质谱法鉴定蛋白质

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  • Michael A. Baldwin
    一致
    应解决对应的通信:质谱设施,药物化学系,加州大学,旧金山,CA 94143-0446
    隶属关系
    群众光谱设施,加州大学制药化学系,旧金山,CA 94143-0446
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  • 作者脚注
    *此工作部分由NCRR RR01614部分支持。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    2 S. A.Car,个人沟通。
      在过去的二十年中,质谱已经成为从生物来源复杂混合物中蛋白质鉴定的主要方法。这主要归因于幸运的乐曲进展,允许含有涉及的常规量(通常是毫微微胶种)的常规分析,例如复杂混合物中的肽,如肽,其基因组数据库的快速生长可用于搜索质谱法(小姐)
      使用的缩写是:MS,质谱;马尔迪,矩阵辅助激光解吸/电离; ESI,电容电离; TOF,飞行时间; LC,液相色谱; MS / MS,串联MS; QQTOF,Quadrupole质量选择器和具有正交加速度TOF的四极碰撞单元; CID,碰撞诱导的解离; HPLC,高压LC; ICAT,同位素编码的亲和标签。
      1使用的缩写是:MS,质谱;马尔迪,矩阵辅助激光解吸/电离; ESI,电容电离; TOF,飞行时间; LC,液相色谱; MS / MS,串联MS; QQTOF,Quadrupole质量选择器和具有正交加速度TOF的四极碰撞单元; CID,碰撞诱导的解离; HPLC,高压LC; ICAT,同位素编码的亲和标签。
      数据。与科学中的许多其他发展领域一样,技术和软件工具的创建以及数据的初始生成和解释是专家领域,人们不仅认识到了方法的好处,还具有其实际和潜在的弱点。 。现在,随着质谱技术和蛋白质组学工具的变得越来越可获得和可访问,更广泛的研究人员正在施加相同的方法,通常对对统治性的主要限制的理解基本上不那么了解,这对结果的可靠性和意义重大影响了。理想情况下,MS社区应建立应由研究人员使用的蛋白质的质谱鉴定标准。由于这仍然是一种快速发展的领域,具有许多不同的实验方法和不同的搜索和解释数据的方式,很难颁布艰难和快速的规则。尽管如此, 分子& Cellular Proteomics 根据新兴知识以及由MS社区的过去20年建立的生物学MS原则,正在试图制定蛋白质组学论文的可接受标准。雇用MS的蛋白质组学论文的作者必须让自己充分意识到正在推动这些准则的关键问题。因此,遵循的论文试图突出目前使用中方法的强度和弱点。尤为重要的是要认识到,对于从数据库搜索返回的任何蛋白质匹配,存在非零概率将是错误的。多次,数据的质量是可以忽视错误阳性的概率,但在某些情况下,搜索引擎返回的标识很可能不正确。因此,简单地列出了从任何搜索引擎回来的所有命中,然后讨论它们的生物学意义,这是不可接受的,因为它们是明确的。

      肽分析

      几乎没有例外,蛋白质鉴定基于蛋白化消化产生的肽的分析。除非序列中的随后的氨基酸是脯氨酸,否则最广泛使用的酶是胰蛋白酶,其在赖氨酸和精氨酸的C末端侧水解蛋白质。这是有利的,因为除蛋白C末端以外的每种肽具有至少两个用于有效质子化的位点,N-末端氨基和C末端碱性残余物,因此肽易于电离并检测为正离子。然而,由于各种原因,仅来自待检测的任何蛋白质的潜在胰蛋白酶肽的子集是正常的,特别是当肽直接离子化的不同,在其中可能存在可用质子的竞争中。还存在非常小或非常大的肽的实验限制,这是不受单一酶可控的因素,因为这取决于蛋白质中的赖氨酸和精氨酸残基的分布。通过用不同特异性的第二种蛋白酶如胰凝乳蛋白酶进行平行消化,可以改善蛋白质序列覆盖,然后组合两种消化以进行共同分析。
      S. A.Carr,个人沟通。
      实际上,检测到从任何蛋白质产生的大部分肽是否取决于许多变量:原始样品中存在的该蛋白质的量;任何蛋白质提取,消化和肽提取的效率;存在其他蛋白质和其他杂质;和质谱仪的灵敏度和性能特征及其电离,质量分离和离子检测模式。
      蛋白质组学分析中使用的质谱仪使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或电喷雾电离(ESI),但它们在其操作和性能特征中变化很大。早期数据库搜索是基于低分辨率线性马尔迪 - 飞行时间(MALDI-TOF),其具有±2 da的质量准确性(
      • Henzel W.J.
      • 比赛。
      • 心理J.T.
      • 黄S.C.
      • 格兰利C.
      • Watanabe C.
      通过蛋白质序列数据库中的肽片段的分子量搜索鉴定二维凝胶的蛋白质。
      )。然而,这不再是可接受的,因为通过限制任何给定的质量的肽的可能组成来增加数据库搜索的可靠性(
      • 克劳瑟K.R.
      • 贝克P.
      • 伯灵名A.L.
      精确质量测量(±10 ppm)在蛋白质识别策略中的作用,采用MS或MS / MS和数据库搜索。
      )。具有反射的延迟提取MALDI-TOF仪器应优于50ppm的质量精度,并且可以通过仔细的内部校准来实现更好的(~10ppm)。 ESI一直是液相色谱(LC)-MS和LC串联MS(MS / MS)的标准电离方法,尽管可以将分离的级分沉积在马尔达靶标以进行在线或离线分析(
      • 预夹J.
      • 胡诗
      • Rejtar T.
      • karger b.l.
      毛细管电泳 - 基质辅助激光解吸/电离使用真空沉积界面的飞行时间的质谱。
      • 预夹J.
      • 胡诗
      • Rejtar T.
      • Moskovets E.
      • karger b.l.
      使用真空沉积界面的毛细管阵列电泳-Maldi质谱..
      • Krutchinsky A.N.
      • Kalkum M.
      • 临时。 B.T.
      用MALDI-Quadrupole离子阱质谱仪自动鉴定蛋白质。
      )。 ESI通常用于单个和三重Quadrupoles以及通常提供适度分辨率的四极离子陷阱。具有正交加速度TOF(QQTOF)的四极块质量选择器和四极碰撞单元的组合给出了高分辨率(~10,000),如果晶片很好,也许5 ppm质量精度(
      • 道森J.H.J.
      • Guilhaus M.
      飞行质谱仪正交加速时间。
      • dodonov a.f.
      • 切尔诺什维奇I.v.
      • Laiko V.v.
      大气压电离电离仪的大气压电离仪。
      • verentchikov a.v.
      • 站立K.G.
      反映飞行时间质谱仪具有电喷雾离子源和正交提取。
      • 莫里斯H.R.
      • Paxton T.
      • 戴尔A.
      • Langhorne J.
      • 伯格米
      • Bordoli R.S.
      • 霍伊斯J.
      • Bateman R.H.
      高灵敏度牢固地激活分解串联质谱在新型四极/正交 - 加速飞行时间谱仪上的串联质谱。
      )。傅里叶变换MS具有1 PPM的质量准确性的最终性能,但这些仪器更昂贵,更高贵,直到现在,他们的部署大部分限于大型MS设施。

