使用多路复用离子迁移光谱法推进肝纤维化蛋白签名的高通量鉴定*

      使用较少的侵入性,更安全和更近期使用的疾病状态的快速诊断比目前所用的方法是医学领域的关键方向。虽然基于MS的蛋白质组学方法已经尝试满足这些目标,但临床相关的生物流体样本中巨大的蛋白质浓度的挑战,如临床相关的生物流体样本,加上满足人类生物多样性的需求已经放缓了他们的就业。在此,我们报告使用新的仪器平台,通过耦合快速气相多路复用离子迁移率分离的技术进步,通过液相色谱和MS耦合技术进步,从而显着提高测量灵敏度和吞吐量,进一步实现了未来的高吞吐量MS为基础临床应用。液相色谱 - 离子迁移率光谱 - MS平台分析来自60名后发纤维化进展和60例非传单患者的血液血清样品分析血清样品和60例非筛选患者的潜在型疾病表征。
      迄今为止基于MS的蛋白质组学技术的临床前和临床应用分析复杂的生物流体的预期缺乏,主要是由于分析敏感性和产量的缺陷。这些缺陷导致通常未能自信地检测和定量中等至低浓度的蛋白质的测量,或者没有提供足够的样本分析通量以进行统计相关性。目前利用具有更高敏感性的有针对性的MS分析来解决这些缺点(
      • Picotti P.
      • rinner o.
      • Stallmach R.
      • Dautel F.
      • Farrah T.
      • Domon B.
      • 文字H.
      • Aeberberold R.
      用于蛋白质和蛋白质素的选定反应监测测定的高通量产生。
      ,
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • Spiegelman C.H.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.
      • Keshishian H.
      • 霍尔S.C.
      • 艾伦S.
      • 黑人r.k.
      • 博赫斯C.H.
      • 降低C.
      • Cardasis H.L.
      • Cusack M.P.
      • 迪克德
      • 吉布森B.W.
      • 举行。
      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
      • carr s.a.
      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
      );然而,这些研究通常只分析鉴定为生物学显着的小蛋白质清单。临床应用中,靶向MS测量越来越常见(
      • Roschinger W.
      • Olgemoller B.
      • 指胡特R.
      • LieBl B.
      • Roscher A.A.
      分析质谱研究进展,改善遗传性代谢疾病的筛选。
      ,
      • 加利斯S.
      • Duriez E.
      • Domon B.
      选择的反应监测适用于蛋白质组学。
      ),他们审查的蛋白质数量有限并不一定反映人群中的生物多样性,在制定诊断中的个体疾病指数方面对诊断进行广泛的未明确测量(
      • 伍德科克J.
      “个性化医学”在药物开发和药物治疗中的前景。
      )。由于医学的未来进入了个人分析方法(
      • Chan I.S.
      • 吉斯堡G.S.
      个性化医学:进步和承诺。
      ,
      • 哈钦森L.
      个性化癌症医学:承诺和进步时代。
      ),基于MS的稳健高吞吐量临床测量的可能性是高度吸引力,但只有在可以解决其缺陷时才具有高度吸引力。
      获得越来越多地保留有针对性分析的益处的广泛未确定测量的初步步骤利用技术进步,例如更快的分离,更有效的离子源,具有更大动态范围的探测器,以及具有更高分辨率和精度的MS测量。已经采用先进的液相分离以提供显着的敏感性增加,如液相色谱(LC)中检测到的较高数量的蛋白质所示
      使用的缩写是:
      小姐
      质谱
      IM小号
      离子迁移光谱法
      LC.
      液相色谱法
      到F
      飞行时间
      m / z.
      群众对费用
      HCV.
      丙型肝炎病毒
      NP.
      非投手
      SP.
      进步慢速发展
      FP.
      快速进步
      C4A
      补充组件4a.
      ECM1
      细胞外基质蛋白
      lgals3bp.
      Galectin-3结合蛋白
      ACTB.
      细胞骨架β-肌动蛋白
      TGFBI.
      转化生长因子-β-诱导蛋白Ig-H3
      F12
      凝血因子XII.
      TGF-β1
      转化生长因子β
      vtn.
      Vitronectin
      l
      Lumican.
      F10
      凝血因子X.
      C5
      补充因子5.
      A1BG
      α-1B-糖蛋白
      CFH.
      补体因子H.
      IGFALS.
      胰岛素样生长因子结合蛋白复合酸不稳定亚基
      维生素K依赖性蛋白C.
      RBP4
      视黄醇结合蛋白4
      HPX.
      血红蛋白
      A2M
      Alpha-2-macroglobulin
      F2
      凝血酶原
      QSOX1
      巯基氧化酶1。
      1使用的缩写是:小姐
      质谱
      IM小号
      离子迁移光谱法
      LC.
      液相色谱法
      到F
      飞行时间
      m / z.
      群众对费用
      HCV.
      丙型肝炎病毒
      NP.
      非投手
      SP.
      进步慢速发展
      FP.
      快速进步
      C4A
      补充组件4a.
      ECM1
      细胞外基质蛋白
      lgals3bp.
      Galectin-3结合蛋白
      ACTB.
      细胞骨架β-肌动蛋白
      TGFBI.
      转化生长因子-β-诱导蛋白Ig-H3
      F12
      凝血因子XII.
      TGF-β1
      转化生长因子β
      vtn.
      Vitronectin
      l
      Lumican.
      F10
      凝血因子X.
      C5
      补充因子5.
      A1BG
      α-1B-糖蛋白
      CFH.
      补体因子H.
      IGFALS.
      胰岛素样生长因子结合蛋白复合酸不稳定亚基
      维生素K依赖性蛋白C.
      RBP4
      视黄醇结合蛋白4
      HPX.
      血红蛋白
      A2M
      Alpha-2-macroglobulin
      F2
      凝血酶原
      QSOX1
      巯基氧化酶1。
      -MS基研究(
      • 沉Y.F.
      • 赵立
      • Berger S.J.
      • 安德森G.A.
      • Rodriguez N.
      • 史密斯r.d.
      高效纳米级液相色谱法在线偶联,与质谱法使用纳米电子喷雾电离进行蛋白质组学。
      然而,然而,与血液样本最兼容的长LC分离是非常耗时的。快速气相离子迁移光谱(IMS)在几十毫秒的时间等级中进行的分离提供了额外的分离阶段和一种降低延长LC分离时间的需求的方式。在IMS分离中,在基于离子形状快速地通过缓冲气体进行电场进行电场的离子,例如紧凑的物种比延伸结构更快(
      • 梅森E.
      • 麦迪亚尔E.
      ,
      • Guevremont R.
      • SiU K.W.
      • 王J.
      • 丁L.
      电喷雾产生离子的组合离子迁移率/飞行时间质谱研究。
      )。 IMS可以耦合在LC和正交加速度飞行时间(TOF)MS阶段之间。通过将这三个正交分离结合到单个LC-IMS-MS仪器仪表平台中,多维高分辨率嵌套光谱是含有洗脱时间,质量电荷比(m / z.)样品中所有可检测离子的IMS漂移时间(
      • Sowell R.A.
      • Koeniger S.L.
      • 情人节S.J.
      • 月亮M.H.
      • CLEMMER D.E.
      纳米射线LC / IMS-MS和LC / IMS-CID / MS的蛋白质混合物。
      ,
      • 面包师E.S.
      • liveay e.a.
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • Danielson 3,W.f.
      • 之前的D.C.
      • 易卜拉欣Y.M.
      • Lamarche B.L.
      • Mayampurath上午
      • 什叶派A.A.
      • 霍普金斯D.F.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      • Belov M.E.
      一个LC-IMS-MS平台,提供高通量蛋白质组学研究的动态范围增加。
      )。该稿件的目的是评估LC-IMS-MS平台性能,仅针对LC-MS仅平台,并确定它与临床样本进行的程度如何。

