差异14-3-3亲和捕获揭示了磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的新下游靶标*

  • Fanny Dubois.
    脚注
    隶属关系
    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • Franck Vandermoere
    脚注
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • AurélieGernez.
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • 简墨菲
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • 瑞秋龙
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • 帅辰
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • Kathryn M. Geraghty.
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • 尼克A.莫里斯
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    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • 卡罗尔·麦克风
    一致
    应解决谁的通信:医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,英国苏格兰邓迪DD1 5eh。电话:44-1382-385766;传真:44-1382-223778;
    隶属关系
    医学研究委员会蛋白磷酸化单位,邓迪大学生命科学学院,邓迪DD1 5eh,苏格兰,英国
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了英国医学研究委员会通过发展途径资金计划奖励和核心资金,糖尿病英国,跨学科研究协作蛋白质组学技术(用于研究蛋白质组(Rasor)的激进解决方案)获得生物技术和生物科学研究理事会和工程和物理科学研究委员会,以及支持邓迪大学信号转导治疗的公司,即Astazeneca,Boehringer Igelheim,Glaxosmithkline,Merck-Serono和辉瑞。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充图。 1和2和表1-4。
    ‡这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
      我们设计了一个14-3-3亲和力捕获和释放,同位素差异的策略(d0/d4)胰蛋白酶体消化物的二甲基标记,以及鉴别胰岛素/ IGF1 /磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的新靶靶标。特别是四种已知的胰岛素调节蛋白(PFK-2,PRAS40,AS160和MyO1C)具有高d0/d4值意味着它们在胰岛素刺激的14-3-3结合蛋白质中比未刺激的细胞更高。在新型候选物中,胰岛素受体衬底2,促液化CCDC6,E3泛素连接酶ZnRF2和信号通配体SASH1响应于IGF1 /磷脂酰肌醇3-激酶信号传导结合14-3-3s。胰岛素受体底物2,ZnRF2和SASH1也通过P90RSK调节,而CCDC6和PRAS40则不调节。相反,肌动蛋白相关的蛋白质血管扩张剂刺激的磷蛋白和脂解刺激的脂蛋白受体,其具有较低d0/d4评分,无论IGF1和磷酸酯如何,绑定14-3-3。磷酸化的Ser19ZnRF2(rtrayps19GS),磷酸胺90sash1(rkrrvps90QD)和磷酸 - 系列493..脂解刺激脂蛋白受体(rprarps493..LD)在这些蛋白质中提供14-3-3个结合位点中的一种。差分14-3-3捕获提供了一种强大的方法来定义特定信号通路的下游调节机制。
      活化的酪氨酸激酶受体通常驱动细胞以同化营养成分;调节同化的分区,使储存聚合物和生物合成前体和能量产生;并促进细胞生存,生长,分裂,运动和分化。从该频谱,每个细胞显示根据激素,特异性受体,来自其他信令途径,代谢条件和效应蛋白的细胞补充的串扰的特定响应子集。例如,胰岛素在骨骼肌中刺激葡萄糖摄取和糖原合成,而IGF1
      使用的缩写是:
      IGF1
      胰岛素样生长因子1
      CCDC6
      含有含有卷线域6
      美国国税局
      胰岛素受体底物
      LSR.
      脂解刺激脂蛋白受体(也称为LISCH7,肝特异性碱性螺旋环 - 螺旋亮氨酸拉链转录因子)
      PAS.
      磷酸盐衬底
      PI.
      磷脂酰肌醇
      PKB.
      蛋白激酶B,也称为Akt
      PMA.
      Phorbol Ester Phorbol 12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯
      SASH1
      无菌α基序和SH3域域的蛋白质1
      漩涡
      血管扩张剂刺激的磷蛋白
      是相关的蛋白质
      ZNRF.
      锌和戒指
      MAPK.
      促丝糖型活化蛋白激酶
      血凝素
      ERK.
      细胞外信号调节激酶
      SCX.
      强阳离子交换
      LTQ.
      线性陷阱四极轴
      MGF.
      吉祥物通用格式
      KLC.
      Kinesin轻链子
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      E3
      泛素 - 蛋白质异肽连接酶
      E2
      泛素载体蛋白
      AGC.
      CAMP依赖性蛋白激酶A,CGMP依赖性蛋白激酶G,以及磷脂依赖性蛋白激酶G系列蛋白激酶
      1使用的缩写是:IGF1
      胰岛素样生长因子1
      CCDC6
      含有含有卷线域6
      美国国税局
      胰岛素受体底物
      LSR.
      脂解刺激脂蛋白受体(也称为LISCH7,肝特异性碱性螺旋环 - 螺旋亮氨酸拉链转录因子)
      PAS.
      磷酸盐衬底
      PI.
      磷脂酰肌醇
      PKB.
      蛋白激酶B,也称为Akt
      PMA.
      Phorbol Ester Phorbol 12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯
      SASH1
      无菌α基序和SH3域域的蛋白质1
      漩涡
      血管扩张剂刺激的磷蛋白
      是相关的蛋白质
      ZNRF.
      锌和戒指
      MAPK.
      促丝糖型活化蛋白激酶
      血凝素
      ERK.
      细胞外信号调节激酶
      SCX.
      强阳离子交换
      LTQ.
      线性陷阱四极轴
      MGF.
      吉祥物通用格式
      KLC.
      Kinesin轻链子
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      E3
      泛素 - 蛋白质异肽连接酶
      E2
      泛素载体蛋白
      AGC.
      CAMP依赖性蛋白激酶A,CGMP依赖性蛋白激酶G,以及磷脂依赖性蛋白激酶G系列蛋白激酶
      促进许多细胞类型的存活,生长和增殖(
      • 科恩P.
      二十世纪扭动了破译胰岛素信号。
      ,
      • 兰川兰德
      • 科恩P.
      胰岛素样生长因子体系在产前生长中的作用。
      )。
      这些细胞反应中的许多通过PI 3-激酶介导,所述PI 3-激酶产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸盐,促进AGC蛋白激酶如PKB / AKT和其他信号组分(
      • 科恩P.
      二十世纪扭动了破译胰岛素信号。
      ,
      • Manning B.D.
      • 坎特利L.C.
      AKT / PKB信令:在下游导航。
      )。通过与酪氨酸磷酸化的受体(例如血小板衍生的生长因子受体(例如胰岛素受体底物)的含有胰岛素受体底物如胰岛素受体底物而活化,PI 3-激酶激活,其被活化的胰岛素受体磷酸化。放松管制的PI 3-激酶和下游信号与伤口愈合,免疫应答,神经变性和心血管疾病的问题有关;降低PI 3-激酶信号传导可能是胰岛素抵抗和II型糖尿病;并且该途径通常在人肿瘤中激活(
      • 霍金斯P.T.
      • 安德森K.E.
      • 戴维森克。
      • Stephens L.R.
      通过哺乳动物细胞中的I类Pi3ks发信号。
      ,
      • 袁t.L.
      • 坎特利L.C.
      癌症中的PI3K途径改变:主题的变化。
      )。为了帮助确定这些疾病的药物靶标,必须定义将PI 3-激酶和其他信号通路连接到下游效应器的机制,并了解不同激素/细胞类型组合的特异性。
      必须发现许多缺少PI 3-激酶/ AGC激酶的底物,用于解释对胰岛素和生长因子的所有细胞反应(
      • Manning B.D.
      • 坎特利L.C.
      AKT / PKB信令:在下游导航。
      )。 PI 3-激酶/ PKB信号传导的几种靶标,包括TSC2(
      • Manning B.D.
      • TEE A.R.
      • logsdon m.n.
      • Blenis J.
      • 坎特利L.C.
      鉴定结节硬化复合体-2肿瘤抑制剂基因产物结带蛋白作为磷酸膦酸碱基三酶/ AKT途径的靶。
      ),PRAS40(
      • Kovacina K.S.
      • 公园G.Y.
      • BAE S.S.
      • Guzzetta A.W.
      • Schaefer E.
      • Birnbaum M.J.
      • Roth R.A.
      鉴定富含脯氨酸的AKT底物作为14-3-3结合伴侣。
      ),AS160(
      • 凯恩斯。
      • 萨诺H.
      • 刘S.C.
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      • 泳道W.S.
