关于人角膜成纤维细胞的蛋白质组学分析,参照眼透明度*

  • 亨利克·凯林
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    奥胡斯大学医院眼科医院,NørRebrogade44,8000 Aarhus C,丹麦

    奥胡斯大学科学园区分子生物学系,Gustav Wieds Vej 10C,8000 Aarhus C,丹麦
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  • IDA B.Thøgersen.
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    奥胡斯大学科学园区分子生物学系,Gustav Wieds Vej 10C,8000 Aarhus C,丹麦
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  • Gordon K. Klintworth.
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    病理学和眼科,杜克大学医学中心,达尔姆,NC 27710
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  • Jan J. Enghild.
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    奥胡斯大学科学园区分子生物学系,Gustav Wieds Vej 10C,8000 Aarhus C,丹麦
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  • TorbenMøller-Pedersen
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    应解决谁的通信:奥胡斯大学医院,Nørrebrogade44,8000Aarhus C,丹麦。电话:45-89493227;传真:45-86121653
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    奥胡斯大学医院眼科医院,NørRebrogade44,8000 Aarhus C,丹麦
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生研究院(RO1-EY12712),丹麦医学研究委员会,丹麦预防眼病和失明,Novo Nordic Foundation,Ingeniør8月Frederik的丹麦医学研究委员会Erichsens Legat,Ingrid Mukhholms Legat,Fongen Tillgegidenskabens Fremme,Alice OgJørgenA.Rasmussens纪念格兰特,JørgenBagenkopNielsens Meropia Foundation,Aarhus大学研究基金会,丹麦眼科研究基金会,丹麦医学协会研究基础,Svend HA Schrøders基金会,Toyota Foundation,Jacob Madsens Foundation,Lars Andersens Foundation,Torben和Alice Frimodts Foundation,Fabrikant Einar Willumsensensensensensensensensensensensensensengat,奥古斯丁基氏岛和奥古斯丁基金会,哈德尼尔森基金会和Apotekerfonden AFF 1991.该本文的出版成本部分地支付页面费用部分支付。因此,本文必须根据18 U.S.c,标明“广告”。第1734节仅表明这一事实。
      透明的角膜基质含有环形成纤维细胞的群体,其被称为角蛋白酶,其散布在胶原蛋白薄片之间。在正常条件下,角蛋白细胞是静态和透明的。然而,在角膜损伤之后,角膜织物被激活并转化为反向散射伤口愈合成纤维细胞,导致角膜渗透率。目前,最受欢迎的假设表明,特定的含有酶结晶蛋白的水溶性蛋白质涉及维持角膜细胞透明度。具体而言,角膜雾度发展被认为与反射角膜成纤维细胞中的低水平细胞质酶结晶蛋白相关。为了进一步调查这一假设,我们使用了蛋白质组学方法来鉴定代表一个血清培养的人角膜成纤维细胞中最丰富的水溶性蛋白质体外反射伤口愈合角蛋白酶型的模型。一维凝胶的密度测定表明,没有单一蛋白质同种型超过总水溶性蛋白质级分的5%,这是根据当前定义的角膜酶结晶素的资格特性。该结果表明伤口愈合的角膜成纤维细胞不含酶结晶素。总共254个来自二维凝胶的蛋白质鉴定,代表118个不同的蛋白质。保护抗氧化胁迫和蛋白质错误折叠的蛋白质突出,表明这些方法可以参与来自角膜成纤维细胞的细胞质光散射的产生。
      角膜是身体唯一的透明结缔组织,负责眼睛中可见光总屈光力的~70%。角膜基质(厚度〜450μm)主要由由I型,III和V胶原蛋白组成的均匀原纤维形成的胶原膜(
      • 马歇尔G.E.
      • konstas a.g.
      • Lee W.R.
      老年人角膜细胞外基质组分的免疫功能性定位。 II。胶原蛋白类型v和vi ..
      ,
      • Birk D.E.
      • 惠誉。
      • 狒狒J.P.
      • DOANE K.J.
      • linsenmayer t.f.
      胶原蛋白原纤维生成在体外:I型和V胶原蛋白的相互作用调节原纤维直径。
      )。均匀直径(〜30nm)和胶原型原纤维的常规间隔(中心之间的〜60nm)导致光的破坏性干扰除了前向方向,因此角膜细胞外基质的光学透明度(
      • 莫里斯D.
      角膜的结构和透明度..
      ,
      • Komai Y.
      • Ushiki T.
      人体角膜和巩膜中胶原蛋白原纤维的三维组织。
      )。基质还含有多层静态角膜成纤维细胞,称为角蛋白酶,其在胶原薄层之间散布。在正常条件下,静态角蛋白酶是透明的,但在研究时除了核 体内 使用扫描折叠镜面显微镜(
      • 加拉尔B.
      • 莫里斯D.
      角膜基质中光散射的条纹..
      ),狭缝灯生物测定或 体内 共聚焦显微镜(
      • Møller-Pedersen T.
      角膜织物反射率和角膜阴霾..
      )。这种隐形隐形表明角膜织卵细胞质和细胞过程的折射率类似于角膜基质细胞外基质的折射率(
      • Møller-Pedersen T.
      角膜织物反射率和角膜阴霾..
      )。
      角蛋白细胞具有增殖和转化的动态潜力。因此,在诸如准分子激光角膜切除术治疗近视的角膜损伤后,角蛋白细胞转化为纺锤形成纤维细胞(
      • Møller-Pedersen T.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • 詹斯特J.V.
      PRK后角膜雾霾开发由基质组织的体积进行调节。
      ,
      • Møller-Pedersen T.
      • 李H.F.
      • Petrolloww.
      • Cavanagh H.D.
      • 詹斯特J.V.
      折射术后伤口修复的共聚焦微观表征..
      )。角膜成纤维细胞通过迁移和增殖和沉积无序和非透明矩阵组分来重新损坏受损区域(
      • CINTRON C.
      • 施耐德H.
      • kublin c.
      角膜疤痕形成..
      ,
      • CINTRON C.
      • kublin c.l.
      角膜组织再生..
      ,
      • 罗斯r.
      • 埃弗雷特N.B.
      • Tyler R.
      伤口愈合和胶原蛋白形成..
      )。然后通过连续降解和合成细胞外基质来改造受损的基质来重建高度有序的胶原结构(
      • 罗斯r.
      • 埃弗雷特N.B.
      • Tyler R.
      伤口愈合和胶原蛋白形成..
      ,
      • Cionni R.J.
      • Katakami C.
      • Lavrich J.B.
      • 高W.W.
      兔角膜撕裂后胶原蛋白代谢..
      )。在伤口愈合过程的最新阶段,角膜成纤维细胞经历了表型变化到肌纤维细胞中,这是伤口收缩的原因(
      • 詹斯特J.V.
      • 罗德里格斯米。
      • 赫尔曼伊。
      缺血角膜伤愈合成纤维细胞的表征。新的洞察力进入myofibroblast ..
      ,
      • 詹斯特J.V.
      • Petrolloww.
      • 巴里p.a.
      • Cavanagh H.D.
      角膜基质伤口愈合期间α-平滑肌(α-SM)肌动蛋白的表达。
      ,
      • 韦尔奇M.P.
      • 奥德兰G.F.
      • 克拉克r.a.
      F-actin束形成,胶原蛋白和纤连蛋白基质组装的时间关系,以及纤连蛋白受体表达伤口收缩。
      )。由于角膜细胞与角膜织物的细胞体的浅散射增加,伤口愈合过程降低了角膜的光学透明度
      • Møller-Pedersen T.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • 詹斯特J.V.
      PRK后角膜雾霾开发由基质组织的体积进行调节。
      ,
      • Møller-Pedersen T.
      • 李H.F.
      • Petrolloww.
      • Cavanagh H.D.
      • 詹斯特J.V.
      折射术后伤口修复的共聚焦微观表征..
      ,
      • Møller-Pedersen T.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • 詹斯特J.V.
      对TGFβ中和抗体调节基质纤维化,但在PRK之后的光量效应的回归不等..
      ,
      • 詹斯特J.V.
      • Møller-Pedersen T.
      • 黄杰。
      • 萨克斯下午
      • kays w.t.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • Piatigorsky J.
      角膜透明度的细胞基础:“角膜晶晶体”的证据..
      )。这些结果表明,伤口愈合期间的角膜细胞雾度的发展是部分地引起来自基质细胞的细胞质的光的反向散射的增加。
      在眼睛透镜中,已经研究了眼镜透明度和不透明度的发展。 α-和β/γ-晶体是所有脊椎动物眼晶状体的主要水溶性蛋白,对该组织的光学性质和透明性至关重要。 α-晶素是小型热休克蛋白家族的成员,并具有伴随蛋白质聚集的伴侣样活性(
      • Horwitz J.
      α-结晶素可以用作分子伴侣..
      ,
      • Horwitz J.
      alpha-crystallin ..
      )。 β/γ-晶素与微生物氧化应激蛋白有关(
      • Wistow G.
      镜片晶体蛋白:基因招聘和进化动力..
      )并致力于发育白内障(
      • 畏缩J.
      晶体:基因,蛋白质和疾病..
      )。据信α-和β/γ-晶素的高浓度和低聚复合物形成通过短程空间订单(1)通过短程空间订单给出眼睛晶状体和光学性能(
      • 延迟M.
      • Tardieu A.
      微晶蛋白的短距顺序占眼透镜透明度的账户。
      )。
      对各种脊椎动物和无脊椎动物的几项研究显示了晶状体和角膜上皮细胞中的水溶性蛋白质的特异性累积。晶状体和角膜中的丰富的分类蛋白蛋白通常与代谢酶相似或相同,因此称为酶结晶蛋白。大多数哺乳动物积累醛脱氢酶3(ALDH3)
      使用的缩写是:AA,氨基酸; ALDH,醛脱氢酶; 1D,一维; 2D,二维; dthiothreitol; ER,内质网; IL,白细胞介素;马尔迪,矩阵辅助激光解吸/电离; MS,质谱; MS / MS,串联质谱; PBS,磷酸盐缓冲盐水; ROS,反应性氧气物种; TOF,飞行时间; tkt,transpterolase; UB,泛素;紫外线,紫外线。
      1使用的缩写是:AA,氨基酸; ALDH,醛脱氢酶; 1D,一维; 2D,二维; dthiothreitol; ER,内质网; IL,白细胞介素;马尔迪,矩阵辅助激光解吸/电离; MS,质谱; MS / MS,串联质谱; PBS,磷酸盐缓冲盐水; ROS,反应性氧气物种; TOF,飞行时间; tkt,transpterolase; UB,泛素;紫外线,紫外线。
      在角膜上皮(
      • Abedinia M.
      • 画。
      • 阿尔加伊玛。
      • 福尔摩斯R.S.
      牛角膜醛脱氢酶:主要可溶性角膜蛋白,具有可能的双重保护作用..
      ,
      • verhagen c.
      • Hoekzema R.
      • verjans g.m.
      • Kijlstra A.
      鉴定牛角膜蛋白54(BCP 54)作为醛脱氢酶..
      ,
      • Cooper D.L.
      • 浸信会e.w.
      • Enghild J.J.
      • isola n.r.
      • Klintworth G.K.
      牛角膜蛋白54K(BCP54)是肿瘤相关(3类)大鼠醛脱氢酶(ratald)的同源物。
      ,
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      )。 Transketolase(TKT)是小鼠和人角膜上皮中的主要蛋白质(
      • 萨克斯下午
      • Salamon C.
      • kays w.t.
      • 郭杰。
      • yu f.x.
      • Cuthbertson R.A.
      • Piatigorsky J.
      Transketolase是小鼠角膜中的主要蛋白质..
      ),α-烯醇酶在人,小鼠和鸡肉癌症中相对丰富(
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      )。在牛角膜上皮细胞中过表达了异柠檬酸脱氢酶(
      • 太阳L​​.
      • 太阳t.t.
      • Lavker r.m.
      鉴定细胞溶质NADP+ - 依赖性异柠檬酸脱氢酶,其优选以牛角膜上皮表达。角膜上皮结晶..
      ),而肽基 - 脯氨酰 CIS.-trans 异构酶和精氨酸琥珀酸裂解酶在鸡的角膜上皮中的高浓度下发现(
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      )。谷胱甘肽 S - 与转移酶相关 S-crystallin在鱿鱼角膜中丰富(
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      ),而斑马鱼积累戈尔洛林和角膜上皮中的肌动蛋白(
      • 徐ys.
      • kantorow M.
      • 戴维斯J.
      • Piatigorsky J.
      露珠蛋白的证据是斑马鱼中的角膜结晶素..
      )。已经提出,以超过角膜细胞的总水溶性蛋白质含量的浓度的浓度存在的蛋白质应定义为酶 - 结晶(
      • Piatigorsky J.
      镜片和角膜中的基因分享:事实和含义..
      )。角膜酶 - 晶体蛋白的功能尚不清楚,但已经提出它们用于使催化以及结构作用使得在透镜中的α-和β/γ-晶体中来源于α-和β/γ-晶体,从而有助于透明度和光学性质角膜细胞。
      TKT和ALDH1是兔角酸纤维素中的丰富蛋白质(
      • 詹斯特J.V.
      • Møller-Pedersen T.
      • 黄杰。
      • 萨克斯下午
      • kays w.t.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • Piatigorsky J.
      角膜透明度的细胞基础:“角膜晶晶体”的证据..
      )。这两种蛋白质包含来自普通兔角膜的新鲜分离的角蛋白酶中的约30%的水溶性蛋白质含量,但在光散射的角膜成纤维细胞中减少至小于15%(
      • 詹斯特J.V.
      • Møller-Pedersen T.
      • 黄杰。
      • 萨克斯下午
      • kays w.t.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • Piatigorsky J.
      角膜透明度的细胞基础:“角膜晶晶体”的证据..
      )。这些结果表明了角膜基质细胞中细胞透明度与酶 - 晶体水平之间的表观相关性。但是,Aldh3a1缺乏小鼠(
      • nees d.w.
      • Wawrousek e.f.
      • Robison Jr.,W.G.
      • Piatigorsky J.
      在醛脱氢酶3a1缺陷小鼠中结构正常的玉米羚..
      )和tkt.+/- (
      • Xu Z.P.
      • Wawrousek e.f.
      • Piatigorsky J.
      Transketolase HaploUncy降低小鼠脂肪组织和女性生育。
      )小鼠没有显示角膜表型,表明角膜透明性不需要酶结晶。其他研究表明,丰富的水溶性酶 - 结晶素保护角膜免受紫外线(UV)引起的氧化损伤。因此,异柠檬酸脱氢酶可防止脂质过氧化和氧化DNA损伤(
      • 李三。
      • 酸值H.J.
      • 公园D.C.
      • 歌B.J.
      • HUH T.L.
      • 公园J.W.
      细胞溶质NADP.+ - 依赖性异柠檬酸脱氢酶状态调节细胞的氧化损伤..
      ),虽然Aldh3a1通过去除通过脂质过氧化产生的毒性醛来排毒细胞环境(
      • Pappa A.
      • 陈C.
      • Koutalos Y.
      • Townsend A.J.
      • Vasiliou V.
      Aldh3a1保护人体角膜上皮细胞免受紫外线和4-羟基-2-珠珠诱导的氧化损伤。
      ,
      • Pappa A.
      • Estey T.
      • Manzer R.
      • 棕色D.
      • Vasiliou V.
      人醛脱氢酶3A1(ALDH3A1):角膜中的生化特征和免疫组织化学定位..
      )。此外,通过直接吸收紫外线辐射,Aldh3a1可以用作角膜中的紫外线滤光器(
      • 米切尔J.
      • cenedella r.j.
      紫外线吸收术的定量。
      )。然而,尽管有些关于角膜中的水溶性蛋白质的作用的各种建议,但相信角膜透明度的维持和细胞雾度的发展是合理的,依赖于蛋白质表达谱。
      在本研究中,通过一维(1D)和二维(2D)页面分析培养的人角膜成纤维细胞的可溶性蛋白质组,并通过基质辅助激光解吸鉴定出最丰富的水溶性蛋白质中的118个。电离(MALDI)质谱(MS)或MALDI四极杆飞行时间(TOF)串联质谱(MS / MS)。所鉴定的蛋白质参与蛋白质折叠和降解,细胞增殖,分化和凋亡,代谢,细胞骨架组织和细胞运动,防止氧化应激,信号转导和分泌蛋白质的方法。基于所鉴定的蛋白质,我们提出氧化应激可能导致蛋白质展开,其可以参与来自角膜成纤维细胞的增强的反向散射。已知不可逆氧化蛋白的聚集是不透明的结晶透镜。因此,可以在伤口愈合期间的角膜细胞雾度的发展是以某种方式使晶体透镜中的氧化应激诱导的不透明度的形成。