      数据库搜索蛋白质识别

      基于肽分析,至少有三种蛋白质鉴定方法。第一次发育通常称为肽质量映射或质量指纹(
      • Henzel W.J.
      • 比赛。
      • 心理J.T.
      • 黄S.C.
      • 格兰利C.
      • Watanabe C.
      通过蛋白质序列数据库中的肽片段的分子量搜索鉴定二维凝胶的蛋白质。
      ,
      • Wada Y.
      • Hayashi A.
      • Masanori F.
      • Katakuse I.
      • Ichihara T.
      • Nakabushi H.
      • Matsuo T.
      • Sakurai T.
      • 松树H.
      新胎儿血红蛋白变体的表征,Hb F Izumi A通过分子二次离子质谱法替代的γ6Glu。
      • 莫里斯H.R.
      • Panico M.
      • 泰勒G.W.
      重组-DNA蛋白质产品的Fab-mapping ..
      • 詹姆斯P.
      • Quadroni M.
      • Carafoli E.
      • Gonnet G.
      蛋白质识别由质量型材指纹识别..
      • HOJRUP P.
      • Roepstorff P.
      使用质谱分子量信息以序列数据库中的蛋白质。
      • Pappin D.J.
      • HOJRUP P.
      • bleasby a.j.
      通过肽质量指纹快速鉴定蛋白质..
      • yates j.r.
      • Speicher S.
      • 格里芬P.R.
      • Hunkapiller T.
      肽大规模地图:一种高度信息丰富的蛋白质鉴定方法。
      )。这依赖于通过在数据库中每种蛋白质的理论消化产生的肽的预测分子质量值进行实验确定的MS峰值质量值。具有相对较小的数据库的早期观察表明,只有三个或四个肽匹配少量可以足以识别正确的打击,即使具有来自线性Maldi-Tof仪器的相对低精度的质量测量(
      • Henzel W.J.
      • 比赛。
      • 心理J.T.
      • 黄S.C.
      • 格兰利C.
      • Watanabe C.
      通过蛋白质序列数据库中的肽片段的分子量搜索鉴定二维凝胶的蛋白质。
      )。但最近,基因组数据库已经迅速增长, 例如 截至2003年6月14日,NCBINR数据库包含1,446,218个条目,比较年前50%以上。因此,蛋白质鉴定的标准变得更加严格,更准确的质量测量至关重要。还需要匹配更多数量的肽并覆盖较大的蛋白质序列。第二种方法使用来自MS / MS的各个肽的碰撞诱导的解离(CID)光谱。在数据库搜索的发展之前,使用具有快速原子轰击电离的高性能多扇形仪器的肽MS / MS光谱用于 德诺维 肽 sequencing (
      • Biemann K.
      • 勺子。
      蛋白质中结构修饰的串联质谱特征。
      )。在20世纪90年代中期,由MALDI或ESI生成的这种MS / MS光谱与数据库中所有蛋白质预测的序列标签相匹配, IE。 (短的)部分片段离子,其可归因于对应于预测肽的子集的氨基酸的相干序列(
      • 威尔m。
      肽序列标签序列数据库中肽鉴定差错鉴定。
      • ENG J.K.
      • mccormack a.l.
      • yates j.r.
      一种与蛋白质数据库中氨基酸序列相关的肽串联质谱数据的方法。
      • 威尔m。
      纳米电子涂布离子源的分析性能。
      • 克劳瑟K.R.
      • 贝克P.R.
      • 伯灵名A.L.
      来自MALDI / PSD的肽片段离子标签,用于耐腐蚀基因组数据库。
      ),如在蛋白质prospector的MS标签等程序中所实施的。在其最新形式中,这种搜索基于通过已知的碎裂规则在实验观察到的片段离子和所有预测肽的所有预测片段之间的比较。每种肽匹配可以与蛋白质匹配连接,并且即使单个肽也可以正确识别蛋白质,尽管可能在密切相关的蛋白质中复制相同的序列,因此匹配多种肽序列提供更大的统计置信度。显然,与任何一种蛋白质相匹配的肽数越大,序列覆盖率越大,正确鉴定的概率越大。耐腐蚀搜索将允许肽从数据库肽与单个氨基酸不同时鉴定肽,并且已经开发了技术以识别远程序列同源物,但这些是耗时和计算密集的(
      • 泰勒J.A.
      • 约翰逊R.S.
      序列数据库通过De Novo Peptide测序搜索串联质谱法..
      ,
      • 黄兰
      • 雅各布r.j.
      • Pegg S.C.-h.
      • Baldwin M.A.
      • 王C.C.
      • 伯灵名A.L.
      • 巴比特P.C.
      20S蛋白酶组的功能分配 T. Brucei. 使用质谱和新的生物信息学方法..
      )。最后,如果没有发现匹配,因为数据库中不存在蛋白质, 德诺维 肽测序继续是一种有价值的方法,基于已知的肽碎片规则(
      • Biemann K.
      通过串联质谱和高能量碰撞诱导的解离肽测序。
      )。这与质量良好的光谱很简单,并且由于数据库中的误差,由于数据库错误,基因组序列和处理或后期改性蛋白质,物种差异和非特异性酶切割而具有良好的肽。广泛测序的益处的早期例子是测定GALβ-1,3的主要结构(
      • 预夹J.
      • 胡诗
      • Rejtar T.
      • Moskovets E.
      • karger b.l.
      使用真空沉积界面的毛细管阵列电泳-Maldi质谱..
      )GLCNACα-2,3-唾液酸酶(
      • Wen D.X.
      • Livingston B.D.
      • Medzihradszky K.F.
      • 凯尔姆斯。