      实验步骤

       LC.-IMS-MS和LC-MS

      对120种人血清样品的分析在内部建造仪器上进行,将1M离子迁移率分离与Agilent 6224 TOF MS升级到1.5米的飞行管,在增强的动态范围模式下提供〜25,000的分辨率(
      • 面包师E.S.
      • liveay e.a.
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • Danielson 3,W.f.
      • 之前的D.C.
      • 易卜拉欣Y.M.
      • Lamarche B.L.
      • Mayampurath上午
      • 什叶派A.A.
      • 霍普金斯D.F.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      • Belov M.E.
      一个LC-IMS-MS平台,提供高通量蛋白质组学研究的动态范围增加。
      )。在串联MS(MS / MS)模式和串联MS(MS / MS)模式和内部内置IMS-MS仪器。装有内部填充毛细管柱的全自动内置的4柱HPLC系统用于具有移动相A的仪器,其在水中由0.1%甲酸组成,在乙腈中包含0.1%甲酸(
      • liveay e.a.
      • 唐克。
      • 泰勒B.K.
      • Buschbach M.A.
      • 霍普金斯D.F.
      • Lamarche B.L.
      • 赵立
      • 沉Y.
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • 凯莉r.t.
      • UDSeth H.R.
      • 史密斯r.d.
      全自动四柱毛细管LC-MS系统,用于最大化蛋白质组学分析中的产量。
      )。在LTQ orbitrap Velos MS上进行100分钟的LC梯度(使用60cm长柱,其中O.360μm,即75μm,3μmc18 包装材料),而IMS-MS仅使用具有较短柱的60分钟梯度(具有相同尺寸和包装的30厘米)。两个梯度增加到0至60%的流动相B,直到当B在95%吹扫时,在运行的最后2分钟内。注入5μl的每个样品,用于分析,并且在100分钟梯度为0.4μL/ min的恒定流速下操作HPLC,对于60分钟的梯度为1μL/ min。从400-2000收集Velos MS数据 m/z 分辨率为60,000(自动增益控制(AGC)目标:1×106)。 IMS-MS数据从100-3200收集 m/z.

       其他方法

      提供样品制备,纳米普克,质谱,信息学方法和统计分析的详细说明 补充方法.

