高通量血清 N-glycomics:方法比较和应用研究类风湿性关节炎和妊娠相关变化*[S]

  • Karli R. Reiday.
    一致
    应该解决对应的通信:P.O. Box 9600,2300 RC Leiden,荷兰。电话:+ 31-71-52-68701;
    隶属关系
    来自‡蛋白质组学和代谢组学中心,
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  • 阿尔伯特邦德
    脚注
    隶属关系
    来自‡蛋白质组学和代谢组学中心,

    §风湿病学,莱顿大学医学中心(LUMC),莱顿,荷兰;
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  • RenéHennig
    脚注
    隶属关系
    ¶MAXPlanck Institute(MPI)为复杂技术系统动态,39106 Magdeburg,德国;

    ‖glyxeragmbh。,德国马格德堡39120;
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  • 理查德A.加德纳
    脚注
    隶属关系
    ** Ludger,Ltd。,Culham Science Center,Abingdon,牛津郡,英国;
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  • roisin o'flaherty.
    脚注
    隶属关系
    ‡‡糖科学集团,国家生物加工研究与培训研究所(NIBRT),FOSTERS Avenue,Blackrock,Co.都柏林,爱尔兰;
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  • IrenaTrbojević-akmačić
    脚注
    隶属关系
    §§Genos糖科学研究实验室,克罗地亚萨格勒布;
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  • Archana Shubhakar.
    隶属关系
    ** Ludger,Ltd。,Culham Science Center,Abingdon,牛津郡,英国;
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  • Johanna M.W. Hazes.
    隶属关系
    ¶¶荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学医学中心的风湿病学;
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  • Udo Reichl.
    隶属关系
    ¶MAXPlanck Institute(MPI)为复杂技术系统动态,39106 Magdeburg,德国;

    德国生物工业工程椅子,39106,德国生物工业工程椅子瓦顿堡大学;
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  • Daryl L. Fernandes.
    隶属关系
    ** Ludger,Ltd。,Culham Science Center,Abingdon,牛津郡,英国;
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  • Majapučić-baković
    隶属关系
    §§Genos糖科学研究实验室,克罗地亚萨格勒布;
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  • erdmann rapp.
    脚注
    隶属关系
    ¶MAXPlanck Institute(MPI)为复杂技术系统动态,39106 Magdeburg,德国;

    ‖glyxeragmbh。,德国马格德堡39120;
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  • 丹尼尔I.R.斯宾塞
    脚注
    隶属关系
    ** Ludger,Ltd。,Culham Science Center,Abingdon,牛津郡,英国;
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  • Radboud J.E.M.达洛恩
    脚注
    隶属关系
    ¶¶荷兰鹿特丹伊拉斯谟大学医学中心的风湿病学;
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  • Pauline M. Rudd.
    脚注
    隶属关系
    ‡‡糖科学集团,国家生物加工研究与培训研究所(NIBRT),FOSTERS Avenue,Blackrock,Co.都柏林,爱尔兰;
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  • Gordan Lauc
    脚注
    隶属关系
    §§Genos糖科学研究实验室,克罗地亚萨格勒布;