      实验步骤

       细胞培养-

      从丹麦角膜银行,奥胡斯大学医院,艾哈斯大学医院(HBSS; HBSS; Life Technologies,Inc.)中获得了四名人体供体玉米体(66和51岁和66和73岁的女性)。纽约州大岛)。在去除去除膜 - 内皮络合物和上皮后,使用7mm的内皮侧从内皮侧冲压中央基质。将基质按钮切成1毫米3 碎片并在1ml HBS中洗涤三次,然后用于在40ml细胞培养烧瓶中的外植体(Nunc,Roskilde,丹麦)。
      在5%的CO中在37℃下培养角膜成纤维细胞2 - 在Dulbecco的改良Eagle的介质/螺母混合物F-12(HAM)中(Life Technologies,Inc.)的含有10%胎儿牛血清(Life Technologies,Inc。),100u / ml青霉素,100μg/ ml链霉菌霉素(Life Technologies,Inc。)和0.25μg/ ml静脉曲化(Amphyericin B)(Life Technologies,Inc。)。当培养物乘以汇合时,细胞被胰蛋白酶化0.25%(w / v)胰蛋白酶/ 1 mm EDTA混合物(Life Technologies,Inc。)并转移至250ml细胞培养烧瓶(第一段通过)。随后,汇合培养物在1:4中分开,并且在通过PBS Dulbecco的细胞刮板刮擦,在收获磷酸盐缓冲盐水(PBS)Dulbecco(Life Technologies,Inc.)中洗涤来自第三通物的细胞。细胞以1,000×旋转下来 g 在25℃下10分钟,在相同的缓冲液中彻底洗涤三次。洗涤和离心后,将角膜成纤维细胞重悬于0.1×PBS Dulbecco的水中,并含有2米m 1,10-菲利啉(Sigma,St.Louis,Mo),40μm trans-epoxysucinyl-l-lecylamido(4-胍) - 丁烷(E-64)(Sigma)和2米m Pefabloc sc(Fluka,Buchs,Switzerland)。通过在冰上的超声处理裂解细胞,通过以33,000×离心分离可溶性级分 g 在4°C下15分钟并储存在-80°C。