      结果

       IM小号-MS开发和改进,以提高敏感度和占空比

      由于IMS漂移细胞端子的显着离子损失,IMS-MS的实际使用最初通过其低灵敏度阻碍。通过重新聚焦离开源的离子和离开漂移细胞的离子(Fig. 1A),增加IMS阶段基本上无损(
      • 唐克。
      • Shvartsburg A.A.
      • Lee H.N.
      • 之前的D.C.
      • Buschbach M.A.
      • 李F.
      • tolmachev a.v.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      使用电动离子漏斗界面高灵敏度离子迁移率/质谱法。
      )。然而,由于空间电荷约束,使用有效的离子源和具有有效离子积聚的接口是有问题的。已经阻碍了IMS-MS的额外限制的限制是其固有的低占空比。在传统的IMS实验期间,离子在来自先前分组出口的所有离子之后仅脉冲到漂移细胞中,导致仅利用源中产生的小百分比的离子。为了解决该约束,开发了一种基于HATAMARD变换的多路复用方法,使得离子的离散数据包可以在漂移细胞中共存,只要它们由于扩散扩大而没有重叠(Fig. 1B1C)(
      • Belov M.E.
      • Buschbach M.A.
      • 之前的D.C.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      多路复用离子迁移率光谱分析 - 飞行时间的飞行时间质谱法。
      )。该方法基本上避免了空间充电限制,允许更高的IMS占空比,显着提高测量灵敏度,并且已经显示其伪随机序列的去卷积大大降低了所得离子的光谱中的噪声,从而为所得到的离子达到更高的信噪比(
      • 掌握B.H.
      • Belov M.E.
      • 之前的D.C.
      • Danielson 3,W.f.
      • 易卜拉欣Y.
      • 史密斯r.d.
      离子迁移率正交飞行时间质谱法的伪随机序列改性。
      )。除了从IMS分离的降低的频谱拥塞之外,这些改进具有更快的LC梯度时间,从而增加分析吞吐量(
      • 面包师E.S.
      • liveay e.a.
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • Danielson 3,W.f.
      • 之前的D.C.
      • 易卜拉欣Y.M.
      • Lamarche B.L.
      • Mayampurath上午
      • 什叶派A.A.
      • 霍普金斯D.F.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      • Belov M.E.
      一个LC-IMS-MS平台,提供高通量蛋白质组学研究的动态范围增加。
      )。为了利用更快的样品分析和更高的灵敏度测量,我们开发了一种LC-IMS-MS分析平台,具有上述敏感性改进,适用于临床聚焦的大规模蛋白质组学测量。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1A,ESI-IMS-MS平台的示意图,具有较小(绿色)和更大(红色)构象离子,示出了IMS漂移细胞中的尺寸分离。B,多路复用(左)和解复用(右)嵌套IMS谱显示IMS漂移时间(x 轴)和 m / z. (y 轴)对于9个肽混合物,其中8个离子包裹同时释放到漂移细胞中。 C,由于LC向LC-IMS-MS分析增加了第三维度,因此需要额外的图来说明LC总离子色谱图(x 轴)和IMS漂移时间(y 在(左)和(右)以后的人血清数据集和(右)解复用之前的轴)。 D,LTQ Orbitrap Velos(左)和IMS-MS(右)的MS光谱示出了IMS-MS频谱的降噪以及额外的漂移时间信息如何大大简化峰值检测,最终导致更多标识。 E,(Dynorphin a猪)3+ 将100pg / ml掺入人血清中,在LC-IMS-MS光谱中缠绕。光谱中的强度 B, C, D, 和 E 由颜色表示(红色是最少在对数刻度上最强烈而蓝色的)。

       LC.-IMS-MS平台评估和验证

      在新LC-IMS-MS平台的初始评估中,将其性能与LC-MS平台(包括市售LTQ orbitrap Velos)进行比较。在每个平台上分析九种血清样品,使用100分钟的LC梯度用于LC-MS,而60 min LC梯度用于LC-IMS-MS。即使分析时间较短,>与LC-IMS-MS平台相比,检测到20%的光谱分析(推定肽)与LC-MS平台( Fig. 1D),归因于从附加IMS分离和从多路复用的噪声比率的降低的频谱拥塞的观察。这些属性允许检测LC-MS实验中未见的其他蛋白质,以及在LC-IMS-MS分析中观察到具有显着差异丰度的肽的额外覆盖和置信度。为了进一步理解为什么在LC-IMS-MS平台中观察到更多特征,即使LC梯度还原,检测研究的后续限制并涉及两个平台分析与八个的正常人体血清样品的三种技术复制非人肽在100pg / ml至100ng / ml的浓度范围内。总的来说,LC-IMS-MS平台以与浓度的线性相关性,浓度为浓度~100×的浓度,较低的变异系数(CV)值和适度较高的吞吐量(60分钟 相对 100分钟)如图所示 表I.Fig. 1E。这些优点说明了增强动态范围,蛋白质组覆盖率和LC-IMS-MS平台的提高速度的潜在增益。为了允许直接比较TOF MS(60 min LC分离)和LTQ orbitrap Velos(100分钟分离),除去IMS漂移细胞。这两个仪器都显示出类似的检测限率(表I.[图表说明利用LC-IMS-MS平台观察的增加的测量灵敏度可以特别归因于IMS分离。
      表I.缩放丰度和变异系数(CV)夹在人血清中掺入60分钟的LC-IMS-TOF MS,60 min LC-TOF MS和100分钟LC-LTQ orbitrap Velos分析
      尖峰水平中性质量最丰富的充电状态肽缩放丰富
      a 3个数据集的肽丰度值平均并将其重新缩放到0至1000的范围,以进行直接仪器比较(通过将每个仪器中的最丰富的肽值除以1000)。
      和 CV Values
      b CV值位于括号中。
      ,
      c nd =未检测到。
      60分钟LC-IMS-TOF MS60分钟LC-TOF MS100分钟LC-LTQ Orbitrap Velos
      100 pg / ml梅特汀2844.754, 5n n n
      100 pg / mlDynorphin猪(Frag 1-13)1602.9831.7(18)n n
      1 ng / mldes pro ala bradykinin920.50221(12)n n
      1 ng / ml亮氨酸Enkephalin.555.27123(10)n n
      10 ng / ml3x旗肽2860.145115(8)125(20)n
      10 ng / ml物质P.1346.732126(7)138(18)112(19)
      100 ng / ml[Ala92] -peptide 62122.184868(4)848(11)841(12)
      100 ng / ml甲硫氨酸Enkephalin.573.2311000(3)1000(9)1000(10)
      a 3个数据集的肽丰度值平均并将其重新缩放到0至1000的范围,以进行直接仪器比较(通过将每个仪器中的最丰富的肽值除以1000)。
      b CV值位于括号中。
      c nd =未检测到。
      更全面地评估LC-IMS-MS平台的适用性,我们在涉及患有慢性丙型肝炎病毒(HCV)的患者的研究中使用它。 HCV代表全球公共卫生问题,影响估计130-170万人(
      • Llovet J.m.
      • Burroughs A.
      • 布鲁克斯J.
      肝细胞癌。
      )是美国和欧洲肝脏移植的主要原因,导致医疗保健服务的重大负担(
      • 夏尔顿M.
      • 鲁珀特克。
      • 贝尔S.H.
      • 低音N.
      • Schafer D.
      • Wiesner R.H.
      • 逃离K.
      • 魏Y.
      • Everhart J.
      长期结果和建模,以预测HCV感染的接受者中的结果:NIDDK肝移植数据库的结果。
      ,
      • 汤姆森B.J.
      • 芬奇r.g.
      丙型肝炎病毒感染。
      )。在这种疾病中,肝脏引发了称为纤维化的持续炎症和修复反应,其特征在于纤维组织的形成和肝脏瘢痕形成。由于HCV患者的预后与纤维化的发展有关和肝硬化和肝细胞癌的风险,准确评估纤维化进展对于患者护理是重要的。目前,肝活检代表了产生关于纤维化程度的准确信息的主要技术;然而,它们具有多种缺点,包括并发症的风险(IE。 由于小型标本尺寸和组织学评估中的可变性,对肺,肾脏或结肠的主要出血或无意穿刺,成本和偶尔不准确的结果。这些缺点刺激了无创方法的开发,可以可靠地预测,诊断和评估纤维化程度(
      • Mukherjee S.
      • Sorrell M.F.
      肝纤维化的非侵入性试验。
      ,
      • Plebani M.
      • 巴西D.
      慢性肝脏和胃病的无侵袭性评估。
      )。
      在这项研究中,最初利用了在华盛顿州医疗中心大学肝移植后选择的血液血清样品,以评估LC-IMS-MS平台进行临床用途(Fig. 2)。这些60个样本代表了30名患者,其非竞争者(NP)显示出没有或轻度纤维化的纤维化,而在20至4至4岁)上,与30名在类似时期开发的“第3至4阶段”纤维化的患者相比时间并分层进入缓慢的进展(SP; 3-4岁的纤维化术后3-4级)或快速进展(FP; 2年内2年内3-4阶段纤维化)。这些移植患者中的纤维化程度从0到4中得分,利用Batts-Ludwig评分系统,在特定时间点Pteransplant收集血清样品(见 补充表S1补充移植样本数据)。使用多变量方法,患者匹配移植器官的供体年龄,移植器官的冷缺血时间和活检时间,这是肝脏移植后患有肝脏移植后与复发性丙型肝炎相关的纤维化进展风险的最重要的临床变量。最终匹配导致30个病人对(进步者 相对 非竞争者)和所有样品被分析为利用LC-IMS-MS平台进行每个患者样品的全局蛋白酶评估的技术复制。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2在本研究中使用了来自肝移植后60例HCV患者的血液样本。 根据手术后几个月到几年的肝脏发生的纤维化量,患者分为非,缓慢或快速纤维化进展组。生物静止的患者为研究,使得非竞争者患者可以与缓慢或快速进展相匹配,导致30个注重良好的患者对。