    ***萨格勒布大学药房和生物化学学院,克罗地亚10000萨格勒布
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  • 曼弗雷德武力
    脚注
    隶属关系
    来自‡蛋白质组学和代谢组学中心,
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  • 作者脚注
    * *这项工作得到了欧盟第七框架计划项目Highglycan(278535)和荷兰关节炎基金会(NR-10-1-411)。竞争金融利益:Richard Gardner,Archana Shubhakar,Daniel I. Spencer和Daryl L.Fernandes在Ludger,Ltv.聘请了Ludger,Lauc,Gordan Lauc是Irens and IrenaTrbojević-Akmačić和MajaPučić-Baković是Genos Gycoscience研究实验室的员工而且,RenéHennig和埃尔德曼RAPP在Glyxera GmbH中使用,所有这些都是进行商业糖基化分析。 Karli R. Reiding和Manfred Wuhrer是知识产权的发明者,授权于Ludger,Ltd。和Glyxera GmbH。
    本文包含补充材料表S1-S11和图3和图3。 S1-S6。
    §§§这些作者与第一名作者同样贡献。
    ¶¶¶这些作者的贡献平等为高级作者。
      N - 糖基化是一种基本上重要的蛋白质改性,具有对糖蛋白特征如血清半衰期和受体相互作用的重大影响。人血清中超过一半的蛋白质是糖基化的,蛋白质糖族的相对丰度通常反映了健康和疾病的变化。目前有几种分析方法能够分析总血清N - 以高吞吐量的方式进行糖基化。
      在这里,我们评估并比较三种高吞吐量发布的性能N-glycome分析方法。包括具有荧光检测(HILIC-UHPLC-FLD)的亲水性 - 相互作用超高效液相色谱,用2-氨基苯甲酰胺标记,具有激光诱导的荧光检测(XCGE-LIF)的多重毛细血管凝胶电泳,具有8-氨基芘-1,3,6-三磺酸标记,以及基质辅助激光解吸/电离飞行时间的质谱(MALDI-TOF-MS),具有连锁特异性唾液酸酯化。所有方法评估了相同的血清样品面板,在妊娠期间的多个时间点和产后女性和类风湿性关节炎患者(RA)的患者中获得。我们将分析方法与其技术性能进行比较,以及它们描述血清蛋白质的能力N-glycosylation在整个妊娠,RA和RA病活动变化。
      总的来说,该方法在其检测和相对定量的血清蛋白质的检测和相对定量中得到了类似的方法N - 糖基化。然而,非MS方法在MALDI-TOF-MS上显示出优异的重复性,并允许最佳结构分离低复杂性N-Glycans。 MALDI-TOF-MS实现了最高吞吐量,并提供了更高复杂性的组成信息N-Glycans。因此,MALDI-TOF-MS可以建立妊娠和RA内的联系特异性唾液酸化差异,而HILIC-UHPLC-FLD和XCGE-LIF在α1,3-和α1,6-分支半乳糖基化的差异。虽然方法的结合被证明是对血清蛋白的分析最有利的N-Glycosylation,可通知的方法选择可以对单一蛋白质的糖基化分析或不同复杂性的样品进行。
      糖基化是一种关键和普遍存在的共同和后期蛋白质改性,其影响各种各样的生物学功能(
      • Varki A.
      聚糖的生物学作用。
      ,
      • 哈特G.W.
      • COPELAND R.J.
      糖类袭击了大时间。
      )。蛋白质的操纵 N-glycosylation已经有效地对影响分子中的蛋白半衰期和受体相互作用是有效的,因为γ-免疫球蛋白(IgG)和α-免疫球蛋白(IgA)以及促红细胞生成素(
      • 汤姆兰姆
      • 施洛德T.
      • Dashivets T.
      • 马利克斯。
      • venal c.
      • Bulau P.
      • RügerP.
      • Reusch D.
      IgG1的体外甘油工程及其对Fc受体结合和ADCC活性的影响。
      ,
      • Rouwendal G.J.
      • van der lee m.m.
      • 迈耶斯。
      • 重新获得K.R.
      • Schouten J.
      • de Roo G.
      • 蛋D.F.
      • 雷森J.H.
      • 鲍罗斯诗
      • Wuhrer M.
      • verheijden g.f.
      • Dokter W.H.
      • Timmers M.
      • Ubink R.
      通过IgA的高N-聚糖唾液化促进了抗HER2 IGA和IgG1体内疗效的比较。
      ,
      • 哦,M.J.
      • 华硕。
      • Kim B.J.
      • jeong h.n.
      • 济鸿
      • Grimm R.
      • yoo J.s.
      • 一个H.J.
      MS重组促红细胞生成素生物治疗剂和生物仿制物的拟合特征分析平台。
      )。此外,病原体和癌细胞以及其受体的聚糖是对小分子药物和生物药物的靶向靶标(
      • Pancera M.
      • Shahzad-Ul-Hussan S.
      • 多莉亚玫瑰n.a.
      • McLellan J.S.
      • Bailer R.T.
      • 戴克
      • Loesgen S.
      • 胜过M.K.
      • STAUPE R.P.
      • 杨Y.
      • 张B.
      • 公园R.
      • Eudaiey J.
      • Lloyd K.E.
      • Blinn J.
      • alam s.m.
      • Haynes B.F.
      • amin m.n.
      • 王l.x.
      • 伯顿D.R.
      • Koff W.C.
      • Nabel G.J.
      • MASCOLA J.R.
      • BEWLEY C.A.
      • kwong p.d.
      通过HIV-1中和V1-V2定向抗体PG16的不同N-Glycan识别的结构基础。
      ,
      • von Itzstein M.
      • 吴W.Y.
      • Kok G.B.
      • Pegg M.S.
      • Dyason J.C.
      • 金B.
      • van phan t.
      • Smythe M.L.
      • 白色H.F.
      • 奥利弗S.W.
      • 等等。
      富含流感病毒复制效力酶酶抑制剂的理性设计。
      ,
      • Dalziel M.
      • Crispin M.
      • Scanlan C.n.
      • Zitzmann N.
      • DWEK R.A.
      糖基化治疗剥削的新兴原理。
      )。纵向研究表明了总血浆蛋白的显着稳定性 N - 在几年内的个人(
      • Gornik O.
      • 瓦格纳J.
      • PUCIćM.
      • knezevića。
      • Redzic I.
      • Lauc G.
      人血浆中N-聚糖谱的稳定性。
      ,
      • Hennig R.
      • Cajic S.
      • Borowiak M.
      • Hoffmann M.
      • Kottler R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      通过人血浆N-Glyce的纵向研究对个性化诊断。
      ),虽然人口研究揭示了蛋白质的关联 N - 具有衰老,性别,炎症,体重指数,新陈代谢和各种癌症和自身免疫障碍的糖基化(
      • 重新获得K.R.
      • Ruhaak L.R.
      • 呃。
      • El Bouhaddani S.
      • van den akker e.b.
      • 普拉姆
      • McDonnell L.A.
      • HOUWING-DUISTERMAAT J.J.
      • Slagboom P.E.
      • 叶师米
      • Wuhrer M.
      通过基质辅助激光解吸/电离 - 傅里叶变换离子回答 - 与炎症和代谢健康标记分析的人血浆N-糖基化。
      ,
      • albrecht s.
      • 不合理的
      • Muniyappa M.
      • rudd下午
      糖基化作为炎症性关节炎的标志物。
      ,
      • VučkovićF.
      • Theodoratou E.
      • Thaci K.
      • Timofeeva M.
      • vojta A.
      • Štambukj.
      • Pučić-bakovićm。
      • rudd下午
      • ððl
      • 伺服器D.
      • WennerströmA.
      • Farrington S.M.
      • Perola M.
      • Aulchenko Y.
      • 邓洛伐克。
      • 坎贝尔H.
      • Lauc G.
      IgG在结肠直肠癌中的Glycome。
      )。单一蛋白质和复杂生物流体的纵向糖基化分析为早期检测系统改变的机会提供了机会,可用于分层患者人群(
      • kemna m.j.
      • 普拉姆
      • 范排名第P.
      • Koeleman C.A.M.
      • Jansen B.C.
      • Damoiseaux J.G.M.C.
      • 科恩·托尔维达J.W.
      • Wuhrer M.
      IgG患者患者的吡酰基化和唾液酸唾液酸化水平预测PR3-ANCA相关血管炎患者的复发。
      ,
      • Novokmet M.
      • Lukiće。
      • VučkovićF.
      • ð寿ž。
      • Keser T.
      • Rajšlk。
      • Remondini D.
      • Castellani G.
      • Gašparovićh。
      • Gornik O.
      • Lauc G.
      急性全身炎症中IgG的变化和总血浆蛋白质聚合物。
      ,
      • Verhelst X.
      • Vanderschaeghe D.
      • CastéraL.
      • Raes T.
      • 盖特A.
      • Francoz C.
      • Colman R.
      • Durand F.
      • Callewaert N.
      • van vlierberghe H.
      基于糖类的测试预测肝硬化肝细胞癌的发展。
      )。
      过去十年的达到了分析方法的主要发展 N - 糖基化分析(
      • Shubhakar A.
      • 重新获得K.R.
      • 加德纳R.A.
      • 斯宾塞D.I.
      • Fernandes D.L.
      • Wuhrer M.
      糖类研究的高通量分析与自动化。
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      • Gaunitz S.
      • NAGY G.
      • pohl n.l.
      • Novotny M.v.
      复合糖蛋白分析的最新进展。
      )。例如,通过亲水性相互作用液或反相色谱偶联至质谱法(以下)促进聚糖和糖肽的深入研究(
      • 沃克S.H.
      • Carlisle B.C.
      • Muddiman D.C.
      逆相和亲水性相互作用液相色谱平台的系统比较,用于分析N键聚乙醇。
      )和多孔石墨碳等材料显示出天然和渗透甲基聚糖的高度异构分离(
      • 阿什伍德C.
      • 林C.H.
      • Thaysen-Andersen M.
      • 包装机N.H.
      使用负离子PGC-LC-ESI-MS / MS中的诊断产物离子释放N-和O-聚糖的异构体的辨别。
      ,
      • 周S.
      • 黄扬
      • 董X.
      • 彭W.
      • Veillon L.
      • Kitagawa D.A.S.
      • Aquino a.j.a.
      • Mechref Y.
      在高温下通过多孔石墨碳(PGC)-LC-MS / MS对透甲基化聚乙烯的异构分离。
      )。然而,对于聚糖分析的方法,只有几个已经证明了高吞吐量(HTP)能力来简要构成许多当今临床队列的数千个样本。到目前为止,所有包含超过2,000例患者的最大族谱分析研究是用荧光检测(HILIC-(U)HPLC-FLD)的亲水 - 相互作用(超级)高性能液相色谱(
      • Lauc G.
      • 埃斯法迪A.
      • 霍夫曼J.E.
      • 海沃德C.
      • kneževića。
      • Kattla J.J.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
      • VITART V.
      • 亚伯拉罕J.L.
      • Pučićm.
      • Novokmet M.
      • Redžići。
      • 坎贝尔S.
      • 野生S.H.
      • Borovečkif.
      • 王W.
      • Kolčići。
      • Zgaga L.
      • Gyllensten U.
      • 威尔逊J.F.
      • 赖特A.F.
      • 哈斯蒂N.D.
      • 坎贝尔H.
      • rudd下午
      • 鲁丹一世。
      基因组学符合糖类 - 人N-Glycame的第一个GWAS研究将HNF1Alpha鉴定为血浆蛋白岩藻糖基化的主调节剂。
      ,
      • Ruhaak L.R.
      • 呃。
      • 叶师米
      • Hokke C.H.
      • Westendorp r.g.
      • Houwing-duistermaat J.
      • Wuhrer M.
      • 雷德德·芬
      • Slagboom P.E.
      血浆蛋白N-聚糖型材与日历年龄,家族性长寿和健康有关。
      ,
      • Lauc G.
      • 霍夫曼J.E.
      • Pučićm.
      • Zgaga L.
      • Adamczyk B.
      • Mužinića。
      • Novokmet M.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
      • krištićj.
      • Keser T.
      • VITART V.
      • Scheijen B.
      • 呃。
      • Molokhia M.
      • 帕特里克A.L.
      • McKeigue P.
      • Kolčići。
      • Lukići.k.
      • venann o.
      • van leeuwen f.n.
      • Ruhaak L.R.
      • HOUWING-DUISTERMAAT J.J.
      • Slagboom P.E.
      • 叶师米
      • de craen a.j.
      • 雷德德·芬
      • 曾Q.
      • 王W.
      • 哈斯蒂N.D.
      • Gyllensten U.
      • 威尔逊J.F.
      • Wuhrer M.
      • 赖特A.F.
      • rudd下午
      • 海沃德C.
      • Aulchenko Y.
      • 坎贝尔H.
      • 鲁丹一世。
      与人免疫球蛋白G的N-糖基化相关的基因座显示出具有自身免疫疾病和血液学癌症的肺炎。
      ),具有激光诱导的荧光检测(XCGE-LIF)的多路复用毛细管凝胶电泳(
      • Ruhaak L.R.
      • Koeleman C.A.
      • 呃。
      • STAM J.C.
      • 范·赫姆斯特D.
      • 迈尔A.B.
      • HOUWING-DUISTERMAAT J.J.
      • Hensbergen P.J.
      • Slagboom P.E.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      通过高通量糖基化谱系的靶向生物标志物发现人血浆α1-抗酸胰蛋白酶和免疫球蛋白A.
      )和基质辅助激光解吸/电离(飞行时间)质谱(MALDI-(TOF)-MS)(
      • 重新获得K.R.
      • Ruhaak L.R.
      • 呃。
      • El Bouhaddani S.
      • van den akker e.b.
      • 普拉姆
      • McDonnell L.A.
      • HOUWING-DUISTERMAAT J.J.
      • Slagboom P.E.
      • 叶师米
      • Wuhrer M.
      通过基质辅助激光解吸/电离 - 傅里叶变换离子回答 - 与炎症和代谢健康标记分析的人血浆N-糖基化。
      )并评估了释放 N来自总血清/血浆或单糖蛋白的糖粉,如IgG和α-1-抗抗果糖。但是,虽然每个分析方法都证明了对分析的信息 N - 复杂混合物的糖基化,它们都不是在没有后续实验的情况下提供全结构表征,例如超糖糖苷酶消化和/或串联 - MS(
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
      • Helland A.
      • Yakhini Z.
      • børresen-dale a.l.
      • rudd下午
      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      ,
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      人血浆的N-甘氨酸。
      )。
      对于相对较低的复杂性的聚糖,例如在IgG的片段结晶(Fc)部分上发现,比较分析显示上述分析方法之间的高度相似的结果(
      • 霍夫曼J.E.
      • Pučić-bakovićm。
      • KlarićL.
      • Hennig R.
      • Selman M.H.
      • VučkovićF.
      • Novokmet M.
      • krištićj.
      • Borowiak M.
      • muth t.
      • PolašekO.
      • Razdorov G.
      • Gornik O.
      • 普拉姆
      • Theodoratou E.
      • 赖特A.F.
      • 鲁丹一世。
      • 海沃德C.
      • 坎贝尔H.
      • 雷德德·芬
      • Reichl U.
      • Aulchenko Y.S.
      • RAPP E.
      • Wuhrer M.
      • Lauc G.
      四种方法对免疫球蛋白G遗传学和流行病学研究中的四种方法的比较性能。
      ,
      • Reusch D.
      • Haberger M.
      • 迈尔B.
      • 迈尔M.
      • Kloseck R.
      • Zimmermann B.
      • 钩马
      • Szabo Z.
      • 科普斯
      • Wegstein J.
      • alt n。
      • Bulau P.
      • Wuhrer M.
      治疗免疫球蛋白G分析方法的比较 - 第1部分:基于分离的方法。
      ,
      • Reusch D.
      • Haberger M.
      • Falck D.
      • 彼得B.
      • 迈尔B.
      • Gassner J.
      • 钩马
      • 瓦格纳K.
      • BONNINGTON L.
      • Bulau P.
      • Wuhrer M.
      治疗免疫球蛋白G FC-糖基化谱分析方法的比较 - 第2部分:质谱法。
      )。然而,对IgG-Fc糖基化的研究不包括较高天数的结构, IE。 三年度和四年度物种,也不是高水平的终端 N - 除IgG以外的大多数血清蛋白上发现 -​​ 乙酰呋喃酸(
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      人血浆的N-甘氨酸。
      ,
      • clerc f.
      • 重新获得K.R.
      • Jansen B.C.
      • Kammeijer G.S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      人血浆蛋白N-糖基化。
      )。此外,许多生物源显示出比人IgG更多的异质糖基化,并且关于这种复杂样品对HTP族方法的比较性能的信息仍然缺失。
      在这里,我们研究了最新一代HTP的表现 N-glycome分析方法,专注于Hilic-Uhplc-FLD,Xcge-LiF和Maldi-Tof-MS。通过这项研究,我们旨在评估它们对总血清蛋白质的各自适用性 N-glycome(TSNG)分析,探索方法之间信息的重叠和正交性,并确定其强度和缺点,以揭示不同类型的 N-Glycan属性。为了在临床相关的环境中回答这些问题,所有方法都受到分析诱导的类风湿性关节炎(PARA)队列的相同次集,旨在探索类风湿性关节炎(RA)严重程度的纵向研究怀孕期间的女性经历(
      • 德曼y.a.
      • Dolhain R.J.
      • van de geijn f.e.
      • Willemsen S.P.
      • Hazes J.M.
      怀孕期间类风湿性关节炎的疾病活性:全国范围的前瞻性研究结果。
      )。

