赖氨酸琥珀酸底物和琥珀酰化调节酶COBB的鉴定 大肠杆菌*

  • Gozde Colak.
    脚注
    隶属关系
    本5月芝加哥大学芝加哥大学癌症研究部60637;
    搜索本作者的文章
  • 中宇谢
    脚注
    隶属关系
    本5月芝加哥大学芝加哥大学癌症研究部60637;
    搜索本作者的文章
  • Anita Y.Zhu.
    脚注
    隶属关系
    康奈尔大学化学与化学生物学系,纽约伊萨卡,伊萨卡14853;化学蛋白质组学中心和
    搜索本作者的文章
  • Lunzhi戴
    隶属关系
    本5月芝加哥大学芝加哥大学癌症研究部60637;
    搜索本作者的文章
  • 吉·鲁
    隶属关系
    本5月芝加哥大学芝加哥大学癌症研究部60637;
    搜索本作者的文章
  • 易张
    隶属关系
    中国科学院上海上海原药研究所药物研究国家重点实验室,上海,201203
    搜索本作者的文章
  • Xuelian Wan
    隶属关系
    中国科学院上海上海原药研究所药物研究国家重点实验室,上海,201203
    搜索本作者的文章
  • 岳晨
    隶属关系
    本5月芝加哥大学芝加哥大学癌症研究部60637;
    搜索本作者的文章
  • yoon h. cha.
    隶属关系
    康奈尔大学化学与化学生物学系,纽约伊萨卡,伊萨卡14853;化学蛋白质组学中心和
    搜索本作者的文章
  • 荨麻林
    一致
    Tel.:607-255-4650,传真:607-255-1903;
    隶属关系
    康奈尔大学化学与化学生物学系,纽约伊萨卡,伊萨卡14853;化学蛋白质组学中心和
    搜索本作者的文章
  • 兴明赵
    一致
    电话:773-834-1561,传真:773-702-3701;
    隶属关系
    本5月芝加哥大学芝加哥大学癌症研究部60637;