       1D和2D页面 -

      对于1D SDS-PAGE,将角膜成纤维细胞的可溶性部分与含有1米的SDS样品缓冲液混合m 二硫醇(DTT)和使用甲基2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇/ HCL系统在5-15%梯度凝胶中运行(
      • 埋葬A.F.
      蛋白质和肽混合物的分析。三种十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲系统的评价。
      )。凝胶是Coomassie蓝色染色,并在三个样品上进行密度测定法。
      对于2D页面,将角膜成纤维细胞的可溶性分数与样品缓冲液混合(5 m 尿素,2 m 硫脲,2%(w / v)3 - [(3-胆氨基丙基)-dimethylammonio] -1-丙磺酸(Chaps)(sigma),2%(w / v) N - N,N - 二甲基-3-氨基-1-丙二磺酸盐(SB3-10)(SB3-10),10米m DTT, 2 mm EDTA, 2 mm 1,10-菲咯啉,40μm E-64, 2 mm PEFABLOC SC和0.5%(v / v)载体两种(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)的pH 4-7或6-11按照固定的pH梯度)(
      • rabilloud t.
      • Adessi C.
      • Giraudel A.
      • Lunardi J.
      固定的pH梯度改善二维电泳中​​蛋白质中的溶解..
      ,
      • 赫伯特B.
      二维电泳蛋白质溶解的研究进展..
      )至0.5-1mg / ml的最终蛋白质浓度,并在25℃下在旋转下孵育1小时。将溴酚蓝加入到样品中以终浓度为10μg/ ml,通过以33,000×离心除去不溶物质 g 在25°C下30分钟。将溶解的样品(350μL)加载到18cm的固定性干燥剂(Amersham Biosciences)上,pH范围为4.5-5.5,5.7,4-7或6-9,并用干燥剂覆盖液(Amersham Biosciences)覆盖。在25℃温育12-18小时后,使用ICGphor系统I(Amersham Biosciences)进行16-18小时,并根据Görg的协议进行16-18小时 等等。 (
      • GörgA.
      • Obermaier C.
      • Boguth G.
      • 更难A.
      • Scheibe B.
      • Wildgruber R.
      • Weiss W.
      具有固定的pH梯度的二维电泳的当前状态..
      )。将蛋白质聚焦在第一电泳尺寸中约124kVH。通过将固定的pH梯度条带入10ml还原缓冲液中,减少并烷基化,并通过减少缓冲液(6 m urea, 50 mm Tris-HCl(pH8.8),30%(v / v)甘油,2%(v / v)sds和6.5米m DTT)在旋转和10mL烷基化缓冲液中在25℃下进行15分钟(6 m urea, 50 mm Tris-HCl(pH8.8),30%(v / v)甘油,2%(v / v)sds和10米m 碘乙酰胺)分别在25℃下旋转15分钟。
      对于第二尺寸电泳,将条带转移至18×23.4 -cm的Sds-聚丙烯酰胺凝胶(12.5%),覆盖0.5%琼脂糖,并在Hoefer Dalt TM罐(Amersham Biosciences)中以约17,000℃运行6小时在含有25米的运行缓冲液中,每凝胶为20°Cm Tris, 192 mm 甘氨酸和0.1%(w / v)sds。将凝胶固定过夜,并且如MS分析所描述的那样通过银染料来观察蛋白质(
      • 舍甫琴科A.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      蛋白质银染色聚丙烯酰胺凝胶质谱测序。
      )。扫描凝胶并在6℃下储存在5%(v / v)乙酸中。

       MS分析的样品制备 -

      切除2D感兴趣的凝胶斑点并在0.5ml水中洗涤,并在0.1ml 50%(v / v)乙腈中孵育2倍15分钟。通过在50μl乙腈中孵育15分钟并在50μl0.1中平衡凝胶塞脱水。 m NH4HCO3 在加入50μl乙腈之前5分钟,并将样品温育15分钟。除去上清液后,将凝胶塞在速度-AC中冻干10分钟。通过加入5μl50m来进行凝胶灭绝m NH4HCO3 含有来自猪(Promega,Madison,Wi)的25μg/ ml测序级修饰胰蛋白酶,然后在20℃下孵育5分钟。 NH.4HCO3 (15 μl of 50 mm)加入样品中,然后在37℃下孵育16-18小时。
      对于MALDI-MS分析,使用Ziptip P10移液管尖端(Millipore,Bedford,MA)分离所得的胰蛋白酶消化肽,并使用含有70%(v / v)乙腈的0.5μl基质溶液,0.03 %(v / v)三氟乙酸(蛋白序列级)和0.4%(w / v)重结晶α-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma)。

       MALDI-MS或MS / MS-蛋白质识别

      使用Q-TOF Ultima全球仪器(Micromass / Waters Corp.,United Kingdom)获得MALDI-TOF MS或MS / MS数据。质谱仪在范围内校准 m / z. 50-3000使用聚乙二醇混合物(1.7mg / ml PEG200,PEG400,PEG600,PEG1000和PEG2000,50%(v / v)乙腈中的0.28mg / ml NaI)。使用Glu-纤维蛋白肽B(分子量= 1570.6774)(Sigma)作为锁定质量校准每种光谱。
      对于肽指纹识别,在800-3000范围内以阳性离子模式获得质谱 m/z。肽的质量清单用于搜索瑞士 - Prot / Trembl(
      • Boeckmann B.
      • Bairoch A.
      • APWEILER R.
      • 布尔特米尔。
      • Estreicher A.
      • Gasteiger E.
      • 马丁M.J.
      • Michoud K.
      • O'Donovan C.
      • Phan I.
      • Pilbout S.
      • 施耐德M.
      2003年Swiss-prot蛋白知识库及其补充Trembl ..
      )使用搜索引擎吉祥物软件(矩阵,伦敦,英国)在本地吉祥物服务器上的NCBINR蛋白质数据库(
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库的基于概率的蛋白质识别。
      )。通过50ppm的肽质量耐受性,尿酸汀残基的氨基甲酰基变化进行,并允许单一错过的胰蛋白酶切割。仅接受由吉祥物概率分析和至少五种肽质量定义的显着命中。通常,肽质量精度在10 ppm范围内。
      对未被肽指纹识别未鉴定的蛋白质进行串联质谱。选择丰富的MS前体离子并获得MS / MS数据。氩气被用作碰撞气体,并且根据肽质量,碎片所需的碰撞能量范围为50至120V。通过将MS前体离子固定到其内部来校准MS / MS数据 m / z. 从MS获得。使用搜索引擎吉祥物软件(矩阵科学)来搜索蛋白质数据库的所得质量列表来搜索蛋白质数据库(
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库的基于概率的蛋白质识别。
      )。通过肽质量耐受性为2Da,MS / MS离子容差为0.8Da,氨基甲酰胺残留物的肽质量耐受性进行搜索,并达到一个错过的切割。对于所有识别,使用人蛋白质数据库。

      结果

       1D页面和暗管定量量化 -

      当透明角蛋白细胞暴露于胎牛血清时,它们转化为具有梭形形态和纤维细胞骨骼组织的表征的反射表型(
      • 詹斯特J.V.
      • 巴里p.a.
      • Lind G.J.
      • Petrolloww.
      • Garana R.
      • Cavanagh H.D.
      角膜角膜晶状体:原位和体外组织细胞骨骼收缩蛋白..
      ,
      • 芬西伊芒
      在修复角膜中的角蛋白酶和成纤维细胞表型..
      )。因此,培养的第三段的人角膜成纤维细胞(图。1A)被用作 体外 角膜成纤维细胞溶于蛋白质组研究的模型系统。对于初始分析,通过1D页面分析可溶性分数。通过1D凝胶的密度测定的量化显示,在可溶性级分中没有单一蛋白质同种型超过蛋白质总量的2.5%。鉴定四个最强烈的乐队透露,最丰富的蛋白质是肌动蛋白,两种不同的vimentin同种型和annexin a2。因此,肌动蛋白(〜47kDa)占可溶性蛋白质含量的2.1±0.2%,而两个Vimentin同种型〜59和〜51.3 KDA分别上升1.5±0.1和1.1±0.1%。 Annexin A2(〜38kDa)占可溶性分数中总蛋白的1.0±0.2%(图。1B)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1培养的角膜成纤维细胞和1D SDS-PAGE。A,纺锤形人体角膜成纤维细胞在10%胎牛血清中培养。 B,来自人角膜成纤维细胞的可溶性部分的1D SDS凝胶。凝胶是合作蓝染色,并指示了四个最强烈的带的身份。

