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改进细胞外基质蛋白质组覆盖物的溶液辅助消化方法*

  • Kirk C. Hansen.
    一致
    应当解决谁的通信:科罗拉多大学蛋白质组学设施健康科学中心,12801 East 17th Ave.,Aurora,Co 80045。电话:303-724-3325;
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    科罗拉多大学癌症中心蛋白质组学和质谱设施,科罗拉多州科罗拉多州阿罗拉,科罗拉多州80045

    科罗拉多州科罗拉多州科罗拉多大学部门80045
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  • Lauren Kiemele.
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  • ori maller.
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  • Aarthi Shankar.
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  • jaime fornetti
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  • 辣椒安排
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  • 作者脚注
    *通过全国卫生学院通过科罗拉多州大学综合癌症中心核心支持和国家研究资源中心的S10RR023015,得到了全国卫生学院的支持.P30CA046934-17。这项工作也得到了国防部授予BC051532和屠夫基金会(对斯皮达)和科罗拉多州的癌症联盟(K. H.)。
    *本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
      上皮细胞行为由周围细胞外基质(ECM)的组成协调;因此,ECM蛋白质鉴定对于了解正常生物学和疾病状态至关重要。 ECM蛋白的蛋白质组学分析已被ECM的不溶性和消化性抗性性质受到阻碍。在这里,我们探讨了结合快速超声波和表面活性剂辅助消化的效用,用于ECM样品的详细蛋白质组学分析。与传统过夜消化相比,这种优化方法显着改善了胶原蛋白I的序列覆盖率,揭示了Matrigel中的数百个先前未识别的蛋白质,并鉴定了与大鼠乳腺分离的ECM的蛋白质谱系与发现的大鼠乳腺分离在Matrigel。在三维培养测定中以研究上皮细胞-ECM相互作用,发现乳腺上皮细胞与Matrigel相比,当用乳腺腺衍生的基质接种时,发现乳腺上皮细胞经历了广泛的分支形态发生。累积地,这些数据突出了ECM组成和功能的组织特异性,并且不需要对ECM样品的蛋白质组学表征的优化技术,例如这里描述的那些。
      细胞外基质(ECM)
      使用的缩写是:ECM,细胞外科
      细胞外基质
      COL1
      I型胶原蛋白
      ehs.
      Engelbreth-holm-swarm
      FN.
      纤连蛋白
      NLC.
      Nanoflow LC.
      LTQ.
      线性离子陷阱
      F A
      甲酸
      撒谎
      表面活性剂辅助胰蛋白酶消化
      rcf.
      相对离心力
      uatd.
      超声波辅助胰蛋白酶消化
      3D
      三维
      SCX.
      强阳离子交换
      IPI.
      国际蛋白质指数
      1D
      一维
      FDR.
      假发现率
      1使用的缩写是:ECM,细胞外科
      细胞外基质
      COL1
      I型胶原蛋白
      ehs.
      Engelbreth-holm-swarm
      FN.
      纤连蛋白
      NLC.
      Nanoflow LC.
      LTQ.
      线性离子陷阱
      F A
      甲酸
      撒谎
      表面活性剂辅助胰蛋白酶消化
      rcf.
      相对离心力
      uatd.
      超声波辅助胰蛋白酶消化
      3D
      三维
      SCX.
      强阳离子交换
      IPI.
      国际蛋白质指数
      1D
      一维
      FDR.
      假发现率
      是组织微环境的关键组成部分。 ECM在胚胎干细胞开发和分化中发挥枢轴作用(
      • ingber d.e.
      通过工程肿瘤微环境可以逆转癌症吗?
      ,
      • Engler A.J.
      • Sen S.
      • Sweeney H.L.
      • 讨厌D.E.
      基质弹性指示干细胞谱系规范。
      )以及许多生理(
      • 安排
      • Mitrenga T.
      • 麦迪亚尼尔S.
      • Kaeck M.
      乳腺ECM组成和功能通过生殖状态改变。
      )和病理过程,包括癌症进展(
      • 安排
      • elias a。
      multiStep肿瘤瘤和微环境。
      ,
      • Radisky E.S.
      • Radisky D.C.
      乳腺癌的基质诱导:炎症和侵袭。
      )。 ECM的细胞调节已经在近年来高频研究(
      • 安排
      • o'brien J.
      • 鲁道夫M.
      • 斯坦坦T.
      • Borges V.
      患有乳腺的微环境介导乳腺癌进展。
      ,
      • F A TA J.E.
      • Werb Z.
      • Bissell M.J.
      细胞外基质的乳腺支化形态发生的调节及其重塑酶。
      )。但是,我们能够全局表征ECM组合物 体外 体内 由于ECM蛋白质如高分子量聚糖等几种独特的属性而受到严重限制,以及共价蛋白质交联剂的存在(
      • 胶凝胶。
      • PöschlE.
      • Aigner T.
      胶原蛋白结构,功能和生物合成。
      ,
      • 锡尔莫尔S.
      • raccurt m.
      • 格拉德F.
      • Gleyzal C.
      • Grimaud J.A.
      • Sommer P.
      溶酶氧化酶基因在原位和侵袭性导管乳腺癌中的基质反应中的表达。
      ,
      • 袁L.S.
      • Siegel M.
      • Choi K.
      • Khosla C.
      • 米勒C.R.
      • 杰克逊e.n.
      • Piwnica-蠕虫D.
      • 丰富的小时
      转谷氨酰胺酶2抑制剂KCC009破坏细胞外基质中的纤连蛋白组装,并使原位胶质母细胞瘤敏化为化疗。
      )。由于胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质,因此证明了传统的蛋白质组学方法证明是无效的,因为胶原蛋白的鉴定,胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质。
      超声波长期以来用于消化生物无机材料,以允许最大和可重复的提取,从而准确地鉴定小分子和无机分析物(
      • Bermejo P.
      • Capelo J.L.
      • Mota A.
      • 马德里y.
      • Camara C.
      酶消化和超声:分析化学中的一种强大的组合。
      )。最近,卡佩洛 等等。 (
      • Capelo J.L.
      • Maduro C.
      • Vilhena C.
      电热原子吸收光谱法讨论与超声固液提取与元素分析(总含量)相关的参数。概述。
      )使用超声波能量来催化蛋白质的胰蛋白酶消化以进行随后的质谱鉴定。在这里,我们试图确定该方法是否可以优化以准备基于质谱的分析的ECM样本。对于方法开发,我们使用大鼠尾胶原作为代表性ECM蛋白,目前的蛋白质组学方法已经证明相对不成功。 I型胶原蛋白被定义为右手三重螺旋异构体,其包含两种相同的α1链和形成纤维网的一个α2链(
      • 胶凝胶。
      • PöschlE.
      • Aigner T.
      胶原蛋白结构,功能和生物合成。
      )。三螺旋结构的物理性质使蛋白质抗蛋白质作为胰蛋白酶(
      • 锡尔莫尔S.
      • raccurt m.
      • 格拉德F.
      • Gleyzal C.
      • Grimaud J.A.
      • Sommer P.
      溶酶氧化酶基因在原位和侵袭性导管乳腺癌中的基质反应中的表达。
      )。在这项工作中,我们专注于开发消化方法,提高了我们对I型胶原蛋白制剂进行蛋白质组学分析的能力,然后使用该方法鉴定EHS鼠软骨肉瘤基质的蛋白质组成(
      • 袁L.S.
      • Siegel M.
      • Choi K.
      • Khosla C.
      • 米勒C.R.
      • 杰克逊e.n.
      • Piwnica-蠕虫D.
      • 丰富的小时
      转谷氨酰胺酶2抑制剂KCC009破坏细胞外基质中的纤连蛋白组装,并使原位胶质母细胞瘤敏化为化疗。
      ),本文称为Matrigel,以及来自大鼠乳腺组织的基质制备。
      在这项研究中,我们开发了一种适用于对ECM蛋白的二维液相色谱 - 串联质谱分析的消化方法。我们的消化方法涉及三个超声波循环,用于快速初始胰蛋白酶消化,然后使用酸不稳定的表面活性剂过夜消化。这种方法导致胶原蛋白肽鉴定的显着改善,并在Matrigel和乳腺组织中鉴定先前无表征的ECM蛋白质。预计我们ECM优化超声辅助胰蛋白酶消化方法的应用是显着提高了组织和疾病状态特异性ECM蛋白的鉴定。