    中国科学院上海上海原药研究所药物研究国家重点实验室,上海,201203
    搜索本作者的文章
  • Minjia Tan.
    一致
    应解决对应的通信:电话:86-21-50800172,传真:86-21-50800172;
    隶属关系
    中国科学院上海上海原药研究所药物研究国家重点实验室,上海,201203
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生研究院(GM103250,CA160036,GM098596和T32GM08500),中国科学技术部的国家科学研究(2012年ZX09301001-007),中国自然科学基金会(授予第3137081414号)和上海浦江计划(授予13PJ1410300)。
    本文含有补充材料。
    §这些作者平等为此作品贡献。
      赖氨酸琥珀酰化是一种新鉴定的蛋白质在原核和真核细胞中存在的翻译后修饰途径。然而,琥珀酸底物和调节酶仍然很大程度上是未知的,妨碍了这种改性的生物学研究。在这里,我们在782个蛋白中报告了670个蛋白质和2,803次赖氨酸乙酰化(KAC)位点的2,580个细菌赖氨酸琥珀酸位点的鉴定,代表了第一赖氨酸琥珀酰化数据集和野生型的最大KAC数据集大肠杆菌。我们响应于高葡萄糖量化赖氨酸琥珀酰化和KAC基材的动态变化。我们的数据表明,高葡萄糖条件导致更多赖氨酸 - 琥珀酰化蛋白,并增强了比Kac肽更显着的琥珀酰亚胺肽的丰富,表明葡萄糖对琥珀酰化具有比乙酰化更深刻的影响。我们进一步鉴定了COBB,一种已知的SiR 2样细菌赖氨酸脱乙酰酶,作为第一原核算法酶。作为赖氨酸的双官能酶的鉴定细菌COBB和脱乙酰化活性的双官能酶表明,真核KAC调节酶可能在具有非常不同的结构上的各种赖氨酸酰化的酶活性。此外,赖氨酸琥珀酰化可能在某些生理条件下相对于赖氨酸乙酰化具有独特且更深刻的调节作用。
      赖氨酸乙酰化(KAC)
      使用的缩写是:
      kac.
      赖氨酸乙酰化
      基因本体论
      HDAC.
      组蛋白脱乙酰酶
      H / L.
      很亮的灯光
      HPLC.
      高效液相色谱
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      ko.
      昏死
      ksucc.
      赖氨酸琥珀酰化
      多发性硬化症
      质谱
      PTM.
      翻译后修改
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      s
      suin。
      1使用的缩写是:kac.
      赖氨酸乙酰化
      基因本体论
      HDAC.
      组蛋白脱乙酰酶
      H / L.
      很亮的灯光
      HPLC.
      高效液相色谱
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      ko.
      昏死
      ksucc.
      赖氨酸琥珀酰化
      多发性硬化症
      质谱
      PTM.
      翻译后修改
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      s
      suin。
      是一种动态和进化的保守后翻译后修饰(PTM),已知参与各种细胞过程的调节(
      • 杨X.J.
      • Seto E.
      帽子和HDAC:从结构,功能和调节到新的治疗和预防策略。
      ,
      • Finkel T.
      • 邓C.X.
      • 斯多斯洛拉夫斯基r.
      SIRTUIN生物学和生理学的最新进展。
      ,
      • 芬利L.W.
      • 卡拉克省A.
      • 李杰。
      • Souza A.
      • egia a。
      • 张继夫
      • Teruya-Feldstein J.
      • 更多的ira p.i.
      • Cardoso S.M.
      • 克兰克C.B.
      • Pandolfi P.P.
      • Haigis M.C.
      SIRT3通过HIF1Alpha稳定化反对癌细胞代谢的重编程。
      ,
      • 史密斯B.C.
      • 定居B.
      • Hallows W.C.
      • Craven M.W.
      • 丹努准
      通过肽阵列和机器学习确定的SIRT3基质特异性。
      ,
      • Hebert A.S.
      • Ditenhafer-Reed K.E.
      • yu w.
      • Bailey D.J.
      • Selen E.S.
      • Boersma M.D.
      • 卡森J.J.
      • Tonelli M.
      • 气球A.J.
      • Higbee A.J.
      • Westphall M.S.
      • Pagliarini D.J.
      • Prolla T.A.
      • assadi-porter f.
      • 罗伊斯。
      • 丹努准
      • Coon J.J.
      卡路里限制和SIRT3触发线粒体蛋白乙酰胺的全球重新编程。
      ,
      • Hirschey M.D.
      • Shimazu T.
      • Huang J.Y.
      • Schwer B.
      • verdin E.
      SIRT3调节线粒体蛋白乙酰化和中间代谢。
      ,
      • 伦巴第D.B.
      • tishkoff d.x.
      • Zwaans下班
      蛋白质乙酰化的线粒体调节。
      ,
      • Starai V.J.
      • CERIC I.
      • COLE R.N.
      • Boeke J.D.
      • Escalante-Semerena J.C.
      活性赖氨酸脱乙酰化乙酰-CoA合成酶的SiR2依赖性活化。
      ,
      • 赵某。
      • 徐W.
      • 江W.
      • yu w.
      • 林Y.
      • 张T.
      • 姚杰。
      • 周L.
      • 曾Y.
      • 李H.
      • 李Y.
      • 施J.
      • W.
      • 汉考克三。
      • 秦立
      • Chin J.
      • 杨P.
      • 陈X.
      • 雷Q.
      • 熊Y.
      • 关卡。
      蛋白质赖氨酸乙酰化对细胞代谢的调节。
      )。该改性的状态由两组酶控制,其具有相反的酶活性,赖氨酸乙酰转移酶,其将乙酰基加入赖氨酸(Lys或K)残余物,以及除去乙酰基的组蛋白赖氨酸脱乙酰酶(HDAC)(
      • Shahbazian M.D.
      • 格兰斯坦M.
      特异性特异性组蛋白乙酰化和脱乙酰化的功能。
      ,
      • 罗斯S.Y.
      • 丹努准
      • Allis C.D.
      组蛋白乙酰转移酶。
      ,
      • 顾w.
      • 罗德尔r.g.
      通过P53 C-末端结构域的乙酰化激活P53序列特异性DNA结合。
      ,
      • 隆堡C.
      • 瓜迪奥拉A.
      • 邵罗。
      • kawaguchiy。
      • ITO A.
      • 尼克松A.
      • Yoshida M.
      • 王X.F.
      • 姚明。
      HDAC.6是微管相关的脱乙酰酶。
      ,
      • 史密斯B.C.
      • Hallows W.C.
      • 丹努准
      SIRTUINS的机制和分子探针。
      ,
      • Imai S.
      • 瓜伦特L.
      十年的NAD依赖性SIR2家族脱乙酰酶:对代谢疾病的影响。
      ,
      • 李克。
      • 工人J.L.
      组蛋白乙酰转移酶复合物:一种尺寸不适合所有。
      )。 HDACS分为几个类别(
      • Frye R.A.
      原核和真核siR2样蛋白的系统发育分类。
      ):I类(HDAC1,-2,-3和-8),类IIa(HDAC4,-5,-7和-9),IIB类(HDAC6和-10),III类(SIRT1-7)和第四级(HDAC11)。一些HDAC的脱乙酰化活动弱(例如 SIRT4-7和HDAC4,-5和-7-11)以及SIRT5作为度离琥珀化和脱龙化酶的演示,表明一些HDAC酶具有与乙酰化无关的活性(
      • 彭C.
      • 卢Z.
      • 谢Z.
      • 程泽。
      • 陈Y.
      • 棕褐色
      • 罗h.
      • 张Y.
      • 他w。
      • 杨克。
      • Zwaans下班
      • Tishkoff D.
      • HO L.
      • 伦巴第D.
      • 他是
      • 戴J.
      • verdin E.
      • 你们。
      • 赵玉。
      赖氨酸丙基化基材及其调控酶的第一次鉴定。
      ,
      • 杜杰克
      • 周Y.
      • 苏X.
      • yu J.J.
      • 汗科
      • 姜河
      • kim J.
      • 哇J.
      • kim j.h.
      • Choi B.H.
      • 他B.
      • 陈W.
      • 张某。
      • CERIONE R.A.
      • Auwerx J.
      • 郝Q.
      • 林H.
      SIRT5是NAD依赖性蛋白质赖氨酸脱龙酶和度琥珀酰基酶。
      )。
      长时间,将赖氨酸乙酰化被认为是蛋白质修饰,其限于核(
      • 科恩T.
      • 姚明。
      ACK-知识可逆乙酰化。
      )。细胞溶质KAC底物的鉴定和核外的一些HCACS的定位表明了赖氨酸乙酰化的非核功能(
      • 隆堡C.
      • 瓜迪奥拉A.
      • 邵罗。
      • kawaguchiy。
      • ITO A.
      • 尼克松A.
      • Yoshida M.
      • 王X.F.
      • 姚明。
      HDAC.6是微管相关的脱乙酰酶。
      ,
      • 科恩H.Y.
      • 拉莫斯。
      • Bitterman K.J.
      • he
      • imahiyerobo t.a.
      • 米勒C.
      • Frye R.
      • Ploegh H.
      • 凯斯勒光明
      • sinclair d.a.
      CBP和PCAF通过CBP和PCAF的Ku70末端的乙酰化对抗Bax介导的凋亡。
      ,
      • Michishita E.
      • 公园J.Y.
      • Burneskis J.M.
      • 巴雷特J.C.
      • 堀川I.
      进化的保守和非经受性的植物蛋白质的局部典型和功能。
      )。第一个蛋白质组学筛选鉴定了细胞溶质和线粒体级分中的数百种底物蛋白,并在线粒体蛋白和代谢酶中展示了高丰度的KAC(
      • 金S.C.
      • Sprung R.
      • 陈Y.
      • 徐Y.
      • 球H.
      • PEI J.
      • 诚龙
      • Kho Y.
      • 肖H.
      • 肖L.
      • 格兰顿N.V.
      • 白云
      • 杨X.J.
      • 赵玉。
      蛋白质组学调查显示的赖氨酸乙酰化的基材和功能多样性。
      )。该结果意味着KAC具有多种的非核作用,可以调节新陈代谢和线粒体的功能(
      • 金S.C.
      • Sprung R.
      • 陈Y.
      • 徐Y.
      • 球H.
      • PEI J.
      • 诚龙
      • Kho Y.
      • 肖H.
      • 肖L.
      • 格兰顿N.V.
      • 白云
      • 杨X.J.
      • 赵玉。
      蛋白质组学调查显示的赖氨酸乙酰化的基材和功能多样性。
      )。从那时起,我们和其他人已经广泛地表征了细胞乙酰胺(
      • Hebert A.S.
      • Ditenhafer-Reed K.E.
      • yu w.
      • Bailey D.J.
      • Selen E.S.
      • Boersma M.D.
      • 卡森J.J.
      • Tonelli M.
      • 气球A.J.
      • Higbee A.J.
      • Westphall M.S.
      • Pagliarini D.J.
      • Prolla T.A.
      • assadi-porter f.
      • 罗伊斯。
      • 丹努准
      • Coon J.J.
      卡路里限制和SIRT3触发线粒体蛋白乙酰胺的全球重新编程。
      ,
      • 赵某。
      • 徐W.
      • 江W.
      • yu w.
      • 林Y.
      • 张T.
      • 姚杰。
      • 周L.
      • 曾Y.
      • 李H.
      • 李Y.
      • 施J.
      • W.
      • 汉考克三。
      • 秦立
      • Chin J.
      • 杨P.
      • 陈X.
      • 雷Q.
      • 熊Y.
      • 关卡。
      蛋白质赖氨酸乙酰化对细胞代谢的调节。
      ,
      • 陈Y.
      • 赵W.
      • 杨杰斯。
      • 程泽。
      • 罗h.
      • 卢Z.
      • 棕褐色
      • 顾w.
      • 赵玉。
      定量乙酰胺分析显示SIRT1在调节不同底物和细胞途径方面的作用。
      ,
      • C.
      • Kumar C.
      • GNAD F.
      • Nielsen M.L.
      • rehman m.
      • Walther T.C.
      • 奥尔森J.V.
      赖氨酸乙酰化靶标复合物并共调节主要细胞功能。
      ,
      • 张克。
      • 郑S.
      • 杨杰斯。
      • 陈Y.
      • 程泽。
      综合分析蛋白质赖氨酸乙酰化 大肠杆菌.
      )。
      赖氨酸琥珀酰化(KSUCC)和赖氨酸丙基化途径是两种PTM途径,最近在细菌和哺乳动物细胞中鉴定并综合验证,鉴定了多种底物蛋白,使用HPLC-MS / MS,合成肽的共洗,同位素标记,使用泛抗KSUCC抗体和蛋白质组学分析的Western印迹分析(
      • 彭C.
      • 卢Z.
      • 谢Z.
      • 程泽。
      • 陈Y.
      • 棕褐色
      • 罗h.
      • 张Y.
      • 他w。
      • 杨克。
      • Zwaans下班
      • Tishkoff D.
      • HO L.
      • 伦巴第D.
      • 他是
      • 戴J.
      • verdin E.
      • 你们。
      • 赵玉。
      赖氨酸丙基化基材及其调控酶的第一次鉴定。
      ,
      • 张Z.
      • 棕褐色
      • 谢Z.
      • 戴L.
      • 陈Y.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酸鉴定为新的翻译后修饰。
      )。我们还表明,KSUCC存在于核心组粒中(
      • 谢Z.
      • 戴J.
      • 戴L.
      • 棕褐色
      • 程泽。
      • 吴y.
      • Boeke J.D.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酰化和组蛋白的赖氨酸丙基化。
      )。在酵母组蛋白中,一些KSUCC位点位于组蛋白与DNA保持密切接触的区域中,表明KSUCC位点可以通过改变染色质结构来参与基因调节(
      • 谢Z.
      • 戴J.
      • 戴L.
      • 棕褐色
      • 程泽。
      • 吴y.
      • Boeke J.D.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酰化和组蛋白的赖氨酸丙基化。
      )。然后,我们发现SIRT5是III类HDAC系列的成员可以作为度离酶化酶活性 体外体内 (
      • 彭C.
      • 卢Z.
      • 谢Z.
      • 程泽。
      • 陈Y.
      • 棕褐色
      • 罗h.
      • 张Y.
      • 他w。
      • 杨克。
      • Zwaans下班
      • Tishkoff D.
      • HO L.
      • 伦巴第D.
      • 他是
      • 戴J.
      • verdin E.
      • 你们。
      • 赵玉。
      赖氨酸丙基化基材及其调控酶的第一次鉴定。
      ,
      • 杜杰克
      • 周Y.
      • 苏X.
      • yu J.J.
      • 汗科
      • 姜河
      • kim J.
      • 哇J.
      • kim j.h.
      • Choi B.H.
      • 他B.
      • 陈W.
      • 张某。
      • CERIONE R.A.
      • Auwerx J.
      • 郝Q.
      • 林H.
      SIRT5是NAD依赖性蛋白质赖氨酸脱龙酶和度琥珀酰基酶。
      )。在最近的一项研究中,我们揭示了SIRT5是KSUCC的关键调节酶,并且KSUCC蛋白在一组线粒体酶中丰富,主要涉及脂肪酸代谢,氨基酸降解和三羧酸循环(
      • 公园J.
      • 陈Y.
      • tishkoff d.x.
      • 彭C.
      • 棕褐色
      • 戴L.
      • 谢Z.
      • 张Y.
      • Zwaans下班
      • Skinner M.E.
      • 伦巴第D.B.
      • 赵玉。
      SIRT5介导的赖氨酸Desuccinylation影响不同的代谢途径。
      )。重要的是,Ksucc不仅在哺乳动物细胞中非常动态,而且在细菌中是非常动态的(
      • 张Z.
      • 棕褐色
      • 谢Z.
      • 戴L.
      • 陈Y.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酸鉴定为新的翻译后修饰。
      ,
      • 谢Z.
      • 戴J.
      • 戴L.
      • 棕褐色
      • 程泽。
      • 吴y.
      • Boeke J.D.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酰化和组蛋白的赖氨酸丙基化。
      )。这些证据界面强烈表明赖氨酸琥珀酰化可能在细胞功能调节中是重要的PTM。
      尽管哺乳动物细胞中鉴定了KSUCC途径的关键要素,但细菌中的对应物仍然很大程度上。我们和其他人使用了蛋白质组学方法来鉴定细菌中的KAC底物(
      • 张克。
      • 郑S.
      • 杨杰斯。
      • 陈Y.
      • 程泽。
      综合分析蛋白质赖氨酸乙酰化 大肠杆菌.
      ,
      • 张继夫
      • Sprung R.
      • PEI J.
      • 棕褐色X.
      • 金斯。
      • 朱H.
      • 刘C.F.
      • 格兰顿N.V.
      • 赵玉。
      赖氨酸乙酰化是一种高度丰富和进化的改变的改性 大肠杆菌.
      ,
      • 王Q.
      • 张Y.
      • 杨C.
      • 熊H.
      • 林Y.
      • 姚杰。
      • 李H.
      • 谢L.
      • 赵W.
      • 姚y。
      • Z.B.
      • 曾R.
      • 熊Y.
      • 关卡。
      • 赵某。
      • 赵G.P.
      代谢酶的乙酰化坐标坐标碳源利用和代谢助焊剂。
      ,
      • Weinert B.T.
      • Iesmantavicius V.
      • 瓦格纳S.A.
      • SchölzC.
      • Gammesson B.
      • Beli P.
      • nyströmt。
      • C.R.
      '乙酰磷酸酯是赖氨酸乙酰化的关键决定因素 大肠杆菌。'。
      )。 SiR2样酶COBB是细菌中最佳研究的蛋白质脱乙酰酶(
      • Starai V.J.
      • CERIC I.
      • COLE R.N.
      • Boeke J.D.
      • Escalante-Semerena J.C.
      活性赖氨酸脱乙酰化乙酰-CoA合成酶的SiR2依赖性活化。
      )。最初将COBB鉴定为活化乙酰-CoA合成酶所需的酶(
      • Starai V.J.
      • CERIC I.
      • COLE R.N.
      • Boeke J.D.
      • Escalante-Semerena J.C.
      活性赖氨酸脱乙酰化乙酰-CoA合成酶的SiR2依赖性活化。
      )。最近,Cobb显示在细菌能量代谢中发挥作用(
      • 王Q.
      • 张Y.
      • 杨C.
      • 熊H.
      • 林Y.
      • 姚杰。
      • 李H.
      • 谢L.
      • 赵W.
      • 姚y。
      • Z.B.
      • 曾R.
      • 熊Y.
      • 关卡。
      • 赵某。
      • 赵G.P.
      代谢酶的乙酰化坐标坐标碳源利用和代谢助焊剂。
      )和压力反应(
      • 马Q.
      • 木头t.k.
      原核生物中的蛋白质乙酰化增加了应力阻力。
      )。这些研究表明,KAC是一种进化的PTM,具有在原核生物中能量代谢中的作用。然而,尚未研究细菌中赖氨酸乙酰化的动态变化。另外,赖氨酸琥珀酰化和其调节酶的底物不知道。
      在本文中,我们报告了基于细胞培养物(Silac)中的氨基酸稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法,以鉴定和定量细菌赖氨酸琥珀酰化的变化,以及葡萄糖,葡萄糖,主要能量源。我们的筛选在782个蛋白中检测到670个蛋白质和2,803 kac位点的2,580个赖氨酸 - 琥珀酰化位点 大肠杆菌。我们的定量蛋白质组学数据显示,葡萄糖对KSUCC产生了更深刻的影响而不是KAC。此外,我们发现COBB,已知的原核脱乙酰化酶具有双酶活性,以催化从改性赖氨酸残基中除去两种结构不同的赖氨酸酰基,乙酰基和琥珀酰基。

