCD的0.02de,并为CID光谱设定为0.6Da。对于所有搜索,最小肽长度被指定为6个氨基酸和最大肽长度为50氨基酸。肽电荷状态限于MaxQuant的搜索+7。针对下载的酵母UNIPROT数据库进行搜索 www.yeastgenome.org. 2014年10月含有6,750个条目,UPS标准的快速序列和常见的污染物。搜索有胰蛋白酶特异性,允许2个错过的裂缝。随着碘乙酰胺或乙烯基吡啶的Cys烷基化,并将氧化在搜索参数中包括可变修改。没有固定修改。
      所有搜索引擎的搜索结果在蛋白质上以1%的假发现率(FDR)过滤,并使用过滤器(版本2.05版本日期2013年5月6日)。出口进一步分析的结果包括所有肽光谱匹配(PSM),其分配给一种或多种蛋白质并通过统计显着性过滤器。这些结果在MaxQuant和肽级结果文本文件中输出在“证据.txt”文件中输出。

       组蛋白PTMS相对于重肽标准的PRM

      评估嗨 Quan. 推论,我们还使用了从平行反应监测(PRM)测定的PTM化学物质测定,所述分析量相对于内部重标准定量每种肽。填充 等等。 已发布对测定的详细描述(
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      ),在这里我们只会简要概括它。通过离心收集药物处理的细胞。在细胞裂解后,用硫酸萃取组蛋白,用三氯乙酸沉淀。样本由10μ组成g,与后颅相比,减少5倍 等等。 (
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      ),用胰蛋白酶丙种化,脱盐和消化过夜。在第二轮丙酮化后,使用C18 SEP-PAK盒(水)脱盐。在MS分析之前,将同位素标记的合成肽的混合物掺入每个样品中。肽在C18柱(Easy-NLC 1000,Thermo Scientific)上分离,并在PRM模式下通过MS进行分析(Q辐照,热科学)(如前所述)(
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      )。可以在包括合成肽主混合物配方的P100和GCP测定的详细SOP,包括在内 //panoramaweb.org/labkey/wiki/LINCS/Overview%20Information/page.view?name=sops.

       豪华推断模型

      推断蛋白质形式化学计量,我们使用简单的模型 Fig. 1A 用组蛋白H3的蛋白质ort 补充图。S1 用吡胶核糖胺蛋白和丙酮酸脱氢酶的磷蛋白蛋白剂。豪华明确地模拟肽水平,以含有肽源自蛋白质的蛋白质的叠加, Fig. 1A。在该模型中,共享肽作为内部标准不可或缺;它们对不同肽的方程耦合,从而可以估计同源蛋白质和蛋白质常规之间的化学测定物。简单的例子 Fig. 1A 概括为任意数量的蛋白质/蛋白质ort(m)和大于1的任何数量的条件(N > 1) as the system in Fig. 1B shows. HI Quan. 解决该系统,并且独立于外来噪音(p)递送蛋白质水平(Z;来自蛋白质消化,肽电离差异,富集期间的样品损失,甚至均匀干扰); Z 也被推断为解决方案的一部分并丢弃。之前使用过的富含叠加模型在一个条件下量化的肽(
      • 格尔特S.
      • kwon t.
      • Ludwig C.
      • Matondo M.
      • Vogel C.
      • 等等。
      蛋白质量化的统计方法。
      )。但是,对于单个条件,该模型不能独立地从Nuisance Z量化蛋白质,因为系统1中的所有问题 Fig. 1 被确定, IE。 具有无限数量的解决方案(证明1;补充信息)。因此,对于单个条件,该模型不能利用稳健的对应离子对, IE。 与相同化学成分的离子之间的比率。相比之下,嗨 Quan. 仅来自蛋白质的比率及其PTMS仅来自相应离子比率。这是可能的,因为什么时候 N > 1,系统中的系统 Fig. 1B 即使所有肽都分享,通常也具有独特的解决方案,即使所有肽都被共享, 例如 设计矩阵中定义的问题 补充图S1C。我们描述了嗨的条件 Quan. 具有独特的解决方案,用于各个蛋白质形式的丰富和使用凸优化的算法,以找到给定数据的最佳解决方案;查看Malioutov和Slavov(
      • Malioutov D.
      • Slavov N.
      凸起的总比分。
      )和补充信息。