      实验步骤

       材料

      大鼠尾型I胶原蛋白和Matrigel购自BD Bioscience。 BSA,碳酸氢铵,DTT,Tris(2-羧乙基)膦和碘乙酰胺全部购买于Sigma-Aldrich。甲酸(FA),TFA和氯化钾是从Fluka(Buchs,Switzerland)获得的,ACN来自Burdick和Jackson(Morristown,NJ)。胰蛋白酶(测序等级, l-1-甲硅烷基氨基-2-苯基乙基氯甲基酮处理)来自Promega(麦迪逊,Wi)。

       还原,烷基化和标准过夜消化

      通过向最终浓度的5米添加DTT来实现二硫键的减少m (pH 7.4 using 25 mm 碳酸氢铵)并在70℃温育30分钟。冷却至室温后,加入碘乙酰胺(15米m),并将样品在室温下在黑暗中温育45分钟。通过在1.2μg胰蛋白酶(3μl)/100μg胶原蛋白或100μg的基质胶(100μl)中加入标准过夜消化,并在37℃下孵育过夜。

       表面活性剂辅助胰蛋白酶消化(SATD)

      根据制造商的制造方案加入的Rapigest SF表面活性剂(水,Milford,MA)根据制造的方案加入的终浓度为0.1%,如上所述进行消化。在37℃过夜消化后,将溶液用TFA酸化至终浓度为0.5%。将样品在37℃下温育30分钟,然后在15,000 rcf下旋转10分钟。所得到的上清液用于蛋白质组学分析。

       超声波辅助胰蛋白酶消化(UATD)

      将双去离子水加入到100μg样品中,在600μleppendorf管中的总体积为100μl。使用环形支架固定管,使得Songator尖端从管的底部0.5cm,管底部浸没在湿冰浴中。将胰蛋白酶(1.2μg)加入样品中。 450瓦的布兰森Sonifier(Branson,Danbury,CT)用于功率等级1(~10瓦),50%占空比,Sonicator循环60秒,关闭30秒,然后再次重新打开60秒。向样品中加入另外的胰蛋白酶(1.2μg),施加相同的超声处理循环一次或两个额外的循环。

       乳房ECM孤立

      成年女性Sprague-Dawley无污染鼠(Harlan-Teklad,印第安纳波利斯,IN)被安置并在符合科罗拉多州大学健康科学中心动物护理和使用委员会和人文护理的国家卫生政策研究所的18周安乐死使用实验室动物。收获淋巴结无骨髓乳腺,冷冻冷冻,并储存在-80℃。基于先前描述的协议进行乳房ECM隔离(
      • 安排
      • Mitrenga T.
      • 麦迪亚尼尔S.
      • Kaeck M.
      乳腺ECM组成和功能通过生殖状态改变。
      )使用来自六只大鼠的池合床乳腺组织。将冷冻腺体短磨削并在高盐中提取/N - 乙基马来酰亚胺溶液(3.4 m NaCl, 50 mm Tris-HCl,pH 7.4,4米m EDTA, 2 mm N - 含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的乙基马来酰亚胺。通过两个离心循环富集ECM(RCF)富集匀浆 最大限度 110,000× g,30分钟,4℃),重悬于中盐/尿素溶液中并在4℃下萃取过夜。在RCF下造粒样品 最大限度 110,000× g并且,ECM富含上清液在4℃下被广泛透析(分子量截止,12,000-14,000 kDa;光谱,Rancho Dominguez,Ca)。

       三维(3D)细胞培养测定

      该协议从krause修改 等等。 (
      • 克雷德S.
      • Maffini M.V.
      • SOTO上午
      • Sonnenschein C.
      一种研究乳腺基质上皮相互作用的新型3D体外培养模型。
      )。简要介绍1:1体积比为600μg/ mL初始大鼠乳腺癌或600μg/ ml matrigel和10.0mg / ml基质素。将对数相MCF12A细胞(40,000 /孔)悬浮在500μL的ECM /基质胶混合物中,并将其接种成10.5mm孔(0.4-μm)的12孔板(BD Biosciences)。在将600μl培养基添加到每个凝胶中并进入每个孔中,将凝胶固化在37℃下在37℃下固化60分钟。培养基由Dulbecco的改良Eagle的培养基/ F-12(Hyclone,Logan,UT),5%马血清(Hyclone),10μg/ ml胰岛素(Intergen,Burlington,MA),500ng / ml氢化体(Sigma)组成, 20ng / ml重组人表皮生长因子(Bd Biosciences)和100ng / ml霍乱毒素(列出生物实验室,Campbell,Ca)。在培养的第13天在Zeiss Axiovert 25显微镜上拍摄图像(100×)。

       强阳离子交换

      使用10×2.1mm和250×2.1mm多磺酰基串联的Matrigel消化对强阳离子交换(SCX)分馏进行串联进行。 KCl的梯度(300米m)在20%ACN中,使用多维色谱系统(Ettan MDLC,GE Healthcare),在45分钟内以100μl/ min的流速进行0.1%Fa。由于肽较低,SCX分馏 体内 使用串联的两种10×2.1mm多硫氨乙基一列进行乳腺ECM。对于该样品,KCl梯度超过25分钟进行,流速为80μL/ min。将每个100μl级分浓缩至〜40μl以除去ACN。对每馏分的总共8μL进行NLC-MS / MS分析。