      材料和方法

       材料

      大肠杆菌 菌株MG1655和AT713是从耶鲁大学(新避风港,CT)的大肠杆菌遗传股票中心获得,而BL21(DE3)是从诺拉格(Millipore Corporation,Billerica,MA)获得的。 M9最小盐,同位素标记的赖氨酸(l-Lysine-13C6,15N2 盐酸盐)和精氨酸(l-Arginine-13C6,15N4 盐酸盐和其他化学物质被购买为Sigma-Aldrich,Inc。的高纯度或分析级别。(圣路易斯,MO)。修饰的测序级胰蛋白酶是从Promega(麦迪逊,Wi)购买的。 C18 Ziptips购自Millipore Corporation(Billerica,MA)。从Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)获得MS级水和乙腈。泛抗乙酰氰基和抗琥珀酰基抗体购自PTM Biolabs,Inc。(芝加哥,IL)。

      大肠杆菌 Cell Culture

      大肠杆菌 将细胞在M9培养基中培养(补充在100mg / L的20个氨基酸中的每一个,或补充有0.8%丙酮酸,0.8%琥珀酸盐或0.8%葡萄糖的M9培养基。将细胞收获,裂解和Western用针对乙酰氰基或琥珀酰基的PAN-抗体呈印迹。 Coomassie蓝色染色用于装载控制。

      硅胶标签

      接种300ml M9生长培养基(补充有20个氨基酸中的每种氨基酸)用 大肠杆菌 (菌株AT713)培养并生长过夜。收获细胞的时候 A600 达到0.8。将细胞粒料用M9培养基洗涤两次,随后转移到含有轻赖氨酸的M9培养基中( 12C614N2 Lys) and arginine (12C614N4 arg),没有含重赖氨酸的葡萄糖或m9培养基(13C615N2 Lys) and arginine (13C615N4 Arg)和0.8%葡萄糖。将细胞在旋转振荡器(225rpm)上在37℃下在旋转振荡器(225rpm)中孵育约5小时,并在指数相期间收获,具有相当的OD值。在蛋白质组学实验之前通过质谱法测定的重质介质细胞的标记效率大于98%。

      蛋白质裂解物,HPLC分级和胰蛋白酶的制备

      大肠杆菌 通过2,000离心收获细胞g 在4°C下10分钟。用冰冷的PBS洗涤颗粒两次。将细胞重新悬浮在冰冷的网管缓冲液中(100米m NaCl, 20 mm Tris-Cl,pH 8.0,0.5米m EDTA和0.5%Nonidet P-40),并在1分钟间隔下冷却5分钟。等量的蛋白质裂解物 大肠杆菌 在重的沉重(13C615N2 Lys和 13C615N4 arg)媒体或光(12C614N2 Lys和 12C614N4 arg)培养基混合(每毫克)。将混合物以100,000离心g 10分钟。除去上清液并在混合床离子交换柱(Polycat / Wax(250×21.2mm),Polylc,Inc。)中分离并使用发现VP制备型HPLC系统(Shimadzu,Kyoto,Japan)。使用从0%至100%缓冲液B的盐梯度分离蛋白质分离成62个级分(10μmm MES, 800 mm 缓冲液中的NaCl,pH6.0)(10米m MES, pH 6.0, 50 mm NaCl)以16mL / min的流速在4℃下。合并相邻的级分,最后组合成10个最终级分。通过使用10%三氯乙酸(最终体积)和1%脱氧胆酸钠(终浓度)来沉淀各部分。收集蛋白质粒料,用冰冷的丙酮洗涤两次,然后如前所述进行胰蛋白酶消化(
      • 金S.C.
      • Sprung R.
      • 陈Y.
      • 徐Y.
      • 球H.
      • PEI J.
      • 诚龙
      • Kho Y.
      • 肖H.
      • 肖L.
      • 格兰顿N.V.
      • 白云
      • 杨X.J.
      • 赵玉。
      蛋白质组学调查显示的赖氨酸乙酰化的基材和功能多样性。
      )。