      实验步骤

       学习人口

      这里提出的研究是使用Para研究的血清样本进行,前瞻性队列来研究妊娠和RA的相互作用(
      • 德曼y.a.
      • Dolhain R.J.
      • van de geijn f.e.
      • Willemsen S.P.
      • Hazes J.M.
      怀孕期间类风湿性关节炎的疾病活性:全国范围的前瞻性研究结果。
      )。在目前的研究中,血清样品包括在36例RA患者怀孕中,在怀孕的第三个三个月之前获得,在妊娠后26周后获得。在每一时间,使用基于C反应蛋白(CRP)水平(Mg / L)的三个变量(DAS28(3)-CRP),评估疾病活性。此外,32种显然健康妊娠(不具有不良产科历史)的血清样品被包括在妊娠第三个三个月和26周后收集的血清包括对照。所有怀孕都已完成,所有患者均满足1987年美国风湿病学院(ACR)的RA标准。该研究符合赫尔辛基宣言,并受欧洲州鹿特丹鹿特丹伊拉斯大学医学中心的伦理审查委员会批准。
      在178个临床样品中的每一个中,200μL血清分布在两台96孔深阱板上的随机顺序(聚丙烯; Nunc,Rochester,NY)。每平板,额外的两个位置填充有磷酸盐缓冲的盐水溶液,用作坯料,具有相同的等离子体的五个位置,作为技术标准(VisiCon-F冷冻正常对照等离子体;亲和生物学,Ancaster,On)和三个位置促进每个实验室将本地标准列入。这些本地标准仅用于各个实验室的技术验证,并未评估方法比较。从这些主板,将40μL样品分成五对PCR平板(聚丙烯; GRINEL BIO-ONE,Frickenhausen,Germany),其分布在参与的实验室中。

       HILIC-UHPLC-FLD分析

      通过参与者1,2和3进行HILIC-UHPLC-FLD的样品制备和测量,如前所述(
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
      • Helland A.
      • Yakhini Z.
      • børresen-dale a.l.
      • rudd下午
      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      ,
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
      ,
      • akmačići.t.
      • Ugrina I.
      • Štambukj.
      • Gudelj I.
      • VučkovićF.
      • Lauc G.
      • Pučić-bakovićm。
      高通量含量:样品制备的优化。
      ,
      • Adamczyk B.
      • Stöckmannh。
      • O'Flaherty R.
      • Karlsson N.G.
      • rudd下午
      UHPLC血浆N-Glyce的高通量分析。
      )。该程序在补充信息中全面描述(分别, 补充方法M1,M2和M3)。总结, N - 过夜肽从其蛋白质骨干中酶促释放 - 醇苷 - N - 通过再氧化胺化标记的糖苷酶F(PNGase F)处理,用HILIC固相萃取富集,并通过HILIC-UHPLC-FLD分析。对于峰值注释,在葡聚糖梯的外部UHPLC运行上校准样品保留时间。特此获得每个信号的葡萄糖单元(GU)值用于连接到先前建立的分配的数据库(补充表S1)(
      • 坎贝尔M.P.
      • 罗伊尔L.
      • radcliffe c.m.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      Glycobase和Autogu:基于HPLC的Glycan分析工具。
      )。

       XCGE-LIF分析

      如前所述进行XCGE-LIF样品制备和测量(补充方法M4)(
      • Hennig R.
      • Cajic S.
      • Borowiak M.
      • Hoffmann M.
      • Kottler R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      通过人血浆N-Glyce的纵向研究对个性化诊断。
      ,
      • Hennig R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      一种软件工具,用于基于CGE-LIF基甘油分析数据的自动化高通量处理,由多路复用毛细管DNA测序器产生。
      ,
      • Hennig R.
      • RAPP E.
      • Kottler R.
      • Cajic S.
      • Borowiak M.
      • Reichl U.
      通过Xcge-LiF的病毒糖蛋白的N-糖基化指纹纹理。
      )。简要地, N通过Pngase F从血清蛋白释放,通过用8-氨基丙烯-1,3,6-三磺酸的还原胺化荧光标记,通过HILIC固相提取富集,并通过激光的多重毛细管凝胶电泳系统分析 - 引起的荧光检测。每个样品通过共同迁移的荧光标准内部校准,由此产生的迁移时间以建立的数据库值(补充表S2)(
      • Hennig R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      一种软件工具,用于基于CGE-LIF基甘油分析数据的自动化高通量处理,由多路复用毛细管DNA测序器产生。
      )。通过Glyxtool执行自动迁移时间归一化,峰值拣选,集成和数据库匹配(
      • Hennig R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      一种软件工具,用于基于CGE-LIF基甘油分析数据的自动化高通量处理,由多路复用毛细管DNA测序器产生。
      )。

