鉴定 O- 联系N - 使用二维凝胶电泳和质谱法在大鼠骨骼肌中的乙酰甘氨酸蛋白蛋白;

  • Caroline Cieniewski-Bernard
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    UnitéMiledeDeCherche,Center National de La Recherche Scientifique 8576,Glycobiologie Structurale et fonctionnelle,IFR118,和
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  • Bruno Bastide.
    一致
    应该解决谁的通信:LaboratoiredeGlustratiatéNeuomusculaire,UniversitédeScienceset Technologies de Lille,59655 Villeneuve d'Ascq Cedex,法国。电话:33-320-336-141;传真:33-320-436-555.
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    LaboratoiredeGlustratiatéNeuomusculaire,Universitédesscienceset Technologies de Lille,59655 Villeneuve d'Ascq Cedex,法国
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  • 托伊莱夫瓦尔夫
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    UnitéMiledeDeCherche,Center National de La Recherche Scientifique 8576,Glycobiologie Structurale et fonctionnelle,IFR118,和
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  • JérômeLemoine.
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    UnitéMiledeDeCherche,Center National de La Recherche Scientifique 8576,Glycobiologie Structurale et fonctionnelle,IFR118,和
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  • yvonne mounier
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    UnitéMiledeDeCherche,Center National de La Recherche Scientifique 8576,Glycobiologie Structurale et fonctionnelle,IFR118,和
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  • Jean-Claude Michalski
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    UnitéMiledeDeCherche,Center National de La Recherche Scientifique 8576,Glycobiologie Structurale et fonctionnelle,IFR118,和
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了Center National De La Recherche Scientifique(CNRS)/UnitéMicledeCherche8576(J.-C. Michalski博士),IFR 118和中央国家D'Etudes Spatiales(第3194号-2002)。本研究中使用的蛋白质组学设施是由欧洲共同体(联邦联邦),Région诺敦 - 帕斯 - 德拉斯(法国),CNRS,Lille的Génopôle,以及大学德里尔斯·德里尔斯·德里尔。
      O- 联系N - 乙酰甘氨酸氨基氨基化( O- GLCNAC)是具有磷酸化复杂相互作用的核 - 细胞质蛋白的调节后修饰。 O- Glcnac已被描述为营养传感器,用作尿苷二磷的供体的UDP-Glcnac水平N - 乙酰甘氨酸:多肽β-N - 受葡萄糖的细胞命运调节的 - 乙酰基 - 葡糖氨基氨基转移酶。因为肌肉收缩均依赖于葡萄糖代谢,并且通过磷酸化/去磷酸化过程的高度调节,我们决定调查鉴定 O- 使用蛋白质组学方法的骨骼肌中GlcNAC改性蛋白质。将十四蛋白鉴定为存在 O- glcnac修饰。这些蛋白质可以分类为三种主要类:I)蛋白质,含有糖酵母途径和能量代谢和III的细胞质和核或结构蛋白,II)蛋白质的蛋白质和骨质蛋白质(肌球蛋白)重链)。减少了 O- 在14天的后肢卸载后测量GlcNAC水平在缓慢的姿势肌肌中,功能性萎缩模型,其特征在于收缩力的减少。这些结果强烈建议 O- GlcNAC修饰可以作为骨骼肌生理学中的重要调节系统。
      细胞有很多方法可以将其蛋白质组的复杂性从DNA增加到功能蛋白质。其中,翻译后修饰如磷酸化,糖基化或乙酰化为细胞蛋白质组提供额外的功能复杂程度。碳水化合物共享真正的结构多样性,并通过两种主要类型的联系,蛋白质附着在蛋白质中,分别是芦笋( n )或丝氨酸/苏氨酸( O- )残留物。碳水化合物的结构多样性使它们能够确保与其他分子非常特异和选择性相互作用。 O- 联系N - 乙酰甘氨酸氨基氨基部分( O- GLCNAC)
      使用的缩写是: O- 格纳克, O- 联系N - 乙酰甘氨酸胺基化; WGA,小麦胚芽凝集素; HRP,辣根过氧化物酶;胡,后肢卸货; EDL,伸展位Digitor onalus; dthiothreitol; IAA,碘乙酰胺; MALDI-TOF,综合辅助激光解吸/电离 - 飞行时间; OGT,UDP-GlcNAC-肽-β-GlcNAc转移酶; O-glcnacase, N - 乙酰-β-d-Glucosaminidase; IPG,固定的pH梯度; ECL,增强化学发光; TLC,薄层色谱; TBS,TRIS缓冲盐水; 2D,二维; ACN,乙腈,TFA,三氟乙酸。
      1使用的缩写是: O- 格纳克, O- 联系N - 乙酰甘氨酸胺基化; WGA,小麦胚芽凝集素; HRP,辣根过氧化物酶;胡,后肢卸货; EDL,伸展位Digitor onalus; dthiothreitol; IAA,碘乙酰胺; MALDI-TOF,综合辅助激光解吸/电离 - 飞行时间; OGT,UDP-GlcNAC-肽-β-GlcNAc转移酶; O-glcnacase, N - 乙酰-β-d-Glucosaminidase; IPG,固定的pH梯度; ECL,增强化学发光; TLC,薄层色谱; TBS,TRIS缓冲盐水; 2D,二维; ACN,乙腈,TFA,三氟乙酸。
      构成丰富和动态的可逆形式的糖基化,对大量细胞质和核蛋白质(审查,参见参考文献。
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      • 哈特G.W.
      核细胞立体 O- 糖基化: O- glcnac和功能性蛋白质组学..
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      • 坂鸟酸。
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      蛋白质功能的不同调节 O- GLCNAC:翻译后修饰的核和细胞质碳水化合物..
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      • 哈特G.W.
      O- GLCNAC:监管后翻译后修改..
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      • 井L.
      • 哈特G.W.
      O- GLCNAC转动二十:功能含义对糖和细胞溶质蛋白的翻译后修饰。
      )。单糖 N - 通过UDP-glcnac-peptide-β-glcNAc转移酶(OGT)与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基连接 - 乙酰戊酰胺与蛋白质(
      • Haltiwanger R.S.
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      酶促添加 O- GLCNAC至核和细胞质蛋白。鉴定尿苷二磷 - N - 乙酰葡糖胺:肽β-N - 乙酰甘氨酸氨基氨基丙烷酶..
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      • Haltiwanger R.S.
      • Blomberg M.A.
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      核和细胞质蛋白的糖基化。尿素二磷纯化和表征 - N - 乙酰葡糖胺:多肽β-N - 乙酰甘氨酸氨基氨基丙烷酶..
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      • 鲁布斯W.A.
      • 汉诺威J.A.
      功能表达 O- 联系GlcNAc transferase. Domain structure and substrate specificity..
      )使用UDP-GLCNAC作为糖供体,可以通过 N - 乙酰-β-d-Glucosaminidase( O- glcnacase)(
      • 井L.
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      动态的 O- 核和细胞溶质蛋白的糖基化:核细胞间质β的进一步表征 - N - 乙酰甘氨酸氨基氨基氨基, O- glcnacase ..
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      • dong d.l.
      • 哈特G.W.
      纯化和表征 O- GLCNAC选择性 N - 乙酰-β-d - 大鼠脾细胞溶胶葡萄氨酰胺酶..
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      • comer f.i.
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      动态的 O- 核和胞质蛋白的糖基化:中性,细胞源β的克隆和表征 - N - 来自人脑的乙酰葡糖胺酶..