      含有Ksucc或Kac肽的肽的连续亲和力富集

      使用先前描述的方法顺序富集含有Ksucc或Kac(以下称为Ksucc肽和Kac肽的肽)(
      • 金S.C.
      • Sprung R.
      • 陈Y.
      • 徐Y.
      • 球H.
      • PEI J.
      • 诚龙
      • Kho Y.
      • 肖H.
      • 肖L.
      • 格兰顿N.V.
      • 白云
      • 杨X.J.
      • 赵玉。
      蛋白质组学调查显示的赖氨酸乙酰化的基材和功能多样性。
      )。简而言之,将来自每个HPLC级分的胰蛋白酶肽在100米中溶解m NH4HCO3 (ph 8.0)。将样品以50,000离心g 10分钟除去不溶性颗粒。通过在室温下在室温下孵育与抗琥珀酰亚胺或抗乙酰氰基抗体(PTM Biolabs Inc.,芝加哥,IL)在室温下温育4小时,通过将具有20-40μl琼脂糖珠抗体(PTM Biolabs Inc.)的蛋白质温度孵育,进行亲和力纯化。用NetN缓冲液洗涤珠子三次,用EtN缓冲液两次(50米 m TRIS-CL,pH 8.0,100米m NaCl, 1 mm EDTA),一次用水。用0.1%三氟乙酸从珠粒中洗脱富集的KSUCC肽。在KSUCC肽富集之后,使用抗KAC抗体进一步富集KAC肽的残余上清液,类似于最近报道的方法(
      • Mertins P.
      • 乔J.W.
      • Patel J.
      • Udeshi N.D.
      • 克劳瑟K.R.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.W.
      • Gillette M.A.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
      )。在纳米HPLC-MS / MS分析之前,在SpeedVAc中干燥洗脱的KSUCC和KAC肽。

      纳米HPLC-MS / MS分析

      使用OMIX C18提示(安捷伦技术,Santa Clara,Ca)脱盐分馏分并溶解在溶剂A中(水中0.1%甲酸)。然后将样品注入手动填充的反相C12柱(100mm×75μm,4μm粒度,现象,St. Torrance,CA)上,连接到Eksigent Nanolc-1d加上HPLC系统(AB Sciex,Framingham,嘛)。肽在溶剂A中从5%至80%溶剂B(0.1%甲酸中)在溶剂A中洗脱,以2-H梯度为200nl / min的流速。通过纳米涂布离子源直接将分析物直接电离并喷洒到LTQ orbitrap Velos质谱仪中。质谱分析在数据依赖性模式下进行,在使用傅立叶图中使用傅立叶变换MS和使用碰撞引起的双线性离子阱中的碰撞诱导的解离MS / MS扫描之间的全MS扫描之间的自动切换。全文谱带 m/z 收购了350至1500的范围,分辨率为60,000 m/z = 400在配置文件模式中。锁匠at. m/z 445.120024已启用全文分析。每个全文谱中的20个最强烈的离子依次分离MS / MS碎片,其归一化碰撞能量为35%。从MS / MS碎片中排除了单电荷或多以上电荷的离子。动态排除持续时间设置为36秒,重复计数为2,排除窗口设置为参考物质的0.01%。

      基于Silac的数据处理和分析

      已获取的MS原始数据以MaxQuant软件(1.0.13.13)处理(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )和吉祥物软件(版本2.1)(
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库来搜索基于概率的蛋白质识别。
      )。 MaxQuant软件产生了Peaklist生成,前体质量重新校准,氧化硅对提取和氧化硅比计算。将胰蛋白酶指定为切割酶,并且将错过的裂解的最大数量设定为2.甲硫氨酸氧化和蛋白质N-末端乙酰化被规定为可变修饰,并且通过碘乙酰胺的半胱氨酸烷基化被规定为所有数据库搜索的固定改造。进行了三组数据分析:(1)硅胶被选为“双峰”和 13C615N2 - , 13C615N4-Arg,并将赖氨酸琥珀酰化(或乙酰化)特定为可变的改性,以获得可量化的赖氨酸琥珀酰化(或乙酰化)现场信息(Silac对搜索); (2)Silac被选为“单身” 13C615N4-arg指定为固定修改和 13C615N2而且 13C615N2 - 将琥珀酰化(或乙酰化)指定为可变修饰,以鉴定在重型介质中生长的细胞的赖氨酸琥珀酰化(或乙酰化)位点(仅限唯一搜索); (3)被选择为“单体”作为“单体”,其具有指定为可变改性的赖氨酸琥珀酰化(或乙酰化),以鉴定在光介质中生长的细胞的赖氨酸琥珀酰化(或乙酰化)位点(仅光搜索)。使用吉祥物对NCBI Refseq进行数据库搜索 大肠杆菌 str。 K-12 Substr。 DH10B蛋白质序列数据库与逆转的诱饵数据库(在前向数据库中的4,128个序列,包括普通污染物),其初始前体容差为7ppm和0.5da的片段质量偏差。所有这三套吉祥物搜索结果都是通过MaxQuant进一步处理的。蛋白质,肽和修饰位点的假发现率阈值固定为0.01。 MaxQuant软件组装肽/蛋白质基团并计算出错误的发现率和氧化硅酸量化比率。在生物信息学分析之前除去具有低于20或C-末端肽修饰的造型肽的染色肽。通过使用如前报道的标准进行手动检查选择性验证鉴定的肽(
      • 陈Y.
      • kwon s.w.
      • 金S.C.
      • 赵玉。
      用串联质谱进行蛋白质序列数据库鉴定的肽的手动评估综合方法。
      )确保质谱数据分析的最高串行性。

      赖氨酸琥珀酰化和赖氨酸乙酰化基材的基序分析

      所有识别的KSUCC(或KAC)基材 大肠杆菌 用于分析用icelogo软件(版本1.2)的赖氨酸琥珀酸(或乙酰化)位点的侧翼序列(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )。选择修饰位点的六个相邻的氨基酸残基作为阳性组。嵌入式瑞士人“大肠杆菌 (菌株K12)“用作负组。

      功能丰富分析

      大卫 (
      • 黄达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      生物信息学富集工具:大型基因清单综合功能分析的路径。
      )用于对基因本体学(GO)生物过程的所有KSUCC蛋白的功能性富集分析,分子功能(
      • ashburner m.
      • 球C.A.
      • 布莱克J.A.
      • Botstein D.
      • 巴特勒H.
      • 樱桃准晚
      • 戴维斯A.P.
      • Dolinski K.
      • 德怀特S.S.
      • EPPIG J.T.
      • 哈里斯M.A.
      • 山D.P.
      • ISSEL-TARVER L.
      • Kasarskis A.
      • 刘易斯S.
      • Matese J.C.
      • Richardson J.E.
      • Ringwald M.
      • 鲁宾上午
      • Sherlock G.
      基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
      ),基因和基因组(Kegg)代谢途径的京都百科全书(
      • Kanehisa M.
      • goto s.
      Kegg:Kyoto Encyclopedia的基因和基因组。
      )和pfam功能域(
      • 芬恩r.d.
      • 泰特J.
      • 朦胧J.
      • Coggill P.C.
      • Sammut S.J.
      • Hotz H.R.
      • CERIC G.
      • Forslund K.
      • 艾迪S.R.
      • Sonnhammer E.L.
      • Bateman A.
      PFAM蛋白质家族数据库。
      )。总数 大肠杆菌 基因组信息被用作背景。在此分析中选择了David的所有数据库。 Benjamini(调整 p 价值)截止为0.05来控制家庭宽的假发现率。

      蛋白质 - 蛋白质相互作用网络分析

      字符串数据库(版本9.05)用于富集分析 大肠杆菌 KSUCC蛋白质 - 蛋白质互动网络(
      • Jensen L.J.
      • Kuhn M.
      • 斯塔克米
      • Chaffrons。
      • CREEVEY C.
      • Muller J.
      • Doerks T.
      • 朱利安P.
      • 罗斯A.
      • Simonovic M.
      • Bork P.
      • von mering c.
      String 8-蛋白质的全球视图及其在630个生物中的功能相互作用。
      )。只有高信任互动(得分>7)在琥珀酰化的蛋白质和高置信蛋白之间(得分>0.7)在字符串数据库中获取分析。 MCode插件工具包用于识别高度连接的群集,并且通过Cytoscape软件(3.0.1版)可视化交互网络(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      )。