       使用2D页面的蛋白质组研究 -

      使用pH梯度4-7进一步通过2D页面进一步分析角膜成纤维细胞的可溶性蛋白质组(图2A),6-9(图。2B),4.5-5.5(图2C.),5.5-6.7(图2D)。没有观察到供体中蛋白质表达谱的明显差异。所有在一起,通过MALDI-MS或MS / MS鉴定254个凝胶斑点。因此,所有斑点都指示 Fig. 2 通过质谱法鉴定。所鉴定的蛋白质代表了118个不同的蛋白质,其根据当前文献中报道的功能和细胞定位进行分类(表I.)。在显而易见的情况下,在不同凝胶上分析同一点,斑点被赋予相同的点ID(图2,A-D)。大多数已鉴定的蛋白质参与蛋白质折叠和降解,细胞增殖,分化和凋亡,代谢,细胞骨架组织和细胞运动,保护免受氧化应激,信号转导和蛋白质分泌的方法。因此,32个鉴定的蛋白质参与蛋白质折叠和降解(F),24中的细胞增殖,分化和细胞凋亡(P),23中的代谢(M),21与细胞骨架组织和细胞运动有关(C)。 ,17在氧化还原调节和氧化应激防御(O)中,13中的信号转导(L),11中的分泌途径11,其余的蛋白质涉及细胞免疫防御(I)等其他功能,蛋白质合成(Y),转录,剪接,离子转运和渗透调节(T)(表I.)。
      图缩略图Gr2a.
      Fig. 2来自人角膜成纤维细胞的可溶性级分的2D页。 使用pH梯度,来自人角膜成纤维细胞的溶于蛋白质组的2D凝胶(18×23.4厘米)(A)4-7,(B)6-9,(C)4.5-5.5,和(D)5.5-6.7。所有2D凝胶都是银染色。凝胶中的注释是指的指数ID号码 .
      图缩略图GR2B.
      Fig. 2来自人角膜成纤维细胞的可溶性级分的2D页。 使用pH梯度,来自人角膜成纤维细胞的溶于蛋白质组的2D凝胶(18×23.4厘米)(A)4-7,(B)6-9,(C)4.5-5.5,和(D)5.5-6.7。所有2D凝胶都是银染色。凝胶中的注释是指的指数ID号码 .
      T有能力的 I在人体角膜成纤维细胞的可溶性部分中鉴定的蛋白质
      蛋白质acc。不。功能和本地化fl AA./MTH./ pi.TH.Mob./ pi.ob.凝胶ID.现货ID.覆盖的片段
      actin,β或γP02570或P02571C / C.375 / 41.7 / 5.344.6 / 5.2A / C.14A19-K373.
      44.6 / 5.2A / C.15A29-K373.
      44.6 / 5.3A / C.16A19-K373.
      44.6 / 5.3A / C.17A29-K373.
      35.5 / 5.4A / C.83V96-R372
      42.6 / 5.1C152A19-K336.
      42.5 / 5.1C153A19-K336.
      31.5 / 5.4C176G63-K373
      35.5 / 5.5C186V96-R372
      36.0 / 5.2C198I85-K336
      37.0 / 5.2C199I85-K336
      酰基 - COA结合蛋白P07108m / c / n87/9.9 / 6.19.5 / 5.6D216S2-K67
      醇脱氢酶[NADP+](Aldo-keto还原酶1a1)P14550M / C.325 / 36.8 / 6.340.9 / 6.2D145M14-K308
      α-肌醇蛋白1P12814C / C.892 / 103.5 / 5.229.1 / 4.7A / C.66I656-R863
      Annexin A1P04083p / l / t / c / a / n346 / 38.8 / 6.628.7 / 5.1A / C.34Q10-R228
      28.3 / 5.0A / C.48G30-R228
      37.2 / 6.2B218Q10-R228
      Annexin A2P07355p / l / t / c / a339/38.7 / 7.617.5 / 5.6A53L11-R168
      27.3 / 5.8A95A29-R205.
      33.3 / 6.2D121L11-R245
      18.9 / 5.2C141L11-R168
      annexin V.P08758p / l / t / c / a320 / 35.8 / 5.034.3 / 5.1A75G7-R285
      ATP合成酶α链,线粒体前体P25705毫米553 / 59.8 / 9.214.3 / 4.8C157T46-K194
      ATP合成酶β链,线粒体前体 P06576毫米529 / 56.5 / 5.348.9 / 5.0A / C.4L95-K480
      ATP合酶D链,线粒体前体O75947毫米161/18.5 / 5.224.5 / 5.1C120T10-K121
      β2-microglobulin,前体P01884119/13.8 / 6.110.8 / 6.1D230v102-k111.
      钙蛋白(S100A6)P06703p / f / l / r / n90 / 10.2 / 5.39.1 / 5.1C133E41-R55.
      9.9 / 5.1C134E41-R55.
      Calgizzarin(S100A14或S100A11P)NP_066369.U / U.102/11.4 / 7.88.9 / 6.4A61I4-K78
      钙调蛋白P02593l / s / p / c149 / 16.8 / 4.114.6 / 4.0A49E15-K149.
      Calretetitulin,前体P27797F / S / E.417/48.3 / 4.356.8 / 4.3A74E25-K286.
      Calumenin,前身O43852S / E / s315 / 37.1 / 4.547.0 / 4.5A43V28-K284
      组织素B,前体P07858I / p / f / i339/38.8 / 5.927.6 / 5.1A / C.22I210-R331
      31.8 / 5.5A73L80-R331
      26.9 / 5.7A94I210-R331
      组织素D,前体P07339P / L / F / I / L.412 / 45.0 / 6.131.9 / 5.2A / C.72Y123-R411
      31.0 / 5.9D109Q185-R411
      32.3 / 5.4C187Y123-R411
      33.2 / 5.1C196Q185-R411
      细胞分裂控制蛋白42同源物(G25K GTP结合蛋白)P21181C / P / L / C.191/21.7 / 5.823.6 / 5.6D31T108-R120
      23.6 / 6.1D124T108-R120
      氯化物细胞内通道蛋白1(CLIC1)O00299O / T / N / C.241 / 27.3 / 5.132.8 / 5.0C195I21-K238
      氯化物细胞内通道蛋白4(CLIC4)Q9Y696C / P / C / M / N253 / 29.0 / 5.531.1 / 5.4C173A25-R227.
      Clathrin轻链BP09497M / I / C / A / L.229 / 25.3 / 4.631.0 / 4.5A69L96-K204
      Cofilin,非肌肉同种型P23528c / c / n166/18.7 / 8.213.8 / 5.4A / C.62K34-K92
      19.6 / 8.3B179A35-R146
      毁坏P18282c / c / n165 / 19.0 / 8.118.8 / 8.3B178C23-K151
      二氢甲酰甲酰胺琥珀酰亚胺转移酶组分2-氧基氟盐脱氢酶复合物,线粒体前体(E2)P36957毫米453 / 49.0 / 9.022.0 / 5.0A / C.102D313-R325
      Dynein轻链2a或2b,细胞质Q9NP97或Q8TF09.C / P / C.96/109 / 6.6-6.910.2 / 5.6D217D59-R70
      电子转移黄酮蛋白β亚基(ETF-β)P38117毫米255 / 28.1 / 8.226.5 / 5.3C142E60-R233
      伸长因子1-β(EF-1β)P24534Y / C.225 / 24.8 / 4.532.2 / 4.6A97S8-K22
      伸长因子2(EF-2)P13639Y / C.858 / 96.1 / 6.411.9 / 6.0D227A786-R801.
      内质网蛋白29,前体(ERP29)P30040F / S / E / s261 / 29.0 / 6.829.8 / 6.5A44G37-K253
      29.3 / 5.9D229G37-K253
      内皮素,前体(GRP94)P14625F / S / E.803/92.7 / 4.824.0 / 6.3D165L494-R503.
      51.3 / 4.7C201T44-R448
      α-烯醇化酶P06733m / t / c / n434/47.5 / 7.034.3 / 6.2A1A33-K343
      38.0 / 6.8A6A121-R372.
      40.5 / 6.2A19A33-K326
      27.6 / 5.2A / C.24A121-K343.
      34.3 / 6.0A27A33-K343
      24.6 / 5.0A47L163-K343
      33.0 / 6.1A65L163-K343
      41.0 / 6.4A67G16-K343
      29.5 / 5.2C110F106-K343
      51.2 / 6.6D131G16-R412
      47.9 / 6.1D140G16-R412
      47.9 / 6.1D143G16-R412
      26.5 / 5.0C146L163-R327
      39.7 / 5.6D175A33-R50
      49.5 / 6.3D200G16-R412
      47.5 / 6.7B220G16-R412
      40.9 / 5.6D244G16-K326
      40.3 / 5.7D246G16-K326
      eNoyl-CoA水解酶,线粒体前体P30084毫米290 / 31.8 / 8.329.1 / 6.4A45G42-R283
      29.3 / 5.7D208G42-K273
      铁链灯链P02792O / T / C / L.175 / 19.9 / 5.520.9 / 5.4C189L155-R169.
      Galectin-1P09382p / c / s / n135 / 14.9 / 5.313.8 / 5.0A / C.39D38-K130
      11.5 / 5.4A113D38-R49
      13.6 / 5.2C135v20-k130.
      14.3 / 5.2C136V20-R112
      谷胱甘肽 S - 转移酶,线粒体前体Q9Y2Q3o / m.226 / 25.5 / 8.514.3 / 6.3D237H75-R225
      谷胱甘肽 S - 转移酶P(GSTP1-1)P09211O / C.210 / 23.5 / 5.426.9 / 5.4A / C.96P2-K141
      25.4 / 5.6D167F56-R71.
      谷胱甘肽转移酶ω1(GSTO 1-1)P78417O / C.241 / 27.8 / 6.231.0 / 5.6D101S2-K220