      • 伯灵名A.L.
      • 保尔森J.C.
      GALβ1,3(4)GLCNAcα2,3-唾液酸三烷烃的初级结构通过质谱序列分析和分子克隆确定。 Sialyl转移酶基因家族中蛋白质基序的证据..
      )。
      使用MS / MS和CID正在成为蛋白质鉴定的已接受标准,并且稳定地替代肽质量指纹识别,尽管串联数据的质量随仪器类型而变化很大。使用源源后衰减的MALDI-TOF仪器的序列离子信息(
      • Spengler B.
      • Kirsch D.
      • Kaufmann R.
      • Jaeger E.
      通过基质辅助激光解吸质谱法测序肽测序。
      )收集艰苦的是,质量分配的准确性相对较低,因此现在几乎没有使用,特别是马尔迪在更高的性能QQTOF上可用(
      • 舍甫琴科A.
      • 切尔诺什维奇I.
      • 站立K.G.
      • 汤姆森B.
      • 威尔m。
      通过纳米电气喷雾,同位素标记和四极/飞行时间质谱仪的组合快速'de novo'肽测序。
      • Krutchinsky A.N.
      • Loboda A.v.
      • Spicer V.L.
      • dworschak r.
      • 站立K.G.
      通过碰撞阻尼接口正交地将基质辅助激光解吸/电离离子进入飞行时间光谱仪。
      • Krutchinsky A.N.
      • 张W.
      • Chait B.T.
      快速可切换的基质辅助激光解吸/电离和电喷雾四极 - 飞行时间的飞行时间质谱法用于蛋白质鉴定。
      • 舍甫琴科A.
      • Loboda A.
      • 舍甫琴科A.
      • 站立K.G.
      Maldi四极针飞行时间质谱:蛋白质组学研究的强大工具..
      • Baldwin M.A.
      • Medzihradszky K.F.
      • 锁下行
      • Fisher B.
      • settineri c.a.
      • 伯灵名A.L.
      基质辅助激光解吸/电离与四极/正交加速时间飞行时间质谱仪进行蛋白质发现,鉴定和结构分析。
      )和tof / tof(
      • vestal M.L.
      • Juhasz P.
      • Hines W.
      • 马丁斯。
      一种新的延迟提取MARDI-TOF MS-MS,用于表征蛋白质消化。
      • Medzihradszky K.F.
      • 坎贝尔准噶梅。
      • Baldwin M.A.
      • Falick上午
      • Juhasz P.
      • vestal M.L.
      • 伯灵名A.L.
      使用高性能MALDI-TOF / TOF串联质谱仪的肽碰撞诱导的解离的特征。
      • Suckau D.
      • Revemann A.
      • Schuerenberg M.
      • HUFNAGEL P.
      • Franzen J.
      • Holle A.
      用于蛋白质组学的新型Maldi升力-TOF / TOF质谱仪..
      ) 仪器。低分辨率的三维离子陷阱非常受欢迎并且非常适合于高吞吐量LC-MS / MS,但在全扫描模式下操作时不能区分不同的电荷状态。这是因为离子不按质量分开但是质量/电荷(m/z),ESI通常提供乘法电荷的离子。基于这种低分辨率离子阱数据的库搜索通常基于前体离子可以具有一个,两个或三个质子的假设来测试多种可能性。对于一些搜索引擎,假设所有片段被单独收取,从而提高任何肽匹配将不正确的概率。然而,离子陷阱的普及已经为软件开发提出了挑战,现在几个搜索引擎现在假设来自繁殖的前体的片段离子也可能是多次充电的。可以从片段离子谱的分析中推导出前体离子电荷状态(
      • 大歌j.
      • Magnin J.
      • Dessigny T.
      • 吉龙M.
      • Masselot A.
      改善肽充电状态分配..
      )。具有更高的分辨率仪器,充电状态从峰间距中明确地明确地确定, 例如 使用QQTOF仪器,傅里叶变换MS已识别质子化分子离子和蛋白质的片段离子的充电状态,可达45kDa(
      • GE Y.
      • Lawhorn B.G.
      • El Naggar M.
      • 施特劳斯E.
      • 公园J.-H.
      • Begley T.P.
      • F. W.
      MLEFFERTY。通过电子捕获解离质谱法向下表征较大的蛋白质(45kDa)。
      )。还可以添加新的离子陷阱设计,包括线性陷阱,提供更高的分辨率,以及与其他质量分析仪相结合,将构成新一代强大的串联仪器的基础。
      数据库搜索中的一个很大程度上是不受控制的可变因素是搜索引擎的选择,其中有几个共同用途(
      • Handley J.
      MS蛋白质识别软件..
      )。许多网站提供了免费访问基于Web的数据库搜索程序,用于肽质量指纹识别和识别序列标签,所有这些都提供了其他工具,例如用于计算同位素模式的程序,预测酶消化模式,以及理论CID碎片预测。有些网站允许免费下载程序。互联网访问的替代方案是购买许可证,以便在内部居住的节目,以及一些质谱仪供应商提供软件和软件许可证购买仪器。所有当前搜索引擎的枚举是一个移动目标,但众所周知的基于Web的示例包括由瑞士生物信息学研究所提供的扩展蛋白质组学服务器上的工具(www.expasy.ch/tools.),来自Matrix Science的吉祥物(英国伦敦; www.matrixscience.com.)和加利福尼亚大学(旧金山,加利福尼亚州; Prospector.ucsf.edu)提供的蛋白质探测器。仪器制造商提供的系统包括从Agilent Technologies(Palo Alto,CA)的Thermo-Finnigan(San Jose,CA)和Spectrum Mill亮相。

