糖蛋白素:频繁的基因多态性影响人血清蕨类植物/α-2-HS-糖蛋白的糖基化图案[S]

  • Yu-Hsien Lin
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    生物分子质谱和蛋白质组学,博物馆生物分子研究和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰

    §Netherlands蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰
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  • 荆珠
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  • 桑德梅耶
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    ¶分子和细胞止血,三柴研究,阿姆斯特丹1066 CX,荷兰
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  • vojtech法郎
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  • Albert J.r. Heck.
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  • 作者脚注
    [S]本文包含补充数据和表格。
      Fetuin,也称为α-2-Hs-糖蛋白(基因名称:AHSG),是较多丰富的糖蛋白分泌到血液中。人类AHSG的两个经常发生的等位基因,导致三种基因型(AHSG * 1,AHSG * 2和杂合AHSG1 / 2)。由AHSG * 1和AHSG * 2基因编码的胎蛋白的骨架氨基酸序列在两个氨基酸中不同,包括一种已知的O-糖基化位点(AA位置256)。虽然已经过广泛研究了蕨类植物水平,但在这种分析中通常忽略起源基因型。由于Fetuin被反复提出了几种疾病的潜在生物标志物,所以基因多态性影响蕨类植物概况的问题是极大的兴趣。在这项工作中,我们描述了芬芳的详细蛋白质形式谱,从10个健康和10名患者个体的血清中分离出来,并调查潜在的糖蛋白核元素相关性,例如基因多态性如何影响糖基化。我们建立了胎儿纯化的有效方法'使用离子交换色谱法的血清。随后,我们进行了与本地质谱和以肽为中心的MS分析集成数据的混合质谱方法。我们的数据揭示了基因多态性对Fetuin糖基化模式的关键影响。此外,我们清楚地观察到源自脓毒症患者的样品中的岩藻糖基化增加。我们的血清蛋白质分析靶向,靶向从20个个体获得的一种蛋白质,暴露蛋白质型谱的宽变异性,当使用Fetuin作为生物标志物时应该考虑到这一点。重要的是,聚焦在单个或少量蛋白质上,定量蛋白质谱可以提供如下所示,已经充足的数据通过基因型和疾病状态对个体进行分类。