      46.3 / 6.6D132G12-R25
      甘油醛3-磷酸脱氢酶P04406M / C.335 / 35.9 / 8.610.6 / 5.9D222L310-R323
      11.9 / 6.2D231L310-R323
      14.8 / 6.3D238L67-R80
      14.1 / 6.4D240L310-R323
      15.3 / 6.5D241L310-R323
      22.0 / 6.5D242L67-R80
      乙醛酸酶I(乳酰谷裂解酶)Q04760o / m / c184/20.8 / 5.324.2 / 5.0C202D29-K179
      GTP结合核蛋白RAN(TC4)P17080p / t / c / n216/24.6 / 7.027.2 / 6.8B205Y39-R56.
      热休克同源71-KDA蛋白(HSC71)P11142F / C.646 / 71.1 / 5.435.5 / 4.7 C155n540-k550.
      43.3 / 4.9C163T273-K550.
      30.1 / 6.3D254G4-K246
      热休克蛋白27-KDAP04792f / p / c / c205 / 22.8 / 6.028.4 / 6.4A40R5-R188
      15.7 / 5.2C137L172-R188
      28.1 / 5.7D207R5-R188
      异质核核糖核蛋白H(HNRNP H)P31943T / N.449 / 49.5 / 5.926.5 / 5.9D226H99-R114.
      26.9 / 6.2D251G17-R29.
      异质核核糖核糖蛋白K(HNRNP K)Q07244t / c / n463 / 51.2 / 5.435.2 / 5.1A103T70-R86.
      组氨酸三核苷酸结合蛋白1P49773t / c / n126/13.8 / 6.513.3 / 6.2D234A8-R119.
      3-羟基异丁酸脱氢酶,线粒体前体P31937毫米336 / 35.7 / 8.429.9 / 5.1C111M150-R167
      假设蛋白质(片段)(IL-25 / SF20)Q9BTK7U / U.171/18.8 / 6.115.6 / 6.2D235S99-K107
      异柠檬酸脱氢酶[NADP+],细胞质O75874m / o / c / p414/46.9 / 6.547.1 / 6.4D144I5-K400.
      78-KDA葡萄糖调节蛋白,前体(BIP)P11021F / S / E.654 / 72.4 / 5.132.6 / 6.7A12V50-R214
      27.6 / 5.1A / C.21A298-K474.
      24.0 / 4.6A46G493-L654
      24.0 / 4.6A89G493-L654
      16.4 / 5.2C128K353-R367
      31.9 / 6.0D148v50-k271.
      30.3 / 5.0C194v50-k271.
      60-KDA热休克蛋白,线粒体前体P10809调频573 / 61.2 / 5.754.9 / 5.2A / C.5A38-K516
      31.9 / 4.7C64T206-R526.
      54.0 / 5.1A / C.78D29-R526
      54.0 / 5.3C182A38-R526.
      miR-相互作用的果蝇样蛋白(msap)NP_055070C / P / C.182 / 21.0 / 4.819.5 / 5.0C158S23-L182
      肌球蛋白碱轻链同种型1,平滑肌和非肌肉NP_066299C / P / L / C.151/17.1 / 4.614.8 / 4.4A55E14-K119.
      14.6 / 4.5A56E14-R146.
      核传输因子2P13662T / C.127/14.6 / 5.110.1 / 5.0A117N107-R120
      核磷(核磷蛋白B23)P06748t / p / f / n294 / 32.7 / 4.618.3 / 4.5A106M81-R101
      核苷二磷酸激酶aP15531m / c / n152/17.3 / 5.819.6 / 6.2A80T7-R114.
      17.1 / 5.1C127F40-K128
      20.1 / 5.6D214T7-K128
      核苷二磷酸激酶B.P22392m / c / n152/17.4 / 8.512.0 / 6.4A63Q50-K143
      19.6 / 8.7B177T7-K143
      13.6 / 5.8D219Q50-K143
      14.1 / 6.4D239D57-E152
      肽基 - 脯氨酰 CIS-TRANS. isomerase (FKBP65)Q96AY3F / S / E.582 / 64.8 / 5.460.6 / 6.3A42E58-R577.
      57.1 / 5.6D112A34-R577.
      57.1 / 5.8D221A34-R485.
      57.1 / 5.7D243A34-R577.
      肽基 - 脯氨酰 CIS-TRANS. 异构酶A(Cellophilin A)P05092F / C.165/18.1 / 7.817.6 / 7.8B180V2-E165
      17.6 / 7.5B181V2-E165
      过氧杂志1Q06830O / C.199 / 22.3 / 8.326.8 / 8.5B190Q141-R151
      过氧杂志2P32119O / C.198/22.1 / 5.424.8 / 5.4A / C.29I8-R150
      过氧杂志3,线粒体前体P30048o / m.256 / 28.0 / 7.725.6 / 6.5A30T38-R214
      26.1 / 5.6D92D171-R184
      过氧杂志4.Q13162O / C.271/30.8 / 5.928.4 / 6.1A82T46-R223.
      过氧杂志5,线粒体前体P30044o / m / p / c214/22.3 / 8.916.4 / 6.1D125E160-R176.
      过氧杂志6.P30041O / C / L / s224 / 25.0 / 6.028.4 / 6.8A85F25-R174.
      28.1 / 6.0D105P2-K199
      磷脂酰乙醇胺结合蛋白P30086l / b / c / s187 / 21.0 / 7.423.9 / 7.4B191L63-R76.
      6-磷葡聚糖酰胺酶(乳酸酯)O95336M / C.258 / 27.8 / 5.728.9 / 5.6D169F41-R246
      28.9 / 5.6D172E57-R72.
      磷酸甘油激酶1P00558M / C.418/44.7 / 7.527.6 / 5.3C108A200-K382
      25.9 / 5.1C119I280-K297
      27.2 / 5.2C122A107-K406.
      26.9 / 5.2C123V19-K406
      40.9 / 6.0D248A107-R123
      磷酸性蛋白酶1,同工酶B.P18669M / C.254 / 28.8 / 6.831.5 / 6.5D197H11-R240
      30.1 / 6.5B210H11-R240
      磷酰胺酶2O15305S / C.246 / 28.4 / 6.429.3 / 6.1D161A2-S246
      聚合酶I和转录物释放因子np_036364.T / N.390 / 43.5 / 5.523.1 / 5.4A93I61-R78
      24.5 / 5.1C192K137-R147.
      prefoldin亚基1.O60925F / C.122/14.2 / 6.312.4 / 5.9D225L29-R39.
      Profilin I.P07737C / C.140 / 15.1 / 8.411.9 / 4.8A / C.58D27-K105
      12.3 / 4.8C130D27-K105
      perhibitin.P35232个人电脑272/29.8 / 5.630.6 / 5.8A100A220-R239.
      31.1 / 5.4C173F12-R253.
      脯氨酰4-羟化酶α-1亚基前体P13674F / S / E.534 / 61.3 / 5.729.4 / 6.1D160D105-E534
      29.7 / 6.1D252S383-R396.
      脯氨酰4-羟化酶β亚基(蛋白质二硫化物异构酶),前体P07237F / E.508 / 57.4 / 4.840.8 / 5.1A / C.13K31-R345
      38.6 / 5.1A / C.77L70-K370
      34.1 / 5.0C149L79-R345
      40.8 / 5.0C151L70-R345.
      42.0 / 5.0C166L79-K370
      38.6 / 5.2C204V82-K386
      蛋白酶抑制剂6.P35237公元前376/42.9 / 5.237.5 / 4.8C154S62-K299
      蛋白酶体活化剂28-α Q06323F / I / C249 / 28.9 / 5.830.2 / 6.0A81I110-R213
      蛋白酶体活化剂28-γQ12920F / I / C254/29.6 / 5.726.1 / 5.8D209L13-K237
      蛋白酶体亚基α型1P25786f / c / n263/29.8 / 6.232.4 / 6.1D2N4-R242.
      蛋白酶体亚基α型2P25787f / c / n234 / 25.9 / 7.128.9 / 6.5D118G5-R219
      蛋白酶体亚基α型6P34062f / c / n246 / 27.8 / 6.328.5 / 6.1D107H12-K164.
      蛋白酶体亚基β型2P49721f / c / n201 / 23.0 / 6.526.1 / 6.4D223V20-R181
      蛋白酶体亚基β型3P49720f / c / n205/23.2 / 6.126.5 / 5.8广告57n18-k192
      蛋白二硫化物异构酶A3,前体(ERP57)P30101F / S / E / C / N.505 / 57.1 / 6.055.9 / 6.1A18Q131-R482
      32.6 / 5.9A28R62-K271
      30.2 / 6.1A32K305-R482
      30.6 / 6.3A33F215-R482
      32.8 / 5.2A / C.50R62-R280
      55.9 / 6.2A79R62-R448
      52.1 / 5.5D84R62-K496.
      31.0 / 6.2D253A174-K496.
      蛋白质-l-IsoSpartate(d-Aspartate) O - 甲基转移酶P22061F / O / C227 / 24.7 / 6.826.5 / 6.1D59A82-R98.
      丙酮酸脱氢酶E1组分β亚基,线粒体前体 P11177毫米359 / 39.5 / 6.237.0 / 5.4C183E259-R269.