      HPLC.测定和COBB的动力学

      通过量化改性和未改性量的组蛋白H3 K9肽,用HPLC测定COBB的活性。反应混合物含有20米m Tris (pH 8.0), 100 mm NaCl, 1 mm DTT, 50 μm 组蛋白H3 K9乙酰化或琥珀酰化肽(
      • 杜杰克
      • 周Y.
      • 苏X.
      • yu J.J.
      • 汗科
      • 姜河
      • kim J.
      • 哇J.
      • kim j.h.
      • Choi B.H.
      • 他B.
      • 陈W.
      • 张某。
      • CERIONE R.A.
      • Auwerx J.
      • 郝Q.
      • 林H.
      SIRT5是NAD依赖性蛋白质赖氨酸脱龙酶和度琥珀酰基酶。
      ), 1 mm NAD+,0.5μm COBB并在37℃下孵育1小时。用1体积的10%(v / v)三氟酸乙酸淬灭反应,并在18,000℃下旋转10分钟g (Beckman Coulter Microfuge)将酶与反应分离。然后通过HPLC分析上清液。确定 kkm. 值,HPLC用于量化以各种浓度的乙酰化或琥珀酰化H3 K9形成的产物的量。用于H3 K9乙酰肽的肽浓度为5,8,10,12,16,32,40,67和268μmm,对于H3 K9琥珀酰基浓度为2,3,4,6,8,12,16,24,32和128μm,具有1分钟(乙酰基)或2分钟(琥珀酰)的野生型COBB的孵育时间,3分钟用于突变版的脱乙酰化。然后通过HPLC使用反相分析柱(KINETEX XB-C18,100,75×4.60mm,2.6μm,现象,现象)分析淬火反应,在0.5ml /中超过20分钟的0%-70%B梯度。闵。产品峰值和基材峰均均量化并转化为初始速率,然后将其绘制抗改性肽浓度并使用kaleidaGraph程序配合。

      野生型COBB和COBB变体的克隆,表达和纯化

      野生型COBB基因是PCR扩增的 大肠杆菌 使用BamHI和XHOI限制性位点,BL21(DE3)并克隆到PET-28a(+)载体中。然后引入COBB表达载体 大肠杆菌 BL21还包含PRARE2以增加罕见TRNA的表达。通过将含有卡那霉素(50μg/ ml)和氯霉素(20μg/ ml)的LB平板上的细胞镀在含有Kanamycin(20μg/ ml)的LB平板上选择成功的转化体。在37℃下选择并在LB中选择并在LB中生长氯霉素(20μg/ ml)过夜,过夜。第二天将细胞转移(1:1,000稀释,v / v)分为2L磅的Kanamycin(50μg/ ml)和氯霉素(20μg/ ml)。用500μm诱导细胞m isopropyl-β-d-1-硫代酰甲酸酐 A600 在15°C下生长0.6并生长过夜。通过在7,330的离心中收获细胞g 在4°C(Beckman Coulter冷藏地板离心机)并通过乳蛋白酶-C3 Cell破坏者(Avestin,Inc.,Ottawa,Ontario,加拿大)通过了10分钟三次。通过在29,300处离心除去细胞碎片g 在4°C(Beckman Coulter)的30分钟。然后使用重力 - 流动Ni - 亲和层析(Sigma)纯化COBB蛋白,并透析含有25米的缓冲液中m Tris pH 8.0, 150 mm NaCl, 1 mm DTT,10%(v / v)甘油。然后将蛋白质等分并在-80℃下保持冷冻。通过PCR位点定向诱变进行COBB,Y92F和R95M的活性位点和催化变体,并以与野生型COBB相同的方式表达和纯化。

      野生型COBB和COBB淘汰大肠杆菌KAC和KSUCC的Western印迹分析

      过夜型野生型和COBB淘汰赛的培养物 大肠杆菌 (AT713)用于单独接种在0.1mg / L的0.1mg / L的氨基酸中分别接种M9培养基,有或没有不同的碳源(开始 A600 <0.1)。将细胞在37℃下持续16小时,连续摇动(A600 = 1.0至1.8),然后收获细胞并裂解蛋白质印迹分析。

      结果

       大肠杆菌赖氨酸琥珀叶植物的定量分析

      我们以前的研究表明,在真核和细菌细胞中存在KSUCC,并且KSUCC是动态的 大肠杆菌 在不同的压力和能源条件下(
      • 张Z.
      • 棕褐色
      • 谢Z.
      • 戴L.
      • 陈Y.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酸鉴定为新的翻译后修饰。
      )。评估KSUCC的动态 大肠杆菌,我们生长了 大肠杆菌 通过补充细菌能量代谢的三个关键代谢中间体的细胞:葡萄糖,丙酮酸和琥珀酸盐。我们对蛋白质裂解物进行了蛋白质印迹分析 大肠杆菌 在最小的M9培养基中生长,无论是没有额外的碳源还是用丙酮酸,琥珀酸或葡萄糖处理(Fig. 1)。有趣的是,这些代谢中间体刺激了赖氨酸琥珀酰化的显着增加。尽管代谢中间体调节赖氨酸琥珀酰化的机制仍然是未知的,但我们的数据表明化合物与赖氨酸琥珀酰化途径之间可能的联系 大肠杆菌。因为葡萄糖是关键的能源 大肠杆菌,我们选择低葡萄糖,作为后续实验的两个实验条件。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1动态 大肠杆菌 赖氨酸琥珀酰化响应于不同的碳源。 将细胞在M9最小培养基或M9培养基中生长,其补充有0.8%丙酮酸,0.8%琥珀酸盐或0.8%葡萄糖。左:制备蛋白质裂解物并用泛抗Ksucc抗体呈涂抹。右:SDS-PAGE凝胶用胶体蓝色染色作为装载控制。
      赖氨酸琥珀酰化基材的鉴定是朝向该途径的分子表征的关键步骤。为此,我们在涉及硅胶的不同葡萄糖浓度下对赖氨酸琥珀酰化基材进行定量蛋白质组学分析,琥珀酰亚胺肽的亲和富集,HPLC-MS / MS分析(Fig. 2A)。 大肠杆菌 细胞在重培养基中生长(重赖氨酸(13C615N2 lys)和重度精氨酸(13C615N4 Arg))补充有0.8%葡萄糖或光培养基(赖氨酸(12C614N2)和精氨酸(12C614N4 arg))没有额外的葡萄糖。在标记后,将来自每组细胞的蛋白质裂解物在1:1的比例(w / w)下混合,使用离子交换色谱法分离,然后胰蛋白酶消化。使用与泛抗琥珀酰基抗体缀合的琼脂糖珠粒进行KSUCC肽的亲和力富集。通过纳米-HPLC-MS / MS分析富集的肽。通过MaxQuant和吉祥物软件处理和分析所获得的质谱数据,以鉴定KSUCC肽并在两组细胞中量化它们的相对丰度。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2定量蛋白质组学 大肠杆菌 赖氨酸琥珀酰化。 A,流程图显示定量蛋白质组学研究的实验程序。 大肠杆菌 细胞在M9最小培养基中生长,没有葡萄糖(左)或0.8%葡萄糖(右)。将来自每组细胞的蛋白质裂解物同等地组合,然后通过离子交换HPLC分离成10分。用胰蛋白酶消化级分并使用泛抗Ksucc抗体富含免疫沉淀。通过纳米-HPLC-MS / MS分析分离的KSUCC肽。 B,Venn图表明唯一的重量(〜85%),仅光(〜0.6%)和重叠(〜14%)赖氨酸琥珀酰化位点。 C,饼图显示每种蛋白质的赖氨酸 - 琥珀酰化位点的总数。 D,icelogo软件生成的赖氨酸 - 琥珀酰化位点的序列图。
      我们使用了1%的假恢复率作为肽和蛋白质鉴定的截止标准。此外,我们除以吉祥物离子得分低于20,以确保高质量的肽鉴定。使用这些标准,我们在670蛋白中鉴定了2,580个赖氨酸 - 琥珀酰化位点 大肠杆菌 (补充表S1A-S1C)。在KSUCC富集的样品中,我们确定了1,510个独特的未修饰的肽。 KSUCC免疫沉淀样品中KSUCC肽的百分比为63.1%(2,580 ksucc肽 相对 1,510个未修饰的肽),表明我们的富集方法的高效率和高质量的抗KSUCC抗体。我们早期研究KSUCC底物的小规模分析鉴定了14 ksucc蛋白 大肠杆菌 (
      • 张Z.
      • 棕褐色
      • 谢Z.
      • 戴L.
      • 陈Y.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酸鉴定为新的翻译后修饰。
      )。这些底物均在此鉴定,提供良好的阳性对照。
      在所有ksucc位点,365个样品种植的细胞中存在(Fig. 2B)。有趣的是,仅在高葡萄糖介质生长的重标记的细胞中检测到2,199个kSucc位点。只有只有KSUCC肽的琥珀杂物肽(2,589个位点的2,199个)占85%,这代表了两个生长条件之间的明显动态差异。
      在670 ksucc蛋白质底物中,39%仅在一个位点浆化,而11%在10个或更多位点进行修饰(Fig. 2C)。最重琥珀酰化的蛋白质包括分子伴伴者DNAK(28位点),伸长因子G(28位点),丙酮酸甲酸甲酸甲酸酯I(24位点),30s核糖体蛋白S1(21位点)和磷酸甘油蛋白酶(21位点)(21个位点)。
      为了评估ksucc位点的潜在衬底主题,我们分析了Ksucc位点的侧翼序列 大肠杆菌 (Fig. 2D)使用iCeloGo算法。该分析表明,谷氨酸残基在克苏氏菌位点周围的地区持续多重,而丝氨酸(Ser)残基被呈现。除了谷氨酸残基外,丙氨酸残基也覆盖在KSUCC位点周围的-4至+3位。