      )。 UDP-GLCNAC的浓度对葡萄糖水平高度敏感,并取决于己糖胺途径(
      • 汉诺威J.A.
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      升高 O- 联系N - 胰腺β细胞中的乙酰氨基葡萄糖代谢..
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      • 哈特G.W.
      一个角色 N - 乙酰甘氨酸作为营养传感器和胰岛素抵抗的介体。
      )。 OGT和 O- Glcnacase似乎调节附件和去除 O- GlcNAC可以与磷酸化过程中的激酶/磷酸酶系统进行比较(
      • comer f.i.
      • 哈特G.W.
      O- 核和细胞溶质蛋白的糖基化。动态相互作用 O- GLCNAC和 O- 磷酸盐..
      )。实际上,磷酸化和 O- GlcNAC修饰通常在相同或邻近羟基部分的相互互核, O- GLCNAC表现为具有复杂的动态相互作用的调节修改,具有磷酸化。这种关系 O- GLCNAC和 O- 磷酸盐,称为“阴阳”过程,已经证明了细胞蛋白的总水平(
      • Lefebvre T.
      • Alonso C.
      • Mahboub S.
      • dupire m.j.
      • Zanetta J.P.
      • caillet-boudin m.l.
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      冈田酸的影响 O- 联系N - 神经母细胞瘤细胞中的乙酰甘氨酸胺水平..
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      • Griffith L.S.
      • Schmitz B.
      O- 联系N - 细胞神经元的乙酰甘氨酸胺水平响应磷酸化的逆时针。
      )还有孤立的蛋白质(
      • 郑X.
      • COLE R.N.
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      • 哈特G.W.
      选择 O- 糖基化/ O- 鼠雌激素受体β的磷酸化..
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      • 杜邦 - 瓦洛斯L.
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      磷酸化与磷酸化平衡的证据 O- tau蛋白的Glcnac糖基化 - 核定核的作用..
      )。许多 O- GlcNAC蛋白已被鉴定到日期:它们属于各类蛋白质,包括细胞骨骼组分(
      • Hagmann J.
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      细胞骨骼蛋白瞳孔是 O- 糖基化..
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      有丝分裂逮捕相关的增强 O- 联系glycosylation and phosphorylation of human keratins 8 and 18..
      ),激素受体(
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      选择 O- 糖基化/ O- 鼠雌激素受体β的磷酸化..
      ),转录因子(
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      O- glcnac和基因表达的控制..
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      转录因子PDX-1由翻译后修改 O - 链接 N - - 乙酰甘氨酸和该修饰与Min6β-Cells中的DNA结合活性和胰岛素分泌相关。
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      • Tsokos G.C.
      • nambiar m.p.
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      ETS转录因子ELF-1的活化需要磷酸化和糖基化:活化ELF-1的缺陷表达涉及系统性红斑狼疮患者的降低的TCRα链基因表达。
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      • Gewinner C.
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      • Beisenherz-Buss C.
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      转录CREB结合蛋白的共膜剂优先与STAT5的糖基化形式相互作用..
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      • Roos M.D.
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      O-glycosylation的SP1衍生的肽嵌段已知的SP1蛋白质相互作用..
      ),激酶(
      • 鲁布斯W.A.
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      功能表达 O- 联系GlcNAc transferase. Domain structure and substrate specificity..
      ),信号分子(
      • Patti M.E.
      • Virkamaki A.
      • LAREADER E.J.
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      • YKI-JARVINEN H.
      葡萄糖胺在体内激活六甲胺途径诱导骨骼肌中早期儿科胰岛素信号传导事件的胰岛素抗性..
      ),核孔蛋白(
      • 霍尔特G.D.
      • 雪C.M.
      • 高级A.
      • Haltiwanger R.S.
      • Gerace L.
      • 哈特G.W.
      核孔复合糖蛋白含有细胞质设置 O- 联系N - 乙酰甘氨酸..
      )和病毒蛋白(
      • 麦地那美国。
      • 格罗夫克。
      • Haltiwanger R.S.
      SV40大T抗原被修改为 O- 联系N - 乙酰葡糖胺,但不是用其他形式的糖基化。
      ),建议 O- GlcNAC可以涉及几种关键的细胞系统(转录,核传输和细胞骨架结构)。众多证据表明了重要性 O- GLCNAC在许多病态中,包括糖尿病,癌症,神经退行性疾病,以及适应过程,其在细胞生命中的至关重要的作用(用于审查,参见参考文献。
      • comer f.i.
      • 哈特G.W.
      O- 核和细胞溶质蛋白的糖基化。动态相互作用 O- GLCNAC和 O- 磷酸盐..
      )。
      肌肉收缩现象均依赖于葡萄糖代谢,并通过磷酸化/去磷酸化过程进行高度调节。此外,哺乳动物骨骼肌纤维显示出具有肌肉纤维的能力来调节其分子,功能性和代谢性能的适应性的巨大潜力,响应于改变的功能性要求,例如神经肌肉活动或机械负荷的变化(
      • Pette D.
      历史观点:哺乳动物骨骼肌的可塑性..
      )。实际上,我们之前已经表明了由后肢卸载(HU)引起的慢速功能转变,其包括在肌球蛋白重链的同种型组合物中慢慢转变(
      • 史蒂文斯L.
      • 苏丹K.R.
      • Peuker H.
      • Gohlsch B.
      • Mounier Y.
      • Pette D.
      肌蛋白重链mRNA和蛋白质同种型在大鼠卸载肌肌中的时间依赖性变化..
      )以及其他关键蛋白质涉及肌肉收缩(
      • Bastide B.
      • CONTI A.
      • Sorrentino V.
      • Mounier Y.
      大鼠肌肉中ryanodine受体的性质,提交给后肢悬浮液。
      ,
      • 史蒂文斯L.
      • Bastide B.
      • kischel p.
      • Pette D.
      • Mounier Y.
      肌钙蛋白亚单位表达在卸载大鼠肌肌中表达的时间依赖性变化。
      )。这些过渡与甘油氧化有氧氧化与糖酵解代谢变化有关(
      • Pette D.
      • Staron R.S.
      哺乳动物骨骼肌纤维的细胞和分子多样性。
      )涉及葡萄糖代谢和磷酸化/去磷酸化事件的两种变化(
      • Bozzo C.
      • 史蒂文斯L.
      • TONIOLO L.
      • Mounier Y.
      • Reggiani C.
      增加肌球蛋白轻链的磷酸化与大鼠唯一的慢速过渡相关。
      ,
      • fitts r.r.
      • Riley D.R.
      • widrick j.j.
      微匍匐环境的生理学邀请审查:微匍匐和骨骼肌..
      )。此外,胡锦涛施用14天的缓慢痉挛性肠道引起萎缩和皮肤纤维钙敏感性降低(
      • 史蒂文斯L.
      • Mounier Y.
      • 圣X.
      • Falempin M.
      15天后,Hindlimb悬浮后大鼠肌肉的收缩性质..
      )。如前所述,已经证明UDP-GlcNAc对葡萄糖水平敏感;此外,糖原含量与糖原含量之间的相关性 O- GlcNAC水平已在骨骼肌中测量(
      • YKI-JARVINEN H.
      • Virkamaki A.
      • Daniels M.C.
      • 麦克莱恩D.
      • GOTTSCHALK W.K.
      胰岛素和葡糖胺输注增加 O- 联系N - 体内骨骼肌蛋白的乙酰 - 氨基葡萄糖..
      )。
      从假设开始 O- Glcnac可能有助于使用我们鉴定的糖蛋白方法的一些肌肉蛋白质的生物学功能 O- GrcNAC改性蛋白在大鼠胃肠肌中,一种典型的快速肌肉,由快速和缓慢的骨骼纤维组成。这项研究表明 O- Glcnac蛋白在肌肉中丰富,我们还确定了总水平的变化 O- 在大鼠之后的Glcnac蛋白在胡后,肌肉萎缩模型。结果表明 O- GLCNAC可以在肌肉生理学中发挥重要的生物学功能。