      丙酮酸激酶,M1或M2同工酶P14618或M / C.531 / 57.9 / 8.040.0 / 6.9A3L33-R294
      P1478638.4 / 6.3A20L33-R376
      28.0 / 6.3A37L33-R246
      40.5 / 6.7A38L33-K305
      38.9 / 6.5A68L33-R294
      38.0 / 5.7D245L33-K336.
      38.0 / 5.8D247L33-K336.
      39.7 / 6.0D249R279-R294
      39.7 / 6.2D250L33-K497
      维甲酸结合蛋白II,细胞(Crabp-II)P29373l / p / c138 / 15.7 / 5.415.2 / 5.3A / C.88V68-K83
      Rho GDP-解离抑制剂1P52565l / p / c204/23.3 / 5.027.6 / 5.0C193S34-K199
      60S酸性核糖体蛋白P0P05388Y / C.317 / 34.4 / 5.737.4 / 5.7D104I17-K297
      SNRNP核心蛋白D3P43331t / c / n126/13.9 / 10.38.7 / 6.3D232V55-R64.
      40s核糖体蛋白S12P25398Y / C.132/14.7 / 6.414.3 / 6.2D236T24-R33.
      40s核糖体蛋白SA(LBP / P40)P08865y / p / c / n295 / 33.0 / 4.833.8 / 4.5A70F90-R180
      应激致磷蛋白1(跳或STI1)P31948f / p / c / p543 / 63.2 / 6.458.2 / 6.2D139A14-R543
      应激 - 70蛋白,线粒体前体(Mortalin)P38646P / F / L / M / C / A / E.679 / 74.0 / 6.058.0 / 5.2C90A147-K595.
      35.1 / 5.0C150S469-K485.
      62.6 / 5.4C170G53-K563
      琥珀酰基:3-酮酸 - 辅酶A转移酶,线粒体前体P55809毫米520 / 56.6 / 7.153.0 / 6.0D138G84-R104
      超氧化物歧化酶(Cu-Zn)P00441O / C.154/16.0 / 5.718.6 / 5.6D215G11-K24
      超氧化物歧化酶(Mn),线粒体前体P04179o / m.222 / 24.9 / 8.425.8 / 6.4D115G76-R216
      25.8 / 6.5D116A203-R216
      25.0 / 6.3D168A203-R216
      25.2 / 6.7B203H54-R216
      24.3 / 6.2D213H54-R216
      9.3 / 6.3D233G76-K89
      T-复合蛋白1,β亚基(TCP-1-β)P78371F / C.535 / 57.5 / 6.018.1 / 5.1A / C.51L26-K170
      51.2 / 6.0D126L26-R516
      T-复合蛋白1,ε亚基(TCP-1-ε)P48643F / C.541 / 60.1 / 5.455.9 / 5.4D171I133-R525
      ThioredoxinP10599O / C.105 / 12.0 / 4.813.4 / 4.9A / C.60T9-V105.
      转化蛋白质RhOA(H12)P06749l / c / a193/22.1 / 5.825.4 / 5.6D86L8-R176
      Transgelin.Q01995C / P / C.201/22.5 / 8.918.3 / 6.4D129L30-K121
      过渡因内质网ATP酶(TER ATP酶)P55072s / t / c / n806 / 90.0 / 5.136.0 / 5.4C185M46-R53.
      平移控制的肿瘤蛋白(TCTP)P13693p / y / c172 / 19.7 / 4.825.2 / 4.8A / C.99I20-K34
      Triosephosphate异构酶P00938M / C.249 / 26.8 / 6.527.3 / 6.5A23K19-K188
      30.1 / 6.5D25K6-R206.
      28.0 / 6.5A54V34-K219
      28.5 / 6.2D114V34-R206
      28.5 / 6.2D156K6-K219
      28.6 / 6.5B206K19-K219
      27.7 / 5.9D211V34-K219
      28.2 / 6.2B212K6-R206.
      27.3 / 5.9D228K19-K219
      Tropomyosinα-3链P06753C / C.247/29.1 / 4.732.7 / 4.9A / C.35K13-D247
      32.8 / 4.9A / C.41K13-D247
      Tropomyosinα-4链P07226C / C.248 / 28.6 / 4.732.8 / 4.8A / C.36K13-I248
      Tropomyosinβ链P07951C / C.284/33.0 / 4.738.9 / 4.9A71K77-L284
      38.6 / 4.7A / C.76L13-R178
      管蛋白α-1链P05209C / C.451 / 50.8 / 4.940.0 / 5.8A87T41-K280
      管蛋白α-6链Q9BQE3C / C.449 / 49.9 / 5.038.6 / 5.4C174T41-K280
      管蛋白β-4链Q13509C / C.450 / 50.9 / 4.836.5 / 5.4C184I47-K58
      管蛋白β-5链P05218C / C.444 / 50.1 / 4.837.0 / 5.3A / C.52F20-K297.
      泛素P02248f / c / n76/8.6 / 6.69.3 / 6.5B188E64-R72.
      泛素缀合酶E2 n(UBC13)Q16781d / f / c / n152/17.2 / 6.115.3 / 5.6D224L15-R141.
      泛素C末端水解酶-11P09936F / C.223 / 25.2 / 5.328.3 / 5.3A / C.26M1-K195
      vP08670C / C.466 / 53.8 / 5.048.1 / 5.0A / C.7L79-K439
      44.5 / 4.8A / C.8T101-R424
      43.3 / 4.7A / C.9L79-R378
      43.3 / 4.8A / C.10L79-R378
      43.3 / 4.9A / C.11T101-R424
      27.6 / 5.1A91D271-E466
      45.7 / 4.6A98T101-R424
      27.2 / 4.9C147F114-R440
      40.8 / 4.7C159L79-K402
      45.9 / 4.9C162L79-R440
      43.9 / 5.0C164L79-R424
      在鉴定的蛋白质中,一个点(点235)似乎是假设蛋白质(登录号 Q9BTK7,trembl入场区没有表达的实验证据 体内。蛋白质 - 蛋白质BLAST搜索对C19ORF10蛋白(AAH03639和NP_061980)(E-VALUTE6E-77),其他假想蛋白质和小鼠白细胞介亚脲-25(IL-25 / SF20)(NP_543027)的高同源性(NP_543027)(NP_543027)(电子值6e-66)。 C19ORF10蛋白质具有173AA的全长173AA,理论PI〜6.2和理论分子量~18.8kDa。因此,本数据表明该蛋白质在人体角膜成纤维细胞中表达。
      一些蛋白质存在于不同的同种型中。这些蛋白质包括肌动蛋白(例如 斑点14-17,152,153,176,186和198; 图2C.),α-烯醇酶(例如 斑点110,131,140,​​146,175,200,244和246; 图2,C和D.),甘油醛3-磷酸脱氢酶(斑点222,231,238,240,241和242; 图2D),78-KDA葡萄糖调节蛋白(BIP)(例如 斑点12,21,46和89; 图2A),磷酸甘油激酶1(斑点108,119,122,123和248; 图2,C和D.),蛋白二硫化物异构酶(脯氨酰4-羟化酶β亚基)(例如 斑点149,151,166和204; 图2C.),蛋白质二硫键异构酶A3(例如 斑点18,28,32,33,50和79; 图2A),丙酮酸激酶m1或m2(例如 斑点245,247,249和250; 图2D),超氧化物歧化酶(Mn)(例如 斑点115,168,213和233; 图2D),Triosephosphate异构酶(例如 斑点25,156,211和228; 图2D)和vimentin(例如 斑点7,8,9-11,147,159,162和164; 图2C.)(表I.)。
      在118个鉴定的蛋白质中,先前已被分类为角膜上皮细胞中的角膜酶 - 结晶蛋白(表二)。因此,非碱性肌动蛋白代表斑马鱼角膜的水溶性蛋白的〜15%(
      • 徐ys.
      • kantorow M.
      • 戴维斯J.
      • Piatigorsky J.
      露珠蛋白的证据是斑马鱼中的角膜结晶素..
      ,
      • Piatigorsky J.
      角膜中丰富的水溶性细胞质蛋白质的谜:“折射”假设......
      ),肽基 - 脯氨酰 CIS.-trans 异构酶A代表鸡肉中的5-10%可溶性蛋白质,α-烯醇酶是哺乳动物和鸡肉中突出的蛋白质,谷胱甘肽 S - 样转移酶样蛋白在鱿鱼角膜中占主导地位(
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      ),而异柠檬酸脱氢酶占总牛角膜上皮可溶性蛋白质的约13%(
      • 太阳L​​.
      • 太阳t.t.
      • Lavker r.m.
      鉴定细胞溶质NADP+ - 依赖性异柠檬酸脱氢酶,其优选以牛角膜上皮表达。角膜上皮结晶..
      )。
      T有能力的 II人的角膜成纤维细胞中的蛋白质被分类为角膜上皮中的酶 - 结晶蛋白
      酶结晶物种参考。
      肌动蛋白,非丝状(与戈尔洛林复合物)斑马鱼
      • 徐ys.
      • kantorow M.
      • 戴维斯J.
      • Piatigorsky J.
      露珠蛋白的证据是斑马鱼中的角膜结晶素..
      α-烯醇化酶人类,老鼠,鸡肉
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      异柠檬酸脱氢酶
      • 太阳L​​.
      • 太阳t.t.
      • Lavker r.m.
      鉴定细胞溶质NADP+ - 依赖性异柠檬酸脱氢酶,其优选以牛角膜上皮表达。角膜上皮结晶..
      谷胱甘肽 S - 转移酶乌贼
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      肽基脯氨酰 CIS-TRANS. isomerase A
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。