       蛋白质的统计趋势,具有显着差异丰度的纤维化条件

      随着LC-IMS-MS的60个HCV肝移植血清样品的数据采集后,评估总体统计显着性。最初,分析了区分NP,SP和FP条件具有显着差异丰度的肽,然后通过合并这些肽来评价蛋白质意义。为了确定肽的重要性,PNNL的DANTE软件用于将峰值强度值转换为LOG2比例,并在统计上比较它们以用于生成P-and Q值的ANOVA(
      • Polpitiya A.D.
      • 钱W.J.
      • jaitly n ..
      • petyuk v.a.
      • Adkins J.N.
      • 营2nd,D.G.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      DANTE:用于测量 - 用于对 - 中型数据的定量分析的统计工具。
      )。我们的分析仅重点关注与Q值的显着改变肽<减少假阳性0.05,使用Dante的汇总参数(基于参考肽的缩放)卷成蛋白质。在蛋白质水平上也完成统计学比较,并且如果具有至少两种肽鉴定,蛋白质仅被认为是显着的。在LC-IMS-MS数据中,统计分析显示出在移植患者的血清中具有显着差异丰度的136个蛋白质。其中,观察到112个蛋白质以区分NP和FP患者组和NP和SP患者组之间的101个,如图77所示 Fig. 3a(参见 补充表S1-S5 对于详细的蛋白质和肽表)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3A,当非开发人与慢速(左)或快速进展(右)进行比较时,表示具有显着差异丰度的蛋白质的相对log2强度改变的热图。 每列代表60例患者中的一种和每一行的重要蛋白。清楚地观察到患者群体之间的趋势,但人口中的生物多样性也被辨别出来。 B,具有显着差异丰度的蛋白质进一步表征为四组:肝脏代谢,先天免疫应答,氧化应激或肝纤维化。显示26个选定的蛋白质显示,用于说明每种类别的趋势,其中UNIPROTKB中给出的基因名称用作缩写蛋白质名称。相对丰度的降低通过绿色显示,红色增加(缺失值显示为灰色)。