      实验步骤

       生物化学 -

      从Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO)购买琼脂糖固定的 - 小麦胚芽凝集蛋白(WGA),外霉素 - 生物素过氧化物酶染色试剂盒,牛半乳糖基三烷基酶和所有化学试剂。从Promega(麦迪逊,Wi)获得测序级修饰的胰蛋白酶;固定的pH梯度(IPG)为3-10线性,UDP-[3H] Gal,防滴释放酶的混合物和增强的化学发光(ECL)Western印迹检测试剂是从Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ)获得的;拉链提示C18 从Millipore(Bedford,MA)获得移液管提示; Pngase F是从新英格兰生物Biolabs获得的(贝弗利,MA);从基因组溶液(剑桥,英国)获得Duracryl 30/08,IPG加载缓冲液和IPG再水合缓冲液; Vivaspin集中器获自vivascience(德国汉诺威);反对- O- Glcnac抗体(RL-2)是从亲和力生物学(Golden,Co)中获得的;硝酸纤维素片是从Advantec MFS(Pleasanton,CA)获得的; Maxiclean墨盒C18是从Alltech(Deerfield,IL)获得的; Microbca蛋白质测定试剂盒从Pierce(Rockford,IL)中获得;和薄层色谱(TLC)铝板是从默克(德国达姆施塔特)获得的。

       动物和肌肉准备 -

      在成年男性Wistar大鼠的骨骼肌上进行实验。实验以及动物的维护条件得到了农业部和教育部的授权(卫生和动物保护部的兽医服务,授权03805)。
      腓肠肌肌肉从雄性Wistar大鼠新鲜除去(n = 3)用腹膜内注射戊巴比妥钠(3 mg.kg)麻醉–1),迅速冷冻,并在液氮中粉碎。选择这种肌肉以其混合的纤维组成及其大尺寸。肌苷重链鉴定的具体实验是在单独的和伸长位的肌肉(EDL)肌肉中进行,主要由缓慢和快速纤维组成(
      • Pette D.
      • Staron R.S.
      哺乳动物骨骼肌纤维的细胞和分子多样性。
      )。将所有样品保持在-80℃直至分析。
      用于分析 O- Hu后GLCNAC水平,大鼠随机分为两组。一组大鼠(n = 4)使用MOTY的模型进行14天的HU(
      • 莫雷。
      • Sabelman E.E.
      • 特纳r.t.
      • Baylink D.J.
      模拟空间飞行的一些方面的一个新的大鼠模型。
      )如前所述(
      • 史蒂文斯L.
      • Mounier Y.
      • 圣X.
      • Falempin M.
      15天后,Hindlimb悬浮后大鼠肌肉的收缩性质..
      )。第二组(n = 4)由非悬浮的对照动物组成。两组动物是年龄和体重匹配的。 2周后,处死动物,如上所述制备肌肉。选择缓慢的肌肉,因为与快速EDL肌肉形成鲜明对比后,这种姿势肌肉呈现出清晰的慢速转变和萎缩。