      验证蛋白质变化化学计量的推断

      我们的型号(Fig. 1B)旨在使蛋白质常规量化对许多系统偏差不敏感。例如,肽的不完全切割, 例如 在酶消化过程中仅释放5%的肽,完全被吸收到相应的滋扰中,如果裂解为所有条件/样品,则不会影响推断蛋白质水平。类似地,如果基溶干扰压缩肽的折叠变化,则压缩的系统成分被滋扰完全吸收。与系统偏差不同,数据中的随机噪声不会被滋扰吸收;它可以降低推理的质量。评估推断的植物丰富的可靠性,嗨 Quan. 仔细评估推论并分配置信水平。评估使用推理特征,例如解释方差的分数,特征值谱间距和噪声灵敏度;请参阅补充信息。
      我们试图通过实验评估嗨 Quan. 通过其他方法可以准确地确定样品中的样品中的样品中的蛋白质Oform修理计量的能力。包括产生和混合烷基化蛋白质常规的第一种方法。第二种方法包括定量组蛋白H3蛋白染料相对于具有已知丰富的重肽标准。

       基于掺入烷基化蛋白质形式的验证

      我们的旨在创造具有已知的化学物质测定物的蛋白质常规混合物,使得它们可用于评估所推断的化学物质的准确性 Quan. 。为此,将动态通用蛋白质组学标准(UPS2)分成两个相等的部分,A和B.在A部分中,用碘乙酰胺共价修饰半胱氨酸,并且如方法中所述,与乙烯基吡啶部分共价修饰 Fig. 2A。我们在预定比率中混合A和B(n)并将每个混合比掺入酵母样品中。所有样品均用TMT标记,并且在MS2水平的报道离子中量化的相对肽水平。
      这些烷基化的UPS蛋白质ort蛋白族具有主要共用肽(肽不含半胱氨酸),并且每种蛋白质常规(含有半胱氨酸肽)的仅一种或几种独特的肽)。你好 Quan. 如图所示模拟了这些肽的相对水平 Fig. 1 并解决模型以推断烷基化蛋白质常规的化学测定物( N ),其应对应于混合比率。实际上,我们发现实际的混合比率(n)对于所有定量的蛋白质orts强烈地关联到推断的比率( N )如图所示 Fig. 2B。检查推断率的准确性 N 更仔细地,我们寻求在推断和预期混合比之间产生误差的分布( N / N. )很多嗨 Quan. 问题,超过UPS2蛋白质形式的数量。为此,我们利用了不同UPS2蛋白的烷基化蛋白质的A / B比应该是相同的,因为蛋白质同时混合并因此以相等的比例混合。因此,我们创建了1500招呼 Quan. 通过用替代共享肽(不含半胱氨酸)和独特的肽(含半胱氨酸)来取样问题,然后推断 N 碘乙酰胺和乙烯基吡啶改性蛋白质常规之间的比率,每个TMT通道的比例为每HI Quan. 问题。相应的相对误差分布如图所示 Fig. 2C 除了从前体离子的丰度估计的比率的误差。所中位的错误低于11%的比率嗨 Quan. 对于独特肽的前体离子区域之间的比率的比率大得多(Fig. 2C )。