      消化孤立的蛋白质 相对 消化蛋白质混合物

      除非除了分离步骤之前,否则通过消化和肽质量指纹识别的蛋白质鉴定对于复杂的蛋白质混合物,除非是分离步骤,否则最常见的是二维凝胶分离。使用大型格式凝胶,可以从单个凝胶中分离和分析数百甚至数千个蛋白质点。这是手动重复和耗时的,但已经开发了自动化方法(
      • binz p.-a.
      • Muller M.
      • Walther D.
      • Bienvenut W.v.
      • GRAS R.
      • Hoogland C.
      • Bouchet G.
      • Gasteiger E.
      • Fabbretti R.
      • 同性恋者。
      • Palagi P.
      • 威尔金斯M.R.
      • 胭脂五。
      • Tonella L.
      • Paesano S.
      • rossellat g.
      • Karmime A.
      • Bairoch A.
      • Sanchez J.-c.
      • Appel R.D.
      • Hochstrasser d.f.
      用于自动化蛋白质组学研究和显示蛋白质组图像的分子扫描仪..
      ),几家公司提供了用于现场鉴定,点切割,消化和肽混合物的机器人在马尔达板上的斑点。在实践中,凝胶分离同样适用于MS / MS,但是另一种方法是消化复合混合物,然后在引入质谱仪之前将肽分离。这种混合物可含有成千上万的蛋白质和多维高压Lc(HPLC), 例如 通过强阳离子交换色谱法初始分离,然后是反相色谱(
      • Washburn M.P.
      • 擦拭。
      • YALES 3RD。,J.R.
      多维蛋白质识别技术酵母蛋白质大规模分析。
      )。由于这种方法不再可能,因为这种方法在特定肽和衍生它们的蛋白质之间丧失,因此CID和肽测序是必需的。后一种方法比二维凝胶分析更容易自动化,因此在许多实验室中,它正在更换凝胶的使用。它还可以与一维凝胶分离组合,其中可以通过HPLC分离将可含有多种蛋白质的单独凝胶分离,可以含有多种蛋白质,并且通过HPLC分离将肽引入质谱仪上(
      • 黄兰
      • Baldwin M.A.
      • 马耳他D.
      • Medzihradszky K.F.
      • 贝克P.R.
      • Allen N.
      • Rexach M.
      • Edmondson R.
      • 坎贝尔J.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • vestal M.L.
      • 伯灵名A.L.
      鉴定核孔隙络合物的蛋白质 - 蛋白质相互作用 S. Cerevisiae. 使用高吞吐量MALDI-TOF / TOF串联质谱..
      )。