       MALDI-TOF-MS分析

      如前所述进行MALDI-TOF-MS样品制备和测量(补充方法M5)(
      • Bladergroen M.R.
      • 重新获得K.R.
      • Hipgrave Ederveen A.L.
      • vreeker G.C.
      • clerc f.
      • 霍尔特S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      • van der burgt y.e.
      基于高通量质谱的血浆N-Glyce分析与连锁特异性唾液酸酯化的自动化。
      ,
      • 重新获得K.R.
      • 空白D.
      • kuijper d.m.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      MALDI-TOF-MS采用纺合特异性唾液酸酯化蛋白质N-糖基化的高通量分析。
      )。简而言之,之后 N通过Pngase F释放,采用自动化平台来通过乙基酯化(α2,6-连接的唾液酸和α2,3-连接的唾液酸的膀胱酸)衍生唾液酸,以进行GHP HILIC固相提取,并在MALDI目标上发现样品(
      • Bladergroen M.R.
      • 重新获得K.R.
      • Hipgrave Ederveen A.L.
      • vreeker G.C.
      • clerc f.
      • 霍尔特S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      • van der burgt y.e.
      基于高通量质谱的血浆N-Glyce分析与连锁特异性唾液酸酯化的自动化。
      )。 MALDI-TOF-MS分析在RETRECTRON阳性模式下进行,累积每点10,000次以随机行走模式。获得的信号被注释为[m + na]+ 聚糖组合物根据信噪比,ppm误差和同位素比(补充表S3)。

       数据预处理和分析

      基于结构注释的参与者之间的信号数在参与者之间统一,主要基于参与者1的命名法(补充表S4)。对于每个方法,信号区域被标准化为每个样本的区域总和(总面积归一化)。基于已知的酶促糖基化途径和糖蛋白群(用于表明,基于已知的酶促糖基化途径和糖蛋白群计算衍生性状 补充表S5,用于描述派生性特征的图例 补充表S6)(
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      人血浆的N-甘氨酸。
      ,
      • clerc f.
      • 重新获得K.R.
      • Jansen B.C.
      • Kammeijer G.S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      人血浆蛋白N-糖基化。
      ,
      • Klein A.
      人类总血清n-glycome。
      ,
      • Nairn A.v.
      • 约克W.S.
      • 哈里斯克。
      • 大厅尤。
      • 皮尔斯准
      • Moremen K.W.
      动物组织中甘油结构的调节:甘草相关基因的转录性分析。
      ,
      • 冻结H.H.
      人类glyce中的遗传缺陷。
      ,
      • 康P.
      • Mechref Y.
      • Novotny M.v.
      聚糖高通量固相渗透料在质谱前。
      )。
      在整个数据分析中,我们在Rstudio 0.98.1091(Rstudio Team,Boston,MA)中使用了R 3.1.2(
      • rcore团队
      R:统计计算的语言和环境。
      )。通过计算平均值,S.D。评估每种方法的可重复性。和技术控制样本内的每个信号的简历(补充表S7)。通过计算Pearson相关性建立了临床资料中糖基化特征之间的相关性,并以热图格式表示结果(补充图S3-S5)。使用总区域归一化糖基化值类似地在r中类似地创建了Boxplots和散点图。
      对于怀孕的关联分析,RA和DAS28(3)-CRP,糖基化(和衍生特质)平均值为0并缩放以表示单个S.D。变化。妊娠被定义为二元变量(妊娠和26周= 0;怀孕的第三个三个月= 1),如Ra(0 =控制,1 = Ra)。使用混合逻辑回归来测试糖基化(独立)与妊娠(依赖)的关联,通过分配每个人随机截距来校正间面效应(补充表S8)。混合逻辑回归另外用于测试糖基化(独立)和RA(依赖性)之间的关联,通过对每个时间点进行随机截距来校正妊娠(补充表S9)。线性回归用于测试糖基化(独立)和线性变量DAS28-CRP(依赖的)之间的直接关联,而混合线性回归用于区分内部效应(建模每单独的随机拦截)或造型的内部效应(建模a每时间点随机拦截)(补充表S10)。
      通过适用Benjamini-Hochberg程序,将研究范围的假发现率控制在5%(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率 - 一种实用而强大的多次测试方法。
      ),导致α= 1.7·10的总体意义阈值−2 (补充表S11)。

       命名法

      在文字中, N-glycan结构遵循牛津命名(
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
      • Helland A.
      • Yakhini Z.
      • børresen-dale a.l.
      • rudd下午
      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      ):A = antennary数量 N - 乙酰葡糖胺,g =半乳糖的数量,m =甘露糖残基的数量(D1-3表示异构物质),f =荧光孔的数量(表示核心岩氧化的结构的开始处的f°),s =数 N - 乙酰呋喃酸,和B =二分裂。括号中的数字表示以下特征的联动, 例如 S [3,6] 2声明两个唾液酸,一种是α2,3-连接,一个是α2,6-连接。
      N-聚糖组合物随后H =己糖,n = N - 乙酰己胺,f =岩藻糖(脱氧糖),s =未指定 N - - 乙酰呋喃酸(唾液酸),L =(含叶酸)α2,3-连接 N - 乙酰呋喃酸,和E =(乙基酯化)α2,6-连接 N - 乙酰甘氨酸。
      通过甘露群组在功能综合症的建议之后用甘草漫画注释(
      • Varki A.
      • Cummings R.D.
      • Aebi M.
      • 包装机N.H.
      • Seeberger P.H.
      • Esko J.D.
      • 斯坦利P.
      • 哈特G.
      • Darvill A.
      • Kinoshita T.
      • Prestegard J.J.
      • Schnaar R.L.
      • 冻结H.H.
      • Marth J.D.
      • Bertozzi C.R.
      • Etzler M.E.
      • 弗兰克米
      • vliegenthart J.f.
      • LüttekeT.
      • 佩雷斯S.
      • 博尔顿E.
      • rudd p.
      • 保索J.
      • Kanehisa M.
      • Toukach P.
      • Aoki-Kinoshita K.F.
      • 戴尔A.
      • Narimatsu H.
      • 约克W.
      • Taniguchi N.
      • Kornfeld S.
      聚糖图形表示的符号命名。
      )使用GlycoWorkBench 2.1设计(构建146)(
      • Ceroni A.
      • 玛雅K.
      • Geyer H.
      • Geyer R.
      • 戴尔A.
      • 哈斯林三。
      GlycoWorkBench:一种用于聚糖的计算机辅助注释的工具。
      )。

      结果

      为了定性地比较糖类分析方法,我们在三个时间点(在妊娠第三个三个月之前的孕孕之前,测量了36名Ra患者怀孕的发布的TSNGS,以及产后26周的26周)和32个健康对照的怀孕(在两次第三个三个月和26周产后)(表I.)。此外,在研究中包含标准血浆样品的重复测量,以建立和内部平板内变化。释放的聚糖样品上使用的方法如下:2-氨基苯甲酰胺标记后的HILIC-UHPLC-FLD,8-氨基芘-1,3,6-三磺酸标记和乙基酯化后的MALDI-TOF-MS后XCGE-LIF唾液酸(表二)。 HILIC-UHPLC-FLD分析由应用其标准方案的三名独立实验室进行(补充方法)。
      表I.研究ACPA的妊娠特征,抗瓜氨酸,抗瓜氨酸蛋白抗体; Ru,类风湿因素。
      怀孕
      控制 (n = 32)Ra(n = 36)
      年龄在交货时期,意思是(S.D.)32.1(4.4)32.5(4.0)
      妊娠期持续时间在几周内,意思(S.D.)40.1(1.4)39.2(1.9)
      疾病持续时间在第一次访问多年,意思是(S.D.)7.3(5.8)
      ACPA阳性患者,N(%)22(61%)
      射频阳性患者, n (%)25(69.4%)
      腐蚀性疾病, n (%)14(38.9%)
      疾病活动评分(DAS28(3)-CRP)在先入为主,平均值(S.D.)3.8(1.0)
      表二参与研究中使用的实验室和方法
      隶属关系(参与者)方法标签或修改清理自动化注解参考
      nibrt(1)HILIC-UHPLC-FLD2-AB标签固相酰肼珠捕获;高度高硅硒鼓样品制备顾值与数据库(
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
      • Helland A.
      • Yakhini Z.
      • børresen-dale a.l.
      • rudd下午
      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      ,
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
      )
      genos(2)HILIC-UHPLC-FLD2-AB标签GHP滤板顾值与数据库(
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
      • Helland A.
      • Yakhini Z.
      • børresen-dale a.l.
      • rudd下午
      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      ,
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
      )
      Ludger(3)HILIC-UHPLC-FLD2-AB标签Ludgerclean T1墨盒样品制备顾值与数据库; LC-MS成分分析(
      • Ventham N.T.
      • 加德纳R.A.
      • 肯尼迪N.A.
      • Shubhakar A.
      • Kalla R.
      • nimmo e.r.
      • Fernandes D.L.
      • Satsangi J.
      • 斯宾塞D.I.
      对血清样品管和加工方法的变化不会引起胞内的[校正]在健康和疾病中自动血清N-聚糖剖面的变化。
      )
      MPI(4)XCGE-LIF.APTS标签Glyxera glyxbeads.正常化;一体化;数据库匹配;质量控制与数据库的标准化迁移时间值(
      • Hennig R.
      • Cajic S.
      • Borowiak M.
      • Hoffmann M.
      • Kottler R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      通过人血浆N-Glyce的纵向研究对个性化诊断。
      ,
      • Hennig R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      一种软件工具,用于基于CGE-LIF基甘油分析数据的自动化高通量处理,由多路复用毛细管DNA测序器产生。
      ,
      • Hennig R.
      • RAPP E.
      • Kottler R.
      • Cajic S.
      • Borowiak M.
      • Reichl U.
      通过Xcge-LiF的病毒糖蛋白的N-糖基化指纹纹理。
      )
      LUMC(5)MALDI-TOF-MS唾液酸的乙基酯化GHP滤板样品制备;一体化;质量控制质量错误;同位素分布(
      • Bladergroen M.R.
      • 重新获得K.R.
      • Hipgrave Ederveen A.L.
      • vreeker G.C.
      • clerc f.
      • 霍尔特S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      • van der burgt y.e.
      基于高通量质谱的血浆N-Glyce分析与连锁特异性唾液酸酯化的自动化。
      ,
      • 重新获得K.R.
      • 空白D.
      • kuijper d.m.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      MALDI-TOF-MS采用纺合特异性唾液酸酯化蛋白质N-糖基化的高通量分析。
      )