       基于PRM量化的组蛋白3蛋白综合的验证

      接下来,我们试图评估嗨的能力 Quan. 为了推断更复杂的PTM蛋白质ort的化学测定物,组蛋白H3的化学素。通过以已知浓度的外部标准(MasterMix),通过先前显影的测定来严格地量化内源性蛋白质族化学测定法(
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      )。对于试验,我们使用通过并行反应监测(PRM)量化的肽在7种药物扰动中。根据次颅克斯之前描述的外部标准估计分数站点占用 等等。 (
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      )。独立地,通过HI推断出相同的化学物质只有 从本土肽的相对水平,不使用MasterMix浓度。这些估计的比较表明良好的一致意见(Fig. 3),支持嗨的能力 Quan. 即使可以通过不同的PTMS修改相同的网站,即使可以修改相同的网站,则推断出分数占用。来自外部标准和HI的估计 Quan. 非常接近,但也显示出一些系统的偏差。这些偏差可能由于不完全蛋白质消化而难以控制肽标准,测量噪声损坏溶解的溶液 Quan. 或未明确包含在模型中的蛋白质。具有定量肽的一些蛋白质常规的丰度比主要蛋白质常规的丰度低1000倍。它们及其相应的肽从嗨省略 Quan. 推论是因为它们的定量需要不切实际的相对量化精度;请参阅补充信息和讨论。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3 你好 Quan. 在组蛋白3的PTM网站占用的PTM网站上准确地infers infers。 A,通过SRM量化组蛋白3肽在7扰动中量化,并且通过两种方法估计的K4甲基化的分数位点占状:估计推断 Quan. 不使用外部标准,根据具有已知浓度的MasterMix外部标准绘制相应的估计(
      • Creech A.L.
      • 泰勒J.E.
      • 迈尔V.K.
      • 吴X.
      • Feeney C.M.
      • Udeshi N.D.
      • 桃子S.E.
      • Boehm J.s.
      • 李J.T.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      通过定量靶向质谱法构建表观遗传学的连接图:染色质谱分析。
      )。每个标记形状对应于图例中所示的PTM站点;甲基化用“me”和乙酰化与“Ac”表示,然后用“Ac”,然后是甲基/乙酰基的数量。 B,来自(a)的验证方法延伸到另一组更复杂的分数位点占K9甲基化和K14乙酰化的占用。