      数据收集和分析的自动化

      在所谓的数据依赖性实验中,用HPLC耦合到串联质谱仪,MS光谱的重复记录与CID分析峰的选择和分析进行交错(
      • 分蘖P.R.
      • 土地A.P.
      • Jardine I.
      • 墨菲下午。
      • Sozio R.
      • Ayrton A.
      • Schaefer W.H.J.
      液相色谱 - 质谱(n)分析在体外形成的新型甘氨酸代谢物的表征。
      )。通过连续运行的这种实验产生的数据量是用于手动解释的压倒性,因此自动化变得必不可少。对信息学程序的有效自动转移质谱数据取决于所谓的“峰值拾取”算法的可靠性和准确性。这些方案通常是仪器制造商的专有,尽管已经描述了一些数学方法(
      • Breen E.J.
      • Hopwood F.G.
      • 威廉姆斯K.L.
      • 威尔金斯M.R.
      高通量蛋白质鉴定的自动泊松峰收获..
      )。理想情况下,它们将仪器专用和技术特异性原料质谱转换为单同位素质量和强度的通用列表,通常在一些光谱处理之后,以增强峰值信封(离子电流型材),同时减少电子和随机噪声。这 m/z 每个峰值的值通常由其质心(峰的质心)定义,以高于峰值高度的一定部分,例如50%,选择避免在基线上包含噪音和噪音允许某种故障完全解析相邻的峰值。 MALDI生成的离子单独收费,但ESI产生的离子通常携带多次电荷,因此ESI峰由分数分开 m/z 价值观。挑战是正确识别每个同位素集群中的第一峰。对于良好的分离的分离的肽离子的分子质量小于~1500da,具有良好的信噪比,这相对简单,作为每个簇中的第一峰, IE。 单同话课峰(
      • carr s.a.
      • 伯灵名A.L.
      • Baldwin M.A.
      术语单位素差异,平均质量,质量分辨率和质量准确性的含义和用法用于测量生物分子。
      ),是最丰富的。在2000年之下,这不再是真,并且随着质量的增加,单同位素峰的正确识别变得逐渐变得更加困难,特别是如果它低于选择以区分实际峰值和背景噪声的阈值。该问题由可能在肽混合物的光谱中发生的重叠同位素簇混合。

      设置变量参数和排名命中

      一旦记录了实验数据,就会进行平滑,可能的基线减法,提取的峰值,并且可能根据排除非肽峰的标准过滤,然后将数据搜索适当的数据库,如研究人员所选择的。所有搜索引擎允许设置多种变量,如蛋白质分子质量范围,Pi范围,峰值的质量耐受性,CID前体离子的质量耐受性,片段离子的质量耐受,电荷数量,数量匹配所需的肽,以及对某些残留物的可能修饰,例如半胱氨酸烷基化或甲硫氨酸的氧化。然后,程序返回一系列命中,根据多种可能的标准之一排名。遗憾的是,目前没有普遍的标准来评分这些计划的产出,因此决定/确定有显着匹配是什么并不简单。搜索引擎提供的信息是可变的, 例如 蛋白质探测器内的评分基于蜂蜜(分子量搜索),这允许蛋白水解产生的肽尺寸的不均匀分布(
      • Pappin D.J.
      • HOJRUP P.
      • bleasby a.j.
      通过肽质量指纹快速鉴定蛋白质..
      )。这并不是特别提供信息,但一些研究人员已经指定了从肽质量映射的击中至少100的肥大得分,以显着。但请注意,可以在上面定义任何蜂蜜阈值,匹配肯定是正确的,下面的匹配项不是。在加州大学,旧金山我们正在基于在MS / MS光谱中观察某些离子类型,诸如的骨架离子的频率开发新的蛋白质探测器的评分系统 yb 比侧链离子更高,如 d, v , 和 w。采用基于概率的评分系统的其他算法包括续集(
      • ENG J.K.
      • mccormack a.l.
      • yates j.r.
      一种与蛋白质数据库中氨基酸序列相关的肽串联质谱数据的方法。
      ),吉祥物(
      • Perkins D.N.
      • pappin d.j.c.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库的基于概率的蛋白质识别。
      )和声纳(
      • 领域H.I.
      • Fenyo D.
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      雷达是一种自动化蛋白质组质谱分析的生物信息学溶液,优化蛋白质识别和关系数据库中的归档数据。
      正在开发)正在制定以提供更可靠的意义阈值,但是靠近阈值的推定匹配可能很不正确。
      通过开发改善现有搜索引擎的评分的统计工具,许多组织解决了这些问题,特别是续集(
      • maccoss m.j.
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      使用修改的续集算法基于概率的蛋白质识别。
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      经验统计模型来估算MS / MS和数据库搜索所做的肽识别的准确性。
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      蛋白质组学中霰弹枪肽测序评估的一种新算法:肽MS / MS光谱和续集序列的支持向量机分类。
      ),而其他人已经开发出独立的工具(
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      基于强度的串联质谱法的统计读入仪..
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      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱鉴定蛋白质的统计模型。
      )。理想情况下,分配的概率将独立于所使用的质谱仪和所使用的搜索引擎。一些方法专注于改善的肽鉴定,它们通常采用训练集来导出肽片段规则的知识库。大多数方法的明确目标是使高通量实验更加可靠,并最大限度地减少对数据的耗时,视觉检查及其主观手动解释的需求。这种方法应促进来自涉及多个LC-MS / MS的实验的整个数据集的分析,其中数万的MS / MS光谱具有数万个MS / MS光谱。描述的一种方法使用期望最大化算法为每个肽识别分配真正的概率值。对整个数据集的分析识别源自单一蛋白质的“兄弟”肽。对于给定蛋白观察到的较高数量的伴侣肽增加了正确鉴定蛋白质的概率。因此,基于统计原理,基于单肽的蛋白质鉴定比基于多种肽的重量更少(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱鉴定蛋白质的统计模型。
      )。还给出了特定肽序列是多于一种蛋白质的一部分的情况,如许多酶家庭中的那样。
      经验表明,对于从单个蛋白质的消化物的任何分析,将观察到的质谱峰,从搜索引擎不匹配。其中一些可以通过落在常规肽离子的元素组合物之外的分数质量值(质量缺陷)来鉴定为非肽峰。其他人可以是来自靶向蛋白质的肽,但由非特异性切割或携带后期性或化学修饰产生。然而,在非常多的情况下,从单个凝胶点切割的样品或在HPLC运行中对应于单个峰的分数将实际上含有多种蛋白质,并且只有肽的子集将与任何给定的蛋白质匹配。如果采用肽质量指纹识别,可以减去与顶部评分命中匹配的肽,然后可以再次检测修正的峰值列表以进行第二和后续蛋白质。然而,MS / MS更好地能够区分肽和非肽信号,并且还可以鉴定修饰的肽。当MS测量与HPLC分离耦合,在线或离线时,将更成功地检测多种蛋白质,部分原因是允许更宽的动态范围,并且因为它减少了抑制效果, IE。 仅存在于混合物中存在的肽的子集的选择性电离。