       信号检测

      HILIC-UHPLC-FLD允许通过匹配标准化保留时间来推断出46个信号的集成 通过 顾值到数据库条目(补充表S1)(
      • 坎贝尔M.P.
      • 罗伊尔L.
      • radcliffe c.m.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      Glycobase和Autogu:基于HPLC的Glycan分析工具。
      )。 XCGE-LIF使能为49个信号的集成,通过匹配迁移时间推断出峰值身份 通过 database entries (补充表S2)(
      • Hennig R.
      • Reichl U.
      • RAPP E.
      一种软件工具,用于基于CGE-LIF基甘油分析数据的自动化高通量处理,由多路复用毛细管DNA测序器产生。
      )。对于MALDI-TOF-MS,检测到61个信号,通过既定质量标准(补充图。S1; 补充表S3)。分析广泛地检测到相同 N-glycan物种,每个方法在结构和组成重叠中有一些变化(补充表S4),任务符合以前建立的血清和等离子体 N - 糖基化特征(
      • Nairn A.v.
      • 约克W.S.
      • 哈里斯克。
      • 大厅尤。
      • 皮尔斯准
      • Moremen K.W.
      动物组织中甘油结构的调节:甘草相关基因的转录性分析。
      ,
      • 冻结H.H.
      人类glyce中的遗传缺陷。
      ,
      • 康P.
      • Mechref Y.
      • Novotny M.v.
      聚糖高通量固相渗透料在质谱前。
      )。
      所有分析方法都显示出与总血清和等离子体型材的表示的相当结果(Fig. 1)。对于所有方法清楚地定义是两种最大信号,主要属于A2G2S [6,6] 2(H5N4E2;对于HILIC-UHPLC-FLD,XCGE-LIF和MALDI-TOF-MS峰值25,4和31)和A2G2S [6] 1(H5N4E1;峰值19,22和22)(补充表S4)。此外,所有方法都表明了亚斯林化的Diantennarary Glycans的高清检测, 例如 Fa2(H3N4F1;峰5,31,5)和Fa2G2(H5N4F1;峰14,45,14)。然而,非MS方法允许单乳糖基状物种的半乳糖连杆位点区分, 例如 FA2 [3] G1(峰值8,39, - )和FA2 [6] G1(峰值9,40, - ),而Maldi-Tof-MS只能检测属于这些结构的常见组合物,即H4N4F1(峰值9 )。同样,虽然存在一分钟 N - 乙酰甘氨酸导致独特的保留/迁移时间,相应的质谱组合物也适用于具有不完全的半乳糖基化的三合一体结构。例如,MALDI-TOF-MS组合物H3N5F1可以与FA2B(峰值6,35,11)或FA3(未检测到)对准,尽管这些不在人血清中高丰度(
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      人血浆的N-甘氨酸。
      ,
      • clerc f.
      • 重新获得K.R.
      • Jansen B.C.
      • Kammeijer G.S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      人血浆蛋白N-糖基化。
      )。另一方面,MS证明能够单独检测不同尺寸的高甘露糖和杂化型 N-glycans,而这些物种与非MS方法中的司法糖苷重叠(补充表S4)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1相同总血浆蛋白的相应谱 N-Glycan标准由Hilic-Uhplc-FLD,Xcge-Lif和Maldi-Tof-MS记录。 (A)由Hilic-UHPLC-FLD获得的2-氨基苯甲酰胺标记得到的色谱图。 (B通过Xcge-LiF在APTS标记后获得的电泳图。 (C)通过MALDI-TOF-MS在乙基酯化后获得的质谱,物种分配为[M + NA]+。所有录音的信号都被批发到了最好的知识,利用这些方法的检测以及生物化学途径和血浆/血清的建立文献 N - 糖基化。连锁的显示已被限制在 N - 乙酰呋喃酸酸(唾液酸),其主要由Maldi-Tof-MS获得。分支差异(半乳糖臂,双分型,岩藻糖位置)仅通过HILIC-UHPLC-FLD和XCGE-LIF来区分。对于信号的完整分配,请参阅 , 也 .
      所有分析也检测到属于三合一结构的两个主要物种, IE。 A3G3S [3,6,6] 3(H6N5L1E2;峰34,3,49)和A3F1GS [3,6,6] 3(H6N5F1L1E2;峰38,5,53)。然而,虽然可以通过MALDI-TOF-MS来区分三合一甘油组合物的特异性唾液酸连杆变体, 例如 H6N5L3,H6N5L2E1,H6N5L1E2和H6N5E3,伴随结构无法清楚地分配给HILIC-UHPLC-FLD和XCGE-LIF的单独信号,而无需额外的酶促除去唾液酸和样品重量的额外步骤。这种情况类似于Tetraantennary组合物。
      基于各种方法实现的结构信息和分离,我们构建了一系列衍生的性状,以描述单甘醇酶促步骤和推定的蛋白质特异性糖基化图案(补充表S5和S6)(
      • clerc f.
      • 重新获得K.R.
      • Jansen B.C.
      • Kammeijer G.S.
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      人血浆蛋白N-糖基化。
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      基于高通量质谱的血浆N-Glyce分析与连锁特异性唾液酸酯化的自动化。
      )。

       方法可重复性

      所有方法都显示出在10个重复中分析的等离子体标准的鲁棒检测,UHPLC通常显示最少的变化和MALDI-TOF-MS补充图S2补充表S7)。具体地,主峰(A2G2S [6,6] 2或H5N4E2)显示为HILIC-UHPLC-FLD的CV(参与者2,其显示UHPLC方法中最低变化),用于XCGE-LEV为5.1% ,以及MALDI-TOF-MS为5.8%。进一步的实例包括Fa2(H3N4F1)的CV,分别为1.7%,13.8%和17.7%,A3G3S [3,6,6] 3为0.9%,10.3%和13.2%。总体而言,每种方法的10个最丰富的峰的平均CV为1.6%,6.9%和11.5%。对于MALDI-TOF-MS,大多数衍生的性状显示比构成特征的单个峰值更高的可重复性,其中由平均CV的50个最丰富的性状为2.6%,而对于非MS方法仍然是衍生性状的CV仍然存在类似于他们的组成峰。