      图形概要

      人胎素,也称为α-2-Hs糖蛋白,是人血浆中循环的丰富糖蛋白。在成年人中,弗顿几乎完全被肝脏分泌(
      • ix J.H.
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      • 勃兰登堡五五
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      人类蕨类植物和代谢综合征之间的关系:来自心灵和灵魂研究的数据。
      )但许多其他细胞可以产生这种蛋白质(
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      组织分布和活性测试表明Fetuin-B和Fetuin-A的类似但不相同的功能。
      )。自1944年的发现以来,人类蕨类植物已经归因于各种生物学职能,但对其确切角色的具体了解仍然是穷人。一种广泛接受的功能是其在钙和磷酸盐代谢中的作用。 Fetuin作为预防异位矿物沉淀和沉积中的基本抑制剂之一(
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      Fetuin-A在矿物贩运和沉积中的作用。
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      Fetuin-钙化基质代谢的调节。
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      透析患者心血管死亡率血清中低胎素-A(AHSG)浓度的关联:横截面研究。
      )。此外,若干研究表明循环胎素水平和炎症和慢性病之间的相关性,例如内毒素血症和败血症(
      • 王H.
      • Sama A.E.
      胎儿毒性损伤和感染的抗炎作用。
      ),心血管疾病(CVD)
      使用的缩写是:
      CVD.
      心血管疾病
      ABC.
      碳酸氢铵
      amac.
      醋酸铵
      ACN.
      乙腈
      asn.
      芦笋
      弱阳离子交换
      CKD.
      慢性肾病
      Dhex.
      脱氧呼吸道
      EMR.
      扩展质量范围辐射加玻璃仪器
      埃莉莎
      酶联免疫吸附试验
      ESI
      电喷雾电离
      ethcd.
      电子转移与更高能量的碰撞解离
      F A
      甲酸
      GLCNAC.
      N-乙酰葡糖胺
      赫奈克
      N-乙酰己糖胺
      IAA.
      碘乙酰胺
      IEX.
      离子交换色谱
      insr.
      胰岛素受体
      遇见
      甲硫氨酸
      小姐
      质谱
      Neu5Ac
      N-乙酰尿胺酸
      ph
      磷酸化
      PTMS.
      翻译后修改
      丝氨酸
      SNPS.
      单核苷酸多态性
      T2DM
      2型糖尿病
      thr
      苏氨素
      XIC.
      提取离子色谱图
      弱阴离子交换。
      1使用的缩写是:CVD.
      心血管疾病
      ABC.
      碳酸氢铵
      amac.
      醋酸铵
      ACN.
      乙腈
      asn.
      芦笋
      弱阳离子交换
      CKD.
      慢性肾病
      Dhex.
      脱氧呼吸道
      EMR.
      扩展质量范围辐射加玻璃仪器
      埃莉莎
      酶联免疫吸附试验
      ESI
      电喷雾电离
      ethcd.
      电子转移与更高能量的碰撞解离
      F A
      甲酸
      GLCNAC.
      N-乙酰葡糖胺
      赫奈克
      N-乙酰己糖胺
      IAA.
      碘乙酰胺
      IEX.
      离子交换色谱
      insr.
      胰岛素受体
      遇见
      甲硫氨酸
      小姐
      质谱
      Neu5Ac
      N-乙酰尿胺酸
      ph
      磷酸化
      PTMS.
      翻译后修改
      丝氨酸
      SNPS.
      单核苷酸多态性
      T2DM
      2型糖尿病
      thr
      苏氨素
      XIC.
      提取离子色谱图
      弱阴离子交换。
      ,2型糖尿病(T2DM)(
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      新发病型糖尿病患者的血浆胎素-A和临床特征的关联。
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      Fetuin-A和肝酶的血浆水平和美国女性患者2型糖尿病的风险。
      )和慢性肾病(CKD)(
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      血清蛋白α2-甲醇 - 乳酸糖蛋白Fetuin-A是一个系统上的异位钙化抑制剂。
      ),提高其用作蛋白质生物标志物的兴趣。
      健康人体中血清或血浆胎素的值范围为300至750μg/ ml(
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      延长释放烟酸降低血清胎素 - 一种代谢综合征中的个体中的浓度。
      )。蕨类素浓度似乎与性别无关,但血清胎素水平与年龄相关,也可能受到遗传背景的影响(
      • VörösK.
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      • HAME M.
      • assal h.
      • KORA H.
      Fetuin-A肥胖症水平:与代谢综合征有关的差异和与临床和实验室变量的相关性。
      )。胎儿基因(AHSG)的高度频繁的遗传多态性,由两种常见的等位基因AHSG * 1和AHSG * 2产生,已经在三十年前描述(
      • Cox D.W.
      • 安德鲁斯B.J.
      • 遗嘱D.E.
      α2HS-糖蛋白的遗传多态性。
      )。基因组分析表明,AHSG * 1等位基因分别在248和256的两个氨基酸中不同于AHSG * 2。 AHSG * 1等位基因的特征在于ACG(THR248)和ACC(THR256),而AHSG * 2等位基因的特征在于ATG(MET248)和AGC(SER256)(
      • Osawa M.
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      人α2-HS糖蛋白(AHSG)多态性的分子证据。
      )。这两种富有的AHSG等位基因导致三种常见基因型(AHSG * 1,AHSG * 2和杂合AHSG1 / 2)。这三种基因型的人口分布在全球范围内变化。来自多种调查的可用数据证明AHSG * 1在最重要的胎儿基因型(
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      AHSG标签单核苷酸多态性与2型糖尿病和血脂血症:7,683名白丹麦受试者中代谢性状的研究。
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      人α2-盐施密蛋白(AHSG)多态性与韩国女性的子宫内膜异位症之间的关系。
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      土耳其人群样本中15蛋白多态性的研究。
      )。例如,发现697个无关意大利人中AHSG * 1,AHSG1 / 2和AHSG * 2的分布约为0.56:0.36:0.08(
      • Cerri N.
      • de Ferrari F.
      伦巴第(意大利)α-2-HS糖蛋白的遗传多态性。
      )。一些研究已经试图探讨这种胎儿基因多态性与某些疾病之间的潜在相关性,然而,报告的数据并非非常定理(
      • 尹l。
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      新发病型糖尿病患者的血浆胎素-A和临床特征的关联。
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      Fetuin-A肥胖症水平:与代谢综合征有关的差异和与临床和实验室变量的相关性。
      )。
      人胎素是糖蛋白及其初级结构和糖基化曲线已描述(
      • Elzanowski A.
      • Barker W.C.
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      • Seibel-Ross E.
      亚α-2-Hs-糖蛋白和胎蛋白中的胱抑素域。
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      • Araaki T.
      • Yoshioka Y.
      • 施密克。
      二硫键在人血浆α2HS-糖蛋白中的位置和域结构中的重复双二硫键。
      )。然而,Fetuin的主要结构是以某种方式难以捉摸的并且报告的差异导致困惑尤其与肽(连接肽)在成熟的人胎素中的缺失/存在相关。根据我们最近的工作(
      • 林Y.H.
      • Franc V.
      • heck a.j.r.
      相似尽管不一样:深入分析人血清,牛血清和重组人胎素的蛋白质ort。
      ),人胎素的主要结构含有连接肽,不同于学习的牛蕨类植物。成熟的人胎素包含与连接肽的A链,连接到较小的B链 通过 单次二硫键。用各种后期改性(PTM)来修饰人胎素;它患有几种N-和O-糖基化和一些磷酸化,产生蛋白质常规的复杂混合物。更详细地,人胎素在A链中的两个N-糖基化位点和两个糖基化位点,B链中的一个O-糖基化位点(
      • 林Y.H.
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      相似尽管不一样:深入分析人血清,牛血清和重组人胎素的蛋白质ort。
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      • Wuhrer M.
      • RAPP E.
      人血浆蛋白的特异性O-糖基化分析。
      )。有趣的是,一个A链O-Glycan位于AHSG * 1基因型中的位置Thr256位置,这正是涉及最常见的基因多态性的位点。是否在AHSG * 2中替换SER在AHSG * 2中的位置256的替代物影响Fetuin的糖基化模式尚未得到解决。在这种情况下,Thr至偏换仍然允许氨基残基是O-糖基化的。通常,PTM可以调节蛋白质结构并在调节蛋白质的稳定性和物理化学性质方面发挥关键作用(
      • 螺罗..
      蛋白质糖基化:性质,分布,酶形成和糖肽键的疾病影响。
      ,
      • SEO J.
      • Lee K.-J.
      翻译后修改及其生物功能:蛋白质组学分析和系统方法。
      因此,需要详细研究蛋白质常规轮廓。人为胎素被认为是某些代谢疾病的生物标志物,但通过各种商业酶联免疫吸附测定(ELISA)的定量分析已被发现是有问题的(
      • 史密斯e.r.
      • 福特M.L.
      • Tomlinson L.A.
      • 岩石b.f.
      • Rajkumar C.
      • 霍尔特S.G.
      血浆Fetuin-A的商业elisas之间的差差:蛋白质糖基化的作用?临床。
      ),我们假设化可以部分地与AHSG * 1和AHSG * 2的糖基化模式的差异部分。
      因为胎儿也被称为负急性相反应物,所以血浆中蕨类素水平与免疫反应之间的关系也相当令人感兴趣。急性期蛋白的糖基化模式可以响应诸如癌症的疾病而变化(
      • 基金A.
      • Utratna M.
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      基于糖基化的血清生物标志物,用于癌症诊断和预后。
      在急性炎症期间。因此,异常糖基化模式与疾病的发育或进展有关(
      • Gornik O.
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      炎性疾病中血清蛋白的糖基化。
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      急性期蛋白质糖基化与焦点对α-1抗胰蛋白酶在急性和慢性炎症条件下的作用和重要性。
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      • napolitano p.g.
      • 摊位J.D.
      • IPPolito D.L.
      严重预液位胰岛血浆蛋白的异常糖基化促进单核细胞粘附。
      )。例如,已经在哈达氟胺,α-1-antiChymotrypsin和α-1-酸糖蛋白上观察到SiaLyl-Lewis X抗原的升高表达,响应于败血症(
      • Brinkman-van der Linden e.c.M.
      • van oommen e.c.r.
      • 范迪吉克W.
      α1-酸糖蛋白在脓乳酸中的糖基化:分支程度的变化及SiaLyl Lewisxgroups的表达。
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      • Brinkman-van der Linden e.c.
      • de haan p.f.
      • Havenaar e.c.
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      炎症诱导的SiaLyl Lewisx的表达不限于α1-酸糖蛋白,但在α1-antichymotrypsin和Haptoglobin的程度上也发生在较小程度上。
      )。虽然之前已经获得了这些急性期蛋白的特异性N-Glycan型材,但据我们所知,在急性和慢性炎症期间没有研究在胎儿中发生的糖基化变化。
      在这里,我们的目标是描述胎儿的植物型谱直接从健康和脓毒症患者个体血清中分离出来,并填补这些知识间隙,从而尤其关注糖蛋白蛋白酶体相关性, 例如 基因多态性如何影响糖基化曲线。这代表了一个具有挑战性的任务,而不仅仅是因为胎素的复杂的植物曲线曲线,而且因为必须从人血清纯化,这含有几种更丰富(Glyco)蛋白质。我们最近证明了使用最先进的混合质谱(MS)方法,组合高分辨率本地MS和以肽为中心的MS,我们可以全面地表征各种治疗和血清糖蛋白上的所有PTMS(
      • 杨Y.
      • 刘F.
      • Franc V.
      • 哈利姆L.A.
      • Schellekens H.
      • heck a.j.r.
      糖蛋白分析中的杂交质谱分析及其在刻划生物纤照中的用途。
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      • Franc V.
      • 朱茹
      • heck a.j.r.
      杂交质谱法综合蛋白质补体组分C8αβγ的综合蛋白质形式表征。
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      • 杨Y.
      • heck a.j.r.
      人血清补体组分C9的蛋白质Oform谱测定,揭示了N-,O-和C-糖基化的意外新特征。
      )。我们以前还报道了从三种不同的生物来源获得的非常明显的植物植物谱,即来自大量供体的血浆衍生的人类蕨类植物,在HEK-293细胞和牛芬内表达的重组人(
      • 林Y.H.
      • Franc V.
      • heck a.j.r.
      相似尽管不一样:深入分析人血清,牛血清和重组人胎素的蛋白质ort。
      )。在这里,我们首先阐述了后一种研究,重点关注来自个体的蕨类植物。因此,我们首先使用一步混合模式离子交换色谱分级(IEX)从几个个体的血清(健康和脓脓毒患者供体)中纯化内源性芬素。(
      • Havugimana P.C.
      • 黄P.
      • Emili A.
      通过使用双柱离子交换高性能液相色谱法通过样品预分馏改善蛋白质组学发现。
      )随后对蛋白质形式谱进行深入表征。我们介绍了一种基于从糖肽的测量收集的数据收集的数据的半自动分配本机MS光谱的算法。我们的数据首次揭示了基因多态性对蕨类植物糖基化图案的显着效果,当蕨类植物将用作生物标志物时需要考虑。基于这些知识,我们可以从20个个人获得并注释Fetuin的完整蛋白质谱图。这些蛋白质常规型材允许分类为三种不同的基因型。同时,看着芬芳从10个健康的个体供体和10个脓肠柄患者供体纯化,我们观察到显着增加的岩氧化,特别是在源自脓毒症患者的样品中的岩藻糖基化,特别是在现场N176中。我们的血清胎素分析明显暴露在各个植物型材上的广泛变化。然而,我们证明这些胎素蛋白质谱可以提供可用于通过基因型和疾病状态对个体进行分类的数据。