      讨论

      目前,在伤口愈合过程中,角膜细胞透明度的普遍假设和细胞渗透率的发育涉及酶 - 结晶,其在角膜上皮和角膜织物中高​​度表达。在角膜角膜细胞中,据信高水平的酶 - 结晶蛋白通过最小化细胞质和细胞外环境之间的折射率波动而有助于细胞的透明度和折射性能(
      • 詹斯特J.V.
      • Møller-Pedersen T.
      • 黄杰。
      • 萨克斯下午
      • kays w.t.
      • Cavanagh H.D.
      • Petrolloww.
      • Piatigorsky J.
      角膜透明度的细胞基础:“角膜晶晶体”的证据..
      ,
      • Piatigorsky J.
      回顾:角膜晶体的案例..
      )。因此,视膜细胞雾度发展被认为与反射角细胞表型的细胞质中的低水平水溶性酶结晶蛋白相关。在本研究中,鉴定了人角膜成纤维细胞中最丰富的水溶性蛋白质的118个不同的蛋白质。大多数已鉴定的蛋白质是来自非透明组织的大多数其他细胞类型的家庭蛋白质。因此,大量鉴定的蛋白质也被其他成纤维细胞如皮肤成纤维细胞(
      • Boraldi F.
      • 比尼L.
      • 利斯特州S.
      • ARMINI A.
      • Pallini V.
      • Tioozzo R.
      • ronchetti i.p.
      • Quaglino D.
      正常人体皮肤成纤维细胞:细胞层和培养基的蛋白质组学分析。
      ,
      • Boraldi F.
      • 比尼L.
      • 利斯特州S.
      • ARMINI A.
      • Pallini V.
      • Tioozzo R.
      • Pasquali-Ronchetti I.
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      ) (访问 proteomics.cancer.dk/jecelis/human_data_select.html.)。该发现可以反映来自反射细胞的光散射的共同机制。

       角膜酶 - 晶体蛋白和各种同种型 -

      1D凝胶的密度测定表明,没有单带超过总可溶性蛋白质级分的5%,这是根据电流定义的角膜酶结晶素的鉴定性。因为酶 - 结晶素的定义相当松散,并且不考虑各种分子量同种型的存在(
      • Piatigorsky J.
      镜片和角膜中的基因分享:事实和含义..
      ),该结果表明培养的人角膜成纤维细胞不含酶结晶素。此外,最丰富的水溶性蛋白质中没有发现Aldh3a1和Tkt,表明这些酶结晶蛋白不存在或仅在低水平下表达,这与先前的结果(
      • Stramer下午
      • 库克J.R.
      • Fini M.E.
      • 泰勒阿。
      • ob.in m.
      在角蛋白酶过渡期间泛素 - 蛋白酶体途径诱导修复成纤维细胞表型..
      )。
      蛋白质组分析鉴定了五种蛋白质,其先前被分类为各种物种的角膜上皮中的酶 - 晶体蛋白(表二)。在以前的一项研究中(
      • Cuthbertson R.A.
      • Tomarev S.I.
      • Piatigorsky J.
      分类群特异性酶作为三种哺乳动物,鸡肉和鱿鱼的角膜上皮中的主要可溶性蛋白质。
      ),全长α-烯醇酶(〜48kDa)显示在人体角膜上皮中高度表达。发现至少八个α-烯醇酶同种型(例如 斑点110,131,140,​​146,175,200,244和246; 图2,C和D.在人的角膜成纤维细胞中,该糖酵解酶/酶结晶素也相当丰富,在角膜成纤维细胞中也是不明的原因,为什么它存在于几种不同的同种型中。然而,通过发现全长α-烯醇酶mRNA的替代翻译可以产生37-KDA同种型可以产生37-KDA同种型,这已知已知其结合C-我的C 启动子和功能作为转录压缩机(
      • Feo S.
      • Accuri D.
      • Piddini E.
      • Passantino R.
      • Giallongo A.
      eno1基因产物与C-myc启动子结合,作为转录压缩机:与Myc启动子结合蛋白1的关系(MBP-1)..
      )。另外,可以通过诸如磷酸化的翻译后修饰来解释具有相似分子量但不同PI值的同种型。因此,α-enolase的同种型(斑点175/246和140/200/131; 图2D),肽基 - 脯氨酰 CIS.-trans 异构酶A(斑点181和180; 图。2B),actin(例如 斑点14-17和152/153; 图2C.)和Triosephosphate异构酶的同种型(例如 斑点114,211和228; 图2D)可能反映翻译后修改。

       代谢-

      静态角细胞进入角膜成纤维细胞表型的转变,其特征在于,通过大规模粗糙的内质网(ER),突出的高尔基装置,以及囊泡数量和线粒体的增加(
      • 詹斯特J.V.
      • 罗德里格斯米。
      • 赫尔曼伊。
      缺血角膜伤愈合成纤维细胞的表征。新的洞察力进入myofibroblast ..
      ,
      • 芬西伊芒
      在修复角膜中的角蛋白酶和成纤维细胞表型..
      )反映蛋白质贩运和呼吸要求的增加。通过鉴定来自角膜成纤维细胞的可溶性级分中的几种线粒体代谢酶来证实这一点。这些蛋白质涉及丙酮酸丙酯(丙酮酸脱氢酶复合物的E1组分β亚基),脂肪酸氧化(ENOYL-COA水解酶),柠檬酸循环(线粒体2-氧缺失脱氢酶复合物的E2组分),呼吸系统链(电子转移三氟蛋白的β亚基)和ADP磷酸化(ATP合酶链)。此外,发现,发现琥珀酰基-3-酮酸 - 辅酶是转移酶,其是酮体分解代谢的关键酶。
      还确定了来自糖酵解途径的几种酶。因此,除了α-烯醇酶之外,这些包括Triosephosphate异构酶,甘油醛3-磷酸脱氢酶,磷酸糖激酶1,磷酸糖激酶1B和丙酮酸激酶。另外,发现来自磷酸磷途径的氧化分支的6-磷光酰胺酶。其他代谢酶包括核苷二磷酸激酶,异柠檬酸脱氢酶和醇脱氢酶,同工酶1a1。因此,目前的蛋白质鉴定在角膜成纤维细胞中的高代谢活性。有趣的是,甘油醛3-磷酸脱氢酶的所有六种同种型都有分子量和Pi值(Mob. ∼10–22 kDa, pIob. ~5.9-6.5)远小于理论值(MTH. ∼36 kDa, pITH. 〜8.6),表明这种酶的深刻片段化(表I.; 图2D)。

       分泌途径 -

      分泌途径涉及耳垂蛋白(表I.)辅助分泌蛋白质的折叠和加工。在本研究中,蛋白质二硫化物异构酶,肽基 - 脯氨酰 CIS.-trans 发现了ER腔内的异构酶和分子伴侣。蛋白二硫化物异构酶A3刺激蛋白质中二硫键的形成和重排,而肽基 - 脯氨酰 CIS.-trans 异构酶(FKBP65)催化 CIS.-trans 肽基 - 脯氨酰残基的异构化并促进蛋白质合成期间分泌蛋白的折叠。此外,已知ER分子伴侣,内皮蛋白,ER蛋白质29和78-kDa葡萄糖调节蛋白(BIP)防止分泌蛋白的聚集。
      参与分泌蛋白质改性的蛋白质也存在于来自角膜成纤维细胞的可溶性级分中。脯氨酰4-羟化酶(α-1和β亚基)催化胶原蛋白和其他蛋白质的翻译后羟基化,β亚基也是蛋白质二硫化物异构酶。一些分泌蛋白质是通过将谷氨酸转换成γ-羧基谷氨酸的系统中的γ-羧化。 Calumenin的功能尚不清楚,但已被证明抑制了ER腔中蛋白质的维生素-K依赖性γ-羧化(
      • 沃林·
      • HUTSON S.M.
      • 这是一个
      • Sweatt A.
      • Sane D.C.
      大鼠遗传造成遗传造成遗传性致病机制..
      )。磷醋酶2是将甘露糖6-磷酸盐(MAN-6-P)转化为甘露糖-1-磷酸酯(MAN-1-P)的胞质酶,这是在ER腔和高尔基装置中进行的蛋白质糖基化的初始步骤所必需的。
      参与蛋白质折叠,脯氨酸羟化和分泌蛋白质糖基化的关键酶的发现符合Cyneal成纤维细胞完成的伤口愈合过程。