      实验设计和方法对结果质量的影响

      在考虑MS的蛋白质标识的可靠性时,必须考虑获得错误结果的各种来源。首先,在初始隔离和消化样品期间存在其他蛋白质的污染,这难以避免低水平样本, 例如 在凝胶电泳期间,从凝胶中切割凝胶,从样品管,移液器,缓冲液或掉入样品中的外来物质(如头发,皮肤,来自衣物,实验室粉尘的材料)。然后,在试图最小化可能对电离的不利影响的盐或洗涤剂的存在时,有效地提取肽和样品的制备,同时最小化可能对电离产生不利影响的盐或洗涤剂的存在。选择的分析技术应该适合样品, 例如 在分析或在LC-MS / MS中,不应分析高度复杂的混合物而没有分离步骤。如果优化前面的步骤,则质谱法适用,仪器保持良好,并且运行合适的校准光谱,所获得的数据应该尽可能良好。
      在将数据提交到搜索引擎中,研究人员必须首先选择合适的数据库,并且必须确保适当设置所有变量。如果可能,特别是如果用户对相关的搜索引擎不太熟悉,则应使用相同数据集的不同值提交多个搜索,理想地使用不同的搜索引擎。在加利福尼亚大学旧金山,我们经常与吉祥物和蛋白质勘探器比较点击。强蛋白击中通常与搜索引擎重合,并且由于额外的肽鉴定,可能会变得更强。如果其他搜索引擎发现不同的肽,则基于单个弱肽的弱命运也可以改善,这可能发生在我们认为具有蛋白质探测器的一些不同离子类型的情况下,或者即使两个搜索都识别相同的肽。相比之下,我们也不太可能相信只有一个搜索引擎发现的弱命中。对于高通量分析,审查每种光谱并不现实,但应仔细审查各种光谱,特别是任何产生特别重要或意外发现的谱。在这些中,应检查信噪比,应确认是否应确认适当的同位素峰,并且应检查同位素间距,以确定充电状态和大规模分配是正确的。然而,如果可以检查原始数据,而不是平滑,去同位素或以其他方式操纵范围的频谱,则这将仅是有意义的。
      源自搜索结果的信息取决于样本的性质,使用的技术和特定的搜索引擎,但有一些一般的原则需要考虑。对于肽质量指纹识别,鉴定的肽应该有足够的序列覆盖率。因此,代表10%序列的四种肽的匹配不构成可靠的击球,不应列为阳性鉴定。相反,表示20%序列的六种肽可能足以暂定鉴定。在这个级别,没有明确的规则,因此用户应该在警告一侧错误,并考虑到越来越大的数据库规模和模糊或不正确的结果的风险,应该认为来自at的证实数据是必不可少的至少一个CID光谱。对于基于CID数据的蛋白质识别,重要的是要理解,第一步需要正确的肽鉴定。只有在实现这一点时,蛋白质标识才有任何相关性。理想地,对肽匹配的检查应该揭示匹配的片段峰倾向于是CID光谱内的更强的峰,优选地分布在整个内部 m/z 范围而不是来自低质量离子的全部。希望,将有一些化学逻辑与频谱和碎片, 例如 组氨酸代表另一个质子化的位点,并在ESI中给予更高的电荷状态,C末端精氨酸 y 而不是 b 离子形成,裂解N-末端到脯氨酸是有利的,因此必须理解的是,蛋白质是可以代表多种形式之一的基因产物。如果截断,则才会在肽中鉴定适当的末端,然后认为该肽可以对应于非特异性切割是非常重要的。如果在肽中观察到对应于实际剪接点的氨基酸序列,则替代的剪接变体才会明确地建立。
      没有结构或序列推论可以基于未观察特异性肽;这种肽可能来自蛋白水解但是根本地没有检测到,由于一种或多种修饰,它可能具有意想不到的质量,或者残留物确实存在于序列中,但蛋白水解可能不会如预期进行。值得注意的是,没有确定特定蛋白质存在的证据并不明确地建立不存在蛋白质的证据。即使蛋白质可以在一个样品中发现但不是另一种样品,但是将其描述为存在于样品A但不是样品B中,这是不正确的。这是MS根本不能证明的东西。
      然后存在支持信息的问题。直到最近,大多数质谱实验都针对识别少量蛋白质。在这种情况下,通过获得适当的抗体并运行蛋白质印迹来常规确认任何鉴定。最后,可能需要创造敲除小鼠,以确定是否存在任何生物相关性,这对于朊病毒蛋白的结合伴侣证明是朊病毒蛋白的结合伴侣(
      • Schmitt-Ulms G.
      • legname g。
      • Baldwin M.A.
      • 球H.L.
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      神经细胞粘附分子(N-CAMS)与细胞朊病毒蛋白的结合。
      )。这种确认在高通量蛋白质组学实验中是不可能的,因此研究人员有责任丢弃边际结果或呈现搜索输出的完整细节,以便其他人可以自身的评估。