       电喷雾电离质谱法

      在LTQ-FT超杂化质谱仪上分析样品。使用双毛细管/纳米upp HPLC系统(Agilent 1200,Agilent,Palo Alto,CA)实现肽脱盐和分离。在该系统上,将8μl样品加载到捕获柱上(Zorbax 300sb-C.18;尺寸,5×0.3毫米; 5μm)并以5%ACN,0.1%FA洗涤,流速为15μl/ min 5分钟。此时,将捕获柱以350nl / min的流速与纳米ump放在一线上。 85分钟从8%ACN至40%ACN的梯度用于分离肽。该柱由内部拉动的360-nm外径/ 100nm内直径熔融二氧化硅毛细管与木星C组成18 树脂(现象,托兰,加利福尼亚州)。使用内部内置的柱加热器将柱保持在恒定的40°C处(
      • Speers a.e.
      • 黑人A.R.
      • 吴C.C.
      升高温度促进整体膜蛋白的霰弹枪分析。
      )。使用仪器提供的Xcalibur(2.0.6版)软件进行数据采集。通过顺序记录MS扫描(m/z 400-2000)在ICR细胞中,而三毫秒2 通过CID在离子阱中获得扫描,用于最强烈的离子。在45秒内拍摄给定离子后,将离子排除在150秒之后。

       MS数据分析

      原始蒸馏器(加州大学旧金山)程序用于使用默认设置将来自原始光谱的解剖封顶峰列表从原始光谱到吉祥物“.mgf”格式。这些峰值列表被搜查针对IPI.Mouse(v3.53.fasta)数据库(55,200蛋白序列)用于Matrigel或ipi.rat(v3.53.fasta)数据库(39,924个蛋白序列)使用蛋白质探测器的大鼠乳腺癌样品的数据库(39,924个蛋白序列) ,LC Batch-Tag Web(第5.0版,加州大学旧金山)和吉祥物 TM值 服务器(版本2.2,矩阵科学;只在 补充 数据)。前体质量耐受设定为片段离子容差的±6ppm和±0.6Da。使用胰蛋白酶特异性允许错过的乳裂。允许氧化氧化,蛋白质N-末端乙酰化和肽N-末端焦化酸形成的修饰,并且Cys氨基甲酰化被设定为固定改性。对于I型胶原蛋白(COL1)的实验,将脯氨酸和赖氨酸的羟基化加入到可变修饰中。此外,对于COL1实验,将吉祥物报告过滤,仅允许具有离子分数的肽比赛>6和需要大胆的红色匹配的蛋白质。在蛋白质探测器中,进行每种肽的最多八种可变的修饰,以允许许多胶原胰蛋白肽中存在的高水平羟基化。使用Ultrasonication使用COL1但没有胰蛋白酶的实验,没有酶特异性( IE。 Fig. 1, lane 5)。对于所有搜索,使用两个搜索引擎使用的默认参数搜索诱饵数据库(反转和随机)来确定错误的发现率。期望两个程序用于两个程序的截止<0.005并具有两个或更多个独特的肽命中。映射到独特的蛋白质序列并达到上述预期截止的剩余肽鉴定是给予的 补充 电子表格。二次胶原数据库搜索是使用蛋白质勘探器进行两者进行的 体内 派生样本集。使用以下例外使用相同的搜索参数:允许总共六种可变改性,允许脯氨酸的羟基化/氧化,并使用更严格的鉴定标准。该标识必须达到低于0.001的预期值,并且单个肽评分大于10,并且识别必须从原始搜索中尚未识别的光谱产生。尽管修饰的数量和修饰的数量(通常用两种,三种羟基化/氧化的脯氨酸鉴定出肽的数量,但这些匹配通常仅被认为是匹配的匹配,并且这些比赛用于报告选择的一种独特的肽最高分)。胶原蛋白大鼠数据库包括IPI.rat(40蛋白)中的独特胶原蛋白条目,同样地胶鼠鼠标数据库包括IPI.Mouse(53蛋白)中的所有独特的胶原蛋白条目。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1胶原蛋白I型消化效率。 显示了Col1消化条件的1D SDS-PAGE图像。将1mg / ml的21μlCOL1加载到每个车道中。 Lane 1,未消化的COL1; lane 2,COL1减少和烷基化,然后用胰蛋白酶过夜消化; lane 3, 和...一样 lane 2 但不降低和烷基化(*); lane 4用rapigest减少,烷基化和胰蛋白酶消化过夜; lane 5,Col1减少并用三个超声波循环处理; lane 6,COL1减少并用三个超声波循环治疗,存在胰蛋白酶; lane 7,用三个超声辅助胰蛋白酶消化治疗的COL1,然后在Rapigest存在下过夜(**)胰蛋白酶消化。