       固定的WGA的亲和层析 -

      O - 链接 N - 乙酰 - d - 如前所述用WGA亲和色谱法纯化 - 葡萄糖胺蛋白质(
      • Lefebvre T.
      • Cieniewski C.
      • lemoine J.
      • Guarardel Y.
      • Leroy Y.
      • Zanetta J.P.
      • Michalski J.C.
      鉴定 N - 乙酰 - d-Glucosamine特异性从大鼠肝细胞溶质和核隔室作为热冲击蛋白的凝集素..
      )。首先,肌粉在结合缓冲液中均质化(20米m Tris/HCl, 200 mm KCl, 1 mm CaCl2, 1 mm MgCl2通过超声波(细胞破坏器B-30),抗滴鼻酶,pH7.8)的混合物(细胞破坏器B-30;布兰森Sonic Power Company,Branson,Mo)。然后将样品以19,000×离心 g 在4°C下1小时。骨骼肌蛋白首先是 N - 用肽 - 糖基化 - N - 糖苷酶F(制造商的规格),然后在4℃下通过WGA-琼脂糖柱(4×1cm)。用150ml结合缓冲液洗涤柱,用50mL 0.2进行洗脱 m Glcnac在同一缓冲区中。然后在4℃下在Vivaspin浓缩器(3-KDA排除尺寸过滤器)上离心脱盐并浓缩洗脱的馏分并浓缩。在二维电泳分析之前,将浓缩的样品冻干。

       单模免疫印迹分析 -

      如已经描述的,使用7.5%SDS-PAGE进行肌蛋白同种型分离(
      • Wada M.
      • 哈马兰菜N.
      • Pette D.
      来自兔骨骼肌的单型IIB,IID和IIA纤维的异常素图案..
      )。肌苷重链同种型是根据以前的报告(
      • 史蒂文斯L.
      • 苏丹K.R.
      • Peuker H.
      • Gohlsch B.
      • Mounier Y.
      • Pette D.
      肌蛋白重链mRNA和蛋白质同种型在大鼠卸载肌肌中的时间依赖性变化..
      )。
      通过SDS-PAGE使用10-20%梯度线性凝胶获得WGA固定化纯化蛋白的单免硫化。然后使用50μg蛋白质(Microbca蛋白质测定)进行这些分析。电转换器在0.45μm硝酸纤维素片上进行。 O- 使用单克隆小鼠抗 - 揭示GlcNAC蛋白 O- Glcnac抗体(RL-2)或用辣根过氧化物酶标记的WGA(HRP-WGA)。
      用于使用反的启示 O- Glcnac抗体,膜在Tris缓冲盐水中5%非脱脂干乳溶液饱和(TBS:15米m Tris, 140 mm NaCl,0.05%Tween-20,pH 8.0);将抗体(稀释1:1000在5%乳TBS中)在4℃下孵育过夜。 5×10分钟后,抗 - O- 使用外向生物素 - 生物素过氧化物酶染色试剂盒检测GlcNAc抗体。
      对于使用HRP-WGA的启示,通过在80℃下在甲酸pH 2.0的溶液中温育30分钟,直接将WGA固定化纯化的糖蛋白直接脱粘。然后,在用TBS的4×10分钟洗涤后,在3%牛血清白蛋白-TBS的溶液中饱和膜。在4×10分钟洗涤后,将膜与HRP-WGA(稀释1:10,000在TBS中)温育1小时。膜最终在TBS中洗涤5×10分钟。在这两种情况下,使用ECL Western印迹检测试剂和Hyperfilms BioMax MR进行检测,以确保最佳蛋白质检测。

       二维(2D)电泳 -

      肽质量映射鉴定,骨骼肌 O- GlcNAC蛋白首先在2D-PAGE上分离。将WGA固定化的纯化蛋白重悬于200μL负载缓冲液和200μl补液缓冲液(Amersham Pharmacia Biotech),均质化,并在室温下摇动1小时。将样品装入第一尺寸条(18厘米,PI 3-10)上,并在一夜之间发生再水化。在24小时期间,凝胶在100,000 v / h中运行。运行后,在缓冲器I的20分钟平衡后,将第一尺寸凝胶装载在10%丙烯酰胺凝胶上(1.5 m TRIS / HCL,6 m 尿素,2%SDS,30%甘油,0.01%溴苯酚蓝,35米m Dithiothreitol(DTT),pH 8.8),然后在缓冲液II中进行20分钟的平衡(1.5 m TRIS / HCL,6 m 尿素,2%SDS,30%甘油,0.01%溴苯酚蓝,87米m 碘乙酰胺(IAA),pH 8.8)。在SDS电泳之后,凝胶是银染色。

       “凝胶”消化蛋白质 -

      切除斑点,通过减少30米的溶液来脱离凝胶碎片m 铁氰化钾/ 100米m 硫代硫酸钠,然后用水洗涤片。蛋白质在56℃下减少30分钟,10米m DTT在0.1 m NH4HCO 3 然后用55米烷基化m IAA在0.1 m NH4HCO 3 在黑暗中在室温下30分钟。用0.1洗涤凝胶片 m NH4HCO 3 15分钟,然后脱水并被CH缩小3CN在真空离心机中。
      对于用胰蛋白酶的“凝胶”消化,在含0.1的消化缓冲液中再水化凝胶片 m NH4HCO 3, 5 mm CaCl2,和5ng /μl胰蛋白酶在4℃下30-45分钟。除去过量的上清液,凝胶片覆盖10-20μl的0.1 m NH4HCO 3 缓冲。消化在37℃下进行过夜。