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      • Lienhard G.E.
      一种鉴定丝氨酸激酶基材的方法。 AKT用RAB GTP酶活化蛋白(间隙)结构域磷酸化新的脂肪细胞蛋白。
      )和含有Fyve结构域的磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶(
      • Berwick D.C.
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      • Heesom K.J.
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      PI.KFYVE的蛋白激酶B磷酸化调节贩运Glut4囊泡。
      使用抗PAS抗体鉴定出来,该抗PAS抗体松散认识到PKB的最小磷酸化共识,即rXRXX.(PS / PT)PS是磷素,PT是磷酸辛。用于鉴定新的下游靶标的另一个有用的特征是PKB的磷酸化有时会产生14-3-3s的结合位点,其是与靶蛋白上的特定磷酸化位点结合的二聚体蛋白。因此,PKB促进14-3-3s与蛋白质的结合,包括PFKFB2心脏PFK-2(
      • Rubio M. Pozuelo
      • Geraghty K.M.
      • 黄B.H.
      • 木头。
      • 坎贝尔D.G.
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      14-3-3-富含200人磷酸蛋白的亲和纯化揭示了对细胞代谢,增殖和贩运的调节的新联结。
      ,
      • Rubio M. Pozuelo
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      • 黄B.H.
      • 莫里斯N.
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      14-3-3S通过与PKB磷酸化心脏果糖-2,6-双磷酸激酶/磷酸酶结合来调节果糖-2,6-双磷酸水平。
      ),bimel(
      • qi x.j.
      • Wildey。
      • 豪豪
      证据表明BiMEL的Ser87通过Akt磷酸化并调节BiMEL凋亡功能。
      ),β-​​catenin(
      • 田Q.
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      蛋白质组学分析鉴定14-3-3zeta与β-连环蛋白相互作用,并通过Akt促进其活化。
      ),P27(KIP1)(
      • Sekimoto T.
      • Fukumoto M.
      • Yoneda Y.
      14-3-3抑制苏氨酸157磷酸化P27(KIP1)的核定位。
      ),PRAS40(
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      • 公园G.Y.
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      鉴定富含脯氨酸的AKT底物作为14-3-3结合伴侣。
      ),foxo1(
      • 雷纳G.
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      • unterman t.g.
      蛔虫在横纹肌(FKHR)磷酸化位点调节14-3-3结合,转移和核靶向的作用。
      ),miz1(
      • Wanzel M.
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      AKT和14-3-3 eta调节Miz1以控制DNA损伤后的细胞周期停滞。
      ),TBC1D4(AS160(
      • Geraghty K.M.
      • 陈S.
      • 哈尔泰尔J.E.
      • 易卜拉欣A.F.
      • t
      • 莫里斯N.A.
      • Vandermoere F.
      • Moorhead G.B.
      • 哈RDIE D.G.
      • Mackintosh C.
      响应于IGF-1,EGF,PMA和AICAR的多立体磷酸化和AS160的14-3-3结合。
      ,
      • RAMM G.
      • 在努力硕士
      • Guilhaus M.
      • 詹姆斯D.E.
      胰岛素刺激的Glut4易位在胰岛素刺激的Glut4易位中的作用,其与Rabgap As160的相互作用。
      )和tbc1d1(
      • 陈S.
      • 墨菲J.
      • t
      • 坎贝尔D.G.
      • 莫里斯N.A.
      • Mackintosh C.
      生长因子,胰岛素和AMPK活化剂的TBC1D1和AS160的互补调节。
      )。功能上14-3-3s可以触发其目标构象的变化,并改变目标如何与其他蛋白质相互作用。符合14-3-3 /靶相互作用对生长因子和胰岛素的细胞反应很重要,与结合14-3-3s的靶竞争的试剂抑制糖酵解刺激物果糖-2,6-2,6-2,6-的IGF1刺激的增加。二磷酸(
      • Rubio M. Pozuelo
      • Geraghty K.M.
      • 黄B.H.
      • 木头。
      • 坎贝尔D.G.
      • 莫里斯N.
      • Mackintosh C.
      14-3-3-富含200人磷酸蛋白的亲和纯化揭示了对细胞代谢,增殖和贩运的调节的新联结。
      )和PKB依赖性细胞存活率(
      • 大师S.C.
      • 傅H.
      14-3-3蛋白质介导必需的抗凋亡信号。
      )。
      上述蛋白质上的约14-3-3个结合位点也可以被其他嗜碱性蛋白激酶磷酸化(
      • Jacinto E.
      • Lorberg A.
      酵母和哺乳动物中AGC激酶的调节。
      )。例如,AS160和TBC1D1是由多立体磷酸化调节的两种相关的兔子(用于RABs的GTPase-Activating蛋白,Chabluated磷酸化合物对葡萄糖的吸收量的血浆膜来调节。 AS160上的两个14-3-3结合位点可以通过PKB,P90RSK,血清和糖皮质激素诱导的激酶和其他激酶磷酸化,而TBC1D1上的14-3-3结合位点之一也是基材能量传感激酶AMP活化蛋白激酶(
      • Geraghty K.M.
      • 陈S.
      • 哈尔泰尔J.E.
      • 易卜拉欣A.F.
      • t
      • 莫里斯N.A.
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      响应于IGF-1,EGF,PMA和AICAR的多立体磷酸化和AS160的14-3-3结合。
      ,
      • RAMM G.
      • 在努力硕士
      • Guilhaus M.
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      胰岛素刺激的Glut4易位在胰岛素刺激的Glut4易位中的作用,其与Rabgap As160的相互作用。
      ,
      • 陈S.
      • 墨菲J.
      • t
      • 坎贝尔D.G.
      • 莫里斯N.A.
      • Mackintosh C.
      生长因子,胰岛素和AMPK活化剂的TBC1D1和AS160的互补调节。
      )。因此,葡萄糖贩运对胰岛素和AMP活化蛋白激酶激酶活化剂在不同组织中的相对敏感性可以部分取决于AS160和TBC1D1的分布。其他胰岛素调节的14-3-3个靶标,如肌蛋白1C(
      • yip m.f.
      • RAMM G.
      • 在努力硕士
      • Hoehn K.L.
      • 瓦格纳M.C.
      • Guilhaus M.
      • 詹姆斯D.E.
      Camkii介导的肌苷电动机MyO1C的磷酸化是脂肪细胞中胰岛素刺激的Glut4易位所必需的。
      ),也是磷酸化的收敛点,由一个以上的AGC和/或CA2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶。
      在这里,当在细胞中激活PI 3-激酶途径以14-3-3和PA和PAS的“背景”中,发现许多蛋白质比已经鉴定的蛋白质显示器显示14-3-3和/或PAS结合信号。绑定状态不受PI 3-Kinase信令的影响。我们的目标是挑选PI 3-激酶调节蛋白质,这在哺乳动物细胞中的数百份14-3-3个结合伴侣挑战(
      • Rubio M. Pozuelo
      • Geraghty K.M.
      • 黄B.H.
      • 木头。
      • 坎贝尔D.G.
      • 莫里斯N.
      • Mackintosh C.
      14-3-3-富含200人磷酸蛋白的亲和纯化揭示了对细胞代谢,增殖和贩运的调节的新联结。
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      • vintersten k。
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      • bouwmeester t.
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      转基因小鼠蛋白质组学识别涉及细胞骨骼重排和细胞信号传导的新的14-3-3相关蛋白。
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      Kinesin轻链2和14-3-3蛋白的磷酸化依赖性相互作用。
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      • koch h.b.
      • yates 3rd,J.R.
      • Hermeking H.
      靶向蛋白质组学分析14-3-3 sigma,P53效应器通常在癌症中沉默。
      )。我们使用了14-3-3个亲和力捕获和释放,确定的磷酸肽,并设计了一种定量蛋白质组学方法,其中来自胰岛素刺激的14-3-3结合蛋白质 相对 分别用含甲醛或重的同位素标记未刺激的细胞。这些屏幕的候选者的生化检查,其中包括与糖尿病,癌症和神经变性疾病的联系的蛋白质,证实了PI 3-激酶的新型下游靶标的鉴定,其中一些也是MAPK / P90RSK信号传导的收敛点。