       intermethod信号相关

      使用临床群组数据,我们可以探索哪些信号在正交方法中显示出类似的行为。为此,在所有单个信号的方法之间计算Pearson相关系数(Fig. 2),以及衍生的特征(补充图S3-S6)。注意,以这种方式获得的相关性是相似性的结果 N妊娠,RA和疾病活动的糖类行为以及在本研究中未占该研究的其他生物学和技术来源。因此,当信号含有相同的聚糖结构(单分离出)或当不同的聚糖经历相同的酶改性时发生阳性相关性(当不同的酶促改性时)(多次偏见,分享单个属性,例如抗洲岩藻糖基化)。由于酶底物和产品之间的关系,因此可能类似地产生负相关性(例如 半乳糖基化的方法在半乳糖基化和非甲酰基化物种之间产生负相关,蛋白质 - 丰度变化(例如 所有Diantennarary等诸如免疫球蛋白的所有Diantennarary物种的增加将导致所有三烯和四年期聚糖中的相对减少)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2热图可视化来自MALDI-TOF-MS,HILIC-UHPLC-FLD(参与者2)和XCGE-LIF的信号之间的PEARSON相关性。 (A)HILIC-UHPLC-FLD(水平)与MALDI-TOF-MS(垂直)。 (B)Xcge-Lif(水平)与MALDI-TOF-MS(垂直)。 (C)HILIC-UHPLC-FLD(水平)具有XCGE-LIF(垂直)。在临床数据上计算信号相关性,并且代表与妊娠和RA等生物表型的行为的相似性以及技术变异。十字架(X)表示相关性以下的相关性 p value of 1·10−5,而点(。)表示下面的相关性 p 价值0.05。对于非MS方法之间的类似热图和衍生的特征看 。 h = hexose,n = N - 乙酰己糖胺,f =脱氧糖(岩藻糖),L =(含叶)α2,3-连接 N - 乙酰呋喃酸,和E =(乙基酯化)α2,6-连接 N - 乙酰甘氨酸。
      在UHPLC方法之间观察到含有相同聚糖的峰的良好相关性,例如峰值5(Fa2;平均值 r = 0.90 S.D. ±0.07),峰值27(Fa2G2S [6,6] 2; r = 0.93±0.01)和峰34(A3G3S [3,6,6] 3; r = 0.90 ± 0.02) (补充图S4A-4C.)。横跨该方法相关的信号通常具有低强度。相应的XCGE-LEF注释也可见上述信号的强相关性, IE。 UHPLC峰5具有Xcge-Lif峰值31(Fa2; r = 0.96),27,7(Fa2G2S [6,6] 2; r = 0.87)和34,34(A3G3S [3,6,6] 3; r = 0.88) (补充图S4D)。在单个信号旁边,衍生的特征显示在方法之间具有高度可比性(补充图S5)。

       信号分配方法的互补性

      当使用MALDI-TOF-MS进行比较非MS方法的信号时,分析具有两个绝大正交方法的样本集的优点变得显而易见(Fig. 2)。例如,在几个情况下,模棱两可的非MS信号通过利用与MS的相关性来归因于特定的聚糖结构。这里的一个实例是色谱峰28,而理论上涵盖Fa2Bg2s [6,6] 2,Fa2Bg2s [3,6] 2和Fa2Bg2s [3,3] 2,与MALDI-TOF-MS组合物H5N5F1E2强烈相关(FA2BG2S [ 6,6] 2; r = 0.92)和具有H5N5F1L1E1的较小度(FA2BG2S [3,6] 2; r = 0.27)和H5N5F1L2(FA2BG2S [3,3] 2;未检测到)(Fig. 2A, 补充图S3)。类似地,通过相关性,XCGE-LiF峰值1可能含有H6N5E3(A3G3S [6,6,6] 3; r = 0.68),即使这不是主要注释电泳信号(Fig. 2B)。另一方面,结构特征可以根据非MS方法的作用归因于MALDI-TOF-MS组合物。例如,具有至少一种α2,3-连接的唾液酸的岩藻糖基化的三亚烷组合物用岩卷心 - 岩氧化物质强烈地相关,但不具有核 - 岩氧化结构, 例如 H6N5F1L1E2具有UHPLC峰38和Xcge-LiF峰值5(A3F1G3S [3,6,6] 3; r = 0.86且 r = 0.82),而不是UHPLC峰36(FA3G3S [3,6,6] 3; r = 0.10)。虽然核 - 岩藻糖基化结构仍然可能存在于MALDI-TOF-MS组成中,但似乎在群组内观察到的主要差异起代替于抗长期岩藻糖基化。
      在单个聚糖旁边,衍生的特征在MS和非MS方法之间显示出良好的重叠,但是由于信号的明确组成分配,可以为MS构建更大的这些。补充图S6)。

       与妊娠和ra联系

      在PARA研究中,我们对不同方法进行了比较,在整个妊娠期间观察到的糖基化变化(在妊娠,妊娠第三个三个月,产后26周),以及与RA病活动的关联如das28(3)-crp值表达。通过混合模型回归分析的显着发现的效果方向评估方法之间的可比性,并表示为盒子和散点图(Fig. 3)。对于所有分析,糖基化参数以零为零并缩放以表示单个S.D。变化。在研究范围的假发现率为5%(导致阈值α= 1.7·10,效果被认为是显着的−2)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3HILIC-UHPLC-FLD(参与者2)的可比性(剩下),Xcge-Lif(中间)和Maldi-Tof-MS(正确的)检测妊娠,RA和RA疾病活动的临床特征。 (A)单甘油信号(%面积)与妊娠的可比性(Precinception = PC,妊娠第三个三个月= TM3,26周,26次产后= PP3),RA(健康=白色,RA =灰色)。 (B)衍生糖基化性状具有妊娠和RA的糖基化性状的可比性。 (C)通过单一的妊娠和RA唯一检测到衍生的性状差异。 (D)衍生的糖基化性质与Ra疾病活性的关系(DAS28(3)-CRP)。对于派生特征的传说看 .
      怀孕表明对TSNG产生了重大影响,并通过所有方法观察到一致的效果(补充表S8),用于单个聚糖(Fig. 3A)和衍生的特征(Fig. 3B)。值得注意的实例包括妊娠的Fa2减少,如Hilic-Uhplc-FLD(参与者2整个)峰值5(β= -2.32 SE±0.38),Xcge-Lif峰31(β= -2.37±0.39)和Maldi -TOF-MS组合物H3N4F1(β= -2.34±0.43),并且相应地增加了IgG-Fc(A2FS0G;分别,β= 1.62±0.27,β= 1.92±0.31, β= 1.67±0.28)(
      • clerc f.
      • 重新获得K.R.
      • Jansen B.C.
      • Kammeijer G.S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      人血浆蛋白N-糖基化。
      )。同样,所有方法都表明唾液酸化司管种类的平二分,可能代表非IgG-Fc免疫球蛋白糖基化(A2FSB,β= -3.10±0.48,β= -1.55±0.26,β= -1.81±0.29) (
      • clerc f.
      • 重新获得K.R.
      • Jansen B.C.
      • Kammeijer G.S.
      • 邦德A.
      • Wuhrer M.
      人血浆蛋白N-糖基化。
      )。
      有趣的是,其中一个主要 N - 甘露甘露甘蔗用妊娠改变,即完全α2,3-唾液酸化的A3F1G3S [3,3,3] 3,只有唯一可分离的MALDI-TOF-MS组合物H6N5F1L3(β= 1.61±0.26),但也可能驱动模糊分配的UHPLC信号33(β= 2.92±0.43)和Xcge-Lif信号3(β= 1.31±0.24)中的变化。然而,由于保持和迁移时间重叠,只能为MALDI-TOF-MS(β= 2.57±0.40)建立Triantennarary物种(A3GL)上的α2,3-连接的唾液化的衍生性状(Fig. 3C)。另一方面,HILIC-UHPLC-FLD,怀孕术语术语是单亚乳糖基化的半乳糖和二割的半乳糖位置的强烈差异 N-glycan物种(例如 相对6臂半乳糖基化,Fa2 [R6] BG1,β= -9.41±2.42),而Xcge-Lif可以唯一地检测单一年内物种的Glcnac位置的变化(例如 相对6臂GlcNAc位置,A1 [R6] G1,β= 1.96±0.31)。
      RA患者与健康对照之间的差异在于怀孕期间的差异而被证明不那么明显,但在方法中类似地检测到。混合逻辑回归用于将糖基化参数与Ra(健康= 0,Ra = 1)进行比较,通过对每个时间点进行随机截距来校正妊娠(补充表S9)。 RA患者显示常见于IgG-Fc(A2FS0G,用于HILIC-UHPLC-FLDβ= -1.89±0.36的聚糖的含半乳溶胶化,用于Xcge-LiFβ= -1.85±0.36,以及MALDI-TOF-MS β= -1.78±0.36),较高平等唾液酸化岩藻糖基化的二环物质(A2FSB,β= 1.25±0.31,β= 0.53±0.21,β= 0.88±0.26)(Fig. 3B)。通过HILIC-UHPLC-FLD和MALDI-TOF-MS检测到具有较高平等的伴随的非粘结的非缀合化的司管物质(A2F0SOB,分别β= 1.11±0.28和β= 0.69±0.20)。来自Maldi-Tof-MS的缺席,但对于非MS方法存在的是分支的差异,以降低复杂性 N - Glycans,即Hilic-Uhplc-FLD,单亚乳糖基化和唾液酸唾液酸雌乳糖物种的相对6-分支半乳糖基化合物(FA2 [R6] BG1S1,β= -0.90±0.30)和Xcge-Lif的单一长年体的抗洲分支(A1 [R6] G1,β= -1.05±0.28)(Fig. 3C)。
      最后,使用线性回归来利用糖基化(独立)与DAS28(3)-CRP(依赖)的关联。此外,混合线性回归与每单独的随机截距一起使用,以评估整个妊娠的关联或每时间点随机截距来评估个体之间的关联。这些不同的型号提供了高度全等的调查结果(补充表S10)。总而言之,对于每种方法,在DAS28(3)-CRP和IgG-Fc型半乳糖基化(A2FS0G,HILIC-UHPLC-FLDβ= -0.51±0.11,Xcge-Lifβ= -0.51±0.11 ,MALDI-TOF-MSβ= -0.50±0.11)(Fig. 3D)。随着疾病活动的增加证明是三合一体结构的岩藻糖基化(A3F,β= 0.50±0.11,β= 0.33±0.12,β= 0.38±0.12),以及其唾液化(A3Sβ= 0.52±0.11,A3FS β= 0.23±0.12(趋势),A3FGSβ= 0.41±0.12)。 MALDI-TOF-MS分析具体表明,岩藻糖基化和唾液酸化的增加类似于三年和四月(例如 A4FEβ= 0.42±0.12)并显示在这些增加中没有唾液酸连杆偏倚(例如 A3EFβ= 0.39±0.12 相对 A3LFβ= 0.40±0.12)。另一方面,HILIC-UHPLC-FLD再次能够检测与变化的疾病活动(FA2 [R6]G1S1β= -0.34±0.12)检测显着的分支差异,而XCGE-LEV显示出单一长年体的较高分辨率(例如 A1Fβ= 0.48±0.14)。