       质谱-

      在“凝胶中”胰蛋白酶消化后,从凝胶颗粒中提取胰蛋白酶肽。添加50μl25米后m NH4HCO 3, 凝胶片摇动15分钟。收集上清液。用30μl乙腈(ACN / HCOOH /水(45/10/45,V / v / v))进行两次连续提取,摇动20分钟。用第一个等分的NH合并上清液4HCO 3。用ACN / HCOOH(95/5,v / v)进行最后一次提取20分钟,摇动。将萃取物合并在一起并在真空离心机中干燥。使用拉链尖端脱盐样品C18 移液器尖端;拉链尖塔上的肽的结合和洗涤在水中的0.1%三氟乙酸(TFA)中实现。用5μl0.1%TFA在ACN /水(60/40,v / v)中进行洗脱。将样品在真空离心机中干燥并重新悬浮在水中的0.1%TFA。
      使用肽质量指纹进行蛋白质鉴定在基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(Voyager de-str Pro)上进行。将一个微升的脱盐和浓缩样品直接发现在靶板上,用1μl新鲜制备的2,5-二羟基苯甲酸基质(10mg / ml溶解在CH中3哦/ h.2O(70/30,v / v))。肽质量指纹光谱在反射阳性离子模式下登记。平均而言,每光谱累积150-200个激光镜头。使用胰蛋白酶自蛋白酶分别在842.5100,1045.5642和2211.1046Da中,使用胰蛋白酶自蛋白酶的单位素质量块内校准每个光谱。使用来自NCBI和Swiss-Prot数据库的蛋白质探测器程序(Prospector.ucsf.edu)的MS配合模块,用50ppm的误差容差鉴定蛋白质。

       总O-GLCNAC水平测定 -

      水平 O- 通过放射性标记在100μg蛋白质(Microbca蛋白质测定)上以100μg蛋白质(Microbca蛋白质测定)测量GlcNAc。在50μl溶解的样品中,在10μl10×标记缓冲液中稀释50μlAcogalactosylated半乳糖基转移酶(100米 m HEPES-NaOH, 100 mm galactose, 50 mm MnCl2加入pH7.3)。用水将体积调节至90μl。通过加入10μl25μm来引发反应m 5'-amp含有3μCI的UDP- [3H] GAL将最终集中度带到2.5米m 5'-AMP。在40μ的存在下,将样品在37℃下孵育2小时m O- (2-乙酰氨基-2-脱氧 - d-Glucopyranylidene)氨基 - N - 苯基氨基甲酸酯。通过加入11μl10×终止溶液(0.1)停止反应(0.1 m EDTA,10%(W / V)SDS),并将样品煮沸3分钟。通过将样品通过其乙酸盐形式通过一定的Dowex 1×2柱通过样品消除放射性前体。用水洗涤柱子,在Beckman LS6000TA设备(Beckman Coulter,CA)上加入Aquasafe后,计算非训练分数。水平 O- glcnac标有[3H]使用UDP的特定放射性测定GA1 [3h] gal和计数效率。该实验是三种测定的特征。

       还原β-消除 -

      将100微克纯化的糖蛋白用于该实验。使用还原β-消除的经典条件(最终浓度为0.1 m naoh和1 m BH4na)。将反应在45℃下进行18小时。通过在其h中通过dowex 50×8列而停止+ 在冰上形成,然后通过过滤在玻璃纤维上除去树脂。然后在C上脱盐含有β-消除产物的溶液18 柱在水中的0.1%TFA平衡,并在ACN /水中用0.1%TFA进行洗脱(60/40,v / v)。将洗脱的样品在真空离心机中干燥,重悬于10μl水中,并通过TLC分析。在溶剂Buoh / Ch中获得TLC的迁移3COOH / H.2o(40/20/30,v / v / v)。用硫酸orcinol开发了启示。

       统计分析-

      将值呈现为平均值±SE和观察次数。使用学生进行统计分析 t 试验,所设定的可接受的意义水平 p < 0.05.

      结果

       在WGA固定的亲和柱上纯化的许多骨骼肌蛋白质是O-Glcnac-

      O- 使用通过WGA固定的柱的粉碎样品,使用WGA固定柱的粉碎样品制备来自骨骼肌的GlcNAC改性蛋白。保留 O- glcnac蛋白。 WGA是一种植物凝集素,对两者都有双重特异性 O- Glcnac终端残留物和唾液酸。测试特殊性 O- 进行GlcNAC蛋白质纯化,使用蛋白质印迹技术进行单尺寸凝胶电泳。
      如图所示 图。1A,许多蛋白质富集在WGA固定的柱上,特别是分子量高于45kDa的蛋白质。然后用HRP-WGA显示这些纯化的蛋白质(图。1B) 之后 (图1C.)纯化的糖蛋白的化学脱盐:图案在没有去脱胶或脱裂化之后相似,表明WGA仅识别我们样品中的蛋白质轴承末端GLCNAC残基,而不是唾液酸。没有检测到信号(图。1D)当WGA在0.2存在下孵育时 m GLCNAC,表明WGA信号是特定的 O- Glcnac残留物。用抗 - 抗议者获得了类似的结果 O- Glcnac抗体。如观察到 图1E.,反 O- 在WGA固定的亲和柱上纯化的GlcNAc抗体识别蛋白质,在银染色后揭示(图。1A),证实这些蛋白质是 O- glcnac修饰。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1在WGA固定的亲和柱上纯化的糖蛋白的单模凝胶电泳。 纯化的蛋白质在丙烯酰胺(10-20%)的线性梯度上运行(10-20%):A)或使用HRP-WGA的免疫印迹分析而无需化学脱胶(B),化学脱胶后HRP-WGA(C),HRP-WGA存在于0.2 m of free GlcNAc (D)或抗议 O- glcnac抗体(E )。
      Fig. 2 表明,在WGA固定柱上纯化的还原β-消除糖蛋白纯化后,只有 N - 乙酰葡糖胺醇作为产品(与a的共同迁移 N - 乙酰葡糖胺醇标准),仅展示这一点 O- glcnac蛋白不再 O- 糖类存在于样品中。这些对照实验表明,在WGA固定柱上纯化的蛋白质是 O- glcnac蛋白和不是唾液酸化糖蛋白。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2肌肉糖蛋白的减少β消除产物的TLC初步 N-deglycosylated。 纯化在WGA固定柱上纯化的一百微克腓肠肌蛋白质酶促改性[3h] gal在他们的 O- 使用牛半乳糖基转移酶的Glcnac残基。在标记后,进行还原β消除以释放 O- 联系sugars. The labeled sugars were analyzed on TLC.