      实验步骤

       材料

      合成肽来自Graham Bloomberg(布里斯托大学)。寡核苷酸来自MWG-Biotech。 IGF1来自BioSource。 Microcystin-LR来自Linda Lawton(Robert Gordon的大学,阿伯丁,苏格兰,英国)。 Vivaspin集中器来自vivascience。组织培养试剂来自Invitrogen。蛋白酶抑制剂混合物片(目录号1697498)和测序级胰蛋白酶来自罗氏应用科学。预制SDS-聚丙烯酰胺凝胶来自Invitrogen。蛋白质G-Sepharose和色谱基质来自GE Healthcare。甲醛-d0 和 -d2 来自Sigma-Aldrich,除非另外用其他化学品来自BDH化学品或Sigma-Aldrich。

       刺激和提取HELA和HEK293细胞

      据我们所知,HELA S3和HEK293细胞不表达胰岛素受体,尽管它们具有与同源受体较低亲和力的IGF1受体,但是
      • eNTINGH-PEARSALL A.
      • KAHN C.R.
      胰岛素和胰岛素样生长因子-i(IGF-I)受体响应胰岛素和IGF-1的差异作用。
      )。因此,比IGF1便宜的胰岛素用于LeLa S3细胞的大规模实验,其在含有10%Fcs,1%谷氨酰胺,1%青霉素 - 链霉素和1%钠的Dulbecco改性鹰培养基中培养的大规模实验。丙酮酸。试验实验表明Hela S3细胞的血清饥饿4小时,然后用50毫升/ mL刺激(300 nm)胰岛素给出了PKB的最大磷酸化(THR(P) 308 和 Ser(P)473)和As160(thr(p)642)。通过离心和快速冷冻收获细胞。
      为了 Fig. 5,HEK293细胞(欧洲集合细胞培养物)在Dulbecco的改性鹰培养基中的15厘米菜肴中培养,含有10%(v / v)fcs,2米M L. - 谷氨酰胺,非必需氨基酸和1%青霉素 - 链霉素。在〜60%汇合下,使用30μL1mg/ ml聚乙烯亚乙基氧化物转染细胞5μgDNA。 36小时后,用温热的PBS漂洗细胞,在Dulbecco的改性Eagle培养基中用温热的PBS和血清饥饿8小时。在指定的情况下,用PI-103预孵育细胞(1μm 30分钟)和Bi-D1870(10μm 30分钟)并刺激20分钟,含有50ng / ml IGF1和100ng / mL PMA。在0.5ml冰冷裂解缓冲液中裂解细胞(50米m Tris-HCl,pH 7.5,1米m EGTA,1%TRITON X-100,1 1米m 酸钠,50米m sodium fluoride, 5 mm 焦磷酸钠,0.27 m 蔗糖,0.1%(体积)2-巯基乙醇,“完全”蛋白酶抑制剂混合物(一种片剂/ 50mL)。通过在15,000rpm下在4℃下离心20分钟来澄清细胞裂解物。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5美国国税局2,CCDC6,ZnRF2,SASH1,PRAS40,VASP和LSR的细胞调节为14-3-3结合。 HA-IRS2,HA-CCDC6,HA-ZNRF2(野生型和S19A突变体),HA-SASH1(野生型和S90A突变体),HA-PRAS40,HA-VAP和HA-LSR(野生型和S493A突变体)与所指刺激的转染HEK293细胞分离,并抗HA免疫沉淀物(IP. 通过14-3-3覆盖物和蛋白质印迹分析。注意,在更高的曝光和其他实验中,显然没有ZnRF2 S19a突变完全废除14-3-3结合。作为刺激和抑制剂的功效的对照,用针对磷酸磷的抗体分析裂解物308 和 phospho-Ser473 PKB. / AKT,总PKB / AKT,磷酸欧克/ 2(Perk.)和总ERK1 / 2。 PI.3,pi-103; 出价,Bi-D1870。

       14-3-3亲和层析

      14-3-3亲和层析涉及蛋白质的结合至14-3-3-琼脂糖(混合BMH1和BMH2,来自14-3-3种同种型 酿酒酵母酿酒酵母)通过竞争用14-3-3结合合成araapsapa磷肽的竞争来洗脱特异性结合的蛋白质(Fig. 2)如波兹瓦罗·卢比奥 等等。 (
      • Rubio M. Pozuelo
      • Geraghty K.M.
      • 黄B.H.
      • 木头。
      • 坎贝尔D.G.
      • 莫里斯N.
      • Mackintosh C.
      14-3-3-富含200人磷酸蛋白的亲和纯化揭示了对细胞代谢,增殖和贩运的调节的新联结。
      )除了高盐洗涤仅为500ml并且省略了模拟肽洗脱。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2胰岛素刺激鉴定磷酸化和结合14-3-3s的蛋白质的实验策略。 A,如“实验程序”所详细的,Hela悬浮细胞培养物血清饥饿并刺激或不具有胰岛素。蛋白质被捕获在14-3-3琼脂糖柱上,洗涤直至在流过中不可检测的蛋白质,并且通过竞争用1米竞争洗脱蛋白质m 浓度14-3-3结合合成磷肽Araapsapa。浓缩洗脱液,用胰蛋白酶消化,并与含有氘的甲醛一起孵育(d0 用于胰岛素刺激细胞的制备)或两个氘(给予 d4 对于从未刺激的细胞中加入肽上的每种二甲基)。 d0/d4 确定在“实验程序”下确定的比率。 B,用于鉴定衍生自蛋白质蛋白质的磷酸肽的策略捕获和从胰岛素刺激细胞的提取物中捕获和释放。通过在“实验程序”下进一步详细描述的二氧化钛亲和力富集磷酸肽。

       Western印迹,14-3-3远西覆盖物和免疫沉淀

      绵羊抗HA针对肽YPETDVPDYA提出,绵羊抗AS160被提出对Kakignkp(
      • Geraghty K.M.
      • 陈S.
      • 哈尔泰尔J.E.
      • 易卜拉欣A.F.
      • t
      • 莫里斯N.A.
      • Vandermoere F.
      • Moorhead G.B.
      • 哈RDIE D.G.
      • Mackintosh C.
      响应于IGF-1,EGF,PMA和AICAR的多立体磷酸化和AS160的14-3-3结合。
      )。抗磷酸-1 / 2(thr(p)202/ tyr(p)204),抗磷酸308 PKB,抗PKB / AKT来自细胞信号传导技术。对于蛋白质印迹,所示的抗体以1μg/ mL使用。通过ECL试剂或奥德赛红外成像系统(Li-Cor,Inc.)可视化蛋白质印迹和14-3-3叠层(使用Digoxigenin标记的14-3-3s代替一抗原代抗体)。对于用抗HA的免疫沉淀,将4μg抗体/ mg裂解物在4℃下混合1小时,然后加入蛋白G-Sepharose(30μl50%悬浮液中裂解缓冲液)并进一步混合1小时。将悬浮液以12,000×离心 g 洗涤之间1分钟。