      讨论

      在化学上相同离子之间使用比率的想法是定量蛋白质组学的基石(
      • ong s.e.
      基于质谱的蛋白质组学转变定量。
      ,
      • Blagoev B.
      • ong s.e.
      • Kratchmarova I.
      用定量蛋白质组学对磷酸赖斯汀依赖信号网络的时间分析。
      )。它在基于独特肽的蛋白质相对定量的背景下使用了二十年(
      • Altelaar A.
      • 弗雷泽C.K.
      • 预想赛C.
      • Hennrich M.L.
      • Schram A.W.
      • Timmers H.T.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      基于基于定量蛋白质组学的基于稳定同位素标记。
      )甚至应用于推断磷酸化位点占用的特殊情况(
      • DOST B.
      • Bandeira N.
      • 李X.
      • Briggs S.P.
      • BAFNA V.
      基于精确的质谱基蛋白质量化通过共用肽。
      ,
      • 奥尔森J.V.
      • vermeulen M.
      • 桑塔马里亚A.
      • Kumar C.
      • 米勒M.L.
      • Jensen L.J.
      • GNAD F.
      • Cox J.
      • Jensen T.S.
      • nigg e.a.
      • 布鲁纳克斯。
      定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
      )。我们的作品扩大并概括了所有肽,对复杂蛋白质常规的组织物,以及无限数量的条件。至关重要的是,嗨 Quan. 允许准确,高效,数值稳定的推断,从而导致可靠性估计。
      你好 Quan. 需要并取决于准确的相对量化。通过技术发展允许准确估计相应的离子比率,大大而越来越缓解这种限制。这种改进包括仪器进步(
      • Zubarev R.A.
      • Makarov A.
      露天度质谱。
      ,
      • Nagornov K.O.
      • Kozhinov A.N.
      • Tsybin Y.O.
      回旋频处的傅里叶变换离子回旋谐振质谱。
      ),无干扰串联质量标签(
      • 冬季S.V.
      • 梅尔F.
      • Wichmann C.
      • Cox J.
      • Meissner F.
      EASI标签可实现准确的基于多路复用和无干扰MS2的蛋白质组量化。
      ),增强来自质谱(
      • Sinitcyn P.
      • 鲁道夫J.D.
      • Cox J.
      理解质谱基霰弹​​枪蛋白质组学数据的计算方法。
      )但是,这些技术的技术不允许从自下而上的LC-MS / MS中准确估计PTM网站占用(
      • Giansanti P.
      • Aye T.T.
      • van denorn h.
      • 彭米
      • van Breukelen B.
      • Heck A.J.
      一种基于多蛋白酶的人磷酸肽阿特拉斯。
      )。 你好 Quan. 依赖性对相对量化的准确性的依赖性随着蛋白质文件丰富的差异而增加。如果两种蛋白质的水平差异超过3-6个数量级,则可能从独特肽的前体离子区域更好地推断出这种差异。相关噪声(由于蛋白质消化和电离的可变性)通常低于100倍(
      • 彭米
      • taouatas n。
      • 卡帕多娜S.
      • van Breukelen B.
      • 穆罕默德S.
      • Spolten A.
      • Heck A.J.
      绝对蛋白质定量的蛋白酶偏置。
      )因此小于信号。你好 Quan. 当蛋白质和蛋白质Oforms具有相当的丰富(10-100倍差异)而是不同的功能时,效用特别相关(
      • Slavov N.
      • Semrau S.
      • Airoldi E.
      • Budnik B.
      • 范欧雅纳州A.
      核心核糖体蛋白中的差分化学计量。
      ,
      • Emmott E.P.
      • Jovanovic M.
      • Slavov N.
      核糖体化学计量:从形式到功能。
      )因此,准确的量化对于量化丰富的相对较小的差异是必不可少的。量化此类蛋白质形式是一个令人兴奋的前沿,用于了解转录后调节(
      • van den berg p.r.
      • Budnik B.
      • Slavov N.
      • Semrau S.
      胚胎干细胞分化期间动态转录后调节。
      ,
      • 弗兰克A.
      • Airoldi E.
      • Slavov N.
      人体组织的转录后调节。
      )和定义单细胞蛋白质蛋白质蛋白质的细胞类型(
      • Budnik B.
      • 征收E.
      • HARMANGE G.
      • Slavov N.
      范围 - MS:单哺乳动物细胞的质谱测量细胞分化期间的蛋白质组异质性。
      )。
      嗨的一般形式 Quan. 描述 Fig. 1C indicates that HI Quan. 甚至广泛地定义了蛋白质ortmors。相反,嗨 Quan. 可以应用于共享肽的任何组蛋白质。在这里,我们强调应用于蛋白质ortms,因为现有的自下而上方法更适合于量化具有产生许多独特肽的低同源性的蛋白质之间的化学计量。对于具有多种独特肽的蛋白质,可能对一些肽特异性偏差(来自蛋白质消化和肽离子化效率的变化)进行平均并降低。然而,这种偏差是蛋白质ord的更严重的问题,只有一种或只有少数独特的肽(
      • Giansanti P.
      • Aye T.T.
      • van denorn h.
      • 彭米
      • van Breukelen B.
      • Heck A.J.
      一种基于多蛋白酶的人磷酸肽阿特拉斯。
      )。对于这样的蛋白质ort,嗨 Quan. 可以在化学相同的离子之间仅使用比率精确地估计化学测定物。

       补充信息

      补充信息包括扩展的实验程序,数学证据和补充图。可以在补充信息中找到。可以在以下内部找到用于交互式数据分析的补充网站: //web.northeastern.edu/slavov/2014_HIquant/ Python代码实现嗨 Quan. 可在: //github.com/nslavov/HIquant.

      数据可用性

      数据在Proteomexchange(登录ID:PXD008557,URL)上提供: http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=PXD008557)通过Massive(登录ID:MSV000081857,URL: //massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/dataset.jsp?task=38f67398ac7a4547b68f343ca1aff905 )。

      致谢

      我们感谢S.Carr,A. Ivanov,S. Macnamara,Y. Katz和Ma。 Blanco有关帮助,批判性讨论和反馈。 N.S.在与亚历山大·瓦·欧德纳纳丁的博士后,谢谢他的慷慨支持。

      补充材料

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