       WGA纯化蛋白的2D凝胶电泳 -

      为了识别 O- 在WGA固定的亲和柱上纯化骨骼肌蛋白的GlcNAC改性,我们使用2D凝胶电泳分离蛋白质。
      总胃肠肌蛋白的2D电泳比较(图3A)在WGA固定的亲和柱上纯化后,肌肉蛋白的2D电泳(图3B.)表明了这一点 O- GLCNAC后翻译后修饰存在于众多蛋白质上,大量蛋白质存在 O- GlcNAc蛋白通常在骨骼肌中弱表达。凝胶的比较分析 图3,B (银染色 O- glcnac蛋白在WGA柱上纯化)和 C (西方印迹 O- 在WGA柱上纯化的GlcNAc蛋白,用2D凝胶电泳分离并在化学脱胶后用HRP-WGA染色)证实纯化在WGA固定化的亲和柱上的蛋白质仅是完全的 O- glcnac蛋白。我们必须注意到一些斑点,对应 O- 弱表达或具有少量的Glcnac蛋白 O- GLCNAC网站,透露 图3B. 没有被检测到 图3C.据推测,因为敏感性 O- GlcNAC蛋白质检测使用凝集素(IE。 WGA).
      图缩略图GR3.
      Fig. 32D-PAGE MACTROCNEMIUS肌肉的地图使用第一维的IPG 3-10和第二维的SDS-PAGE(10%)。 2D电泳是对300μg的胃肠肿瘤总蛋白作为对照进行(AWGA亲和柱上的银染色)或1mg富含蛋白质(B,银染色; C,Western印迹通过HRP-WGA揭示了糖蛋白的化学脱裂化后的HRP-WGA)。 MALDI-TOF质谱法蛋白质组学分析后鉴定的蛋白质由数字表示(1–14,见文字)。

       蛋白质组学分析 -

      切除最佳斑点并提交给蛋白质组学分析。 表I. 提供14个斑点的蛋白质鉴定(盘旋 图3B.)通过MALDI-TOF质谱。这些蛋白质可以分为三类:第一个对应于涉及信号转导的蛋白质,并且在细胞质和细胞核和结构蛋白之间的易位中,例如αb晶体(spot 1图3B.),磷酸膦酸3-激酶调节亚基(spot 2),蛋白质磷酸酶2a(spot 3),丝裂剂活化蛋白激酶激酶激酶激酶激酶8(spot 4),酵母核蛋白定位的同源物4(spot 5)和丝氨酸蛋白酶抑制剂III(spot 6)。七种蛋白质构成第二类,对应于含有糖酵解途径和能量代谢的酶,例如肌肉特异性β-烯醇酶(spot 7),肌肉特异性果糖二磷脂酶醛糖酶(spot 8),肌酸激酶m(spot 9),三糖磷酸异构酶(现货10),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(现货11.),线粒体苹果酸脱氢酶(现货12.)和碳酸酐酶III(点13​​.)。第三类对应于参与收缩机制的蛋白质,特别是其中一个被鉴定为肌蛋白重链(现场14. )。
      T有能力的 I在骨骼肌中鉴定的O-GlcNAc蛋白,在WGA柱上纯化后,在2D电泳和MALDI-TOF质谱分析上分离
      名称Mr (Da) PI. 得分(NCBI)得分(瑞士人)匹配肽数量覆盖序列的百分比
      蛋白质涉及信号转导,核转运和结构蛋白
      αb结晶19 9586.81.66E + 53.23E + 51466
      磷酸阳岩 - 3-激酶调节亚基,P85855325.91.24E + 4.9.16E + 3.813
      蛋白质磷酸酶2a.455555.42.01E + 4.2.70E + 4.1643
      地图激酶激酶激酶8528085.71.09e + 51.05E + 5916
      酵母核蛋白定位的同源物468 0576.01.18E + 51015
      丝氨酸蛋白酶抑制剂III455555.32.54E + 6.8.83E + 6.1643
      糖酵解途径和能量新陈代谢的蛋白质
      肌肉特异性β-烯醇酶46 9617.69.61E + 35.09e + 3.1524
      3.00E + 8.1.41E + 8.2448
      果糖二磷酸酶醛糖酶,肌肉特异性39 3528.32.55E + 103.01e + 9.1965
      2.74E + 104.07e + 91350
      肌酸激酶,m形式43 0196.63.05e + 9.1.258E + 9.2660
      1.42E + 95.55E + 83070
      9.98E + 57.22E + 51853
      三糖磷酸异构酶26 9216.46.35E + 3.2.23E + 41242
      甘油醛-3-磷酸脱氢酶35 8368.42.78E + 12.5.39E + 112147
      苹果酸脱氢酶线粒体35 6568.96.23E + 51.962E + 51122
      碳酸酐酶III29 4016.91.14E + 6.2.99E + 6.1353
      收缩蛋白
      肌球蛋白重链103 5835.32.72E + 4.1414
      某些 O- 在Gastrocnemius中鉴定的GlcNAC蛋白显示不同的同种型,根据其Pi的差异分开,并且可能代表不同的相同磷酸化形式 O- glcnac蛋白;其中一些由MALDI-TOF质谱法鉴定(表I.)。 β-烯醇酶,肌酸激酶M或果糖 - 双磷脂酶醛糖酶(斑点7., 8, 和 9图3B. )。
      所有其他切除的斑点对应于由于它们非常低的表达水平和非常低的概率分数而不成功地识别的蛋白质。应该提到的是,在凝胶上观察到的两个大带的分析(箭头图3B.)尚未成功地归因于已知的蛋白质。我们认为这些带对应于由2D凝胶电泳未解决的蛋白质混合物。
      O- 使用抗免疫斑分析,确认了考虑其在肌肉收缩中的关键作用特别有趣的肌球蛋白,这是特别有趣的。 O- Glcnac抗体。所有肌球蛋白同种型都毫不含糊地确定为 O- Glcnac蛋白,如图所示 Fig. 4, lane 2。没有检测到信号 Fig. 4, lane 3,当反 O- 将GlcNAc抗体在0.2的存在下培养 m GLCNAC,表明在Western印迹上观察到的信号是特异性的 O- GLCNAC部分而不是不代度的信号。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4分析对 O-GLCNAC改性肌球蛋白(7.5%SDS-PAGE)。 不同的肌球蛋白重链同种型( MHC )在银染色后被检测到(lane 1)或使用抗议 O- glcnac抗体(lane 2)。在0.2的存在下控制抗体的特异性 m GlcNAc (lane 3 )。