      讨论

      以前的方法比较涉及发布的分析 N - 单蛋白的糖粉和糖肽,例子是IgG,前列腺特异性抗原和转铁蛋白(
      • 霍夫曼J.E.
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      治疗免疫球蛋白G分析方法的比较 - 第1部分:基于分离的方法。
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      分析糖蛋白聚糖 - HUPO人类疾病糖类/蛋白质组倡议多机构研究的比较方法。
      )或分析有限数量的复杂样品(
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      从培养细胞系中分析N-和O型聚糖的分析方法的比较:Hupo人类疾病糖类/蛋白质组倡议多制度研究。
      )。在目前的研究中,我们主要专注于具有展示的高通量能力的方法。我们选择了对发布的分析 N - 来自血清糖蛋白总池的糖粉,对生物标志物筛选的样本类型的感兴趣,并且可以显示 N-glycosylation的相当复杂性(
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      • Ruhaak L.R.
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      • STAM J.C.
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      • Slagboom P.E.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      通过高通量糖基化谱系的靶向生物标志物发现人血浆α1-抗酸胰蛋白酶和免疫球蛋白A.
      )。这些研究的技术考虑包括分析物稳定性和准备和测量吞吐量,以及用于整合和分析的软件解决方案,其所有大型数据集,所有这些都已经明显地解决了所指示的技术。为了理解方法的技术可能性和限制,需要考虑它们的分离机制。 1)HILIC-UHPLC-FLD基于其与固定相的亲水性相互作用分离聚糖结构,通常意味着具有较大的结构以及具有较大表面积或充电的结构 N - 乙酰呋喃酸酸,具有增加的保留时间(
      • Hemströmp.
      • Irgum K.
      亲水相互作用色谱。
      )。 2)在Xcge-Lif Glycans中,沿着聚合物填充毛细管内的电场分开,根据它们的质量/电荷(m / z.)比例及其尺寸/形状(流体动力直径)。较低的分析物 m / z. (更高的电荷和/或较低质量)通过比具有更高的毛细管更快地迁移 m / z. (
      • Hennig R.
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      使用标准DNA测序设备的超敏性分析和N型寡糖的序列。
      )。 3)MALDI-TOF-MS将电离聚糖分离(这里[M + NA]+) 经过 m / z. 与用于稳定唾液酸的酯化方法以防止唾液酸化物质中不利的负电荷,并在α2,3-(含叶酰胺化)和α2,6-连接(乙基酯化)唾液酸之间引入不利的负电荷以引入不利的负电荷。
      • 重新获得K.R.
      • 空白D.
      • kuijper d.m.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      MALDI-TOF-MS采用纺合特异性唾液酸酯化蛋白质N-糖基化的高通量分析。
      )。
      在该比较研究中,我们根据技术复制测量来判断HTP TSNG方法的相对性能,以及来自怀孕期间RA患者内疾病活动的纵向研究的一组样本(
      • 德曼y.a.
      • Dolhain R.J.
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      • Willemsen S.P.
      • Hazes J.M.
      怀孕期间类风湿性关节炎的疾病活性:全国范围的前瞻性研究结果。
      )。

       吞吐量和可重复性

      样品制备通量在方法之间证明是类似的,它们中的每一个需要(过夜)酶促 N - 在分析之前,甘油还原末端或唾液酸中的1-2-H化学衍生化,在唾液酸中,以及HILIC固相萃取。报告了Hilic-UHPLC-FLD和MALDI-TOF-MS工作流程的自动样品制备(
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
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      • Bladergroen M.R.
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      • van der burgt y.e.
      基于高通量质谱的血浆N-Glyce分析与连锁特异性唾液酸酯化的自动化。
      )但协议中的一致性建议XCGE-LIF可以利用类似的策略。除了样品制备外,MALDI-TOF-MS显示出最高的分析产量,每种样品的10 s的近似的产量近似,而XCGE-LIF和UHPLC需要40分钟至一小时。 XCGE-LIF的主要优点是多路复用能力(含有高达96个毛细血管),允许同时分析多达96个样品,这将每个样品的有效分析时间降低至小于30秒。
      被证明的最可重复的方法是HILIC-UHPLC-FLD(尽管参与者之间的变化),而MALDI-TOF-MS显示出最具技术的变化。有趣的是,虽然MALDI-TOF-MS方法的可重复性确实导致了对生物效应的更大的S.SS,但统计显着性的相应降低(增加 p 价值通过通常一个或多个数量级,在实践中,由于缺乏统计功率,在这项研究中拒绝了很少的发现。因此,MALDI-TOF-MS的可重复性似乎不会阻碍较大的群组的含量分析,但非MS方法的可重复性肯定是有益于量化小效果尺寸的益处。
      兴趣,而Maldi-Tof-MS可重复性对于衍生性状较高,这通常是化学上相似的分组 N-Glycan物种,对于HILIC-UHPLC-FLD或XCGE-LIF没有观察到这种改进。这将建议存在测量误差的特定MS特定组件,可能是相对电离效率或响应线性,这两者都可以使用内部标准来控制(
      • 锣B.
      • Hoyt E.
      • Lynaugh H.
      • Burnina I.
      • 摩尔R.
      • 汤普森A.
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      N-糖基胺介导的同位素标记,用于质谱基于基于质谱的N键聚乙醇的定量分析。
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      • 皮尔斯米
      • 奥兰多R.
      用13CH3I通过同位素渗透化合物的相对定量聚糖的相对定量。
      )。