      结果

       大鼠尾型I胶原消化

      选择胶原蛋白用于方法优化,以确定有效的胰腺炎纤维化ECM蛋白的有效胰腺炎食谱所需的参数。通过各种消化方法制备两种不同的大鼠尾胶原制剂(适用于制备1的三份和制备2的全丙烯酸酯)。基于凝胶带强度和质谱法鉴定各种消化方法的效率。在37℃下隔夜胰蛋白酶消化,导致通过NLC-MS / MS分析分别具有七个和五个独特的α1和α2链肽的有限蛋白水解,得到每个链的5%覆盖率( Fig. 1 , 车道3. , 和 表I. ,第2行)。 表I. ,第1行表明,随着还原和烷基化,分别用7和12%的覆盖率鉴定12和27个独特的肽。首先减少和烷基化的样品之间的弹性图案和强度似乎没有差异(lane 2)和不是(lane 3)。然而,肽鉴定结果表明消化效率的可测量差异。
      表I. MS / MS鉴定胶原蛋白的辨证
      使适应
      a n 除非另有说明,否则= 7。
      超声波Col1亚基 分数 独特的肽覆盖范围
      %
      O / N消化(Fig. 1,lane 2)α1397127
      α28172712
      O / N消化(Fig. 1, lane 3)α124275
      α216755
      表面活性剂辅助O / N胰蛋白酶消化(Fig. 1, lane 4)α114714728
      α213044231
      没有胰蛋白酶(Fig. 1, lane 5)
      b n = 4.
      vα1000
      α2000
      UATD( Fig. 1, lane 6)vα110533318
      α213804222
      uatd然后表面活性剂辅助的o / n消化(Fig. 1, lane 7)vα127798535
      α220266039
      a n 除非另有说明,否则= 7。
      b n = 4.
      接下来,我们应用了一种消化方法,证明是非常成功的其他难以消化的样品,例如膜蛋白。胶原蛋白我与Rapigest混合,一种不干扰胰蛋白酶活性的酸不稳定的表面活性剂(
      • umar A.
      • 戴尔巴特J.C.
      • Timmermans上午
      • Foekens J.A.
      • Luider T.M.
      通过基质辅助激光解吸/电离 - 飞行激光解吸/离子溶解时间和基质辅助激光解吸/电离 - 飞行量/时间的基质辅助激光解吸/电离时间来优化微小乳腺癌组织肽分析。
      )。然后将样品减少,烷基化,并用胰蛋白酶消化过夜。 1D凝胶条带(Fig. 1, lane 4)肽鉴定结果显示出对标准消化方法的显着改善,平均47个独特的胶原蛋白α1(28%覆盖率)和42个独特的α2肽(31%覆盖率; 表I. )。然后,我们应用了一个超声波循环,由超声处理组成60秒,30秒和60秒的循环,并重复两次。条带图案表明,没有单独的蛋白酶超声波暴露不会显着降低胶原1带尺寸(Fig. 1, lane 5)。与该观察结果一致,四丙烯酸NLC-MS / MS分析(来自第一胶原制剂的三个,也是甚至没有酶特异性搜索的肽鉴定( 表I. ,第4行)。使用在循环之前添加胰蛋白酶的超声处理导致观察到的高分子量带的显着减少(lane 6)显着的肽鉴定结果33和42种独特的肽,得到18和22%的覆盖率( 表I. 尽管消化时间非常短,但分别为6分钟的超声波暴露。最后,我们施加超声处理方法,然后施加表面活性剂辅助过夜消化,进一步增加消化(lane 7)。这种组合方法表明,NLC-MS / MS分析鉴定的肽数量分别鉴定为α1和α2链的平均85和60个独特的肽和35%和39%的覆盖率。累积地,具有表面活性剂辅助消化的超声波的组合方法对胶原蛋白I的胰蛋白酶I的胰蛋白酶消化效率进行了添加作用,与过夜消化相比,蛋白质鉴定分数和蛋白质序列覆盖率显着增加。

       Matrigel消化和蛋白质组学分析

      为了评估优化的消化方案增加衍生自EHS小鼠软骨肉瘤的地下室膜中鉴定的蛋白质数量的能力,通过经典的过夜消化(两者和没有表面活性剂)消化Matrigel,具有超声辅助胰蛋白酶消化和方法合并。结果显示在 Fig. 2。与胶原I样品获得的1D凝胶结果类似,使用标准胰蛋白酶消化协议消化过夜时,发生了很少的消化(Fig. 2, lane 2)。进行降低和烷基化的Matrigel,然后过夜胰蛋白酶消化显示出消化的改善(Fig. 2, lane 3)。然而,即使在这些条件下,观察到高分子体积带,证明不完全消化。通过超声波辅助消化来实现改善的消化(Fig. 2, lane 4)在超声处理辅助消化后再次进行减少,然后再次烷基化( Fig. 2, lane 5)。我们证实,在凝胶上观察到的条带的减少导致胰蛋白酶增加了2-H NLC-MS / MS。超声波辅助消化方法导致鉴定蛋白质更多的蛋白质〜50%,蛋白质评分增加5倍,用于前五种蛋白质鉴定(结果未显示)。从胰蛋白酶暴露于表面活性剂的样品中染色的蛋白质显示出广泛的消化(Fig. 2, lane 6)。然而,超声和表面活性剂辅助消化方法的顺序治疗导致了最少的可观察蛋白质染色,表明这种方法会增加蛋白质识别(Fig. 2, lane 7)。通过使用我们的结合消化方法获得的这些有希望的结果,我们追求了Matrigel的深入蛋白质组学分析。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2消化matrigel。 1D SDS-PAGE图像显示二硫化物状态对使用SATD,UATD和组合方法的Matrigel消化效率的影响(车道3-7) 相对 过夜胰蛋白酶消化(lane 2)。所有通道都装满了21μgmatrigel。在不降低二硫化物的情况下,在消化程序后仍然保持高分子体重带( 车道2. 4)。使用UATD消化的样品显示出少量的分子量带(lane 5)。 UATD和SATD的组合(lane 7)显示蛋白质染色量最少。 红色的& Alkyl,减少和烷基化。
      具有与组合消化方法的消化基质胶,我们使用二维色谱分离方法鉴定蛋白质,然后在LTQ-ICR质谱仪上进行串联MS分析。在SCX运行期间收集总共64个级分,基于最高UV信号强度通过NLC-MS / MS分析36。通过针对国际蛋白质指数数据库(IPI.Mouse)来搜索数据,我们确定了许多地下室膜和传统的ECM蛋白。绝大多数蛋白质由鉴定,蛋白质序列覆盖率和最佳期望值的数量决定是基底膜组分层粘连蛋白α,β和γ; niden(entactin);和perlecan(hspg2)。我们确定了额外的蛋白质类别,包括代谢酶,转录因子,可溶性细胞外蛋白和蛋白酶。总之,使用少于0.005的预期值和至少两个独特的肽,以高置信度识别310个蛋白条目。所产生的假发现率(FDR)计算为0.26%。鉴定出鉴定的另外的ECM蛋白,排名前25位排名蛋白质鉴定 表二。提供了完整的标识列表 补充 数据包括额外的肽鉴定,其映射到独特的蛋白质序列(总FDR为0.71%)。
      表二Matrigel鉴定的蛋白质部分列表
      蛋白质名称加入否。独特的肽蛋白质得分最好的期望价值
      前25名蛋白质
      Laminin亚单位α11 IPI. 00113726.3.150484548.7
      Laminin亚基β12 IPI. 00338785.3.113369962.8
      Perlecan(HSPG2)3 IPI. 00515360.8104332637.6
      Laminin亚单位γ14 IPI. 00400016.1.80278955.3
      nidogen-15 IPI. 00111793.1.1.61198258.5
      Laminin亚单位α56 IPI. 00116913.3.2382310.6