      实验步骤

       化学品

      Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany)购买二硫代噻唑(DTT),三氟乙酸(TFA),甲酸(ABC),碳酸氢铵(AMAC)和醋酸铵(AMAC)。用作参考标准的胎儿样品从人血清样品池中纯化,并从Sigma(α-2-Hs糖蛋白; Uniprot Coder:P02765,Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)中获得。乙腈(ACN)购自BioSolve(Valkenswaard,荷兰)。从Promega(麦迪逊,WI)获得测序级胰蛋白酶。 Gluc-C是从Roche(印第安纳波利斯)获得的。

       单个血清样本

      来自10个匿名健康捐赠者的个体血清由Sanquin Research提供,荷兰阿姆斯特丹提供。在知情同意后并按照Sanquin的道德委员会获得等离子体样本。每个单独的全血都收集在9ml吸尘器管(Greiner Bio-One,Kremsmunster,奥地利)中含有Z血清凝块活化剂。然后整个血液在室温下未分配30-60分钟。通过1800×离心除去凝结材料 g 在室温下持续20分钟,将血清转移为1ml等分试样以清洁1.5ml Eppendorf管,在液氮中旋转冻结并储存在-80℃。来自10名脓毒症患者的人类血清样本是从美国哥伦布,哦,美国的发现生命科学获得。将所有血清样品储存在-80℃直至分析。

       实验设计与统计理由

      我们纯化了芬芳,并对20个个体(10个健康供体和10例患者供体)获得的血清蕨类植物为中心的MS分析。我们的质谱数据表明,每个Fetuin基因型都包含独特的特征。这些特征存在于所有20血清样品中,用于将供体的分类(使用Pearson相关系数)进入其基因型。在基因型分类之后,我们研究了健康和化粪池之间的岩氧化酶的差异。为此,我们应用了一个标准 t - 确定这两组捐赠者之间存在统计上有显着差异。

       双柱离子交换色谱法从单个血清样品中纯化

      Agilent 1290 Infinity HPLC系统(Agilent Technologies,Waldbronn。德国)由真空脱气器,二元泵,具有500μl注射器环的冷冻自动进样器组成,使用两个带有恒温器,自动收集分数模块和多波长探测器的两个柱舱。在这个研究中。由串联蜡猫(Polywax LP,200×2.1mm ID,5μm,1000; Polycat A,50×2.1mm ID,5μm,1000)两级柱组成的双柱设置。设置。所有列从Polylc Inc.(哥伦比亚,美国)获得
      • Havugimana P.C.
      • 黄P.
      • Emili A.
      通过使用双柱离子交换高性能液相色谱法通过样品预分馏改善蛋白质组学发现。
      )。将柱子隔室冷却至17℃,同时将其他隔室冷却至4℃以最小化样品降解。流动相缓冲器A由100米组成m AMAC在水中,流动相缓冲B由2.5组成 m amac在水中。通常,每次运行(〜3.5mg总蛋白)注入50μl血清样品。使用多步梯度实现洗脱,该多步梯度与增加的缓冲液B:(步骤1;平衡)0%B,0-6分钟; (步骤2;盐梯度)0-20%B,6-11分钟; (步骤3;盐梯度)20-36%B,11-24分钟; (步骤4;高盐漂洗)36-100%B,24-28分钟; (步骤5;高盐洗)100%B,28-32分; (步骤6;恢复)100-0%b。流速设定为800μL/ min。使用自动馏分收集器,通过在19-23分钟的每0.5分钟收集的280nm和时间基馏分的吸收监测色谱图。

       Fetuin的本机MS分析

      从最丰富的血清蛋白IgG和白蛋白分离的人胎素馏分,从22.5-23分钟之间收集(见 补充图。S1)。含有约25-30μg的蕨蛋白的该级分,缓冲液交换为150米m AMAC(ph 7.2)通过超滤(Vivaspin500,Sartorius Stedim Biotech,德国),配有10 kda切断过滤器。通过280nm的吸光度测量蛋白质浓度并调节至2-3μm 在本机MS分析之前。
      在具有延长质量范围(EMR)(Thermo Fisher Scientific,Bremen)的改进的辐射加玻璃仪器上分析收集的胎素级分数使用标准 m / z. 500-10,000的范围,如先前详细描述的(
      • 玫瑰r.j.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • Makarov A.
      • heck a.j.r.
      完整大分子组件的高灵敏度横腹部分析。
      ,
      • 罗斯蒂斯。
      • 玫瑰r.j.
      • 汤普森N.J.
      • van duijn E.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • Makarov A.
      • heck a.j.r.
      探索侧面的分析仪通过天然质谱法表征完整抗体。
      )。手动调整运输多助料和离子镜片上的电压偏移,以在升高时实现蛋白质离子的最佳透射 m / z.。在6-8×10的气体压力下使用氮气在HCD电池中使用−10 酒吧。 MS参数通常使用:喷射电压1.2-1.3 V,源片段碎片30 V,源温度250°C,碰撞能量30 V和分辨率(AT) m / z. 200)17,500。如前所述使用CSI簇校准质谱仪(
      • 玫瑰r.j.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • Makarov A.
      • heck a.j.r.
      完整大分子组件的高灵敏度横腹部分析。
      )。
      通过使用完整的批量软件(蛋白质指数Ver.1.5)将天然质谱法解构到零电荷来提取观察到的胎磺的预观察蛋白质的精确肿块。
      • 伯尔尼姆。
      • 骑士龙
      • kk y.j.
      • 唐W.
      • Becker C.
      • 卡尔森e.
      • 克莱特D.
      • Sen K.I.
      • 吉利N.
      • 朴实士D.
      • Franc V.
      • heck a.j.r.
      用于天然质谱法的解压缩折叠。
      )。对于PTMS的分析,手动处理数据,基于已知的生物合成途径检索糖粉结构。平均质量用于这些计算; Hexose / Mannose / Galaction(六角形/ Gal,162.1424 DA),N-乙酰己胺/ N-乙酰葡糖胺(六烷基/ glcnac,203.1950Da),脱氧糖(DHEX,146.1430Da),N-乙酰甘氨酸(Neu5ac,291.2579 Da和磷酸化(PHO 79.9799DA)。所有使用的符号和命名法都基于联盟的功能族的建议(
      • 哈特G.
      • Esko J.D.
      • Kinoshita T.
      • Cummings R.D.
      • Schnaar R.L.
      • 冻结H.H.
      • Etzler M.E.
      • Bertozzi C.R.
      • LüttekeT.
      • 戴尔A.
      • vliegenthart J.f.
      • 斯坦利P.
      • Prestegard J.J.
      • Aebi M.
      • rudd p.
      • 包装机N.H.
      • Kanehisa M.
      • Kornfeld S.
      • Narimatsu H.
      • 博尔顿E.
      • Varki A.
      • Darvill A.
      • 保索J.
      • Seeberger P.H.
      • 佩雷斯S.
      • 约克W.
      • 弗兰克米
      • Aoki-Kinoshita K.F.
      • Marth J.D.
      • Taniguchi N.
      • Toukach P.
      聚糖图形表示的符号命名。
      )。