       功能分类和与以前发现的比较

      血清结果在功能分类,重点关注对肝功能的比较最相关的机制:肝脏代谢,免疫反应(先天和适应性),氧化应激,肝纤维化和分泌效应(补充表S5, Fig. 3B)。综合趋势揭示了纤维化患者肝脏代谢血清水平标记减少,氧化应激标记物增加(如前所述(
      • 钻石D.L.
      • Jacobs J.M.
      • Paeper B.
      • Proll S.C.
      • 格里尼科米。
      • Clishers Jr.,R.L.
      • Larson上午
      • yeh m.m.
      • 营2nd,D.G.
      • 史密斯r.d.
      • Katze M.G.
      人肝活检蛋白质组学分析:丙型肝炎病毒诱导的纤维化和线粒体功能障碍。
      )))。机械地,这反映了肝脏功能衰减的总代谢的减少,但在显着的氧化胁迫下似乎在导致应激响应蛋白的产生。与任何全面的血清/血浆蛋白质研究一样,也捕获多种签名免疫蛋白质,包括适应性免疫球蛋白反应,急性期和炎症标记的改变,以及补体途径。虽然可能与纤维化进展的标记不具体,但这些签名仍然反映了这种生物流体中可见的毛重变化,作为肝损伤的直接结果。然而,与HCV感染的具体相关性是在SP和FP患者组中表现出低丰度的补体组分4a(C4a),与最近的纸张一致,该纸张由于HCV因转录抑制而导致HCV感染患者的活性显着降低蛋白质(
      • imakiire K.
      • uto h.
      • 佐藤Y.
      • Sasaki F.
      • Mawatari S.
      • IDO A.
      • Shimoda K.
      • Hayashi K.
      • Stuver S.O.
      • ITO Y.
      • okanoue t.
      • Tsubouchi H.
      具有持续正常正常的丙氨酸氨基转移酶水平或慢性丙型肝炎的丙型肝炎病毒载体血清补体组分C4a水平的差异。
      ,
      • Banerjee A.
      • Mazumdar B.
      • 迈耶克。
      • 迪比塞布里。
      • 雷R.B.
      • 射线R.
      丙型肝炎病毒蛋白C4补充的转录抑制。
      )。
      在肝纤维化蛋白质组织中观察到有趣的趋势,允许分化NP,SP和FP患者组。细胞外基质蛋白如ECM1和半乳糖蛋白-3结合蛋白(LGALS3BP),其有助于慢性肝纤维化中的纤维化组织的胶原基质,SP和FP患者组中增加,以及细胞骨骼β-肌动蛋白(ACTB )已经显示出辐射诱导的皮肤和肌肉纤维化研究增加(
      • 马丁米
      • Lefaix J.L.
      • 盛顿P.
      • 电车F.
      • Daburon F.
      电离辐射后猪皮肤和肌肉纤维化中TGF-β1和β-肌动蛋白基因表达的时间调制。
      )。在FP患者中观察到在转化生长因子-β-诱导的蛋白IG-H3(TGFBI)和凝血因子XII(F12)中进行显着增加。因为TGFBI与转化生长因子β(TGF-β1)相关联,所以与包括组织纤维化的几种病理过程相关的多功能细胞因子表明,通过人肺成纤维细胞的TGF-β1诱导F12表达(
      • Jablonska E.
      • Markart P.
      • Zakrzewicz D.
      • Preissner K.T.
      • Wygrecka M.
      转化生长因子-β1通过Smad3和JNK信号通路在人肺成纤维细胞中诱导人凝血因子XII的表达。
      ),它们在FP患者中的直接向上相关性有意义。最后,在一些蛋白质标志物(如vitronectin(VTN),汉霉蛋白(Lum),凝血因子x(F10)和补体系数5(C5)中观察到差分响应,其降低SP,但是FP的增加。已经显示F10和C5驱动人肺和肝纤维发生中的纤维化反应(
      • 斯科顿C.J.
      • Krupiczojc M.A.
      • KONIGSHOFF M.
      • Mercer P.F.
      • 李玉。
      • Kaminski N.
      • Morser J.
      • 邮政编码
      • 马赫下午
      • Nicholson A.G.
      • Moffatt J.D.
      • Laurent G.J.
      • 德安C.K.
      • Eickelberg O.
      • 钱伯斯r.c..
      凝血因子x的局部表达增加有助于人和鼠肺损伤中的纤维化反应。
      ,
      • Hillebrandt S.
      • Wasmuth H.E.
      • Weiskirchen R.
      • Hellerbrand C.
      • Keppeler H.
      • Werth A.
      • 谢里林 - 索高山R.
      • Wilkens G.
      • Geier A.
      • Lorenzen J.
      • Kohl J.
      • 格雷斯纳上午
      • 母鸡S.
      • Lammert F.
      补体因子5是修饰小鼠和人类中肝纤维发生的定量性状基因。
      )并且由于两种蛋白质在FP血清中升高,并且在纤维发生中有记录的因果作用,现在可以被视为在移植患者移植肝脏中出现的快速病理衰退的关键潜在指标。
      目前的LC-IMS-MS平台血清结果也与先前报道的和验证了来自其他血清研究的HCV进展的有前途的生物标志物的良好良好。鉴定了五种蛋白质(A1BG,CFH,IGFALS,PROC和RBP4),并用选定的反应监测验证,作为潜在的血清生物标志物,将HCV感染的患者从健康个体中分离或区分HCV患者在不同的纤维化阶段(
      • 秦人
      • 周Y.
      • Lok A.S.
      • Tsodikov A.
      • yan x.
      • 灰色L.
      • 袁马。
      • 莫里茨R.L.
      • allas d。
      • OPENN G.S.
      • 引擎盖L.
      SRM靶向蛋白质组学寻找HCV诱导的纤维化进展的生物标志物对Halt-C患者的肝硬化。
      )。在我们的分析中以显着的差异丰度检测到所有五种蛋白质,并观察到相同的表达趋势。另外,诸如C4a(
      • imakiire K.
      • uto h.
      • 佐藤Y.
      • Sasaki F.
      • Mawatari S.
      • IDO A.
      • Shimoda K.
      • Hayashi K.
      • Stuver S.O.
      • ITO Y.
      • okanoue t.
      • Tsubouchi H.
      具有持续正常正常的丙氨酸氨基转移酶水平或慢性丙型肝炎的丙型肝炎病毒载体血清补体组分C4a水平的差异。
      ,
      • Banerjee A.
      • Mazumdar B.
      • 迈耶克。
      • 迪比塞布里。
      • 雷R.B.
      • 射线R.
      丙型肝炎病毒蛋白C4补充的转录抑制。
      ),LGALS3BP(
      • 张k.j.
      • libbrecht l。
      • TINTEMAMEM K.
      • Deforce D.
      • Colle I.
      • van vlierberghe H.
      Galectin-3结合蛋白:根据丙型肝炎相关肝纤维化的血清学和组织学评估。
      ),HPX(
      • 张k.j.
      • TINTEMAMEM K.
      • Deforce D.
      • Colle I.
      • Moreno C.
      • 甜点T.
      • van vlierberghe H.
      新型血清蛋白酶衍生的指标FI-PRO(纤维化蛋白)在慢性丙型肝炎纤维化预测中的用途。
      ),a2m(
      • 张k.j.
      • TINTEMAMEM K.
      • Deforce D.
      • Colle I.
      • Moreno C.
      • 甜点T.
      • van vlierberghe H.
      新型血清蛋白酶衍生的指标FI-PRO(纤维化蛋白)在慢性丙型肝炎纤维化预测中的用途。
      )此前也已经报道,并与当前发现重叠,以及在非酒精性脂肪肝病研究中具有显着差异丰度的绝大多数血清蛋白质(
      • 贝尔L.N.
      • Theodorakis J.L.
      • vuppalanchi R.
      • Saxena R.
      • Bemis K.G.
      • 王米
      • Chalasani N.
      血清蛋白质组学和生物标志物在非酒精性脂肪肝疾病的光谱中发现。
      )。由于LC-IMS-MS测量的高灵敏度,我们能够同时检测许多蛋白的显着性,该蛋白仅被观察为先前手稿中的子集。