       胰蛋白酶消化,二甲基化和磷酸富集

      已经从未刺激或胰岛素刺激的Hela细胞纯化的14-3-3结合蛋白质在含有10米的十二烷基硫酸锂样品缓冲液(Invitrogen)中变性m DTT在95℃下5分钟,冷却,用50米烷基化m 在室温下在黑暗中碘乙酰胺30分钟。将蛋白质样品装载在纽扣4-12%梯度凝胶(Invitrogen)的相邻泳道上,并在160 V电泳60分钟,用胶体Coomassie蓝色(Invitrogen)染色凝胶。将凝胶泳道切成七个相等的部分(凝胶顶部的带1),连续用50米呈依次洗涤m 三乙基铵碳酸氢铵; 50%乙腈,50米m 三乙基铵碳酸氢铵(两次);在SpeedVac(EPPendorf)中干燥之前,乙腈(每次洗涤15分钟)。胰蛋白酶(5μg/ ml胰蛋白酶金; promega),足够的25米m 在30℃下加入三乙基碳酸氢铵以覆盖凝胶片12小时。将上清液转移到新鲜的管中,还加入了凝胶片的两个50%乙腈洗涤。将消化的样品分成两个相等的级分并以速度蒸发干燥。使用二氧化钛的磷酸肽富集一半,使用前面描述的程序的修饰版本与甲醛的另一半用甲醛(
      • HSU J.L.
      • 黄S.Y.
      • 陈S.H.
      二甲基多重标记与蛋白质组学中的时间课程分离和MS分析相结合。
      )。单个胰蛋白酶消化以2μl25米重新溶解m 醋酸钠缓冲液,pH 5.5,30米m 含有0.2%(V / V)甲醛的氰基硼氢化钠(d0 用于从胰岛素刺激细胞的制备 d2 对于非刺激细胞的制备)并在室温下温育15分钟。将二甲基化摘要混合成对相应的凝胶部分,用强阳离子交换(SCX)加载缓冲液(25%乙腈,0.2%甲酸)稀释25倍,并在相同的缓冲液中加载到5μl的孔径50hs珠粒上。将浆料装载在Millipore Scx Ziptip上,用60μlSC​​X加载缓冲液洗涤三次。用2×40μl50%异丙醇洗脱肽,0.2 m 氢氧化铵并在真空下干燥。
      对于磷肽富集,将胰岛素刺激细胞的制剂的胰蛋白酶体消化溶于200mg / ml 2,3-二氢苯甲酸(Sigma-Aldrich)中以80%(v / v)乙腈,5%(v / v)TFA (加载缓冲区)。向每种摘要中加入在将加载缓冲液中平衡的钛晶(5mg为5μm球形),并搅拌10分钟。将浆料装入c中18 StageTip(Proxeon);用80%(v / v)乙腈,5%(v / v)TFA洗涤三次;用40μl1洗脱1 m 氢氧化铵,50%(v / v)乙腈; 40μl50%(v / v)乙腈; 40μl0.5%(v / v)甲酸,50%(v / v)乙腈;合并;并在真空下干燥。

       LC-MS分析

      使用耦合到配备有动态纳米Pray源(OPTRON)的LTQ-ORBITRAP(LTQ-ORBITAP(Thermo Finnigan)质谱仪进行胰蛋白酶摘要分析胰蛋白酶摘要。使用WPS3000T微透镜摄像头,FLM3200微柱开关模块,Ultimate LPG3600 MicroPump,Pepmap C,使用LC封装集成系统(Dionex,Camberley,UK)分离二甲基化肽混合物.Pepmap C.18 柱(75μm,15cm; LC包装)和2%乙腈,水(a)和90%乙腈中的0.1%甲酸,0.085%甲酸(B)中的移动相。柱以300nl / min的流速在2%b中平衡。
      将干燥的消化物在50%(v / v)乙腈,0.1%(v / v)TFA中溶液。用0.1%(v / v)TFA稀释10倍;并加载到c上18 毛细管捕集器(MICHROM Bioresources,Auburn,CA)以20μL/ min的流速在缓冲液中平衡。 8分钟后,毛细管盒与分析柱线切换,并用以下梯度洗脱:2-50%缓冲液B(8-80分钟),50-85%B(80-85分钟),85-2 %B(85-90分钟)和2%B(90-100分钟)。将柱洗脱液电喷雾,电压为1200V施加到Picotip(FS360-50-15-N,新目标,Woburn,MA)。
      使用两种不同的采集方法获得质谱。对于蛋白质识别,LTQ-orbitrap被编程为在300-800-800-1800 AMU质量范围内执行两个FT扫描(60,000分辨率),从每个扫描中选择用于LTQ-MS / MS的每次扫描。使用单个锁定质量(445.1200原子单元)内部校准FT光谱。对于磷酸肽分析,进行相同的两个FT扫描,但在所选离子上进行多级活化,其中中性损失为97.98,48.99,32.66和24.50。对于这两种方法,FT上的目标离子数为500,000,用于绕绕组和10,000毫秒n on the LTQ.

       肽和蛋白质鉴定

      使用RAW2MSM V1.7软件(Matthias Mann)使用Raw2MSM V1.7软件(Matthias Mann)使用默认参数,无任何过滤,充电状态折核或解剖学或解剖学,将原始文件转换为吉祥物通用格式(MGF)文件。使用Mascot 2.2内部服务器对MGF文件进行搜索,针对内部蛋白质指数人3.26数据库(57,846个序列; 26,015,783个残留物)。对于定量二甲基标记实验,搜索参数如下:用胰蛋白酶消化;允许两个错过的乳沟;固定改性,碳酰胺甲基半胱氨酸;可变改性,氧化甲硫氨酸,二甲基末端和二甲基氰胺;具有10 ppm的前体大量耐受性,可能的错误拣选设定为两个同位素;和MS / MS质量公差为0.8 da。吉祥物综合诱饵数据库搜索计算的假发现率为1.39%(38个反向数据库肽,总共2719个肽匹配的匹配)当搜索在连接的MGF文件上进行了一个离子截止值20的离子分数截止和阈值 p <0.05。仅考虑了20多于20克的离子评分的肽,并且仅考虑了具有至少一种独特肽(吉祥物中的红色大胆)的蛋白质。该离子评分阈值足以使假发现率低于2%。含有类似肽的蛋白质并不能仅基于仅基于MS / MS分析来分化的蛋白质,以满足规定的原理。当仅用一种肽​​或仅用一种独特的肽(一个红色粗肽)鉴定蛋白质时,手动检查和注释MS2光谱(补充数据)。
      对于磷酸化部位测绘实验,除了可变修饰外,吉祥物搜索参数除外,包括氧化甲硫氨酸和丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的磷酸化。吉祥物综合诱饵数据库搜索计算时,当在连接的MGF文件上进行搜索时,使用20的离子分数截止为20和意义阈值 p <0.05。考虑了20多个具有离子分数的磷酸肽。该离子评分阈值足以使假发现率低于2%。为了获得更多的信心,手动检查和注释MS2光谱(给出 补充数据)。

       基于同位素的量化

      使用Qual Browser V2.0.7软件(Thermo Finnigan)手动进行量化。只有10倍的信号强度才有唯一的肽(吉祥物中的红色大胆肽)5 计数/ s用于量化。用大规模耐受10ppm的提取离子色谱图的最大高度用于评估每个计算的光/重二甲基化肽对的比率。该反应包含每个标记的两种甲醛分子,导致每标记的4.02511da的质量差异比较光和重肽。 d0/d4 三(可能)肽的比率用于对列中列出的每种蛋白质进行排名 补充表1.

      结果

       通过IGF1增强磷酸化和结合至14-3-3s的蛋白质的可视化,并通过PI 3-激酶抑制剂抑制

      来自未刺激细胞提取物的14-3-3-琼脂糖结合级分含有许多显示14-3-3和PAS结合信号的蛋白质(Fig. 1)。当PI 3-激酶信号传导通路用抑制剂Ly294002阻断PI 3-激酶信号传导途径时,这种信号的编号和强度增加了这些信号的制剂,并降低到基础水平。Fig. 1),Wortmannin和PI-103(未显示)。有些14-3-3和PAS结合信号彼此一致,例如最突出的蛋白质为〜40 kda,这是pras40(
      • Kovacina K.S.
      • 公园G.Y.
      • BAE S.S.
      • Guzzetta A.W.
      • Schaefer E.
      • Birnbaum M.J.
      • Roth R.A.
      鉴定富含脯氨酸的AKT底物作为14-3-3结合伴侣。
      ,
      • 哈尔泰尔J.E.
      • Rubio M. Pozuelo
      • Milne F.C.
      • Mackintosh C.
      大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞生长因子和营养素调节14-3-3结合蛋白P39。
      ),而其他人则不互相对齐(Fig. 1),表示不直接结合至14-3-3S的PAs结合蛋白,或者不折叠井,因此在14-3-3结合测定中表现不佳。相反,我们观察了14-3-3s对非PAS网站的一些结合。注意,尽管升高以检测PKB / AKT底物,但是PAS抗体也可能检测具有相似底物特异性的激酶磷酸化的残留物。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1结合14-3-3S的蛋白质响应于PI 3-激酶依赖性方式的IGF1。 HEK293细胞在含有10%(v / v)血清的培养基中的10厘米直径的菜肴上培养(标记 不血清饥饿)血清饥饿4小时(单纯化)然后用IGF1在50ng / ml下用IGF1表示15分钟,血清为10%(v / v),15分钟。在指出的情况下,将细胞与Ly294002一起温育(l; 100米m 在刺激之前持续1小时。将细胞在0.3ml /烟冰冷裂解缓冲液中裂解,并将3mg的每种提取物加入到100μl50%(v / v)浆料的14-3-3-琼脂糖浆料中,并在末端混合结束4 H。洗涤后,将蛋白质与14-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3-3°覆盖物分析(红色的),其检测蛋白质,其可以直接与Digoxigenin标记的14-3-3蛋白结合。抗PAS抗体也进行了蛋白质印迹(绿色)。