       肽中心蛋白质组学的溶液消化

      从收集的分数中取出约2μg的蕨蛋白并溶解成50米m ABC的浓度为1mg / ml。然后用4米减少样品m DTT在56℃下30分钟并用8米烷基化m IAA在室温下在黑暗中持续30分钟。在37℃下以1:75(w / w)的酶与蛋白质比在蛋白质比中消化胎儿3小时,并通过使用胰蛋白酶进一步消化所得肽混合物(1:100; w)。使用Oasis HLB C18盒,干燥,在液相色谱(LC)-MS和MS / MS分析之前,将含有改性糖肽的所有蛋白水解化物均在20μl0.1%Fa中重构。

       LC-MS和MS / MS分析

      使用Agilent 1290 Infinity HPLC系统(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)分离并分析所有肽(300种Fmol的胎素肽)并分析在线到围网到露天融合Lumos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen)。使用100μm内径2cm捕集柱(内部填充Reprosil-pur C18-aq,3μm)(Maisch GmbH,Ammerbuch-Rentringen,德国)的内部填充来完成反相分离,加上50微米直径50cm分析柱(内部与Poroshell 120 EC-C18,2.7μm)(Agilent Technologies,Amstelveen,荷兰)。流动相溶剂A由水中0.1%的甲酸组成,移动相溶剂B在ACN中由0.1%甲酸组成。流速设定为300 nl / min。使用45分钟的梯度如下:0-5分钟,100%溶剂A; 13-44%溶剂B 20分钟内; 3分钟内44-100%溶剂B; 100%溶剂B 1分钟; 100%溶剂A持续17分钟。对于MS扫描,质量范围设定为375-1500 m / z. 分辨率为120,000,AGC目标为4×105。对于MS / MS测量,电子转移与更高能量碰撞解离(ethcd)联合(
      • 弗雷泽C.K.
      • Altelaar A.F.M.
      • Hennrich M.L.
      • 挖掘D.
      • Zeller M.
      • Griep-raming J.
      • heck a.j.r.
      • 穆罕默德S.
      使用CID,HCD和ETD在LTQ-orbitrap Velos上改善靶向碎片的肽鉴定。
      用常规碰撞能量使用并进行35%。对于MS / MS扫描,质量范围设定为125-2000 m / z.; AGC目标设置为5×104。前体隔离宽度为1.6DA,最大喷射时间设定为200ms。

       LC-MS和MS / MS数据分析

      使用Byonic Software(Ver 3.2.0)(蛋白质Metrics Inc.)(蛋白质Metrics Inc.)加工包含蕨类素蛋白肽的MS / MS光谱的原始数据文件(
      • 伯尔尼姆。
      • kk y.j.
      • Becker C.
      否决:晚期肽和蛋白质识别软件。
      )。以下参数用于通过官分:前体离子容差,10ppm的数据搜索。产物离子容差,20 ppm;固定修改,Cys Carbamidomethyl;可变改性:通过哺乳动物甘草数据库达到氧化,梭甲,Ser,Thr和Tyr磷酸化,以及N-和O-糖基化;允许的切割数量设定为4.胰蛋白酶(C末端RK)和Glu-C(C末端DE)酶特异性搜索被选择用于所有样品。用于肽搜索的FastA文件含有AHSG * 1和AHSG * 2胎蛋白氨基酸序列(UniprotkB - P02765,Fetua_human,AHSG * 1具有Thr-248 / Thr-256; AHSG * 2已达到248 / Ser -256)。使用200使用的核心肽截止得分,并进一步检查所有PTM改性鉴定的光谱。特异性定量蕨类植物PTM的定量如下进行;从每个手动验证的肽蛋白质中取出前三个同位素,用于计算峰面积。含有修饰位点的每种肽单独归一化,使其其所有蛋白质常规区域的总和设定为100%。所有测量的平均肽比例是对丰度的最终估计。使用软件天际线(Ver 4.2.0.18305)获得XIC(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
      • 芬尼G.L.
      • Frewen B.
      • 肯尼尔·
      • Tabb D.L.
      • Liebler D.C.
      • maccoss m.j.
      天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
      )。手动注释每个糖族的聚糖结构。因此,报告的甘草结构被描绘,而没有甘草单元的连锁类型,因为我们所获取的MS / MS数据没有直接提供这些信息。

       使用肽的数据在天然MS光谱中自动化现场特异性蛋白质om Obot

      我们以现场特异性方式注释,每个蛋白质常规由天然MS光谱中的峰值表示,使用来自肽的所有数据的所有PTMS位点的相对丰度(算法公开可用并补充 //github.com/juer120/NativePTMannotation)。注释过程涉及两个主要步骤:(
      • ix J.H.
      • Shlipak M.G.
      • 勃兰登堡五五
      • 阿里斯。
      • 克特雷尔米
      • Whooley M.A.
      人类蕨类植物和代谢综合征之间的关系:来自心灵和灵魂研究的数据。
      )从肽的数据中检索蛋白质常规上所有可能的PTM组合的相对丰度; (
      • Dziegielewska K.M.
      • møllgårdk.
      • Reynolds M.L.
      • 桑德斯N.R.
      人胚胎和胎儿发育中的胎素相关糖蛋白(α2HS)。
      )所有蛋白质常规的质量从天然MS光谱中提取,然后与所计算的蛋白质常规匹配,该蛋白质常规与具有最高相对丰富的PTM组合组成,并且在100ppm内以检测到的蛋白质造型为中心的质量窗口。
      详细地,首先将从蛋白质序列检出的蛋白质骨架的质量输入校正的蛋白质序列用于二硫化物桥(FPB.)然后计算理论 m / z. 通过确定的所有蛋白质ort在确定的电荷状态(Z)中,通过从肽中心测量中鉴定的所有PTMS置换的质量。这 m / z. of a proteoform Fz + 可以计算为:
      Fz+=(FPB.+i=1nfij+z×1,007276)/z