       非体内患者血清验证分析和比较

      利用肝脏移植患者人口的调查在涉及纤维化进展的研究中赋予多种优势。然而,人们认识到,这些研究还引入了与肝纤维化的进展没有机械化相关的临床混淆和变量,而是与移植本身和免疫抑制环境直接相关。为了提供对我们移植模型的重要发现的明确结果,同时验证与纤维化进展直接相关的检测到的血清蛋白的子集,我们利用相同的LC-IMS-MS平台来调查完全独立的HCV感染但非筛选通过阿拉斯加丙型肝炎队列可获得患者群体。基于ISHAK得分0-1的纤维化分层,共鉴定并分析了60例患者血清样品 相对 4-6,在诊断活检的6个月内采样的时间框架,如图所示 Fig. 4A (看 补充表S6有关详细信息,请补充非传输样本数据)。使用独立的分析管道进行随后的肽和蛋白质结果的统计分析(见 补充表S6-S9详情的补充方法)导致78个蛋白质的正交鉴定,这些蛋白质区分纤维化等级(Fig. 4B)。值得注意的是,这些蛋白质中的63个(81%)与那些在初始移植患者结果中显着区分纤维化进展的那些重叠。排除4个移植蛋白质,其降低SP,但FP增加,>以常见的丰富方向性观察91%,基于移植和非翻译研究,提供了核心蛋白质的强烈正交验证。此外,在非翻译数据中的15个蛋白质中的一个唯一显着的蛋白质,一半在移植数据中支持显着的肽,但由于缺乏每种蛋白质的多种肽而被排除。 (看 补充表S9C 对于蛋白质重叠信息)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4A,来自60个HCV感染的非体弹患者的血液样本用于比较和验证移植患者结果。 患者分为两类,低纤维化阶段0和1和高纤维化阶段4,5和6。 B,图示了来自非翻译患者组的差分蛋白的相对Log 2强度改变的热图。每列代表60例患者和78个显着蛋白质中的每一行中的一个。相对丰度的减少由绿色显示,并通过红色增加。
      为了提供来自LC-IMS-MS平台的结果的进一步验证,对蛋白质印迹免疫测定的一部分在移植和非筛选患者组(F2,C4A,QSOX1,ECM1和LGALS3BP中,对五种蛋白质进行了蛋白质印迹免疫测定的一部分。 )。在LC-IMS-MS研究中,F2和C4a在纤维化患者中减少,而QSOX1,ECM1和LGALS3BP增加。这些结果基本上镜像在免疫测定印迹结果中,其中两个移植的NP-FP患者对血清样品被呈涂抹每种蛋白质,如图所示 Fig. 5。还显示了表示LC-IMS-MS测量蛋白值的相应条形图 Fig. 5。 Western印迹提供了对LC-IMS-MS平台的正交验证,两种技术对于所有五种蛋白质显示出良好的一致性。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5对于在匹配的对照(NP)和患者纤维化阶段分析了快速进化(FP)和患者纤维化阶段,对LC的条形图(NP)和患者纤维化阶段分析了某些肝纤维化患者的Western Blot(左)和LC-IMS-MS丰度(右)分析。 IMS-MS丰富数据。 患者对作为清楚起见缩写为PP。对于蛋白质印迹,加载了每种血清蛋白样品的相等量(5μg)。靶向肝脏代谢(F2:患者对22和16),天生免疫系统(C4a:患者对21和29(西方靶向C4β-链,C4a的切割产物)),氧化应激(QSOx1 :病人对24和22)和肝纤维化(ECM1:患者对21和23和LGALS3BP:患者对24和21)。

      讨论

      总的来说,在该手稿中进行的实验说明了多维LC-IMS-MS平台在分析敏感性和特异性方面大大提高了现有的MS技术,增强了测量的动态范围,并提供了高度复杂的低丰度分析物种类的可靠识别和定量生物学矩阵。此外,新平台的增强吞吐量突出了这项技术追求大型临床的全球研究的能力。虽然我们完全期待持续的敏感性和吞吐量进步,但目前平台的开发和示范为进一步努力设定了一个关键的基准。从分层的后发射移植和非传播患者应用该平台的结果比较复发和持续纤维化进展的血清血清样本表明,准确的蛋白质标记面板的准确检测和鉴定,而不是更有限的单独生物标志物,是可行的平台,可能有助于疾病进展的跟踪和测定。
      追求未来的医疗技术,如个人分析可能需要扩大潜在的诊断指标,如目前的研究部分展示,其中蛋白质和相关平台的更大程度的检测将是关键驱动因素。例如,通过将个体的蛋白质丰度与特异性为该人的基线小组相关联,可以更好地检测早期疾病发作,而不是试图与整个人口定义的特定蛋白质丰富值相关联。当然,这需要广泛接受的常规血清收集协议和健康人的分析。当前的MS方法具有通过免疫测定和/或类似技术同时分析多种蛋白质的技术优势。耦合IMS与MS的分离大大提高了测量灵敏度,同时减少了分析时间,将IMS-MS平台作为临床环境中这种应用的关键推动者。然而,我们完全意识到这代表了方法的范式转变,需要时间和精力来开发所需的辅助工具。