       分析物分离和注释

      虽然Maldi-Tof-MS没有主要分开所有 N-glycans但只有具有不同化学成分的那些,Hilic-UHPLC-FLD和Xcge-Lif都会产生独特的标准化保留时间,分别为具有不同结构的聚糖的含量迁移时间。然而,虽然MS分析提供了分辨率以分离大多数可能的组合物,但对于非MS方法,虽然非MS方法,但大部分的甘油结构未与其他分析物分离。因此,只有HILIC-UHPLC-FLD和XCGE-LEV能够揭示其色谱图的低复杂度(IGG-FC)区域的附加特征,或者在TSNG的分析中, 例如N - 乙酰葡糖胺连杆(抗洲或分发),半乳糖位置(α1,3或α1,6分支)和岩藻糖位置(核心或天国)。另一方面,MALDI-TOF-MS证明了较大的甘草结构最具信息量( 例如 例如,在三年度和四年度物种上),例如在LACNAC单位(天数)的确切数量,荧光环晕的数量和数量和连杆 N - 乙酰甘氨酸。为了概括,在分析模式中,HILIC-UHPLC-FLD和XCGE-LIF对于低复杂性样品的高密度结构鉴定出现了最佳, 例如 免疫球蛋白糖基化,是来自血液或大多数常用的重组生产系统,而马尔迪-TOF-MS出现优先适用于分析具有高复杂性和/或更大的样品 N-glycan物种。
      通过包括更多实验尺寸,所以描述的方法可以通过包括更多实验尺寸来获得与聚糖的额外结构信息。人们可以想到分离技术的在线连字符,包括LC-MS(/ MS),CE-MS(/ MS)和离子移动MS的实例(
      • 周S.
      • 董X.
      • Veillon L.
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      • Mechref Y.
      LC-MS / MS分析促进异构特征的渗透氮化的N-聚糖。
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      • Guttman M.
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      通过离子迁移光谱法测定唾液酸连杆异构体的特异性定位。
      )或异糖苷酶消化等离线方法(
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      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      )。在增加信息内容的同时,这些增加的尺寸也大大增加了分析时间和数据复杂性,并且迄今为止仅报告了相对较小的样本集。然而,随着快速甘草制剂的进步,实验室自动化和大数据分析方法的演变,采用这些创新方法在不同糖蛋白水平上的较大样本集合中采用这些创新方法的HTP实验室的想法可能不会太远。如今,对于HTP应用程序更常见的是一种或多个样本的彻底结构注释,期望这些是该组的代表性,例如通过超糖糖苷酶消化或MS / MS实验实现(
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
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      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
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      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      人血浆的N-甘氨酸。
      )。有趣的是,我们的研究表明,通过正交HTP方法的平行族分析允许确定许多样本相关的结构特征,而不必包括吞吐量限制串行连通的步骤。一个突出的例子是与组合物H5N5F1E2相关的结构Fa2Bg2S2,其中Hilic-Uhplc-FLD和Xcge-Lif确定了核 - 岩藻糖基化和二分,而MALDI-TOF-MS确定α2,6-连接 N - 乙酰甘氨酸酸(补充图S3B.S3C)。

       临床观察

      在两者之间发现的关联 N - 糖基化和妊娠,RA和RA病活动(DAS28(3)-CRP)非常符合以前的TSNG研究(
      • Jansen B.C.
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      通过高通量Maldi-Tof-MS研究的妊娠相关血清N-Glycome改变。
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      怀孕期间的总血浆N-Glycome变化。
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      类风湿性关节炎和初级骨关节炎与总血清IgG的糖基化模式的变化。
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      血清蛋白N-糖基化与妊娠期间和妊娠后的类风湿性关节炎疾病活动发生变化。
      ),并同意关于人血清中占单糖蛋白的报告(
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      免疫球蛋白G的半乳糖基化与妊娠期间的类风湿性关节炎之间的关系与唾液酸化无关。
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      免疫球蛋白G(IgG)Fab糖基化分析采用新的质谱高通量分析方法揭示了妊娠相关的变化。
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      炎症诱导的SiaLyl Lewisx的表达不限于α1-酸糖蛋白,但在α1-antichymotrypsin和Haptoglobin的程度上也发生在较小程度上。
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      严重的类风湿性关节炎禁止妊娠诱导的α3-酸糖蛋白的α3-岩藻糖苷的降低。
      )。妊娠的主要发现包括增加的天数,不酸化的FA2半乳糖基化,以及α2,3-连接的唾液化以及唾液酸化Fa2的降低。与Ra的个体被证明平均Fa2的半乳糖基化和较高的二分,与其健康的对应物相比,Ra的疾病活性与A3 / A4正面相关的Ra,用于岩藻糖基化和唾液酸化(无需特别偏好)和与半乳糖基化的含量负相关FA2。
      与释放的TSNG的所有分析一样,这里报道的差异可能来自蛋白质糖基化的变化,或来自血清中糖蛋白相对丰度的差异。尽管如此,改变的糖基化表型似乎反映了IgG-Fc的免疫调节(主要是非缀合的Fa2)(
      • clerc f.
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      • Jansen B.C.
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      免疫球蛋白G(IgG)Fab糖基化分析采用新的质谱高通量分析方法揭示了妊娠相关的变化。
      ),IgG-Fab和其他血浆细胞衍生的免疫球蛋白(高唾液酸化Fa2)(
      • clerc f.
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      免疫球蛋白G(IgG)Fab糖基化分析采用新的质谱高通量分析方法揭示了妊娠相关的变化。
      )或急性期糖蛋白,例如α-1-抗酸蛋白和α-1-酸糖蛋白(三年期)(
      • clerc f.
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      • choi y.j.
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      • SEO J.
      • CHO J.Y.
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      使用LC-MS / MS从间隔式研究表征α-1-酸糖蛋白的位点特异性N-糖肽同种型。
      )。此外,先前报道的MALDI-TOF-MS与DAS28(3)-CRP的A3FGS关联(
      • 重新获得K.R.
      • vreeker G.C.M.
      • 邦德A.
      • Bladergroen M.R.
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      • van der burgt y.e.m.
      • Wuhrer M.
      • Dolhain R.
      血清蛋白N-糖基化与妊娠期间和妊娠后的类风湿性关节炎疾病活动发生变化。
      ),虽然其原产蛋白质尚不清楚。
      有趣的是,HILIC-UHPLC-FLD和XCGE-LIF允许新的结果对妊娠和RA疾病活动发生的糖基化变化,以单亚乳糖溶胶化和单南万年物种的分支差异的形式。例如,妊娠,例如,检测α1,6-分支(与α1,3-分支)检测到非直木单溶胶化的Fa2的α1,6-支链(与α1,3-分支)的增加和二分配变体的降低的α1,6-支链半乳糖基化。与RA疾病活动相同的表型与RA疾病活性相反,主要与妊娠观察的DAS28(3)-CRP减少(
      • 德曼y.a.
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      • Willemsen S.P.
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      怀孕期间类风湿性关节炎的疾病活性:全国范围的前瞻性研究结果。
      )。这些观察结果可以是改变糖基转移酶表达或调节的结果,但是一个有吸引力的替代解释可能是怀孕期间相对IgG - 亚类丰度的转变(
      • 威尔逊R.
      • 麦克莱恩M.A.
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      具有经常性流产史的妇女的异常免疫球蛋白亚类模式。
      )。作为IgG2和IgG3显示高于α1,6-分支半乳糖基化的α1,3-分支半乳糖基,这与IgG1和IgG4相反(
      • 杰弗里斯r.
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      人IgG亚类蛋白N-连接寡糖结构的比较研究。
      ),报告的IgG2和IgG3的相对增加与怀孕会导致我们观察到Tsng中的联系变化(
      • 威尔逊R.
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      • Jenkins C.
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      具有经常性流产史的妇女的异常免疫球蛋白亚类模式。
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      妊娠期间α1-酸糖蛋白,α1-抗酸糖蛋白,白蛋白,白蛋白,C-反应蛋白,IgA,IgG和IgM的参考值。
      )。

       概括

      总之,我们比较了HILIC-UHPLC-FLD,XCGE-LIF和MALDI-TOF-MS的性能,用于分析释放的血清蛋白 N-glycome。在提供方法之间的技术和生物学翻译,我们讨论了它们的优缺点,包括它们各自的吞吐量和重复性(表III.)。此外,我们探讨了TSNG内各种糖基化类型的信息含量的差异,并推测了方法表征不同样品类型的适用性。具有正交HTP方法的组合分析证明对TSNG的研究具有高度信息,并且在确认先前发现的旁边具有LED,以发现与RA和疾病活动相关的新的糖基化性状。
      表III.研究结果概述
      方法信息好处缺点样本适用性
      HILIC-UHPLC-FLD结构的最佳重复性;建立的数据库;良好的A2分离A3 / A4信号重叠;没有小说注释
      a 通过随后的实验可以获得附加信息,例如超糖糖酶测序和串联MS。
      血浆细胞糖蛋白或混合物(免疫球蛋白; A2聚糖)
      XCGE-LIF.结构的由于复用引起的吞吐量;良好的A2分离A3 / A4信号重叠;没有小说注释
      a 通过随后的实验可以获得附加信息,例如超糖糖酶测序和串联MS。
      血浆细胞糖蛋白或混合物(免疫球蛋白; A2聚糖)
      MALDI-TOF-MS组成;唾液酸连锁最好的吞吐量;组成注释;不常见的信号重叠;良好的A3 / A4分离;衍生的特征最低的重复性;没有结构信息
      a 通过随后的实验可以获得附加信息,例如超糖糖酶测序和串联MS。
      肝细胞糖蛋白(急性期蛋白; A3 / A4聚糖);未知样本
      a 通过随后的实验可以获得附加信息,例如超糖糖酶测序和串联MS。

      数据可用性

      致谢

      我们要感谢Gerda Vreeker,Marco Bladergroen和Yuri Van der Burgt为测量Maldi-Tof-MS数据提供帮助。

      补充材料

      参考

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