      其中n是ptm站点的数量; FIJ. 是现场I的第j次修改的质量。其次,我们计算了蛋白质形式F的相对丰度P.z + 具有所有可能的PTM组合,由以下计算:
      P=i=1nPij


      其中PIJ是位于地点I的第j次修饰的正常相对丰富; n是PTM站点的数量。 PIJ计算:
      Pij=Vijj=1kVij


      其中k是现场I(包括未占地网站)的可能PTM同种型的数量; VIJ是位于站点I的第j次修改的丰富,这是基于XIC计算的。第三,我们输入所有 m / z. of proteoforms (Mz + )从原始天然MS谱中提取,然后将它们与理论相匹配 m / z. (Fz + )在100 ppm之内,产生所有匹配的列表 m / z.。最后,我们导出与匹配相对应的PTMS组合的最高相对丰富 m / z. in the list.

      结果

       本土谱和以肽为中心分析蕨类植物纯化的健康个体

      我们启动了我们的研究,详细描述了10名随机选择的健康个体的人血清胎素蛋白质曲线(表I.)。我们很快发现这些人涉及不同的胎儿基因型,并开始研究这种遗传多态性对胎儿糖基化模式的影响。因为蕨类植物由基因Ahsg,ahsg * 1和ahsg * 2的至少两个经常发生的变体产生,所以可以期望观察来自这些个体的胎儿的不同的植物植物谱。为了研究这一点,我们首先在双混合模式柱离子交换色谱系统上装载了每个单独的每个单独的人血清,包括弱阴离子交换(蜡)柱之前的弱阳离子交换(猫)柱。使用这种色谱设施对于血清,我们在每次运行含有胎素的独特级分,随后浓缩,缓冲液交换,并经受高分辨率天然Ms( 补充图S2)。 Fig. 1 显示出来自胎儿的三种不同基因型的三种代表性零电荷去吞压天然质谱(供体F1-AHSG * 1,供体M3 - AHSG * 2,供体F3 - AHSG * 1/2)。所有获得的光谱的分组是基于针对每个基因型特异的签名峰完成的,如下面更详细解释的。尽管所有三种天然谱似乎是完全不同的,但是每个光谱中存在许多峰值,并且主要在信号强度彼此不同。然而,仔细研究光谱揭示了一些关键差异。在AHSG * 2和AHSG * 1/2中检测到42,633.02Da质量的一个强烈峰(42,632.24 DA)在所有AHSG * 1中完全缺失(Fig. 1A, 和 补充图。S2A)。因此,该峰是AHSG * 2和AHSG * 1/2的特异性,其完全没有定义明确的AHSG * 1。有趣的是,AHSG * 1中的缺失的蛋白质Oform似乎代表了AHSG * 1和AHSG * 2之间的蛋白质形状轮廓的显着差异,并在糖基化谱上的遗传多态性的显着影响下暗示。另外,当比较AHSG * 1和AHSG * 2之间的相应峰时,可以观察到16DA的质量差(Fig. 1A1B, 补充图。S2A和S2B)。这是因为AHSG * 1和AHSG * 2的骨架氨基酸序列之间的质量差异,恰好是15.99Da。 Fetuin从杂合子基因型AHSG * 1/2供体的天然质谱显示出更复杂的蛋白质曲线(Fig. 1C, 补充图。S2C)与其他两个基因型相比。这是预期的,因为它应该是AHSG * 1和AHSG * 2所观察到的所有蛋白质形式谱的组合。理论上,我们应该检测所有常用AHSG * 1和AHSG * 2常见的蛋白质常规的双峰。然而,因为很小 m / z. ahsg基因之间的差异(16 da, IE。 1.23 Th for the 13+ 充电状态),我们在实践中观察到更广泛或部分分裂峰,用于杂合子供体所获得的天然质谱。解决如此小的质量差异需要大约4000左右的质量分辨率〜10倍的质量分辨率 m / z.。我们从本地分析中的发现可以进一步支持和解释所有个体供体贫民的随后(Glyco)肽为中心分析。我们用胰蛋白酶和Gluc-C的所有三种基因型消化了Fetuins,导致一组肽,用于随后通过LC-MS / MS分析测序。数据解释提供了有关所有已识别的肽的网站位置,PTM类型,组成和丰度的信息(用于手动注释的MS / MS光谱,请参阅 补充文件S1和S2;用于致癌搜索和MS / MS光谱请参阅数据可用性)。 Fig. 2A, 2B补充文件S1 显示氨基酸序列的两种肽的带注释的ethcd ms / ms光谱 243vavtc.Tvfqtqpv.TSQPQPE.262243vavtc.Mvfqtqpv.SSQPQPE.262,衍生自AHSG * 1和AHSG * 2的蛋白水解消解的签名肽。这些肽含有两个上述基因型位点。值得注意的是,从所有三个胎儿基因型获得的XIC的手动检查显示,AHSG * 1肽上的THR256完全占据含有0,1或2个连接到核心结构六十次的甲酸的O-聚糖1十六进制1,鉴于AHSG * 2肽上的Ser256主要是未经修改的(Fig. 2C, 补充图S3 )。因此,虽然O-Glycan略微修饰了Ser256,但它与THR256显着不同,其被发现是完全O-糖基化的。展示含有跨越三种不同基因型的这些位点的所有检测到的肽变体的相对丰度 Fig. 2C。基于所有10所研究的健康个体所获得的THR / SER256的站点占用的相对定量是使用天际线处理的,并提供 补充表S1。从以肽为中心的数据,我们可以确定解释AHSG * 2中AHSG * 1和42,633.02Da的峰值43,272.88Da之间的质量差异的起源1十六进制1Neu5Ac1 - 15.99).
      表I.捐助者特征概述。第一个列列出了已使用的示例名称
      样本名称性别年龄基因类型样本类型
      M1M48AHSG*1健康
      F1F37AHSG*1健康
      F2F26AHSG*1健康
      F5F63AHSG*1健康
      M2M55AHSG*2健康
      M3M54AHSG*2健康
      F3F33AHSG1 / 2.健康
      F4F27AHSG1 / 2.健康
      M4M27AHSG1 / 2.健康
      M5M63AHSG1 / 2.健康
      F6F68AHSG*1败血症
      F7F19AHSG*1败血症
      F8F73AHSG*1败血症
      M7M18AHSG*1败血症
      F9F33AHSG*1败血症
      F10F82AHSG*1败血症
      M8M47AHSG1 / 2.败血症
      F11F55AHSG1 / 2.败血症
      F12F33AHSG1 / 2.败血症
      F13F37AHSG1 / 2.败血症
      图缩略图GR1.
      Fig. 1不同的基因型导致不同的蛋白质常规谱。 从血清纯化胎素的三个代表性零电荷去酚类天然质谱 A,捐赠者F1(AHSG * 1), B,供体m3(ahsg * 2),和 C,供体F3(AHSG1 / 2)。 AHSG * 1和AHSG * 2之间的相应蛋白质常规在16Da(如蛋白质omm of 43,272.88Da的蛋白质omm显示)中不同 A 和43,289.26 da B)。在 B,具有42,633.02da的质量的蛋白质ofom在656Da的最丰富的蛋白质形状不同,这与肝脏的O-聚糖组成相同1十六进制1Neu5Ac1。可以观察到该蛋白质(42,632.24 DA) C,但完全缺席 A.
      图缩略图GR2.
      Fig. 2不同胎素基因型的肽特征。 肽的ethcd ms / ms光谱 A, 243vavtc.Tvfqtqpv.TSQPQPE.262 (ahsg * 1)和 B, 243vavtc.Mvfqtqpv.SSQPQPE.262 (AHSG * 2),通过蛋白水解消化(胰蛋白酶+ glu-C)获得,含有两个突变位点。醚谱提供唯一肽序列和O-Glycan的唯一肽序列和位置的确认,在AHSG * 1中是THR256。用三个电荷的前体离子获得光谱和 m / z. 对于AHSG * 1和AHSG * 2的958.78和745.03分别,因为这些肽主要是未经修饰的AHSG * 2并且完全改性AHSG * 1。 C,定量肽签名,含有突变和O-糖基化位点THR / SER256。在这些棒中,这些肽的丰度在所有三种基因型中从10个健康个体血清纯化的所有基因型特异性胎素样品进行了平均值,ahsg * 1( n = 4), AHSG*2 (n = 2) and AHSG1/2 (n = 4)。从其相应的提取离子色谱图(XIC)估计肽蛋白质常规的相对丰度并标准化为100 %。 AHSG * 1和AHSG * 2签名肽分别包含THR256和SER256位点。可以提取两种肽并单独定量杂合子AHSG1 / 2供体。黑条未经修改,蓝色棒通过exnac修改1十六进制1 用一个唾液酸和红棒通过六纳克修饰1十六进制1 含两种唾液酸。