      致谢

      我们感谢Michael Perkins和Nathan Johnson为准备数字,Ryan Sontag寻求免疫标语,以及彭尼科尔顿进行稿件的技术编辑。

      补充材料

      参考

        • Picotti P.
        • rinner o.
        • Stallmach R.
        • Dautel F.
        • Farrah T.
        • Domon B.
        • 文字H.
        • Aeberberold R.
        用于蛋白质和蛋白质素的选定反应监测测定的高通量产生。
        NAT。方法。 2010; 7: 43-46
        • addona t.a.
        • Abbatiello S.E.
        • 席克宁B.
        • 冰鞋S.J.
        • MANI D.R.
        • 双打下午。
        • Spiegelman C.H.
        • Zimmerman L.J.
        • 火腿A.J.
        • Keshishian H.
        • 霍尔S.C.
        • 艾伦S.
        • 黑人r.k.
        • 博赫斯C.H.
        • 降低C.
        • Cardasis H.L.
        • Cusack M.P.
        • 迪克德
        • 吉布森B.W.
        • 举行。
        • Hiltke T.
        • 杰克逊A.
        • 约翰森E.B.
        • kinsinger c.r.
        • 李杰。
        • Mesri M.
        • neubert t.a.
        • niles r.k.
        • Pulcoripher T.C.
        • Ransohoff D.
        • Rodriguez H.
        • Rudnick p.a.
        • 史密斯D.
        • Tabb D.L.
        • TEGELER T.J.
        • variyath上午
        • Vega-Montoto L.J.
        • 华兰人A.
        • Waldemarson S.
        • 王米
        • Whiteaker J.R.
        • 赵L.
        • 安德森N.L.
        • 费舍尔S.J.
        • Liebler D.C.
        • Paulovich A.G.
        • Regnier F.E.
        • Tempst P.
        • carr s.a.
        多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
        NAT。 Biotechnol。 2009; 27: 633-641
        • Roschinger W.
        • Olgemoller B.
        • 指胡特R.
        • LieBl B.
        • Roscher A.A.
        分析质谱研究进展,改善遗传性代谢疾病的筛选。
        欧元。 J. Pediastr。 2003; 162: S67-76
        • 加利斯S.
        • Duriez E.
        • Domon B.
        选择的反应监测适用于蛋白质组学。
        J.质谱。 2011; 46: 298-312
        • 伍德科克J.
        “个性化医学”在药物开发和药物治疗中的前景。
        临床。药学。它。 2007; 81: 164-169
        • Chan I.S.
        • 吉斯堡G.S.
        个性化医学:进步和承诺。
        安努。 Rev. Genomics Hum。遗传。 2011; 12: 217-244
        • 哈钦森L.
        个性化癌症医学:承诺和进步时代。
        NAT。 Rev. Clin。 oncol。 2011; 8: 121
        • 沉Y.F.
        • 赵立
        • Berger S.J.
        • 安德森G.A.
        • Rodriguez N.
        • 史密斯r.d.
        高效纳米级液相色谱法在线偶联,与质谱法使用纳米电子喷雾电离进行蛋白质组学。
        肛门。化学。 2002; 74: 4235-4249
        • 梅森E.
        • 麦迪亚尔E.
        将离子的替代物运输到气体中。 威利, 纽约1988
        • Guevremont R.
        • SiU K.W.
        • 王J.
        • 丁L.
        电喷雾产生离子的组合离子迁移率/飞行时间质谱研究。
        肛门。化学。 1997; 69: 3959-3965
        • Sowell R.A.
        • Koeniger S.L.
        • 情人节S.J.
        • 月亮M.H.
        • CLEMMER D.E.
        纳米射线LC / IMS-MS和LC / IMS-CID / MS的蛋白质混合物。
        J.IM。 SOC。质谱。 2004; 15: 1341-1353
        • 面包师E.S.
        • liveay e.a.
        • orton d.j.
        • 摩尔r.j.
        • Danielson 3,W.f.
        • 之前的D.C.
        • 易卜拉欣Y.M.
        • Lamarche B.L.
        • Mayampurath上午
        • 什叶派A.A.
        • 霍普金斯D.F.
        • 唐克。
        • 史密斯r.d.
        • Belov M.E.
        一个LC-IMS-MS平台,提供高通量蛋白质组学研究的动态范围增加。
        J.蛋白质组。 2010; 9: 997-1006
        • liveay e.a.
        • 唐克。
        • 泰勒B.K.
        • Buschbach M.A.
        • 霍普金斯D.F.
        • Lamarche B.L.
        • 赵立
        • 沉Y.
        • orton d.j.
        • 摩尔r.j.
        • 凯莉r.t.
        • UDSeth H.R.
        • 史密斯r.d.
        全自动四柱毛细管LC-MS系统,用于最大化蛋白质组学分析中的产量。
        肛门。化学。 2007; 80: 294-302
        • 唐克。
        • Shvartsburg A.A.
        • Lee H.N.
        • 之前的D.C.
        • Buschbach M.A.
        • 李F.
        • tolmachev a.v.
        • 安德森G.A.
        • 史密斯r.d.
        使用电动离子漏斗界面高灵敏度离子迁移率/质谱法。
        肛门。化学。 2005; 77: 3330-3339
        • Belov M.E.
        • Buschbach M.A.
        • 之前的D.C.
        • 唐克。
        • 史密斯r.d.
        多路复用离子迁移率光谱分析 - 飞行时间的飞行时间质谱法。
        肛门。化学。 2007; 79: 2451-2462
        • 掌握B.H.
        • Belov M.E.
        • 之前的D.C.
        • Danielson 3,W.f.
        • 易卜拉欣Y.
        • 史密斯r.d.
        离子迁移率正交飞行时间质谱法的伪随机序列改性。