      蛋白质定量

      尽管蛋白质组学中的许多实验只需要鉴定蛋白质,但定量也可能是重要的,特别是对于差异分析,例如患病和健康状态的样本的比较。在广泛采用MS之前,通过密度测定法对二维凝胶上的斑点染色强度的比较是该问题的常见方法。凝胶的使用继续进行质谱分析,由某些工人广泛自动化(
      • binz p.-a.
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      用于自动化蛋白质组学研究和显示蛋白质组图像的分子扫描仪..
      )。然而,这种定量方法可能患有有限的动态范围用于染色,蛋白质标识中的不确定性,以及斑点的变暗可能是由于新蛋白质的存在而不是蛋白质的上调蛋白质负责任的。虽然现在常见的是使用显示差异染色的斑点的质谱分析,但混合物中低水平蛋白质的问题可能持续存在。耐凝胶电泳(
      • undu m.
      • 摩根M.E.
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      差异凝胶电泳:一种用于检测蛋白质提取物变化的单凝胶方法。
      ),其可商购获得Dige系统(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ),使用光谱可解析的荧光染料可以将其在单个二维凝胶上分离和定量三个样品。这采用了自动定位和分析蛋白斑点的软件,为观察到差异的统计信心。
      一种不同的方法依赖于MS的功率分离和识别差异同位素标记的物种。一些研究人员比较了在不同同位素环境中生长的细胞中的蛋白质, 例如 合并 15 n或者 13c进入一种蛋白质群体,肽可以与含有更轻同位素的类似物区分 14 n或者 12C通过群众差异(
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      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单准确的方法。
      )。在肽的MS分析中使用至少20年的另一个同位素是 18 o(
      • desiderio d.m.
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      稳定同位素掺入肽内标在生物组织中肽的野外解吸质谱法制备的肽内标。
      )。消化蛋白质 18富含o富含的水导致沉重的同位素掺入形成的每种新肽的C末端,除了预先存在的蛋白C末端。使用1:1的重和轻水水的混合物导致含有肽C末端的所有CID片段的质谱倍增, 例如 y 离子,让他们区分 b 离子和其他N-末端片段。使用消化中的比较蛋白质组学 18通过描述作为“逆标记”的方法进行了新的扭曲。通过进行两个平行但同位素逆转的实验,然后从另一个中减去一种光谱,只有在丰度中衍生自蛋白质的肽仍有待分析(
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      18o标记质谱,用于快速鉴定标记/靶蛋白..
      )。一种复杂因子是通过蛋白酶催化的同位素标记的氧的进一步交换,其可能导致两个存在 18o /羧基,而不是一个。然而,这可以从蛋白水解中解耦(
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      蛋白水解解剖 18o标记:内皮酶催化剂 16 o- 18o交换截短的肽基材..
      )并且有利的是,它给出了4Da的质量差而不是2,从而确保了自然同位素簇的更有效分离。
      引入稳定同位素的另一种方法是用含有光或重同位素的化学试剂差异地标记特定的氨基酸如半胱氨酸。这种试剂可以包含同位素编码的亲和标签(ICAT),以富集标记的肽,以及允许测量相对丰度(
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      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
      )。同位素标记策略的强度是它允许特异性标记掺入两种蛋白质群中,然后可以在任何提取,消化,肽分离和分析之前将其混合在一起。只要掺入不同同位素的肽具有几乎相同的物理和化学性质,峰值高度或来自MS实验的区域的比例将与每种蛋白质的相对量成比例。在实践中,一些同位素比其他同位素更好, 例如 氢气和氘之间的极性的差异影响了HPLC中的保留时间,而掺入 12 C/ 13肽对中的C标签没有可测量的效果(
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      使用可切割的低水平蛋白质混合物的质谱分析 13C-同位素编码亲和标签和多维色谱..
      )。因为在所有肽中存在天然存在的重同位素的分布,所以必须在足够的数字中添加重的同位素以完全分离用光和重试剂衍生的肽的同位素图案。原始ICAT试剂使用了八个氘原子,最近的变种使用九个 13C原子。用于定量的特殊软件正在从仪器制造商和提供MS蛋白质组学工具的网站上获得。在仔细进行实验中,可以测量肽对的强度比率在约10%之内,尽管较弱的肽或受重叠峰的影响可能远远差不多。 ICAT方法适用于高通量实验,可以与优化蛋白质识别的统计方法相结合(
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      新软件工具在同位素编码亲和标签(ICAT)和串联质谱中的定量蛋白质分析中的应用:II。大规模蛋白质分析串联质谱法评价,以及统计工具的应用数据分析与解释。
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      • von haller p.d.
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      新软件工具在同位素编码亲和标签(ICAT)和串联质谱中的定量蛋白质分析中的应用:I。通过应用Icat和串联质谱法鉴定的肽序列和蛋白质的统计数据集与与T细胞共用的蛋白质脂质筏..
      )。
      注意,上述方法仅产生“相对”量,而“绝对”蛋白质定量需要一种诸如稳定同位素稀释的技术,其中将已知量的同位素标记的肽加入到摘要中(
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      特定蛋白的同位素稀释质谱定量:载脂蛋白A-I的模型施用。
      )。这种肽设计成模仿通过感兴趣的蛋白质的蛋白分解形成的肽,并且可以进行化学修饰以模拟改性蛋白质如磷蛋白(
      • 格柏S.A.
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      通过串联质谱法从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白..
      )。