       特定于网站的PTMS本地质谱注释

      我们之前介绍了一种促进来自天然质谱和肽中心LC-MS / MS数据的数据的算法,这使我们能够评估糖肽表征的完整性 在Silico. 从所有组合肽的数据构建完整的蛋白质曲线谱(
      • 杨Y.
      • 刘F.
      • Franc V.
      • 哈利姆L.A.
      • Schellekens H.
      • heck a.j.r.
      糖蛋白分析中的杂交质谱分析及其在刻划生物纤照中的用途。
      )。该算法列出了基于观察到的PTM的蛋白质常规质量的所有可能组合,在肽中心水平,最终构建模拟的天然样质量光谱,其可以与实验性天然质谱相关。然而,在前面的方法中,包含所有预测的蛋白质常规的所得列表,具有总PTM组合物,不含PTMS的任何特定的特定信息。在这里,我们进一步扩展了我们的算法(公开可用)并将其应用于目的地谱系中的所有峰值的半自动注释,现在也包括站点位置。要执行更高级的分配,我们修订了在R中写入的内部脚本(请参阅详细说明的方法部分)。简而言之,我们首先使用衍生自肽的分析的数据(质量和相对强度)生成具有特定群众和概率等级的蛋白质常规文库。所有蛋白质常规组合按照所检测到的PTM肽的强度排序,它们是由其构建的检测到的PTM肽以及其理论和实验群体之间的匹配。这意味着基于肽的质量匹配和强度,对具有相同质量(100ppm以内的蛋白质(100ppm以内)(意味着更近的质量匹配和更高的强度,得到蛋白质组合,但肽组合不同的肽组合和更高的强度越高。接下来,在天然质谱中丢弃具有小于5%(与基峰相关)的相对强度的所有峰。然后将峰的质量与最高排名的蛋白质orts匹配到所生成的库中。这使我们可以以特异性方式用其PTM组合物可视化天然质谱中最可能的蛋白质ort。 Fig. 3 显示出氟霉素的这种可视化,其从所有不同基因型的供体池中纯化(我们的参考样品)。累积地,基于我们的实验数据,我们在Fetuin上定义了一种固定修改(Ser138磷酸化)和五个其他PTM站点(A = ASN156,B = ASN176,C = THR / SER256,D = THR270和E = SER346)。用胎骨骨干质量进行操作的脚本校正由二硫键(-12×1.0079Da)和一种磷酸盐(+79.97)部分(Ser138)诱导的质量偏移。然后基于包含具有最高等级的PTM组合的库自动注释本地质谱中的峰。结果包含具有群众的蛋白质形式列表,最可能的PTM组合和现场特定信息,如图所示 补充表S2.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3胎儿蛋白质谱谱的综合,定量和现场特异性注释。 本网站 - 专门注释的零电荷去卵巢DINCONVOLUTED天然质谱,其各种供体的人血清合并。最丰富的蛋白质常规的总PTM组合物是彩色编码。每种颜色代表没有唾液酸的聚糖组合物;附着的唾液酸的数量标记在每个峰的顶部。所有显示的蛋白质常规含有一个磷酸盐部分。使用我们内部开发的软件分配了胎儿(A = ASN156,B = ASN176,C = THR256,D = THR270和E = SER346)的5种糖基化位点的特异性注释。使用我们的内部开发的软件,利用了本机MS和肽为中心的MS数据集成。可以找到具有所有注释的蛋白质ort的完整列表及其相对丰度 .