      v7 IPI. 00227299.62981553.6
      纤连蛋白 1.
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      8 IPI. 00352163.3.2884221
      血清白蛋白9 IPI. 00131695.3.2474039.8
      过氧化物同源物10 IPI. 00461384.52166421.3
      78-KDA葡萄糖调节蛋白11 IPI. 00319992.1.2272933.9
      Lamin-B1
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      12 IPI. 00230394.51544330.1
      ATP合酶亚单位β,线粒体13 IPI. 00468481.21345938.8
      纤维蛋白原β链14 IPI. 00279079.1.1543832.4
      低密度脂蛋白受体相关蛋白215 IPI. 00349520.5154734.7
      60-KDA热休克蛋白16 IPI. 00308885.61342322
      肌球蛋白-917 IPI. 00123181.4134449.6
      热休克70-KDA蛋白9
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      18 IPI. 00880839.1.1241621.1
      脯氨酰4-羟化酶,β多肽
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      19 IPI. 00122815.3.1132127.1
      SPARC. 20 IPI. 00126343.1.1134944.4
      过渡因内质网ATP酶21 IPI. 00622235.51235626.2
      serotroanferrin22 IPI. 00139788.21235620.8
      UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶123 IPI. 00762897.21235611
      Spectrinα链的同种型2,脑24 IPI. 00753793.2103316.6
      补体组件因子h25 IPI. 00130010.4929012.8
      其他ECM蛋白质
      Lamininβ22-1 IPI. 00109612.2.9(
      • 安排
      • o'brien J.
      • 鲁道夫M.
      • 斯坦坦T.
      • Borges V.
      患有乳腺的微环境介导乳腺癌进展。
      )
      2606.5
      Perlecan同种型(HSPG2)3-1 IPI. 00113824.1.88 (
      • 安排
      • Mitrenga T.
      • 麦迪亚尼尔S.
      • Kaeck M.
      乳腺ECM组成和功能通过生殖状态改变。
      )
      281335.5
      nidogen-25-1 IPI. 00719919.210 (
      • 锡尔莫尔S.
      • raccurt m.
      • 格拉德F.
      • Gleyzal C.
      • Grimaud J.A.
      • Sommer P.
      溶酶氧化酶基因在原位和侵袭性导管乳腺癌中的基质反应中的表达。
      )
      31712.6
      agrn;阿富菊2的agrin36 IPI. 00378698.682477.5
      胶原蛋白α2(iv)43 IPI. 00338452.3.8/10
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      234/332.
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      7
      胶原蛋白α1的同种型2(XVIII)118 IPI. 00131476.24/1
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      112/11
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      4.1
      胶原蛋白α1(iv)120 IPI. 00109588.43/8
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      92/166
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      3.1
      菲比林-1的同种型c170 IPI. 00230432.23745.4
      Laminin亚单位α4215 IPI. 00223446.54983.4
      胶原蛋白α1(XV)394 IPI. 00409035.5.2432.9
      Von Willebrand因子含域的蛋白质1409 IPI. 00331609.71323.9
      sparcl1; SPARC样蛋白1615 IPI. 00308484.3.1262
      胶原蛋白α1(i)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00329872.1.11
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      239
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      21.6
      胶原蛋白α2(i)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00222188.43
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      78
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      7.7
      胶原蛋白α1(vii)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00134652.3.2
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      28
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      5.1
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      除了针对完整蛋白质序列数据库中搜索数据外,我们还执行蛋白质探测器搜索,用于仅包含鼠标胶原蛋白条目的数据库。这允许鉴定羟脯氨酸残基,这是常见的胶原蛋白修饰。在原始搜索中不允许此变量修改,因为它急剧增加了虚假发现率。产生源自未在原始搜索中分配的光谱的肽识别列在其中 补充 数据摘要 表二。我们观察到增加额外的肽,其增加了已经鉴定的胶原蛋白XVIIIα1(从4-5个独特的肽)和IVα1(从三到11个肽)和α2(从8-18个肽)条目(表二)。另外,制备三种新的蛋白质Iα1(11个肽)和α2(三种肽)和α2(三种肽)和VIIα1(两种肽)的新蛋白质鉴定。