       鉴别筛选鉴定其磷酸化和结合14-3-3s的蛋白质的胰岛素被胰岛素刺激

      识别所指示的胰岛素/ IGF1信令的未知靶标 Fig. 1,我们设计了一种基于细胞提取物中的14-3-3结合蛋白的策略,并通过与14-3-3结合磷肽的竞争释放它们,然后用SDS-PAGE,凝胶蛋白酶消化,同位素差异N-末端和赖氨酸胺基肽对肽的二甲基标记,以及定量分析 d0/d4 来自两种制剂的相应肽的比率(Fig. 2A)。
      在几种试验实验中,与胰岛素或血清刺激细胞的提取物相比,将大约两倍的蛋白质分离14-3-3捕获,与血清剥夺的未刺激细胞相比。虽然通过眼睛无法发现在SDS-PAGE上选择性地监管的任何蛋白质,但蛋白质印迹显示,AS160在胰岛素刺激细胞的制剂中更丰富(Fig. 3, A, B, 和 C),而KLC2在两种制剂(未显示)中大致相等。这些发现与胰岛素刺激的AS160的14-3-3结合一致(
      • Geraghty K.M.
      • 陈S.
      • 哈尔泰尔J.E.
      • 易卜拉欣A.F.
      • t
      • 莫里斯N.A.
      • Vandermoere F.
      • Moorhead G.B.
      • 哈RDIE D.G.
      • Mackintosh C.
      响应于IGF-1,EGF,PMA和AICAR的多立体磷酸化和AS160的14-3-3结合。
      ,
      • RAMM G.
      • 在努力硕士
      • Guilhaus M.
      • 詹姆斯D.E.
      胰岛素刺激的Glut4易位在胰岛素刺激的Glut4易位中的作用,其与Rabgap As160的相互作用。
      )和发现KLC2与胰岛素刺激无关14-3-3s。
      N. Wood,B. Wong和C. Mackintosh,未发表的数据。
      因此,我们通过胰蛋白酶进行消化蛋白质,以产生肽的二甲基标记和分析 Fig. 2A.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3d0/d4 (±胰岛素)14-3-3亲和纯化的蛋白质来自未刺激和胰岛素刺激细胞的比率。 A,比较PKB / AKT和AS160总蛋白质水平和磷酸裂解物裂解物中的磷酸化状态,用于14-3-3磷蛋白酶筛选的裂解物。 B,Coomassie染色的蛋白质SDS凝胶蛋白质分离14-3-3捕获和从未刺激和胰岛素刺激的细胞的提取物中释放(将这些量的5次在平行凝胶上运行并用于MS分析)。 C,14-3-3蛋白的远西覆盖物测定蛋白质分离14-3-3捕获和从未刺激和胰岛素刺激的细胞的提取物中捕获和释放。 D,缩略图的 d0/d4 (±胰岛素)排名为14-3-3亲和纯化的蛋白质 离尺度 表示仅在胰岛素刺激细胞的制备中检测的蛋白质。突出显示 粉色的 是否已知蛋白质是磷酸化的并且响应于胰岛素/ IGF1以及发现在本研究中的胰岛素/ IGF1反应的蛋白质而结合14-3-3s。在 蓝色的 是我们已经知道的蛋白质不响应胰岛素/ IGF1以及发现在本研究中不胰岛素/ IGF1反应的蛋白质(参见文本)。 E, 示例 d0/d4 来自CCDC6的肽的比率定量(d0/d4 = 6.4对于该肽的总比例为7.1的总比例来自该蛋白质的肽())和vasp(d0/d4 对于蛋白质的总比例为1.3的= 1.1))在LTQ-orbitrap质谱仪中分析后显示提取的离子色谱图。
      补充表1和4 列出了识别和排序的296个蛋白质 d0/d4 比率高 d0/d4 比率表示从胰岛素刺激的细胞制备14-3-3结合蛋白质的蛋白质似乎更富集。这 d0/d4 (±胰岛素)比率也总结在 Fig. 3D 与例子 d0/d4 给出两种蛋白质的数据 Fig. 3E。两种蛋白质低 d0/d4 分数是Kinesin重链(KIF5B),其间接通过磷酸化的kinesin轻链(KLC)和EML3(ELP95)间接结合14-3-3( Fig. 3D)。在其他项目中,我们没有显示KLC或EML3的胰岛素调节。
      N. Wood,B. Wong,K. DararAnayake,K.Geraghty和C. Mackintosh,未发表的数据。
      然而,尖锐的是,已经已知的四种蛋白质响应于通过PI 3-激酶信号传导的胰岛素/ IGF1结合14-3-3s,即PFKFB2(心脏PFK-2),AKT1S1(PRAS40),TBC1D4(AS160),和myo1c(myosin 1c)(
      • Kovacina K.S.
      • 公园G.Y.
      • BAE S.S.
      • Guzzetta A.W.
      • Schaefer E.
      • Birnbaum M.J.
      • Roth R.A.
      鉴定富含脯氨酸的AKT底物作为14-3-3结合伴侣。
      ,
      • Rubio M. Pozuelo
      • Peggie M.
      • 黄B.H.
      • 莫里斯N.
      • Mackintosh C.
      14-3-3S通过与PKB磷酸化心脏果糖-2,6-双磷酸激酶/磷酸酶结合来调节果糖-2,6-双磷酸水平。
      ,
      • Geraghty K.M.
      • 陈S.
      • 哈尔泰尔J.E.
      • 易卜拉欣A.F.
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      • 莫里斯N.A.
      • Vandermoere F.
      • Moorhead G.B.
      • 哈RDIE D.G.
      • Mackintosh C.
      响应于IGF-1,EGF,PMA和AICAR的多立体磷酸化和AS160的14-3-3结合。
      ,
      • RAMM G.
      • 在努力硕士
      • Guilhaus M.
      • 詹姆斯D.E.
      胰岛素刺激的Glut4易位在胰岛素刺激的Glut4易位中的作用,其与Rabgap As160的相互作用。
      ,
      • yip m.f.
      • RAMM G.
      • 在努力硕士
      • Hoehn K.L.
      • 瓦格纳M.C.
      • Guilhaus M.
      • 詹姆斯D.E.
      Camkii介导的肌苷电动机MyO1C的磷酸化是脂肪细胞中胰岛素刺激的Glut4易位所必需的。
      )得分相对较高 d0/d4 比率,这意味着这些蛋白质在与未刺激的细胞相比的胰岛素刺激的14-3-3结合蛋白中更高度表示(Fig. 3D)。这种已知的“积极态”的聚类是鼓励,而不是在这个阶段精炼初级屏幕,我们决定通过检查具有高低低的个体蛋白质的细胞调节来测试其预测力 d0/d4 比率分别。结果稍后给出。我们还使用了第二次筛选方法。