        肛门。化学。 2008; 80: 2464-2473
        • Llovet J.m.
        • Burroughs A.
        • 布鲁克斯J.
        肝细胞癌。
        柳叶刀。 2003; 362: 1907-1917
        • 夏尔顿M.
        • 鲁珀特克。
        • 贝尔S.H.
        • 低音N.
        • Schafer D.
        • Wiesner R.H.
        • 逃离K.
        • 魏Y.
        • Everhart J.
        长期结果和建模,以预测HCV感染的接受者中的结果:NIDDK肝移植数据库的结果。
        肝脏转机。 2004; 10: 1120-1130
        • 汤姆森B.J.
        • 芬奇r.g.
        丙型肝炎病毒感染。
        临床。微生物。感染。 2005; 11: 86-94
        • Mukherjee S.
        • Sorrell M.F.
        肝纤维化的非侵入性试验。
        Semin。肝病。 2006; 26: 337-347
        • Plebani M.
        • 巴西D.
        慢性肝脏和胃病的无侵袭性评估。
        临床。 ch acta。 2007; 381: 39-49
        • Polpitiya A.D.
        • 钱W.J.
        • jaitly n ..
        • petyuk v.a.
        • Adkins J.N.
        • 营2nd,D.G.
        • 安德森G.A.
        • 史密斯r.d.
        DANTE:用于测量 - 用于对 - 中型数据的定量分析的统计工具。
        生物信息学。 2008; 24: 1556-1558
        • 钻石D.L.
        • Jacobs J.M.
        • Paeper B.
        • Proll S.C.
        • 格里尼科米。
        • Clishers Jr.,R.L.
        • Larson上午
        • yeh m.m.
        • 营2nd,D.G.
        • 史密斯r.d.
        • Katze M.G.
        人肝活检蛋白质组学分析:丙型肝炎病毒诱导的纤维化和线粒体功能障碍。
        肝脏。 2007; 46: 649-657
        • imakiire K.
        • uto h.
        • 佐藤Y.
        • Sasaki F.
        • Mawatari S.
        • IDO A.
        • Shimoda K.
        • Hayashi K.
        • Stuver S.O.
        • ITO Y.
        • okanoue t.
        • Tsubouchi H.
        具有持续正常正常的丙氨酸氨基转移酶水平或慢性丙型肝炎的丙型肝炎病毒载体血清补体组分C4a水平的差异。
        摩尔。 Med。报告。 2012; 6: 259-264
        • Banerjee A.
        • Mazumdar B.
        • 迈耶克。
        • 迪比塞布里。
        • 雷R.B.
        • 射线R.
        丙型肝炎病毒蛋白C4补充的转录抑制。
        J.Virol。 2011; 85: 4157-4166
        • 马丁米
        • Lefaix J.L.
        • 盛顿P.
        • 电车F.
        • Daburon F.
        电离辐射后猪皮肤和肌肉纤维化中TGF-β1和β-肌动蛋白基因表达的时间调制。
        radiat。 res。 1993; 134: 63-70
        • Jablonska E.
        • Markart P.
        • Zakrzewicz D.
        • Preissner K.T.
        • Wygrecka M.
        转化生长因子-β1通过Smad3和JNK信号通路在人肺成纤维细胞中诱导人凝血因子XII的表达。
        J. Biol。化学。 2010; 285: 11638-11651
        • 斯科顿C.J.
        • Krupiczojc M.A.
        • KONIGSHOFF M.
        • Mercer P.F.
        • 李玉。
        • Kaminski N.
        • Morser J.
        • 邮政编码
        • 马赫下午
        • Nicholson A.G.
        • Moffatt J.D.
        • Laurent G.J.
        • 德安C.K.
        • Eickelberg O.
        • 钱伯斯r.c..
        凝血因子x的局部表达增加有助于人和鼠肺损伤中的纤维化反应。
        J. Clin。投资。 2009; 119: 2550-2563
        • Hillebrandt S.
        • Wasmuth H.E.
        • Weiskirchen R.
        • Hellerbrand C.
        • Keppeler H.
        • Werth A.
        • 谢里林 - 索高山R.
        • Wilkens G.
        • Geier A.
        • Lorenzen J.
        • Kohl J.
        • 格雷斯纳上午
        • 母鸡S.
        • Lammert F.
        补体因子5是修饰小鼠和人类中肝纤维发生的定量性状基因。
        NAT。遗传。 2005; 37: 835-843
        • 秦人
        • 周Y.
        • Lok A.S.
        • Tsodikov A.
        • yan x.
        • 灰色L.
        • 袁马。
        • 莫里茨R.L.
        • allas d。
        • OPENN G.S.
        • 引擎盖L.
        SRM靶向蛋白质组学寻找HCV诱导的纤维化进展的生物标志物对Halt-C患者的肝硬化。
        蛋白质组学。 2012; 12: 1244-1252
        • 张k.j.
        • libbrecht l。
        • TINTEMAMEM K.
        • Deforce D.
        • Colle I.
        • van vlierberghe H.
        Galectin-3结合蛋白:根据丙型肝炎相关肝纤维化的血清学和组织学评估。
        欧元。 J.Acettroenterol肝肝醇。 2010; 22: 1066-1073
        • 张k.j.
        • TINTEMAMEM K.
        • Deforce D.
        • Colle I.
        • Moreno C.
        • 甜点T.
        • van vlierberghe H.
        新型血清蛋白酶衍生的指标FI-PRO(纤维化蛋白)在慢性丙型肝炎纤维化预测中的用途。
        欧元。 J. Gastroenterol。肝醇。 2011; 23: 701-710
        • 贝尔L.N.
        • Theodorakis J.L.
        • vuppalanchi R.
        • Saxena R.
        • Bemis K.G.
        • 王米
        • Chalasani N.
        血清蛋白质组学和生物标志物在非酒精性脂肪肝疾病的光谱中发现。
        肝脏。 2010; 51: 111-120