       基于组织的乳腺ECM功能表征,消化和蛋白质组学分析

      由于每个器官的独特功能,预计ECM组合物将是组织特异性的。为此,从成年大鼠的乳腺分离ECM,其功能与Sonnenschein和同事开发的3D细胞培养模型中的基质胶(
      • 克雷德S.
      • Maffini M.V.
      • SOTO上午
      • Sonnenschein C.
      一种研究乳腺基质上皮相互作用的新型3D体外培养模型。
      )。人的永生化乳腺MCF 12A上皮细胞在用乳腺基质培养细胞时,在细胞培养时进行了广泛的分支形态发生,而当这些细胞用基质胶培养时,发生了很少的支化形态发生(Fig. 3)。该观察结果表明,正上皮细胞-ECM相互作用如预测,当细胞和ECM衍生自相同的组织时优化。为了理解这些组织特异性细胞 - ECM互动,我们将我们的消化方法应用于这一点 体内 衍生的乳腺矩阵。对于NLC-MS / MS分析,乳腺基质样品与Mattigel相同制备,除了可获得的起始材料较少,因此较少的阳离子交换分数(
      • tlsty t.d.
      基质细胞可以有助于致癌信号。
      收集并分析。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3乳腺分枝形态发生的3D细胞培养模型。 人乳腺上皮细胞在衍生自定义大鼠乳腺的基质存在下进行广泛的分支形态发生。 AB,MCF12A细胞用Matrigel以3D培养14天(100 \ x)。 CD,用大鼠乳腺基质3D培养的MCF12A细胞13天(100℃)。
      使用我们的优化消化方法,我们鉴定了大鼠乳腺基质(FDR,0.07%)中248蛋白蛋白的肽。顶部鉴定是ECM蛋白PER蛋白,具有超过600个肽;其中的96是独特的,得到37.5%的序列覆盖率()。第二次评分独特的ECM蛋白是胶原α3(VI)。在前五个排名的蛋白中也鉴定了装饰汀,Fiblillin 1和纤连蛋白。在乳腺基质中鉴定几种胶原蛋白,但不鉴定在Matrigel中,包括I和II型腓骨胶原蛋白。当数据被搜索到大鼠胶原蛋白数据库时,鉴定了几种另外的独特肽。最值得注意的是,胶原蛋白Iα1和α2链鉴定分别获得了另外的52和40个独特的肽(表III)。基于这些附加鉴定,胶原蛋白Iα1和α2,IIIα1和VIα1向上移动到前25个识别列表。与Matrigel一样,除了已知的细胞外基质蛋白外,还存在大量的细胞污染蛋白。
      表III乳腺ECM制剂中鉴定的蛋白质部分列表
      蛋白质名称加入否。独特的肽蛋白质得分最好的期望价值
      前25名蛋白质
      Perlecan(HSPG2)1 IPI. 00388323.5 96312537.5
      胶原蛋白α3(vi)2 IPI. 00565677.274242133.9
      Fiblillin-13 IPI. 00204006.1.75247132.5
      胶原α1(xiv)4 IPI. 00360766.453/14
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      1641/262
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      36.9
      纤连蛋白5 IPI. 00200757.1.51168432.8
      菲拉莫-A6 IPI. 00409539.3.50164631.7
      Lamininβ27 IPI. 00212868.1.45142935.8
      Plectin 6.8 IPI. 00209000.239117711.8
      Ahnak核蛋白9 IPI. 00769072.245147112.3
      光谱α链条10 IPI. 00209258.439132523.1
      Periostin,成骨细胞特异性因素11 IPI. 00193018.238130052.1
      Tenascin-X.12 IPI. 00394165.2.45129215.4
      v13 IPI. 00230941.545141769.1
      血清白蛋白14 IPI. 00191737.638127468.8
      Lamininγ115 IPI. 00363849.232111733.2
      拉米A. 16 IPI. 00201060.436122945.3
      肌球蛋白1117 IPI. 00764167.1.31105920.6
      nidogen-118 IPI. 00231136.52993028.1
      Lamininα419 IPI. 00361106.42688419.6
      光谱β.20 IPI. 00555287.22275514.2
      II型细胞骨骼521 IPI. 00382153.42574644.1
      德坦汀 22 IPI. 00199861.1.2369955.9
      管蛋白β-5链23 IPI. 00197579.21757645.9
      补体抑制因子h24 IPI. 00208659.1.2063823.5
      Lamin-B125 IPI. 00231418.52066542.8
      其他ECM蛋白质
      Perlecan(HSPG2)284-KDA蛋白1-1 IPI. 00778528.1.56 (
      • 安排
      • o'brien J.
      • 鲁道夫M.
      • 斯坦坦T.
      • Borges V.
      患有乳腺的微环境介导乳腺癌进展。
      )
      185432.3
      nidogen-218-1 IPI. 00372786.623 (
      • Hendrix M.J.
      • Seftor E.A.
      • Seftor R.E.
      • Kasemeier-Kulesa J.
      • Kulesa下午
      • Postovit l.m.
      用胚胎微环境重编程转移性肿瘤细胞。
      )
      74224.9
      骨蛋白26 IPI. 00362931.1.1955841.9
      胶原蛋白α1(vi)27 IPI. 00371853.3.19/5
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      626/122
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      25
      Lamininβ1.28 IPI. 00365542.32368220.4
      Lamininα2链条30 IPI. 00361301.3.175198.1
      拉加基31 IPI. 00190287.1.1649234.2
      胶原蛋白α2(vi)36 IPI. 00372839.3.14/3
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      490/63
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      20.6
      Lumican. 46 IPI. 00206403.1.1442337
      Biglycan.52 IPI. 00191090.1.1134934.7
      胶原蛋白α1(i)57 IPI. 00188909.28/52
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      259/1891
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      4.7
      胶原蛋白α1(XVIII)61 IPI. 00214859.56/2
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      186/30
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      5.9
      胶原蛋白α2(i)64 IPI. 00188921.1.6/40
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      179/1473
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      5.5
      胶原蛋白α1(XV)68 IPI. 00364868.3.6/2
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      193/43
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      5.4
      胶原蛋白α2(iv)82 IPI. 00365380.36/2
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      182/44
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      6.3
      菲比林-586 IPI. 00326179.3.513914.5
      Lamininα591 IPI. 00190577.451622.5
      胶原蛋白α1(vii)102 IPI. 00767686.24/1
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      127/13
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      2.3
      骨髓蛋白多糖114 IPI. 00206023.1.411122.9
      一咧嘴 121 IPI. 00562438.1.41054
      Papilin,蛋白转油蛋白样硫酸糖蛋白144 IPI. 00367768.3.3.41036.1
      胶原蛋白α1(iv)154 IPI. 00362887.3.2/1
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      80/19
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      2.2
      硫酸化糖蛋白1240 IPI. 00195160.1.2483.6
      Versican核心蛋白261 IPI. 00190776.1.2491.2
      von willebrand figure.291 IPI. 00210224.51350.6
      SPARC. 295 IPI. 00189424.21344.7
      Lamininα1319 IPI. 00363534.44681.9
      Von Willebrand因子含域的蛋白质1337 IPI. 00471665.1.1324.8
      类似于胶原蛋白α3(vi)380 IPI. 00370868.3.1270.8
      含EGF的纤维素样细胞外基质1388 IPI. 00365221.41261.8
      胶原蛋白α1(iii)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00366944.235
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      1304
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      46
      胶原α1(ii)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00394380.45
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      143
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      14.6
      胶原蛋白α1(v)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00365380.32
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      77
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      8.2
      胶原蛋白α2(v)
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      IPI. 00366945.3.2
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
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      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。
      5
      a 在仅胶原蛋白数据库中鉴定为羟基化/氧化脯氨酸作为可变改性。