      化学和后期改造

      MS是研究共价修饰的理想选择,因为所有这些修饰都涉及分子量的变化,其反映在携带改性氨基酸的任何肽的质量中。有时,这是对化学转变的独特可归因,例如-2Da用于二硫键形成或乙酰化的+ 42Da。容易识别一些变化,例如添加氧气的+16DA,但是可能尚不清楚这是否是甲硫氨酸亚砜的常用或更不寻常的东西。它还不确定这是否是在样品处理期间发生的后期改变或发生化学变化。其他群众变化可能更加暧昧, 例如 +80 da可以代表磷酸化或硫化,尽管这些可以通过检测到阴离子 m/z 79 相对 80分别和非常精确的质量测量。已经开发了专门的MS / MS技术,用于鉴定携带特定修饰的肽的前体离子,例如磷酸化或糖基化(
      • Huddleston M.J.
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      • 豆豆
      • carr s.a.
      电喷雾液相色谱/质谱法选择性检测复合混合物中的磷酸肽。
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      质谱法测定披风素水平磷酸肽的选择性检测和序列。
      • Huddleston M.J.
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      • carr s.a.
      电喷雾电离LC / MS和LC / MS / MS的凝结肽的碰撞碎片化:用于选择性检测蛋白质消化中糖肽的方法..
      )。一些修改可能是非常异质的,如 N - 糖基化,尽管酶移除修饰的组可以提供更明确的变化, 例如 N-Glycosidase F删除 N - 链接糖并将天冬酰胺转化为天冬氨酸(+1DA)。对于低化学计量的瞬态修饰,诸如监管作用中发生的磷酸化的主要困难。已采用亲和方法以富集磷酸肽,例如固定的金属离子色谱,但成功(
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      )。当修饰在化学分离期间或质谱仪中时,难以加剧困难。因此,改性肽的CID和MS / MS应潜在地揭示改性位点,但是来自分子离子的磷酸的容易损失可以防止检测任何序列特异性离子。通常,单独的肽质量映射不能用于鉴定后期改变的修饰。基于仅基于MS数据,可以对磷酸肽质量值进行搜索,该质量比氨基酸序列(或160da, 等等 。),但是MS / MS确认序列至关重要,即使无法定义修改的精确站点。其他需要特殊技术的不稳定修改是硫化(
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      ) 和 O-glcnac(
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      结论

      很明显,MS的蛋白质组学分析领域继续处于一个非常动态的状态,使其目前难以指定分析协议和随后的解释性判断的绝对标准。尽管如此,提交基于MS的手稿的作者 分子& Cellular Proteomics 必须采用符合目前可接受的标准的方法。因此,仅基于肽质量指纹识别的蛋白质鉴定不再是可接受的,并且必须通过CID和MS / MS互补。显然,研究人员必须避免“黑匣子”心态,并对理解他们正在使用的方法负责。此外,强烈建议作者承担呈现过多信息时的实验,其数据及其解释的风险。然后,它将在日记编辑和审核人员上努力确定这些信息的一小部分相关,并且出版物需要。作者应该报告他们使用的软件,包括版本,数据库版本和分配给每种蛋白质识别的概率分数。 分子& Cellular Proteomics 还将鼓励出版关于对数据库搜索和统计分析的实验技术或新颖方法的提高的报告,以提高基于质谱测量的蛋白质分析的准确性和可靠性。虽然目前正在使用的方法显然可以很好地工作,但到目前为止,他们的申请已在很大程度上是经验的。本期刊的编辑现在认为,该领域的研究人员在统一,系统的和合理的蛋白质鉴定方面发展,采用和遵守。

      致谢

      我感谢来自的建设性投入 分子& Cellular Proteomics 编辑Ralph Bradshaw,Al Burlingame,Ruedi Aebersold和Steve Carr,以及丹尼斯Hochstrasser和他在Geneprot的同事。

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