      糖尿膜响应葡萄糖的动态

      在生长条件之间重叠的所有KSUCC网站中,通过MaxQuant软件可以量化324(所有KSUCC站点的〜12%)(补充表S1d.)。我们检测了相对于无葡萄糖培养基(光)的高葡萄糖培养基(重)中量化的KSUCc位点的变化。量化的KSUCC位点的平均硅酸含量重/灯(H / L)比例为15.60,中位数H / L比为12.04。在324个可量化的KSUCC位点,响应于高葡萄糖(〜90%)的丰度增加至少4倍(图。 3.A3B)。该结果表明KSUCC通过葡萄糖显着增强。鉴于仅在高葡萄糖中生长的细胞中存在85%的琥珀叶(2,199个位点),赖氨酸琥珀酰化的一般增加比量化的KSUCC位点的结果更显着。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3赖氨酸 - 琥珀酰化肽的氧化硅比(H / L)的分布。 A,散点图显示肽强度(IE。 与响应于高葡萄糖的动态变化相对于它们的动态变化而言,从最小的赖氨酸 - 琥珀酰化肽的每种肽的总体前体离子强度衍生于可量化的赖氨酸 - 琥珀酰化肽。 KSUCC比率(H / L):来自高葡萄糖培养基(重)的MS信号强度除以来自无葡萄糖介质(光)。绿色:-1≤hog2 比率(h / l)≤1;红色:1≤Log2 比率(h / l)≤4.5;黄色:4.5≤Log2 比率(h / l)≤8。 B,表明相对于无葡萄糖(光)培养基的高葡萄糖(重)中Ksucc位点的分布的直方图。这 y-axis表示每个类别中的Ksucc肽数。
      我们接下来分析了由相同蛋白质产生的改性肽的氧化硅比的范围。分布 大肠杆菌 用两种以上可量化的KSUCC位点鉴定的蛋白质显示在 补充图。S1。相同蛋白质中的KSUCC位点的折叠变化范围为1.0至11.4,表明同一蛋白质中不同位点的琥珀酰化水平因蛋白质而异。
      我们修改了先前报告的算法(
      • 奥尔森J.V.
      • vermeulen M.
      • 桑塔马里亚A.
      • Kumar C.
      • 米勒M.L.
      • Jensen L.J.
      • GNAD F.
      • Cox J.
      • Jensen T.S.
      • nigg e.a.
      • 布鲁纳克斯。
      定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
      )估计重和光细胞中赖氨酸琥珀酰化位点的绝对化学计量。该计算基于KSUCC位点的氧化硅比和相应未改性肽和蛋白质的MS强度数据(有关详细信息,请参阅 补充材料和方法 关于赖氨酸琥珀酸和乙酰化位点的绝对化学计量估计的部分。在这些标准之后,我们能够在无葡萄糖和高葡萄糖条件下计算三个KSUCC位点的绝对化学测定剂:膜结合ATP合酶的F1扇区的α亚基的K188,丙酮酸丙酸酯的K162和K45的K162 30s核糖体亚基蛋白S2(补充表S1E)。在无血糖条件下,这三个kSucc位点的化学谱分别为0.14%,0.41%和1.00%。在高葡萄糖条件下,这三个ksucc位点的化学谱分别增加到2.58%,10.20%和33.55%。

      赖氨酸琥珀叶绿素的功能注释分析

      要了解赖氨酸琥珀酰化途径的可能作用,我们使用KEGG进行了富集分析(
      • Mertins P.
      • 乔J.W.
      • Patel J.
      • Udeshi N.D.
      • 克劳瑟K.R.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.W.
      • Gillette M.A.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
      ), 走 (
      • ashburner m.
      • 球C.A.
      • 布莱克J.A.
      • Botstein D.
      • 巴特勒H.
      • 樱桃准晚
      • 戴维斯A.P.
      • Dolinski K.
      • 德怀特S.S.
      • EPPIG J.T.
      • 哈里斯M.A.
      • 山D.P.
      • ISSEL-TARVER L.
      • Kasarskis A.
      • 刘易斯S.
      • Matese J.C.
      • Richardson J.E.
      • Ringwald M.
      • 鲁宾上午
      • Sherlock G.
      基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
      )和pfam数据库(
      • 芬恩r.d.
      • 泰特J.
      • 朦胧J.
      • Coggill P.C.
      • Sammut S.J.
      • Hotz H.R.
      • CERIC G.
      • Forslund K.
      • 艾迪S.R.
      • Sonnhammer E.L.
      • Bateman A.
      PFAM蛋白质家族数据库。
      )。在Kegg代谢途径分析中,前三名富含赖氨酸 - 琥珀酰化基材的类别是核糖体,嘌呤代谢和氨基酰基-TRNA生物合成(Fig. 4A, 补充表S2)。展示了前10个富集的代谢途径的图示 补充图S2A-S2J..
      图缩略图GR4.
      Fig. 4赖氨酸琥珀叶绿素的功能诠释。 A,Kegg裂解蛋白质的Kegg路径分析。 B,用于生物过程(顶面板),分子函数(中间板)和PFAM域(底部面板)的KSUCC网站的代表性的逐个注释。
      我们的分析(辅助表S3A-S3C)显示KSUCC基材主要富集蛋白质表达代谢,在翻译中具有特异性富集(adj p = 1.94 × 10−69),细胞氨基酸代谢(adj p = 2.94 × 10−32)和基因表达(adj p = 2.26 × 10−22)(Fig. 4B,上图)。赖氨酸琥珀酰化基材的分子函数包括核糖体的结构成分(adj p = 1.56 × 10−56)和trna结合(adj p = 2.06 × 10−10)(Fig. 4B,中间板)。有趣的是,PFAM结构域分析显示,富含赖氨酸 - 琥珀酰化的底物与GTP-EFTU结构域富含,其结合并将氨基酰基-TRNA递送至核糖体的部位(
      • Agirrezabala X.
      • 弗兰克J.
      翻译中的伸长率作为核糖体,TRNA和伸长因子EF-G和EF-TU之间的动态相互作用。
      )(补充表S4)。因此,Kegg途径,GO注释和PFAM结构域分析表明赖氨酸琥珀酰化基质与核糖体和蛋白质表达/翻译事件相关。