      讨论

      在本研究中,我们研究了一种新的ECM蛋白溶液消化的新方法,其对标准胰蛋白酶的消化方法具有抗性。优化ECM消化协议的部分理论基于ECM蛋白作为上皮,间充质和干细胞功能的临界调节因子的近期欣赏。 ECM通过多种机制影响细胞行为,包括细胞形状,极性,基因表达,迁移,侵袭,增殖,组织特异性分化和死亡途径(
      • egeblad M.
      • littlepage l.e.
      • Werb Z.
      癌症进展中的肌纤维细胞孢子钳。
      ,
      • Werb Z.
      ECM和细胞表面蛋白水解:调节蜂窝生态学。
      ,
      • Schenk S.
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      来自细胞外基质的穴位[ic]网站的故事。
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      • Barcellos-Hoff M.H.
      制作肿瘤需要组织:表观生物学,癌症和微环境。
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      • tlsty t.d.
      基质细胞可以有助于致癌信号。
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      • Mueller M.m.
      • fusenig n.e.
      肿瘤基质在癌症中的朋友或敌人 - 双极作用。
      ,
      • 安排
      • 奇怪的R.
      • Mitrenga T.
      • 沃尔夫P.
      • Kaeck M.
      纤连蛋白片段在小鼠乳腺上皮细胞中诱导MMP活性:乳腺组织重塑中作用的证据。
      )。事实上,在癌细胞中,ECM已被鉴定为关于转化表型表达的上皮细胞突变(
      • 安排
      • elias a。
      multiStep肿瘤瘤和微环境。
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      • Hendrix M.J.
      • Seftor E.A.
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      • Kasemeier-Kulesa J.
      • Kulesa下午
      • Postovit l.m.
      用胚胎微环境重编程转移性肿瘤细胞。
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      紧张稳态和恶性表型。
      )。尽管这些重要作用,但组织中ECM的蛋白质组成在很大程度上是未知的。这是因为迄今为止,由于样品消化的挑战,ECM的详细生化表征的蛋白质组学方法受到严重的限制。例如,使用目前的富含胶原蛋白的样品的方法,仅鉴定到从成纤维细胞衍生的基质获得的胶原蛋白(
      • Pflieger D.
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      两种皮肤成纤维细胞分泌细胞外基质蛋白的比较蛋白质组学分析。
      )。与这些公布的数据一致,在大鼠尾胶原蛋白的胰蛋白酶消解后,我们鉴定了两个亚基的平均七和五种肽。通过在消化之前减少并烷基化样品,鉴定出显着更多的肽使鉴定为12和27的平均独特肽对于两个亚基。这种差异可能是由于保护三级结构的二硫键,导致蛋白水解的保护。相反,使用我们的组合消化方法,我们鉴定了α1链和60个α2链的60个独特肽的平均85个独特的肽。两种不同胶原制剂的鉴定结果的差异是最小的,表明这种方法的多功能性。
      据报道,涉及气泡成核,生长,然后快速崩溃,这是一种称为空化的超声。据报道,在最后一步中释放的能量以产生升高的温度,压力和自由基形成(.. 哦) (
      • Riesz P.
      • Berdahl D.
      • 克里斯曼C.L.
      通过超声波在水性和非水溶液中产生自由基。
      )。使用我们的消化方法,我们观察到从超声波循环的最小全球样品加热,观察到的38-48°C范围。在探索超声的初步实验中,在没有胰蛋白酶的情况下,我们观察到在使用高功率设置时观察到1D凝胶上的蛋白质带的损失(数据未显示)。这些结果类似于戴维斯的研究结果(
      • 戴维斯K.J.
      氧自由基蛋白质损伤和降解。 I.一般方面。
      )和戴维斯 等等。 (
      • 戴维斯K.J.
      • Delsignore M.E.
      • 林S.W.
      氧自由基蛋白质损伤和降解。 II。修饰氨基酸。
      当用辐射产生的蛋白质样品处理蛋白质样品时,蛋白质条带减少 .哦,在o的存在下2。似乎具有足够的能量输入广泛的酰胺骨干裂解,可能是通过类似的基于基于基于基于基于的机制。通过这些初步实验引导我们开发了我们的目前的方法,使用低功率输入和超声波暴露的循环,以最大限度地减少与温度相关的效果。
      为了确定我们超声波疾病对胰蛋白酶活性的影响,我们测试了超声治疗的能力 相对 控制胰蛋白酶以消化还原和烷基化BSA。我们观察到用超声处理处理胰蛋白酶鉴定的肽减少〜60%,表明酶活性的部分丧失(数据未显示)。然而,尽管在胰蛋白酶活性中存在这种部分损失,但组合的超声波和表面活性剂辅助的胰蛋白酶消化方法使我们能够以前所未有的分辨率表征两种组织ECM制剂的蛋白质组成。胰蛋白酶活性的一些或全部损失可能是超声的是与标准过夜消化中观察到的自身分解的结果。此外,使用没有胰蛋白酶的超声波方法保留蛋白质条带,证明了胰蛋白酶蛋白分解的要求(Fig. 1, lane 5 )。
      Matrigel的蛋白质组合物是感兴趣的,因为它在20世纪70年代发现以来,Matrigel已经用作基础膜替代用于细胞培养工作的基础膜替代,其中它已被证明支持分化(
      • 金H.S.
      • Lee B.L.
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      在体外分化对重构基底膜的结肠癌细胞系分化。
      ), 生长 (
      • 徐C.
      • Inokuma M.S.
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      • 金J.D.
      • 木匠M.K.
      无差异化人胚胎干细胞的无分化饲喂的生长。
      )和有机型形态发生(
      • 安排
      • 奇怪的R.
      • Mitrenga T.
      • 沃尔夫P.
      • Kaeck M.
      纤连蛋白片段在小鼠乳腺上皮细胞中诱导MMP活性:乳腺组织重塑中作用的证据。
      )各种细胞系。此外,Matrigel是在肿瘤异种移植研究中选择的ECM制备,其促进免疫染色小鼠的肿瘤细胞存活,生长和转移(
      • 弗里曼R.
      • Kibbey M.C.
      • 罗伊斯L.S.
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      在用基质胶中投射后,在胸腺小鼠中增强癌症的肿瘤生长和已建立的人和鼠肿瘤细胞。
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      • DAS GUPTA T.K.
      人乳腺癌与胸肉小鼠Matrigel的生长和转移。
      )。虽然Matrigel已被广泛接受作为大多数3D细胞培养工作的标准ECM矩阵,但尚未报告该基质的蛋白质组学表征。在这项研究中,我们发现Matrigel包括但不限于传统的ECM蛋白,如Laminin 1,Niden,Perlecan,胶原IV和纤连蛋白(
      • 袁L.S.
      • Siegel M.
      • Choi K.
      • Khosla C.
      • 米勒C.R.
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      • Piwnica-蠕虫D.
      • 丰富的小时
      转谷氨酰胺酶2抑制剂KCC009破坏细胞外基质中的纤连蛋白组装,并使原位胶质母细胞瘤敏化为化疗。
      )。还鉴定了几种类别的额外细胞外和细胞蛋白。其中几种是基质改性酶,如赖氨酸氧化酶,脯氨酰3-羟基酶和赖氨酸羟基酶,这对于胶原蛋白的稳定性和分子间交联是必不可少的。