       特定于现场的注释完全解释了AHSG * 1,AHSG * 2和AHSG * 1/2胎儿之间观察到的差异

      从基因型代表个体获得的本地质谱,具有定义每个基因型的特异性注释的蛋白质常规(IE。 提供F1 / AHSG * 1,M3 / AHSG * 2和F3 / AHSG * 1/2) 补充图S4。上面已经表明了在定义Fetuin基因型的所有单个中观察到的一些主要差异。然而,它们之间的确切差异可以在特定于蛋白质形式的特异性表征后澄清。最引人注目的是,质量为42,633.02da的高强度峰,从AHSG * 1供体中完全缺失,其组合物由两个双向N-聚糖组成的位置A和B(2 x Hexnac4十六进制5Neu5Ac2)和一个O-Glycan位于D某种位置D(HexNAC1十六进制1Neu5Ac2)。我们解释了在上面的AHSG * 1中没有这种蛋白质形状,是由于位置C(Thr256)O-聚糖现场的完全占用。这与AHSG * 2中的位置C(SER256)形成了对比度,发现其仅部分占用。 AHSG * 1和AHSG * 2之间的第二个主要差异由其两个突变引起的不同蛋白质骨架肿块定义,导致15.99Da(37,177.01-37,193.00)的精确质量差。这可以从F1(AHSG * 1)和M3(AHSG * 2)的天然质谱中的两个最强烈的蛋白质ort中提取 补充图S4ab。虽然两个蛋白质ort患有相同的PTM组合物,但特异性注释也揭示了O-Glycan占据占用率的差异。供体F1在位置C和D处具有O-聚糖,而M3在位D和E.可以找到来自代表不同基因型的三个个体的现场专门注释的蛋白质常规列表 补充表S3-S5。在F1中,我们可以注释16种蛋白质ort(补充表S3),在M3,15个蛋白质形式(补充表S4),最后在杂合子供体F3 34蛋白综合症中(补充表S5)。蛋白质形式曲线不仅通过它们的复杂性而不同,而且达到峰的相对丰富。
      通过较早使用的类似方法来分类二醇工程促红细胞生成素变体的类似方法,我们尝试了基于它们的蛋白质曲线研究的所有10所研究的健康个体的分类。
      • ČavalT.
      • 天W.
      • 杨Z.
      • 克劳森H.
      • heck a.j.r.
      甘油工程促红细胞生成素变体的直接质量控制。
      )。我们最初使用无监督的分层聚类来构建基于所有本机谱系的矩阵,如图所示 Fig. 4A。这已经导致三个独特的集群,也是两个明确的异常值(捐赠者F5和M5)。第一簇代表了来自AHSG * 2捐赠者(橙色盒子)的胎磺。第二(绿色盒子)和第三簇(蓝盒)分别含有来自AHSG1 / 2和AHSG * 1捐助者的Fetuin。在接近检查时,两个异常样本(F5和M5)的天然质谱显示出更复杂的蛋白质曲线,几乎所有峰值以80Da相互彼此相同( 补充图S2)。从LC-MS / MS数据中,我们可以得出结论,这两种供体具有高占用的第二次磷酸化位点,即SER330(补充文件S2)。基于完整的蛋白质曲线,这种额外的磷酸盐部分干扰了基因型分类。尽管如此,正如我们上面鉴定的特征型蛋白质,我们重复了分类,但现在只使用这些签名峰值。结果显示在 Fig. 4B,橙色,绿色和紫色盒子代表Fetuin的遗传变异。该数据清楚地举例说明,在10个健康个体的样本尺寸上,独特的糖基化模式可以与独特的胎儿基因型连接。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4分层聚类胎素蛋白质谱分类。 A,根据其天然质谱之间的相关性来自10个健康个体衍生自10个健康个体的胎素蛋白质谱的无监督聚类。 B,基于特定签名峰的10个健康个体衍生自10个健康个体的聚类(参见 )。圆圈的颜色和尺寸代表了不同基因型的蛋白质形式谱系之间的相似性。橙色,蓝色和绿色盒子代表源自捐赠者的氟磺,分别代表AHSG * 2,AHSG * 1和AHSG1 / 2基因型的捐赠者。比较结果 AB 分类 A 由来自供体F5(AHSG * 1)和M5(AHSG * 2)的两种异常值扭曲,分别由这两个个体中的Fetuin磷酸化的主要变化引起。 C,基于特定签名峰的10个健康和10名脓毒症患者的胎儿蛋白质谱系的聚类,其中粉红色虚线盒表示呋喃衍生自化脓性的胎儿。

       从脓毒症患者供体中的胎素蛋白质谱

      糖基化的交替可以是炎症的商标,如几种急性期蛋白在几种急性期蛋白上发生; α-1-酸糖蛋白,哈达氟氯蛋白和α-1- antichymotfsin(
      • Brinkman-van der Linden e.c.M.
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      α1-酸糖蛋白在脓乳酸中的糖基化:分支程度的变化及SiaLyl Lewisxgroups的表达。
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      炎症诱导的SiaLyl Lewisx的表达不限于α1-酸糖蛋白,但在α1-antichymotrypsin和Haptoglobin的程度上也发生在较小程度上。
      )。然而,胎儿的这种数据是零星的(
      • Karabudak A.
      • 吉亚玛N.H.
      • Moser C.D.
      • Miyoshi E.
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      岩氧化胎素-A作为胆管癌潜在生物标志物的鉴定。
      )。为了探讨,蕨类植物'糖基化图案是否也改变急性炎症,我们从10个单独的脓毒症患者供体中纯化血清氟金( 表I.)并如前所述进行相同的质谱分析。我们的分类策略将所有20个本地质谱(从10个健康和10个脓毒症患者供体从10个健康和10个脓毒症患者供体中)分为三种基因型( Fig. 4C)。该分类可以通过肽为中心的LC-MS / MS数据进一步证实(补充表S6)。接下来,我们专注于我们是否可以对健康和脓毒症患者捐赠者进行分类。由脓肠柄患​​者供体获得的蕨属含有一些分子物种,源自源自骨糖苷化的N-聚糖的蛋白质常规的强度。放大到这一点,我们专注于特定的胎磺索基化的蛋白质血管和其非岩氧化变体,并使用其峰强度的比例来估计岩藻糖基化水平(Fig. 5A)。我们从本地质谱计算了两个蛋白质常规的平均强度,使用在12中检测到的峰值+ 和 13+ charge states (补充表S7)。肽为中心的LC-MS / MS分析允许我们针对败血症最受影响的N-糖基化位点为ASN176(B)。含有该部位的岩藻糖基化肽的峰面积的比率验证了脓毒症患者岩藻糖基化增加的明显趋势(Fig. 5B补充表S8)。因此,蛋白质形式谱的这种变化可用于将脓毒症患者从健康捐赠者分类,具有良好的统计值(p < 0.006).
      图缩略图GR5.
      Fig. 5脓毒症患者展示ASN176上的增强岩藻糖基化。 A,健康供体(F1)和脓菌患者(F6)的两个代表性零电荷去吞压天然质谱。用于特异性分配的岩氧化蛋白质常规的平均强度及其非岩氧化变体用于测定相对岩藻糖基化水平。使用12中检测到的相应离子信号从天然质谱中提取强度+ 和 13+ 充电状态。 B,比较从天然质谱和以肽为中心分析获得的岩藻糖基化程度的比较。肽中心数据中的岩藻糖基化水平取决于含有败血症的含有败血症的N-糖基化位点Asn176的岩藻糖基化和非岩石化肽的峰面积的比率测定。两种方法导致健康和脓毒症患者的统计显着分离 p 值0.001和0.006。 (a = ASN156,B = ASN176,C = THR256,D = THR270和E = SER346)。

      讨论

      在这里,我们将高分辨率本地质谱与肽为中心(Glyco)蛋白质组的蛋白质组合并,以分析培养基丰富的血清糖蛋白蕨类植物,我们能够直接从20个供体,10个健康对照和10名脓毒症患者的血清纯化。从数据来看,显而易见的是,样品源自具有不同经常发生的基因型的人,这一切都导致了不同一组蕨类植物蛋白质常规。我们进一步详细研究了由供体的特定基因型引起的蛋白质常规谱的变化,提供糖蛋白蛋白酶体的一个有趣的例子。我们接下来还将我们的分析扩展到血清患者患者患者供体中纯化的血清。