       假设蛋白/ IL-25的鉴定

      假设的人类蛋白质(登记号 Q9BTK7,Trembl入场)揭示了新型小鼠IL-25 / SF20的高同源性,这是骨髓基质衍生的生长因子。根据先前的发现,IL-25 / SF20是刺激细胞增殖的分泌蛋白质(
      • Tulin E.E.
      • onoda n。
      • Nakata Y.
      • Maeda M.
      • Hafegawa M.
      • Nomura H.
      • Kitamura T.
      SF20 / IL-25,一种新型骨髓基质衍生的生长因子,与小鼠胸腺共享抗原-1结合,支持淋巴细胞增殖。
      ,
      • Tulin E.E.
      • onoda n。
      • Nakata Y.
      • Maeda M.
      • Hafegawa M.
      • Nomura H.
      • Kitamura T.
      收缩信:SF20 / IL-25,一种新型的骨髓基质衍生的生长因子与小鼠胸腺共享抗原-1结合,并支持淋巴细胞增殖。
      )。有趣的是,最近的报道表明,角膜上皮和基质均含有大量的常规骨髓衍生细胞,如巨噬细胞和树突细胞(
      • Brissette-Storkus C.S.
      • 雷诺兹S.M.
      • Lepisto A.J.
      • Hendricks R.L.
      鉴定正常小鼠角膜基质中的新型巨噬细胞群。
      ,
      • Hamrah P.
      • 刘Y.
      • 张Q.
      • Dana M.R.
      角膜基质具有大量的常驻树突细胞。
      )。骨髓衍生的细胞在抗原呈递中具有高效效率,并引发在角膜炎症和同种异体移植排斥反应中的免疫应答。在角膜成纤维细胞中鉴定的小鼠骨髓基质基质衍生生长因子IL-25 / SF20的人类同源物可能在伤口愈合过程中发挥调节作用,这可能包括活化和转变常住骨髓源细胞角膜基质。

       氧化压力防御 -

      活性氧物质(ROS)是细胞毒性,因为它们与脂质和碳水化合物反应,以产生高反应性的剂,损伤DNA和不可逆的氧化蛋白,其可导致蛋白质 - 蛋白质交联,破碎,展开和降解,或蛋白质聚集体的形成(
      • 贝利特B.S.
      • Stadtman e.r.
      衰老,疾病和氧化应激的蛋白质氧化..
      ,
      • Ghezzi P.
      • Bonetto V.
      氧化还原蛋白质组学:鉴定氧化改性蛋白质..
      )。紫外线辐射是ROS的外源来源,而呼吸链如呼吸链的代谢酶系统是ROS和反应性细胞毒性剂的重要内源来源(
      • Lenaz G.
      线粒体在氧化应激和老化中的作用..
      )。因此,与静态角膜细胞相比,增殖角膜成纤维细胞的许多线粒体可能导致成纤维细胞中的氧化胁迫水平高于角细胞。在角膜成纤维细胞中鉴定了几种参与氧化还原调控和防止氧化应激的细胞和细胞溶质蛋白质。这些蛋白质包括线粒体和细胞质谷胱甘肽 S - 转移酶,硫氧化肽和几种细胞质和线粒体过氧氧化毒素,其在消除在代谢期间形成的各种过氧化物中起重要作用。此外,线粒体超氧化物歧化酶(Mn)和超氧化物歧化酶(Cu-Zn)催化o的转化 2 发现了激进过氧化氢。乙醛酸酶I是乙醛酸酶系统的一部分,其催化反应性醛转化为酸,从而排毒胞质溶胶。其中几种已鉴定的蛋白质参与防御氧化应激的事实表明,角膜成纤维细胞感测氧化应激,并且相信内源的ROS水平较高,在增殖的角膜成纤维细胞中比在静态角膜细胞中更高。

       蛋白质折叠和降解 -

      分子伴侣和蛋白质降解机械是细胞保护系统,可帮助蛋白质折叠,防止展开和受损蛋白质的积累。在本研究中,鉴定了参与蛋白质折叠和降解的细胞溶质和线粒体蛋白。
      prefoldin是一种细胞溶胶伴侣,其具有展开蛋白质,主要是actins和管蛋白,对细胞溶质伴侣蛋白T-复合蛋白1提供,这对于这些细胞骨架蛋白的折叠至关重要(
      • Siegers K.
      • Bolter B.
      • Schwarz J.P.
      • 瓶子U.M.
      • 古哈斯。
      • Hartl F.U.
      TRIC / CCT与不同的蛋白质课程的折叠中的不同上游伴侣合作。
      )。 HSP27是一种普遍表达的小型热休克蛋白成员,并且涉及各种功能,包括在热冲击,氧化应激,细胞因子治疗期间包括细胞抗性,并且参与细胞骨架组织。应激诱导的磷蛋白1类似于已知与HSP90和HSP70相互作用并调节其ATP酶活性的细胞质酵母热休克蛋白STI1。此外,发现了细胞骨热休克同源71-KDA蛋白。线粒体60-KDA热休克蛋白涉及线粒体蛋白质进口并防止在线粒体应激条件下展开,而线粒体应激-70蛋白可以是伴侣。
      泛素(UB)-ProteAme系统催化在细胞中产生的展开或受损蛋白质的破坏。先前已经表明,在从角蛋白酶到成纤维细胞的表型转变期间诱导UB-蛋白酶体系,并且在传代培养期间维持在角膜成纤维细胞中的更高水平的无需UB,UB-蛋白缀合物和26S蛋白酶体(
      • Stramer下午
      • 库克J.R.
      • Fini M.E.
      • 泰勒阿。
      • ob.in m.
      在角蛋白酶过渡期间泛素 - 蛋白酶体途径诱导修复成纤维细胞表型..
      )。因此,角膜成纤维细胞具有持久的UB缀合物群,靶向26s蛋白酶物以降解。这些结果与来自UB-蛋白酶体系的几种蛋白质的本发现一致,包括蛋白酶体亚基,游离UB,UB缀合酶和UB C末端水解酶。递质的角膜成纤维细胞中的免费UB和蛋白酶体亚基可以表明,在角膜成纤维细胞中的UB-蛋白酶体系是损伤或展开蛋白质的降解所需的,而不是与TKT(
      • Stramer下午
      • 库克J.R.
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      • 泰勒阿。
      • ob.in m.
      在角蛋白酶过渡期间泛素 - 蛋白酶体途径诱导修复成纤维细胞表型..
      )。因此,与先前发现的本结果可能表明,蛋白质降解的要求,其可以包括氧化蛋白的降解,而不是在角膜细胞中的角膜成纤维细胞。然而,某些氧化蛋白和严重的氧化蛋白质是蛋白酶体的较差的底物,这可能导致在某些疾病中观察到的血胞内夹杂物中氧化蛋白质聚集体的积累(
      • 文格T.
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      用蛋白酶选择性降解氧化修饰的蛋白质底物..
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      • Trojanowski J.Q.
      • 李五。
      通过选择性α-突触核蛋白硝化在突触核苷酸病变损伤中与神经变性相关的氧化损伤。
      )。

       观点 -

      增加对各种角蛋白酶表型的知识对于了解角膜生理学和病理生理学是重要的。调节角膜细胞透明度的生化机制尚未得到完全理解。该研究施用了蛋白质组学方法来鉴定原发性角膜成纤维细胞中可溶性细胞成分,其负责在角膜损伤后观察到的细胞雾度。大多数所鉴定的蛋白质是来自其他组织的其他非透明性纤维细胞。在角膜成纤维细胞中涉及氧化应激防御,蛋白质折叠和降解的多种蛋白质的发现是提出氧化应激诱导的蛋白质展开的基础,可以参与来自这种角蛋白酶表型的光的反向散射。在这方面,应该注意的是,由于镜片蛋白质的氧化和光散射,高分子肿块蛋白质聚集体,氧化应激应该知道导致白内障,高分子肿块蛋白质聚集体(
      • 娄M.F.
      镜片中的氧化还原调节..
      )。因此,在伤口愈合期间的角膜细胞雾度的发展可以以某种方式使晶体透镜中的氧化应激诱导的不透明度的发育中的开发。需要进一步的研究来探索这个假设。

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