       蛋白质的磷酸化残基由胰岛素刺激细胞的裂解物捕获14-3-3亲和力

      在第二种筛选中,我们使用该策略将14-3-3结合蛋白质中的磷酸化残基鉴定在胰岛素/ IGF1刺激细胞的裂解物中 Fig. 2B。完整的结果是 补充表2和3 有摘要 Fig. 4。鉴定的221个磷酸化残基,82(37%)衍生自R.XX.(ps / pt)图案,包括符合r的14(6.3%)XRXX.(PS / PT)PAS主题。 -3的基本残留物是通过嗜碱性AGC和CA磷酸化位点的特征2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶,通常在14-3-3末结合位点中发现。我们还注意到一些XRXX.(PS / PT)位点,其可以通过激酶在CA的几个分支上磷酸化2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族(
      • Manke i.a.
      • Nguyen A.
      • Lim D.
      • Stewart M.Q.
      • elia a.e.
      • Yaffe M.B.
      Mapkap Kinase-2是一种细胞周期检查点激酶,其响应于紫外线辐射来调节G2 / M转变和S相进展。
      ,
      • Stokoe D.
      • Caudwell B.
      • 科恩P.T.
      • 科恩P.
      丝裂原蛋白(MAP)激酶活化蛋白激酶-2的底物特异性和结构。
      )以及+4的Leu的磷酸肽,其优选通过AMP活化的蛋白激酶和其他CA优选2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(
      • Gwinn D.M.
      • Shackelford D.B.
      • egan d.f.
      • mihaylova m.m.
      • 梅里A.
      • vasquez D.S.
      • 土耳其人B.E.
      • Shaw R.J.
      猛禽的AMPK磷酸化介导代谢检查点。
      )。我们鉴定了58(26%)(Ser(P)/ Thr(P)) - Pro图案,其通常与14-3-3结合有关。剩余的81型磷酸盐(37%)变化,但包括+2 + 2的序列,如r中的肽XRXX.(ps / pt)和rXX.(PS / PT)类别。虽然不是14-3-3绑定至关重要,但在规范14-3-3绑定图案中发现了A + 2 Pro,其中采用A CIS. 将肽旋转在对接部位(
      • 痴呆症
      • Ghirlando R.
      • Klein D.C.
      • Ganguly S.
      • Dyda F.
      14-3-3 Zeta的晶体结构:血清素N-乙酰转移酶复合物。酶调节中的脚手架的作用。
      ,
      • Yaffe M.B.
      • 催化剂K.
      • 沃林斯。
      • 鲫鱼P.R.
      • Aitken A.
      • leffers h.
      • gamblin s.j.
      • smerdon s.j.
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      结构基础为14-3-3:磷酸肽结合特异性。
      )。在差分二甲基标记(±胰岛素)和磷肽屏幕上仅发现44种磷酸肽的17个蛋白质,表明这些分析远非饱和(表I.)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4衍生自胰岛素刺激细胞分离的14-3-3结合蛋白的磷酸肽。 根据符合r的图案中是否存在,根据它们是否存在磷酸化的部位。XRXX.(ps / pt),rXX.(ps / pt)除了rXRXX.(ps / pt),(ps / pt)p,或者这些都不是(其他)。一个与r的磷酸化部位匹配XX.(ps / pt)和(ps / pt)p包含在r中XX.(PS / PT)组。
      表I.14-3-3捕获的捕获蛋白质,由他们的d鉴定0/ D.4 比率和磷肽
      批准的基因符号d0/d4 (±insulin) ratio磷酸化残留物如 补充表2和3 用磷酸化残留物和氧化甲硫氨酸以小写字母
      AKT1S1 (PRAS40)9.9lprpr [lntsdfqk]
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      qqyak [slpvsvpvwgfk]
      CAD.6.7r [ihrasdpglpaeepk]
      pdgrfhlppr [ihrasdpglpaeepkek]
      CCDC67.1K [LDQPVSAPPSPR] D
      r [ilqekldqpvsappspr] d
      DUT.1.4m [pcseetpaispskr] a
      EML31.6klsrk [aissanllvr] s
      klsr [kaissanllvr] s
      agpapatpsr [tpslspassldv]
      gkdasifqwr [vlgaggagpapatpsr]
      gkdasifqwr [vlgaggagpapatpsrtpslspassldv]
      FAM122B.3.5dkpeklyspk [ridftpvspapptr]
      dkpeklyspk [ridftpvspapptr]
      dkpeklyspk [ridftpvspapptr]
      apsptrgfgk [mfvsssglppspvpspr]
      DKPEKLYSPK [RIDFTPVSPAPSPTRGFGK]
      DKPEKLYSPK [RIDFTPVSPAPSPTRGFGK]
      FOXK10.3plssr [sapaspthphlmspr]
      HSPB12.7拉尔斯[qlssgvseir] h
      美国国税局29.0rsyr [rvsgdaaqdldr] g
      LMO72.1gimr [rgesldnldspr] s
      Rqr [sasvnkepvslpgimr] r
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      saslprsyrk [tdtvrltsvvtprpfgsqtr]
      LSR.1.2K [nlalsreslvv] -
      r [gpaltpirdeewgghspr] s
      rrpr [arsvdalddltppstaesgsr]
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      Smrvlyymek [Elanfdpsrpgppsgrver]
      eddwrsrpsr [gpaltpirdeewgghsprspr]
      RARRPR [arsvdalddltppstaesgsrsptsnggr] s
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      (same RXRXX.磷酸肽的PS位点)
      MICALL1.L =仅在+胰岛素制剂中发现k [lqelasppagrptpapr] k
      r [veqmpqaspglapr] t
      PFKFB26.2pvrmr [rnsftplsssntir]
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      sssntrirrpr [nysvgsrplkplsplr]
      TPI13.2Kmngr [kqslgeligtlnaak] v
      WDR201.5K [FATLSLHDR] K.
      哟110.6Kshsr [qastdagtagaltpqhvr]
      ppepk [shsrqastdagtagaltpqhvr]
      IVHVR [GDSETDLEALFNAVMNPK]
      qvrpqelalr [sqlptleqdggtqnpvsspgmsqelr]
      ALTPQHVR [AHSSPASLQLGAVSPGTLTPTGVVSGPAATPTAQHLR]
      ALTPQHVR [AHSSPASLQLGAVSPGTLTPTGVVSGPAATPTAQHLR]
      ZNRF.22.6rtr [aysgsdlpsssssgangtagggggar] a
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      r [fpaqvpsahqpsasgaaaaaaaapaapaapr] s
      a RXRXX.(ps / pt)图案。
      虽然许多鉴定的磷酸肽的特征是暗示的,但下一个问题是任何所识别的位点是否实际上通过PI 3-激酶的下游和/或负责这些蛋白质结合14-3-3的嗜碱性激酶磷酸化。文献调查显示了几个rXRXX.(ps / pt)此处鉴定的基序是已知的14-3-3结合位点,其通过PKB和其他AGC激酶磷酸化,包括PFKFB2(心脏PFK-2),坏,AKT1S1(PRAS40)和NEDD4L(NEDD4 -2)(参考文献。
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      不良蛋白质通过EGFR / MAPK和PI3K / AKT激酶途径在PTEN缺陷型肿瘤细胞中积分存活信令。
      ; 补充表3.)。 FOXO1还具有PKB-磷酸化的14-3-3-3-3-3-3结合位点,但在此未鉴定出来,尽管我们鉴定了该蛋白质的(Ser(P)/ Thr(P)) - Pro位点。我们在TSC2上鉴定的磷酸化残余物也是已知的,尽管是否对该网站结合的14-3-3s是有争议的(
      • CAI S.L.
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      调节TSC2 14-3-3结合。
      )。我们还鉴定了先前报告的蛋白质的磷酸化残基,以响应于其他或未知的信号通路,即M110 / Mypt1,Git1,RAF1,A-RAF,KSR,PI4KB,PTPH1,KLC2,ELM3(ELP95)。 ,HDAC4,HDAC7A,MAP3K2,DOCK7,CRTC2,YAP1和WWTR1(TAZ)(参考文献。
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      14-3-3规定了IIA类核导入的IIA类脱乙酰酶。
      ; 补充表3.)。例如,磷酸化的Ser294 (LNRTNPSQP)在磷脂酰肌醇4-激酶IIIβ(PI4KB)上被精确地定位为14-3-3结合位点,其被蛋白激酶D磷酸化,对Golgi贩运的调节至关重要(
      • 哈斯阿
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      将磷酸磷酸蛋白与磷脂酰肌醇4-激酶IIIβ的特异性结合免受去磷酸化并稳定脂质激酶活性。
      )。酵母同源物PIK1在类似磷酸化位点(LKRTAPSNP)(
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      Golgi磷脂酰肌醇4-激酶PIK1的核细胞质血液血液血液血液血液血液血液梭菌由14-3-3个蛋白质调节并坐标,具有细胞生长的GOLGI函数。
      )。

       胰岛素受体底物2(IRS2),CCDC6,ZnRF2,SASH1,PRAS40,血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP)和脂解刺激脂蛋白受体(LSR)的蜂窝调节