       在AHSG * 1中替换THR在AHSG * 2中的SER改变O-糖基化占用

      在天然MS和LC-MS / MS数据中,我们观察到,位于AHSG * 1中的位置256中的突变和AHSG * 2中的SER,对Fetuin O-糖基化具有显着影响,主要是由O-Glycans在AHSG * 2 / Ser256上的占据占用率。值得注意的是,可以通过O-糖基化改变Thr和Ser,但是我们发现与Thr256相比,酸糖基化减少了o-糖基化,与Thr256相比,与O-糖基化占用率的荟萃分析,其报告了相当大的偏好对于Ser(
      • 王S.L.
      • Joshi H.J.
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      表征人血浆,血小板和内皮细胞的O糖基化景观。
      )。我们在这里提供第一个实验证据,展示了弗莱林中Ser的替代性如何改变本网站的占用率。通常,O-糖基化的变化可能影响蛋白质稳定性或免受蛋白水解活性的保护(
      • Jentoft N.
      为什么蛋白质o-糖基化?
      )。早期报道了基因突变,包括SNP,蛋白质糖基化的影响,尽管在几项研究中仅(
      • 丁问:
      • 杨L.
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      蛋白C Thr 315Ala变体导致功能的增益,但表现为II型诊断测定缺陷。
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      与人朊病毒疾病中T183A突变相关的糖基化的丧失。
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      疾病中翻译后修饰位点的损失。
      )。值得注意的是,这种突变与改变的生理状态有关,特别是导致疾病的突变。无论在这里报道的胎素的蛋白质常规谱不同是否需要进一步调查生物学意义。

       胎管骨干处理与磷酸化之间的耦合

      两个健康供体,F5和M5的本地质谱引起了我们的注意,因为它们的植物造影曲线非常明显,代表了两个异常值 Fig. 4A。我们观察到这主要是由额外的胎素磷酸化位点Ser330的占地性占据引起的。人类血清胎素主要以单独磷酸化,在Ser138的近100%的场地占用率近100%(
      • 林Y.H.
      • Franc V.
      • heck a.j.r.
      相似尽管不一样:深入分析人血清,牛血清和重组人胎素的蛋白质ort。
      )。早期的磷蛋白质分析表明,至少四种更多的SER残基可以部分磷酸化(
      • 悬挂。
      • 周H.
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      血清磷蛋白酶组的初始表征。
      )。在最近的一项研究中比较肥胖与瘦人物,Fetuin Ser330的磷酸化归因于人为胎素的代谢活性池,在较大的循环胎儿池中(
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      编码AHSG / FETUIN-A的“节俭”基因符合胰岛素受体:对胰岛素抗性机制的见解。
      )。有趣的是,该SER330磷酸化位点是在40-氨基酸残基长的肽(也称为“连接肽”)中,其被认为在血清中的后期加工过程中丧失。来自文献的数据表明,蕨类素蛋白可以确定以两种加工形式存在于人体血清中,或没有连接肽(
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      )。将胎素分离成两条链的一个推定的蛋白水解裂解在部位340中发生,导致去除Arg残留物。第二种蛋白水解裂解释放连接肽(Ser330的磷酸盐)是Leu300。因此,它诱人探测SER330磷酸化和蕨类植物加工之间可能的串扰机制。该连接肽的一个提出的功能作用是胰岛素受体抑制功能(INSR)(
      • Dziegielewska K.
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      )。与重组人胎​​素(其是包括连接肽的单链蛋白质)相比,从等离子体中分离的成熟人胎素(假设没有连接肽)的insr抑制活性显着降低(包括连接肽的单链蛋白)。因为据报道,7-20%的循环胎儿携带Ser330的磷酸化(
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      延长释放烟酸降低血清胎素 - 一种代谢综合征中的个体中的浓度。
      ),推测使用含有连接肽的单链蛋白循环的人蕨类植物的类似部分诱人(
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      编码AHSG / FETUIN-A的“节俭”基因符合胰岛素受体:对胰岛素抗性机制的见解。
      )。这种未成年人的存在,尽管代谢更具活跃的胎儿池在2型糖尿病的病理学中可能是重要的,其涉及胰岛素受体信号级联的获得或遗传缺陷。我们的数据建议了一个不同的场景。我们在我们之前的研究中显示出,在此,人血清蕨类植物在双链形式架构中存在,但它仍然含有连接肽。将胎素分离成两条链的蛋白水解裂解在上述位置340处发生并完全除去氨基渣。因此,磷酸化位点Ser330的修饰似乎与连接肽的缺失/存在似乎不相关,并且Ser330的磷酸盐的推定调节功能可能是不同的机制。

       败血症在人胎素蛋白质常规中的特异性改变

      在许多疾病中,包括急性和慢性炎症性疾病,几种急性期蛋白显示出改变的糖基化(
      • Mariñok.
      • Saldova R.
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      • rudd下午
      血清N-糖基化轮廓的变化:诊断功能的功能意义和潜力。
      )。然而,人胎素已被分类为阴性急性期糖蛋白,但是尚未描述炎症过程如何影响蕨类糖基化。这里,我们观察到胎儿中的抑制剂从脓肠病患者纯化,在N-糖基化位点Asn176(b)上的岩藻糖基化的统计显着增加。值得注意的是,两个脓毒症患者,M7和F7,没有显示出增加的岩氧化化。与其他患者(18至19岁)相比,这两个患者相当年轻。它先前假设N-Glycan型材受年龄和性别的影响(
      • 丁n.
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      )。虽然可以说是在一个小型数据集上,但我们确实观察了我们在岩氧化和年龄的程度之间的数据中的相关性。然而,显示岩氧化和年龄之间的相关性的数据点数不足以执行适当的统计评估。尽管如此,这进一步支持生物标志物的发现和发展应该严重考虑到捐助者的性别和年龄等因素。是否增加的岩藻糖基化具有功能性后果或几乎没有“疾病状态”的诊断标志物,需要进一步探索。
      总之,我们在此处分析了从20个单独供体中提取的第一次蕨类素样品,10个健康和10次患有脓乳酸的样品。这种个性化的深入蛋白质形式分析提供了一种关于Fetuin加工,Fetuin磷酸化和胎素N-和O-糖基化的数据。我们研究中最有趣的结果之一是常见的胎素基因多态性影响相应的蛋白质的蛋白质型谱。
      在大多数基因组学和蛋白质组学研究中,对Fetuin的研究迄今为止基因多态性的后果,并且蕨类植物加工已经很大程度上被忽略了。我们觉得需要在文献中报告的蕨类植物上表观差异,考虑到捐助者的个体基因型,生理状态和蕨类植物处理状态。经常建议弗妥林是对各种生理国家敏感的蛋白质,但其临床潜力是否强劲,值得进一步调查。我们的数据清楚地证明了单个基因如何导致非常广泛的蛋白质常规,这一切都可以在功能上差异差异。在蛋白质形式水平上,似乎没有厌恶基因,甚至亚丁才表征已经75年前,仍然暴露于表现出不同基因型和生理状态的人体中的人体中的新增功能和令人兴奋的特征。

      数据可用性

      质谱数据通过骄傲沉积在ProteomexChange联盟上(
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      )与DataSet标识符PXD012465和10.6019 / PXD012465的合作伙伴存储库。由于骄傲并未完全支持糖肽数据作用,以自由可用的通用预览文件的形式,包含所有已识别和分配的光谱可在以下链接中获得: //figshare.com/s/c3ef7dba6c2079e0402f.

      致谢

      我们承认荷兰组织的科学研究(NWO)资助大型蛋白质组学设施的支持 [电子邮件 protected] (项目184.032.201)嵌入荷兰蛋白质组学中心。 A.J.R.H.通过NWO Top-Punt授予718.015.003的进一步支持。

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