       总O-GLCNAC水平测定 -

      我们测量了总水平 O- Glcnac在缓慢的卵酸和快速EDL骨骼肌,以及在萎缩的单胞肌中。 Fig. 5 显示相对 O- 在慢速骨骼肌的肌肉蛋白质上的Glcnac水平。有2.83±0.03×10−3 PMOL. O- GLCNAC在控制缓慢骨骼肌肌肉中100μg蛋白质,对比2.39±0.08×10−3 PMOL. O- GLCNAC在控制快速骨骼肌EDL中100μg蛋白质。在Hu的14天后,如前所述的慢性抗原肌中萎缩的壮观发展(参考文献。
      • 史蒂文斯L.
      • Mounier Y.
      • 圣X.
      • Falempin M.
      15天后,Hindlimb悬浮后大鼠肌肉的收缩性质..
      ,未显示)。单独的肌肉重量从0.387±0.013 mg / g(mg肌肉/ k动物;平均值±s.e; n = 4)在HU后的控制条件下至0.156±0.009 mg / g(p <0.05);这种萎缩与下降有关 O- GLCNAC水平,这与EDL快速肌肉中发现的相似(2.35±0.01×10−3 PMOL, p < 0.05).
      图缩略图GR5.
      Fig. 5总共测量 O慢骨骼肌肌肉细胞和快速骨骼肌EDL的-GLCNAC水平。 全部的 O- 通过放射性标记获得GlcNAC水平测定 O- 由牛半乳糖基转移酶的Glcnac Meieties(参见“实验程序”)。测定(n = 3)在缓慢骨骼肌肌肉中进行,在快速骨骼肌EDL中,并在胡后缓慢肌肉。水平 O- Glcnac于10中表达−3 PMOL. O- GLCNAC为100μg蛋白质。值是平均值±S.E.星号表示与对照的显着差异。