      接下来,我们确定候选人中是否存在任何新的PI 3-Kinase信号传导靶标。 d0/d4 ratios (Fig. 2, Fig. 3补充表1/ /或鉴定嗜碱性磷酸化位点(Fig. 4补充表2)。 FIS-Western 14-3-3覆盖测定用于确定从转染的HEK293细胞中提取的标记形式的候选蛋白质直接结合14-3-3s(这是有用的,因为 补充表1 还列出了蛋白质,例如Kinesin重链,其间接通过中间磷蛋白间接结合14-3-3s(
      • Rubio M. Pozuelo
      • Geraghty K.M.
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      14-3-3-富含200人磷酸蛋白的亲和纯化揭示了对细胞代谢,增殖和贩运的调节的新联结。
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      Kinesin轻链2和14-3-3蛋白的磷酸化依赖性相互作用。
      )))。除IGF1(在雷帕霉素抑制剂PI-103的双PI 3-激酶/哺乳动物靶标的存在或不存在中)外,我们刺激了PMA的细胞(在存在或不存在P90RSK抑制剂BI-D1870)中作为第一步测试目标的响应能力对其他信令途径。
      美国国税局2有一个 d0/d4 鉴定了9的比例和磷肽(Fig. 3D, 表I., 和 补充桌子)。已知IRS1结合14-3-3(
      • Craparo A.
      • 弗隆R.
      • gustafson t.a.
      14-3-3(ε)以磷素依赖性方式与胰岛素样生长因子I受体和胰岛素受体基质I相互作用。
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      • isobe t.
      • Ichimura T.
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      • Funaki M.
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      • Onishi Y.
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      • 一个目标。
      • 福岛Y.
      • Kikuchi M.
      • Yazaki Y.
      • 好的。
      • asano t.
      14-3-3蛋白与胰岛素受体基质-1结合,其中一个结合位点在磷酸酪氨酸结合结构域中。
      ,
      • Xiang X.
      • 袁马。
      • 宋y.
      • Ruderman N.
      • 温罗
      • 罗Z.
      14-3-3促进胰岛素刺激的胰岛素受体基质1的细胞内运输。
      ),在这里,我们发现IRS2还在对PI-103阻断的IGF1的响应中直接结合至14-3-3。 IRS2 / 14-3-3的相互作用也被Phorbol酯促进并由Bi-D1870部分抑制(Fig. 5),表明P90RSK在该蛋白质上磷酸化14-3-3结合位点,其中可能具有由不同的Phorbol酯刺激的蛋白激酶磷酸化的第二位点。
      CCDC6也有很高的 d0/d4 score of 7.1 (Fig. 3D, 表I., 和 补充桌子),此处鉴定出该蛋白质上的磷酸化位点(表I.在文献中。我们发现HA-CCDC6以胰岛素刺激和PI-103抑制方式结合在14-3-3s(Fig. 5)。相反,只有来自Phorbol酯刺激的细胞的CCDC6的痕量14-3-3结合信号。
      ZnRF2与A. d0/d4 得分为2.6和rXRXX.(PS / PT)主题(rtrayps19GS)(Fig. 3D, 表I., 和 补充桌子)显示出胰岛素刺激和PI-103抑制结合至14-3-3s。与IRS2和CCDC6相比,ZnRF2还响应于PMA结合至14-3-3s,并且P90RSK抑制剂BI-D1870(Fig. 5)。 IGF1刺激和PMA刺激的14-3-3s至HA-ZnRF2的结合明显降低19 mutation to Ala (Fig. 5)。
      一个R.XRXX.在SASH1中鉴定PS磷酸化基质(在序列RKRRVPS内 90QD; 补充表2和3)。 Fig. 5 表明,HA-SASH1结合14-3-3,通过用IGF1和Phorbol酯刺激细胞来增加其结合能力,并且分别通过PI-103和BI-D1870部分抑制这些规定。通过S90A突变,损失与SASH1结合的IGF1和PMA响应性增加,尽管该突变体中的相对高的“基础”结合至14-3-3。这些数据表明14-3-3二聚体可以结合一个基底位点和IGF1和PMA响应磷酸-Ser90 on SASH1.
      PRAS40是PKB的已知目标(
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      鉴定富含脯氨酸的AKT底物作为14-3-3结合伴侣。
      )。与CCDC6一样,该蛋白质对PI 3-激酶/ PKB选择性地响应于PI 3-激酶/ PKB,并且响应于Phorbol酯而没有结合14-3-3s(参考文献。
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      Fig. 5)。
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      LSR.也有很低 d0/d4 得分为1.2,并为该蛋白质鉴定出磷酸化的位点,包括rXRXX.(ps / pt)网站(rprarps493..LD; Fig. 3D, 表I., 和 补充桌子)。即使从未刺激的细胞提取,HA-LSR也得到14-3-3结合信号,并且信号与IGF1和PMA刺激的细胞没有更强(Fig. 5 和数据未显示)。然而,通过鉴定的R内的S493A突变消除了LSR至14-3-3s的结合 XRXX.PS主题(Fig. 5)。我们注意到SER493.. 在CA中具有各种激酶的潜在部位的特征2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族,并在小鼠LSR中鉴定了13个磷酸化残基(
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      讨论