      大肠杆菌中赖氨酸琥珀酸底物的蛋白质相互作用网络

      蛋白质 - 蛋白质相互作用对细胞生理学的功能和调节至关重要。 PTMS可以通过向对接部位提供募集结合伴侣来介导蛋白质 - 蛋白质相互作用,这通常是含有特异性PTM结合结构域的蛋白质。例如,含有SH2结构域的蛋白质可以结合磷酸酪氨酸残基,而含溴蛋白质的蛋白质结合乙酰氰基(
      • 杨X.J.
      赖氨酸乙酰化和溴琼瓜:一种用于信令的新伙伴关系。
      )。使用字符串数据库(
      • Jensen L.J.
      • Kuhn M.
      • 斯塔克米
      • Chaffrons。
      • CREEVEY C.
      • Muller J.
      • Doerks T.
      • 朱利安P.
      • 罗斯A.
      • Simonovic M.
      • Bork P.
      • von mering c.
      String 8-蛋白质的全球视图及其在630个生物中的功能相互作用。
      ),我们使用Cytoscape中的MCODE插件工具评估赖氨酸 - 琥珀酰胺化基材内的蛋白质相互作用网络(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      )并确定了14个高度互连的网络 大肠杆菌 (补充表S5)。完整的交互网络被说明 补充图S3. Fig. 5 显示来自这项研究的七大富集的相互作用群集(图。 5.A5G)。有趣的是,我们识别的顶部群集(群集1)由核糖体相关蛋白组成(Fig. 5A)。该分析与我们的Kegg途径和功能注释分析对齐,因为它们都显示出核糖体蛋白中的KSUCC位点的富集。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5高度相互联系的赖氨酸 - 琥珀酰化蛋白网络的七种簇。 使用Cytoskape软件(版本3.0.1)的MCODE插件工具包分析赖氨酸 - 琥珀酰胺化蛋白(列出基因名称中列出的基因名称)的相互作用网络。顶部七簇中的赖氨酸 - 琥珀酰化蛋白分别以红色,浅蓝色,绿色,粉红色,蓝色,黄色和紫色显示。没有琥珀酸位点的蛋白质在每个簇中以浅绿色表示。 A,集群1:MCODE得分= 32.197,节点= 71,边缘= 2,286。 B,集群2:MCODE得分= 3.235,节点= 17,边缘= 55。 C,群集3:MCODE得分= 3,节点= 8,边缘= 24。 D,集群4:MCODE得分= 2.75,节点= 8,边缘= 22。 E,群集5:MCODE得分= 2.722,节点= 18,边缘= 49。 F,群集6:MCODE得分= 2.571,节点= 14,边缘= 36。 G,群集7:MCODE得分= 1.75,节点= 8,边缘= 14.列出了详细的群集信息 .

      大肠杆菌 CobB Catalyzes Deacetylation and Desuccinylation with Similar Efficiency

      HDAC.是一组酶,其催化从乙酰氰基残留物中除去乙酰基(
      • 李克。
      • 工人J.L.
      组蛋白乙酰转移酶复合物:一种尺寸不适合所有。
      )。该组酶基于蛋白质序列同源(
      • Frye R.A.
      原核和真核siR2样蛋白的系统发育分类。
      )。最近,据证明,人类血清蛋白,SIRT5被归类为HDAC但仅具有弱的脱乙酰酶活性,是一种有效的NAD+ - 依赖蛋白质赖氨酸亚氨丙基酶和脱龙酶(
      • 彭C.
      • 卢Z.
      • 谢Z.
      • 程泽。
      • 陈Y.
      • 棕褐色
      • 罗h.
      • 张Y.
      • 他w。
      • 杨克。
      • Zwaans下班
      • Tishkoff D.
      • HO L.
      • 伦巴第D.
      • 他是
      • 戴J.
      • verdin E.
      • 你们。
      • 赵玉。
      赖氨酸丙基化基材及其调控酶的第一次鉴定。
      ,
      • 杜杰克
      • 周Y.
      • 苏X.
      • yu J.J.
      • 汗科
      • 姜河
      • kim J.
      • 哇J.
      • kim j.h.
      • Choi B.H.
      • 他B.
      • 陈W.
      • 张某。
      • CERIONE R.A.
      • Auwerx J.
      • 郝Q.
      • 林H.
      SIRT5是NAD依赖性蛋白质赖氨酸脱龙酶和度琥珀酰基酶。
      )。 大肠杆菌 有一个称为COBB的SIRTUIN蛋白,其能够脱乙酰乙烯基 - COA合成酶(
      • Starai V.J.
      • CERIC I.
      • COLE R.N.
      • Boeke J.D.
      • Escalante-Semerena J.C.
      活性赖氨酸脱乙酰化乙酰-CoA合成酶的SiR2依赖性活化。
      )。根据Frye的生物信息学分析(
      • Frye R.A.
      原核和真核siR2样蛋白的系统发育分类。
      ),人体sirt5和 大肠杆菌 Cobb都是III类SIRTUINS。此外,序列对准表明,SIRT5中的Tyr102和Arg105对于Sirt5的曙光碱性活性重要,在Cobb(Tyr92和Arg95)中保守。因此,高度可能的是COBB也可以具有劣霉素酶活性。
      为了测试这种可能性,我们表达和纯化了Cobb。 HPLC测定表明,COBB可以脱乙酰酯,并以相似的效率脱乙酰酯并使组蛋白H3 K9肽(Fig. 6A)。动力学测量(Fig. 6B)证实了脱乙酰酶活性(k = 0.14 ± 0.01 s−1, km. = 15 ± 1 μm, k/km. = 8.9 × 103 s−1 μm−1)类似于度假碱活性(k = 0.24 ± 0.04 s−1, km. = 86 ± 30 μm, k/km. = 2.8 × 103 s−1 μm−1)。此外,当我们突变Tyr92至pHE(Y92F)或Arg95以满足(R95M)时,降琥珀酶活性分别降低约42-或100倍。相反,每个突变仅通过约3倍降低脱乙酰酶活性(Fig. 6B)。这些结果表明TYR92和ARG105对于COBB的度法酶活性而言是重要的,但对于其脱乙酰酶活性分配。我们的数据表明,COBB是多功能的SIRTUIN,可去除乙酰基和带负电荷的琥珀酰基。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6赖氨酸鉴定酶COBB的鉴定。 A,HPLC分析赖氨酸 - 乙酰化(前两条痕迹)和赖氨酸 - 琥珀酰化(底部两痕迹)肽的溶液水解。 B,脱乙酰化和度解琥珀化动力学参数(k, km., k/km.)野生型(WT)和突变的COBB(Y92F和R95M)。由于缺乏使用的酶浓度缺乏酶饱和度,ND表示“未确定”。 C蛋白质裂解物中赖氨酸乙酰化和琥珀酸水平的Western印迹分析来自Cobb WT和Cobb敲除(KO) 大肠杆菌 细胞。左:蛋白质印迹分析用泛抗乙酰氰基抗体分析。 PONCEAU染色用于装载控制。右:WT和COBB KO细胞在40米的存在或不存在下培养m acetate or 40 mm 琥珀酸。用泛抗琥珀酰基抗体呈印蛋白裂解细胞裂解物。 PONCEAU染色用于装载控制。
      测试 体内 Cobb的度琥珀酶活性,我们培养野生型COBB和COBB淘汰(KO) 大肠杆菌 细胞。我们将全细胞裂解物与针对乙酰氰基或琥珀酰基( Fig. 6C)。 COBB KO细胞显示相对于野生型乙酰化水平略微增加(Fig. 6C, 剩下)。 COBB KO细胞的琥珀酰化水平相对于正常条件下的野生型细胞的琥珀酸钠也升高(Fig. 6C,右前两排)。为了支持这种观察,当细胞用40米处理细胞时,赖氨酸琥珀酰化水平相对于野生型细胞,COBB KO细胞中也增加。m succinate (Fig. 6C,右,最后两排)。