      讨论

      本文报告了14的鉴定 O- 通过蛋白质组学方法Glcnac细胞溶质肌肉蛋白。这是关于可能含义的第一个报告 O- glcnac在肌肉生理学中。很多的 O- 通过在WGA固定的亲和柱上纯化后的2D电泳上通过银色染色GlcNAC改性蛋白质染色,表明该骨骼肌后翻译后修饰的丰富蛋白质。然而,由于其低表达水平,没有鉴定这些蛋白质中的大部分。
      此外,根据其Pi分离对应于相同蛋白质不同同种型的一些蛋白质。不同的pi可以参考不同的磷酸化形式。这种观察结果表明一些蛋白质可能同时 O- GLCNAC和 O- 磷酸盐在相同或在邻居网站上。这是M-肌酸激酶和果糖双磷酸酶醛糖酶的情况。对于β-烯醇酶,已经在2D凝胶上鉴定出两种不同的同种型。这两种同种型不对应于不同的磷酸化形式,但是由于存在或不存在C末端赖氨酸(
      • Merkulova T.
      • 卢卡斯M.
      • Jabet C.
      • LamandéN.
      • Rouzeau J.D.
      • Gros F.
      • 拉扎尔M.
      • 凯勒阿。
      小鼠肌肉特异性烯醇酶的生化表征:电泳变体的发育变化和其他蛋白质的选择性结合。
      );尽管如此,这两种同种型都是 O- 联系N - 乙酰甘氨酸氨基苯胺化。
      将所鉴定的蛋白质分别分别分别分别分别分别分别为1)蛋白,其蛋白质涉及在糖浆途径和能量代谢的细胞质和核或结构蛋白,2)酶之间的易位中的信号转导,以及3)收缩蛋白。
      确定 O- 文献中描述的GlcNAc蛋白质与许多功能相关,包括细胞调节,转录机械,蛋白质 - 蛋白质相互作用,细胞骨架蛋白,蛋白质进行蛋白质降解,磷酸酶或激酶(
      • 井L.
      • whalen s.a.
      • 哈特G.W.
      O- GLCNAC:监管后翻译后修改..
      ,
      • Zachara N.E.
      • 哈特G.W.
      出现的重要意义 O- glcnac在细胞调节中..
      )。一些已鉴定的骨骼肌蛋白质落入这些不同的类:酵母核蛋白质定位的同源物对应于核易位的蛋白质,而其他蛋白质涉及酶促系统或细胞内调节途径(蛋白质磷酸酶2a,丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶激酶8,磷酸阳性-3-激酶)或结构蛋白(αB-结晶)。
      一个有趣的观察是,鉴定的蛋白质的主要类蛋白质促进糖尿病途径的酶。由于职位先进 O- Glcnac在控制酶活性中,我们可以假设这一点 O- GlcNAc残基可以调节糖蛋白途径的酶活性,因此可能参与骨骼肌中葡萄糖代谢的调节。值得注意的是,供体糖UDP-GLCNAc的浓度已被证明对葡萄糖水平高度敏感(
      • 汉诺威J.A.
      • 赖Z.
      • Lee G.
      • 鲁布斯W.A.
      • 佐藤三。
      升高 O- 联系N - 胰腺β细胞中的乙酰氨基葡萄糖代谢..
      ,
      • 井L.
      • Vosseller K.
      • 哈特G.W.
      一个角色 N - 乙酰甘氨酸作为营养传感器和胰岛素抵抗的介体。
      )。此外,水平之间的相关性 O- GlcNAC和糖原含量已在骨骼肌中测量(
      • YKI-JARVINEN H.
      • Virkamaki A.
      • Daniels M.C.
      • 麦克莱恩D.
      • GOTTSCHALK W.K.
      胰岛素和葡糖胺输注增加 O- 联系N - 体内骨骼肌蛋白的乙酰 - 氨基葡萄糖..
      )。
      一个角色 O- GlcNAc在蛋白质 - 蛋白质相互作用过程中(
      • Zachara N.E.
      • 哈特G.W.
      出现的重要意义 O- glcnac在细胞调节中..
      )也应该考虑。有证据表明β-烯醇酶和肌酸激酶M,肌肉代谢的两个关键酶之间存在相互作用,在骨骼肌细胞的细胞溶胶中(
      • Foucault G.
      • 空气M.
      • 克里布尔斯。
      • Arrio-Dupont M.
      骨骼肌细胞细胞溶质β-烯醇酶和肌酸激酶之间的相互作用..
      )。已知β-烯醇酶与许多其他蛋白质相互作用:实际上,β-烯醇酶和蛋白酶和唑烷酶或丙酮酸激酶之间的关联具有高亲和力,β-烯醇酶也结合SARCOMERIC蛋白肌钙蛋白(
      • Merkulova T.
      • 卢卡斯M.
      • Jabet C.
      • LamandéN.
      • Rouzeau J.D.
      • Gros F.
      • 拉扎尔M.
      • 凯勒阿。
      小鼠肌肉特异性烯醇酶的生化表征:电泳变体的发育变化和其他蛋白质的选择性结合。
      )。这些可以通过磷酸化和/或可以调节糖酵解酶复合物与收缩装置之间的这些特异性相互作用 O- GLCNAC可以在其利用现场形成ATP。类似地,肌原纤维在肌原纤维中描述了肌肉肌酸激酶,催化磷酸盐部分的可逆转移,作为M带的结构蛋白(
      • 瓦里曼T.
      • 特纳米。
      • eppenberg h.m.
      肌原纤维中肌酸激酶同工酶的定位。 I.鸡骨骼肌..
      )以及与肌动蛋白和脱霉素中间细丝相互作用的αB结晶素以增加Z频带的稳定性(
      • atomi Y.
      • 山田S.
      • Strohman R.
      • nonomura y.
      骨骼肌中的αB-晶体:纯化和定位..
      )。
      O- GLCNAC也与防止退化保护(
      • 韩I.
      • Kudlow J.E.
      减少 OSP1的糖基化与增加的蛋白酶体易感性有关。
      )。的确,这是 O- GLCNAC位点在恒河猴猴透镜αb-crystallin,thr170,在大鼠镜片和大鼠心脏αb-结晶以及人,牛,小鼠和仓鼠αb-结晶中保存,可以防止蛋白质降解中的αb-晶体(
      • 罗基摩尔e.p.
      • Chevrier M.R.
      • Cotter R.J.
      • 哈特G.W.
      动态的 O- 小型热休克蛋白的Glcnacylation A B-晶体..
      )。在缓慢的肌肌中,消毒萎缩与αb-晶体表达的显着降低有关(
      • atomi Y.
      • 山田S.
      • 洪你
      骨骼肌中B结晶素的动态表达。未加速,被动伸展和剥夺的影响..
      )。有可能降低 O- 该蛋白质中的GlcNAC水平诱导其降解,导致肌原纤维蛋白的崩解。
      主要观察涉及鉴定重的肌球蛋白 O- glcnac修饰。肌球蛋白是一种关键的收缩蛋白,其构成哺乳动物肌纤维中厚丝的主要成分,涉及骨骼肌中力发育所需的肌动素跨桥。已经确定了由不同基因编码的肌蛋白重链的不同同种型(
      • 肖弗诺州S.
      • Reggiani C.
      Myofibrillar蛋白的分子多样性:基因调控和功能意义..
      )。除了基于不同基因表达的肌菌素重链表达的多样性之外,已经描述了不同类型的多样性,称为表位多样性(
      • 英语A.W.
      • 纪念J.
      • Pol M.
      • Schwartz G.
      • 雪莉A.
      兔肌肌慢性/βmyosin重链纤维的不同表型:成人肌肉中的一种新型多样性。
      ):有人建议,该表位多样性可能是肌球蛋白重链后翻译后修饰的结果。还有人们证明,兔肌的肌蛋白重链可以通过其氨基 - 末端头部的酪蛋白激酶II磷酸化(
      • Murakami N.
      • kumon a。
      • Matsumura S.
      • 哈拉斯
      • Ikenaka T.
      酪蛋白激酶II的骨骼肌肌球蛋白重链的磷酸化:磷酸化位点对氨基末端的定位。
      )。此外,慢性肌球蛋白重链的磷酸化被报告为涉及表位多样性的潜在翻译后修饰(
      • Pol-Rodriguez M.M.
      • Schwartz G.A.
      • 英语A.W.
      慢/βmyosin重链同种型在成人兔肌肉肌肉中的翻译后磷酸化。
      )。这些作者提出了一些磷酸化的位点可能已经被占用 O- 联系N - 乙酰甘氨酸胺基化。我们的结果明确争辩有利于这一假设。因为表位在轻的Meromyosin中局部化,并且可以在厚的长丝组件中牵连,我们可能会建议 O- GLCNAC,在很大程度上,阴阳工艺可能存在,并且可以参与调节厚丝组件中霉菌素的聚合。然而 O- 必须暂停GLCNAC位点,并且必须怀疑这种翻译后修饰在调节肌动素复合物的调节和肌肉收缩调节中的作用。
      值得注意的是,在已识别的蛋白质中,其中六个是患有肌肉可塑性和适应新的生理条件的蛋白质中。因此,据报道,肌菌素重链,肌肉肌酸激酶,αB-结晶以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶是肌肉剥离的四个前面标记(
      • CROS N.
      • Muller J.
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