      在Matrigel中鉴定的几种细胞蛋白是已知的焦蛋白β1,瞳孔,α-肌醇蛋白,丝素,vinculin,kinectin,ARP2 / 3和局部粘附激酶等焦蛋白粘连或细胞运动复合物的成员。它们的鉴定表明,在整个ECM隔离程序中可以保守一些细胞-ECM蛋白质相互作用。此外,鉴定了几种与焦粘连相关的细胞骨骼和中间丝蛋白。通过与细胞表面ECM受体稳定的蛋白质 - 蛋白质相互作用或纯化方法的非特异性伪像是感兴趣的,并且仍有待确定的问题是纯净的蛋白质 - 蛋白质蛋白质分离的问题。令人惊讶的是,应激响应蛋白质缺氧上调蛋白1,过氧化物素,热休克蛋白70(1a,1b,5,8和9),hsp60和hsp90α和β在Matrigel中相对丰富。 HSP可以介导“国内”危险信号,这代表了对细胞应激的免疫应答的重要引发剂(
      • 张X.
      • 搬运工D.M.
      内源危险信号巨噬细胞激活。
      )。此外,许多HSP被建议为含量的受体的内源性配体(
      • Tsan m.f.
      • 高B.
      热休克蛋白和先天免疫。
      )。总之,优化的消化方法允许我们检测可能对众多功能后果具有功能后果的蛋白质 体外 体内 使用Matrigel的实验。
      从3D培养测定中显而易见的ECM基质的组织特异性,其中通过从大鼠乳腺萃取的ECM蛋白比Matrigel从大鼠乳腺萃取的ECM蛋白更大程度地促进了人乳腺上皮细胞的腺体形态发生。在大鼠乳腺基质和基质胶之间观察到蛋白质组合物的几种差异,其可能有助于这些差异。尽管目前的数据不提供直接蛋白质定量,但可以以半定量方式使用相对蛋白质等级,序列覆盖率和独特肽的数量。首先相对于Matrigel,发现乳腺癌在纤连蛋白(Fn)中高,在层粘蛋白1(α1/β1/γ1)中高。 MRNA和蛋白质水平的纤连蛋白表达已被证明依赖于乳腺的发育状态(
      • 安排
      • Mitrenga T.
      • 麦迪亚尼尔S.
      • Kaeck M.
      乳腺ECM组成和功能通过生殖状态改变。
      )。特别是在青春期和妊娠期间发生的腺体扩张期间上调,并用哺乳期后发生的腺体回归下调(
      • 安排
      • Mitrenga T.
      • 麦迪亚尼尔S.
      • Kaeck M.
      乳腺ECM组成和功能通过生殖状态改变。
      )。与这些观察结果一致,已显示乳腺FN表达被卵巢激素升级(
      • 伍德沃德T.L.
      • Mienaltowski A.S.
      • modi r.r.
      • Bennett J.m.
      • 哈斯林S.Z.
      纤连蛋白和α(5)β(1)整联蛋白是正常小鼠乳腺的发育和卵巢类固醇调节。
      )。乳腺中Fn的这种动态表达模式与报告的Laminin 1 mRNA和蛋白质水平相反,它们在妊娠,哺乳期和断奶诱导的腺体回归中保持在相对恒定的水平(
      • 安排
      • Mitrenga T.
      • 麦迪亚尼尔S.
      • Kaeck M.
      乳腺ECM组成和功能通过生殖状态改变。
      )。此外,与层粘连蛋白相比,在3D培养模型中添加纤连蛋白的增殖增加MCF10A细胞的增殖,一种人的永生化但未转化的线,导致较大的腺体大小。然而,在该研究中未观察到与我们的组织特异性乳腺基质观察到的支化形态发生(
      • 威廉姆斯下午
      • Engler A.J.
      • Slone R.D.
      • Galante L.L.
      • Schwarzbauer J.E.
      纤连蛋白表达调节腺分化期间的乳腺上皮细胞增殖。
      )。最近,据报道,添加胶原蛋白I足以诱导3D培养的乳腺上皮细胞中的分支形态发生(
      • 克雷德S.
      • Maffini M.V.
      • SOTO上午
      • Sonnenschein C.
      一种研究乳腺基质上皮相互作用的新型3D体外培养模型。
      )。仅在大鼠乳腺基质中鉴定潜在的相关性,胶原II,III和V肽,与Matrigel相比,鉴定了I型胶原蛋白的肽显着更多的肽。因此,具有纤连蛋白的音乐会的纤维状胶原蛋白可以促进由大鼠乳腺基质制剂诱导的3D培养测定中的支化形态发生。
      在大鼠乳腺基质中,胶原蛋白VI和Fibrillin,其形式是对于组织弹性,细胞附着和运动性重要的微生物组件,分别被鉴定为具有74和75个独特的肽鉴定的第二和第三顶蛋白。第四种蛋白质,胶原蛋白XIV(脱果)(
      • ehnis t.
      • Dieterich W.
      • 鲍尔米
      • Schuppan D.
      胶原氧化糖(脱紫外兰)细胞粘附位点的定位。
      )属于Facit(具有中断三重螺旋的纤维相关胶原蛋白)的胶原蛋白组,能够结合胶原型VI和牙装蛋白,并被认为是其他胶粘剂之间的交联剂(
      • olsen b.r.
      胶原蛋白IX。
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      • 棕色J.C.
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      • Wiedemann H.
      • Timpl R.
      从人胎盘中分离的胶原型XIV的结构和结合特性。
      )。尽管对Fibrillar胶原蛋白I-V具有较低或没有结合,但XIV胶原型型非螺旋区介导通过成纤维细胞介导胶原蛋白I凝胶的收缩,从而可能影响胶原蛋白原纤维的机械性能(
      • Nishiyama T.
      • McDonough上午
      • Bruns R.R.
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      XII型和XIV胶原蛋白在体外介导带状胶原纤维之间的相互作用,可以调节细胞外基质可变形性。
      )。因此,胶原蛋白型XIV /脱紫外线可参与稳定胶原型原纤维并影响其在乳腺中的三维布置。另外,据鉴定了Tenascin-X,并据报道有助于基质稳定性,并且可能参与胶原蛋白原纤维形成(
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      人对皮卡辛蛋白-X结构域与皮肤细胞外基质分子的相互作用。
      )。
      Matrigel和大鼠乳腺基质在分泌的蛋白多糖组合物中也不同,ECM组分具有高负电荷,其与血清蛋白质结合,包括生长因子,细胞因子和信号分子(
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      硫酸普康肝蛋白多糖细曲哺乳动物生理学。
      )。 Perlecan在两种矩阵中丰富,而Decorin在大鼠乳腺癌中普遍存在。在大鼠乳腺基质中仅发现了几种蛋白内酯,如肝素,吡吡汀,Versican,Versican和小亮氨酸富含蛋白多糖骨蛋白。 Perlecan首先从鼠EHS肿瘤中分离出来,并且已知是基底膜的整体组分,其中层粘连蛋白-1,胶原蛋白IV和纤连蛋白的结合位点。进一步的PERERECAN对于涉及分支形态发生的信号分子的功能是必不可少的,例如WNT和刺猬以及用作炎症细胞因子的缓冲液(
      • Bishop J.R.
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      蛋白多糖的细胞功能 - 概述。
      )。德坦蛋白还结合生长因子和细胞因子,介导胶原纤维组件,从而介导组织张力。随着3D培养建模越来越精致地反映 体内 微环境,在主要ECM粘附蛋白的背景下解决这些各种蛋白转移蛋白酶对细胞行为的影响将是重要的。最后的新方法开发,以最小化ECM制剂的细胞污染水平将进一步促进功能性测定和蛋白质组学分析。
      越来越清楚的是,ECM在确定细胞命运和行为方面发挥着重要作用。为了进行ECM的定量蛋白质组学分析,需要改进样品制备。我们的超声波随后过夜表面活性剂辅助胰蛋白酶消化方法显着增强了ECM蛋白的分析,足够灵活,可以使用各种样品 体外 体内 系统。这种有价值的方法将允许更全面的复杂ECM混合物表征复杂的ECM混合物,了解ECM在组织和疾病特定过程中的作用。

      致谢

      我们感谢Pavel Stric对稿件和Lindsay Hosford和Joanna Marcinkiewicz进行批判性阅读和评论,以提前方法开发贡献。我们还感谢Al Burlingame,Robert Chalkley,Aenoch Lynn,Shenheng Guan和Peter Baker,用于支持和进入蛋白质勘探和生蒸馏器。

      补充材料

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