      14-3-3S结合数百种磷蛋白质,因此定义了哪种信号传导途径刺激磷酸化,其中14-3-3结合位点开启了理解各种细胞过程的全球调节的令人兴奋的机会。在这里,我们组合了14-3-3个亲和捕获和蛋白质组学策略来可视化和识别其14-3-3结合对胰岛素/ IGF1的蛋白质的子集。这些屏幕已被证明是我们用鉴定的胰岛素/ IGF1 / PI 3-激酶信号传导通路的几种新验证的靶标的蛋白质预测Fig. 5)。进一步开采数据集应该是富有成正效果的,并且剩下的候选者包括具有癌症,糖尿病和神经变性障碍的有趣链接的蛋白质。
      与氧化硅酸的方法相比,在细胞阶段进行差异标记,稍后在我们的程序中进行二甲基标记,虽然具有足够的对照,但这不应该是一个问题,我们的方法适用于不能方便的细胞和组织类型塞拉克标记。精制屏幕的定量方面,定义磷酸化化学成分的变化,过滤掉对刺激的轻微反应的蛋白质,等等是通过生化分析(如那些)备份的许多重复性比较 Fig. 5。例如,我们注意到所识别的大多数蛋白质有一个 d0/d4 (±胰岛素)比例大于1(Fig. 3B),建议未知的潜在趋势可能会歪曲数据。可能性是从未刺激的细胞的14-3-3结合蛋白的选择性蛋白水解和/或将胰岛素刺激的内源性14-3-3s的改性,其降低其亲经,以便更容易释放并更好地结合目标。 14-3-3-琼脂糖。
      我们还注意到数据落入了一系列 d0/d4 排名,而不是离散分裂成高,低排名(胰岛素刺激的结合或不)类别。该渐变可以涉及14-3-3s是二聚体的事实,其通常与同一目标上的两个磷酸化位点结合。因此,在某些情况下,胰岛素可以刺激14-3-3结合位点的磷酸化,而其他蛋白质可能已经有一个位点在未刺激状态下磷酸化。例如,14-3-3s至TBC1的基础结合d4 (AS160)由于SER的磷酸化341 当胰岛素刺激SER的磷酸化时明显增强341 和 Thr642 of AS160 (
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      14-3-3蛋白是如何工作的?-GateKeepter磷酸化和分子砧假设。
      )向提供高亲和力14-3-3结合的“网守”提供高亲和力的靶标的概念,其有助于将第二个下亲和位点对接到14-3-3二聚体的另一侧。在这样的配置中,14-3-3二聚体的行为表现为逻辑门,其中需要两个输入(“或”)或两个输入的设备来触发输出。比较数据 Fig. 5 给出了他们的两个磷酸化位点如何与14-3-3二聚体接触的“数字逻辑”中的目标如何不同的感觉。可能取决于亲和力和恐惧的差异。例如,磷酸衬里19 似乎是ZnRF2至14-3-3的绑定的门守网站。相比之下,14-3-3显示与IGF1和PMA不调节的SASH1结合的一种粘合模式,但通过IGF1 / PI 3-激酶和PMA / P90RSK-encightiveSER的磷酸化增强90。在不同激活酶磷酸化的情况下,对于两个不同的输入有效地变为“巧合探测器”。也许14-3-3s的结合和功能效果也可以取决于相关位点的磷酸化和去磷酸化的时间顺序。在未来更广泛地探索14-3-3s的全部数字行为将会有趣。
      总的来说,我们的目标是识别PI 3-激酶信号通路的新靶标。新验证的胰岛素响应靶标包括参与胰岛素/ PI 3-激酶信号通路本身(IRS2)的蛋白质(IRS2),促进蛋白质(CCDC6),E3泛素连接酶意味着在突触囊泡运输(ZnRF2)中,以及信号适配器蛋白质(SASH1)。我们还确认了肌动蛋白相关蛋白VASP和LSR的直接结合,与LISCH样相关的跨膜蛋白受体,其最近与小鼠中II型糖尿病遗传联系在一起。这些调查结果为胰岛素和生长因素控制细胞行为提供了令人兴奋的洞察力前景。
      CCDC6最合适的是与乳头状甲状腺肿瘤中酪氨酸激酶RET或磷酸酶PTEN的转化融合(
      • GrieCo M.
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      H4(D10S170)的克隆和表征,涉及体内RET重排的基因。
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      H4(D10S170),在乳头状甲状腺癌中经常重新排列的基因,与T(5; 10)(Q33; Q22)融合到非典型慢性骨髓白血病中的血小板衍生的生长因子受体β基因。
      ),建议 CCDC6 基因具有高度的重组倾向(
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      癌症。靠近事项。
      )。将正常的CCDC6蛋白鉴定为响应DNA损伤而突变激酶Ataxia Telanciectasia的底物(
      • 梅罗拉F.
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      H4(D10S170)蛋白在ATM依赖性对DNA损伤的反应中的参与。
      )。在野生型细胞中,依托泊苷和电离辐射促进THR上的磷酸化434 通过Ataxia Telanciectasia突变,稳定CCDC6的核积聚并促进细胞凋亡(
      • 梅罗拉F.
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      H4(D10S170),一种经常与乳头状甲状腺癌中的基因重新排列:功能表征。
      )。我们假设响应于PI 3-激酶信号传导的14-3-3至CCDC6的结合可能抑制其凋亡活动。
      锌和环形指状物2是两个E3泛素连接酶(ZnRF1和ZnRF2)中的一种,其锌手指与环手指相邻(
      • Araaki T.
      • Milbrandt J.
      ZnRF蛋白质构成了突触前E3泛素连接酶的家族。
      )。 E3连接酶通常用作特异性模块,使基材与E2带来泛醌。在酵母双杂化实验中,ZnRF2是与UBC13结合的几种E3泛素连接酶之一,为液体的E2连接酶的活性组分63 - 链接的泛素itallation(
      • 计划五。
      • Scheper J.
      • 劳工组
      • Loukili N.
      • okanoy。
      • 汤姆森下午
      Ring Finger蛋白RNF8为基于赖氨酸63的自助氮化合物招募UBC13。
      ),我们发现UBC13与来自转染的HEK293细胞的提取物(数据未显示的数据)的ZnRF2共同净化,表明ZnRF2和UBC13之间的生理伙伴关系。 ZnRF1和ZnRF2均以神经细胞预介绍高度表达,催化活性蛋白质抑制CA.2+ - PC12细胞中的依赖性外尿精(
      • Araaki T.
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      ZnRF蛋白质构成了突触前E3泛素连接酶的家族。
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      • Araaki T.
      • Nagarajan R.
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      损伤后周围神经中诱导的基因的鉴定。表达分析和新型基因发现。
      )。 ZnRF2的丝氨酸19,其响应于IGF1 / PI 3-激酶和Phorbol酯磷酸化并结合14-3-3s,是N-末端到未知功能的法师域(
      • 肖J.
      • 陈H.S.
      黑色素瘤相关抗原的生物学功能。
      ),表明,调节14-3-3s至ZnRF2的结合可能会影响Lys63 通过对ZnRF2的法师结构域的影响。
      SASH1是一种略微表达的含有无菌α基序和SH3结构域的SLY1的信号传导蛋白质的成员,其下调癌症的下调对于转移和生存具有负预后意义(
      • Rimkus C.
      • 马蒂尼尼米
      • Friederichs J.
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      候选肿瘤抑制基因SASH1在结肠癌中的下调表达的预后意义。
      )。
      对于LSR,14-3-3S结合至少一个磷酸化位点(磷酸胺435 within RPRARpS435VDAL),虽然相关激酶未知,但AMP活化蛋白激酶是候选者。 LSR先前被其亲和力孤立,对14-3-3s(
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      靶向蛋白质组学分析14-3-3 sigma,P53效应器通常在癌症中沉默。
      )通过其成纤维细胞生长因子刺激的酪氨酸残基刺激磷酸化(MRvlpyymek,其中Py是磷酸酪氨酸的MRvlpyymek)是一种已知的生长因子信号传导的已知靶标
      • 多恩比上午。
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      成纤维细胞生长因子信号传导酪氨酸磷蛋白酶:胰岛素受体基质-4的作用。
      )。该蛋白质的水平在某些结肠癌中升高(
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      Lisch7 mRNA在结肠癌患者血浆和肿瘤中的预后价值。
      ),而LSR的敲低增加了膀胱癌细胞的动力(
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      在SW780膀胱癌细胞中浸润刺激脂蛋白受体(LSR)敲低时的细胞运动和侵袭增加。
      )。 LSR是一种跨膜蛋白,其具有细胞外免疫球蛋白样结构域和推定的细胞内区域(PFAM数据库)中的磷酸化位点。 LSR的名称是指其作为细胞表面脂蛋白受体的拟议作用,其由游离脂肪酸活化,并将饮食甘油三酯的脂蛋白从血液中清除到肝脏和其他组织中(
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      LSR. - / - 胚胎中成人和胚胎组织和妊娠期致死性的脂肪解刺激受体的分布在12.5至14.5天的妊娠。
      )。该蛋白质的另一个名称,肝细胞特异性基本螺旋环 - 螺旋亮氨酸拉链转录因子(LISCH7)似乎是一种错误数。 LSR由三种相关人类基因中的一种编码( LSR., C1ORF32., 和 ILDR1)和小鼠形式的遗传变异 C1ORF32.,命名 丽莎类似,最近与II型糖尿病的易感性相关联(
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      )。 C1ORF32有丝氨酸(ESRAHS466GFYQ)对应于SER435 在LRS中,虽然不在r中XRXX.PS图案表现出潜在的AMP活化蛋白激酶位点,但在IildR1中没有匹配的丝氨酸残基。鉴于脂肪酸水平升高,富有甘油三酯的脂蛋白与炎症和胰岛素抗性有关(
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      肥胖症中的炎症是脂肪酸代谢和胰岛素抵抗的缺陷之间的常见联系。
      ),我们需要仔细检查这家蛋白质的角色和调节。
      总之,14-3-3捕获和定量蛋白质组学导致我们发现具有细胞凋亡,囊泡贩运,新陈代谢和癌症中的作用的胰岛素信号传导的新下游目标。这些蛋白质的未来工作应该导致令人兴奋的机制见解。虽然胰岛素/ pi 3-激酶/ AGC信号传导在调节许多14-3-3结合蛋白质时具有显着效果(Fig. 1)仅在仅CCDC6和PRAS40随访的目标的目标是对PI 3-激酶的选择性地敏感,而IRS2,ZnRF2和SASH1是PI 3-激酶和MAPK / P90RSK途径的收敛点(Fig. 5)。了解这两个途径如何施加广泛的细胞控制是一个迷人的问题,使得所有更加迫切的问题,因为靶向这些途径的药物是有前途的抗癌疗法,但是在这两个途径之间的相互作用是出现的并且必须理解为设计最佳组合疗法。因此,一种雄心勃勃的目标是使用14-3-3捕获与敏感质谱结合,以定义全局14-3-3结合磷酸酯组合如何应对不同的细胞外刺激和抑制剂。这种变化的14-3-3连接的细胞磷蛋白酶组的这种概述可用于确定其14-3-3结合状态的生物标志物,其表明哪种信号传导途径在健康和患病组织中活跃,以及它们如何对药物作出反应。

      致谢

      我们感谢Claire Balfour用于组织文化支持和由James Hastie博士协调的信号转导治疗抗体生产团队进行抗体纯化抗体。我们还感谢Sandra Crowther,Rachel Naismith和Rebekah Tillotson的帮助,以获得数据分析。

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