      葡萄糖响应大肠杆菌乙酰物的动态

      除了赖氨酸琥珀酰化外,已知赖氨酸乙酰化通过葡萄糖调节(
      • 王Q.
      • 张Y.
      • 杨C.
      • 熊H.
      • 林Y.
      • 姚杰。
      • 李H.
      • 谢L.
      • 赵W.
      • 姚y。
      • Z.B.
      • 曾R.
      • 熊Y.
      • 关卡。
      • 赵某。
      • 赵G.P.
      代谢酶的乙酰化坐标坐标碳源利用和代谢助焊剂。
      )。为了响应于高葡萄糖的赖氨酸乙酰物的动态变化,除了用于赖氨酸琥珀酰化分析的同一实验条件,我们对我们的赖氨酸琥珀酰化分析进行了定量蛋白质组学分析,不同之处在于泛乙酰吡咯抗体用于KAC肽的亲和富集。
      我们的蛋白质组学筛选在782个蛋白中检测到2,803个KAC位点,其中仅在重度(高葡萄糖)细胞中检测到1,778 kAc位点(总量的〜63.4%),两者中检测到931位点(总量的〜3​​3.5%)团体(Fig. 7A, 补充表S6A-S6C)。类似于KSUCC富集方法,KAC富集样品中KAC肽的百分比为67.0%(2,803 kac肽 相对 1,384个未修饰的肽),表明抗体具有高质量。检测到的KAC和Ksucc位点,1,520(39%)重叠,并被两种修改改性(Fig. 7B)。每种蛋白质的乙酰覆盖氨酸位点的总数(补充图S4a)具有与琥珀酰亚胺位点类似的分布(Fig. 2C)。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7定量分析 大肠杆菌 acetylome. A,Venn图显示唯一的重量(63.4%),仅光(3.1%)和重叠(33.5%)赖氨酸乙酰化位点。 B,Venn图显示了两个修改之间的KSUCC-only,仅KAC和重叠站点的数量。
      为了比较KAC和KSUCC改性位点的序列基序,我们分析了赖氨酸 - 乙酰化位点的侧翼序列 e .coli. (补充图S4B)。在KAC位点中,谷氨酸含量超过,在修饰位点两侧的几乎所有五个位置几乎所有五个位置都经历了丝氨酸。这些数据表明,KSUCC网站和KAC位点受到谷氨酸残留物的严重围绕着 大肠杆菌。该分析还显示亮氨酸在Kac肽的位置 - 2,+1和+2处超过了持久性(补充图S4B),与丙氨酸过度置于这些位置的Ksucc肽相反(Fig. 2D)。
      在光和重介质中观察到的KAC位点,823可以通过MAXQUANT量化(补充图S5A和S5B.补充表S6D.)。我们分析了无葡萄糖和高葡萄糖培养基之间的赖氨酸乙酰化蛋白质组的定量变化。在定量的KAC位点中,平均硅酸盐H / L比为3.73,中值硅酸盐H / L比为2.69。在283位点(34%的量化位点),KAC的丰度响应高葡萄糖而增加至少4倍(补充图S5A和S5B.)。
      蛋白质表达和KAC肽的氧化硅酸盐数据使我们能够计算No-葡萄糖和高葡萄糖培养基中的32kAC位点的绝对化学测定体(补充表S6E)。化学素测定的0.2%至74%。在无葡萄糖培养基中,32个KAC位点的14个具有大于10%的化学计量,平均化学计量为19%。这些数字增加到21个位点,平均化学计量为28%的高葡萄糖培养基。

      琥珀叶绿素和乙酰胺的比较

      为了响应葡萄糖而深入了解KSUCC和KAC的动态,我们确定了量化的KSUCC和KAC位点的比例分布。通过计算日志,我们绘制了相应的站点计数2 KSUCC和KAC位点的SILAC H / L比(Fig. 8A)。这些数据显示,葡萄糖刺激赖氨酸琥珀酰化位点(红色)的更大变化而不是赖氨酸乙酰化位点(蓝色)。为了使光和重样品之间的蛋白质表达的变化正常化,我们对10 HPLC分级摘要的HPLC-MS / MS分析进行了培养的HPLC-MS / MS分析(补充表S7)。所确定的蛋白质的氧化硅比分布显示在 补充图S7,中位数H / L比为0.081。和....相比 Fig. 8A结果类似(Fig. 8B)相应蛋白的表达水平的标准化后。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8赖氨酸琥珀叶绿素与赖氨酸乙酰胺的比较。 A,显示氧化硅比的直方图(日志2 (H / L))KSUCC(RED)和KAC(蓝色)地点的分布。这 y-axis表示每个类别的修饰肽的总数。 B,显示氧化硅比的直方图(日志2 (H / L))标准化Ksucc(橙色)和标准化Kac(紫色)肽的分布。 C,散点图显示KAC与KSUCC相关的标准化(H / L)氧化硅比。红色:0.5< Ksucc/Kac ratio <2;蓝色:KSUCC / KAC比率≥2。
      这些结果表明培养基中的葡萄糖浓度 大肠杆菌 对赖氨酸琥珀酸的影响比赖氨酸乙酰化更深刻。为了进一步研究高葡萄糖对两种PTMS的影响,我们比较了甲氧基·克拉(H / L) 相对 标准化的KSUCC(H / L)相同的PTM网站。在KSUCC和KAC实验中可以量化的156个位点(补充表S8),121增加KAC的KSUCC至少2倍,而没有肽相对于KAC显示KSUCC的2倍降低(Fig. 8C补充图S6)。 KSUCC(H / L)/ KAC(H / L)的平均比为5.92,中值比为3.76。结果再次表明高葡萄糖条件对赖氨酸琥珀酰胺化的影响比赖氨酸乙酰化更为深刻。

      讨论

      在本文中,我们报告了对赖氨酸琥珀叶绿素的第一个全局分析 大肠杆菌。我们响应高葡萄糖量化Ksucc和Kac蛋白质谱的动态变化。我们的蛋白质组学数据导致了三个有趣的观察。首先,我们检测到2,580 ksucc和2,803名Kac位点,代表野生型细菌中最综合的Ksucc蛋白质组,这是写作这项工作。在检测到的Ksucc位点中,41%是赖氨酸琥珀酰化的独特,并且与KAC位点没有重叠( Fig. 7B)。其次,我们的数据表明,赖氨酸琥珀酰化比葡萄糖响应于葡萄糖的乙酰乙酰化比赖氨酸乙酰化更大的变化。最后,细菌蛋白质中的赖氨酸琥珀酸基质的高丰度表明原核PTMS虽然尚未仔细研究,但可能是调节生理变化的重要机制。
      在承载KSUCC和KAC位点的蛋白质底物中,121具有KSUCC(H / L)/ KAC(H / L)的比率(KSUCC对KAC的定量变化的比率,同样肽序列,响应于葡萄糖)大于2(补充图S6补充表S8)(
      • Agirrezabala X.
      • 弗兰克J.
      翻译中的伸长率作为核糖体,TRNA和伸长因子EF-G和EF-TU之间的动态相互作用。
      )。在同一部位发生KAC和KSUCC修改的可能性有几种可能的原因。一种可能性是同一部位的琥珀酰化和乙酰化将具有不同的生物学功能,类似于真核生物中的组蛋白修饰(
      • KouzaridesT.
      染色质修饰及其功能。
      )。另一种可能性是,类似于O-Glcnacylation和磷酸化之间的良好的文档相互作用,这对于各种蜂窝功能至关重要(
      • 哈特G.W.
      • Slawson C.
      • Ramirez-Correa G.
      • Lagerlof O.
      o-glcnacylation和磷酸化之间的交叉谈论:信号传导,转录和慢性疾病中的作用。
      ),KSUCC和KAC之间的竞争在相同的赖氨酸残留物中用于微调基材的活性。此外,KSUCC将诱导蛋白质的更明显的化学和结构变化(从赖氨酸残留物的+ 1电荷到-1电荷)而不是Kac。反过来,KSUCC对蛋白质的功能有更深刻的影响。作为一个例子,50s核糖体亚基蛋白L6的一个有趣的网站可以通过Ksucc和Kac(补充表S8)。 ksucc网站(k成员LQLVGGGYR)50s亚单位蛋白L6在高葡萄糖条件下严重琥珀化,硅酸ksucc(h / l)比例为25.69。然而,同一部位的硅酸克拉(H / L)比例仅为0.85。本网站的KSUCC(H / L)/ KAC(H / L)比例为30.36。因此,尽管肽均为乙酰化且琥珀酰化,但是琥珀酰化可能对其结构和功能具有更大的影响。在某些情况下,乙酰化和琥珀酰化的量化可以揭示哪一个是动态的,因此更可能具有监管作用。这些信息对于引导后续实验的设计是重要的,以将两种修饰中的功能后果描述在相同的底物蛋白中。 50S核糖体蛋白L6与称为结构域VI的23s RRNA的一部分结合,其含有EF-Tu-GTP-氨基酰基TrNA三元复合物的结合位点(
      • 戴维斯C.
      • Bussiere D.E.
      • 金色的B.L.
      • Porter S.J.
      • Ramakrishnan V.
      • 白色s.w.
      核糖体蛋白S5和L6:高分辨率晶体结构和蛋白质合成和抗生素抗性的作用。
      )。因此,50s核糖体蛋白L6的增加的赖氨酸琥珀酰化可能对于调节高葡萄糖条件下的蛋白质翻译可能是重要的。
      除了我们在50s核糖体蛋白L6中的发现外,我们还观察到Ksucc在核糖体和翻译相关蛋白中相对常见。我们使用Kegg Database的分析显示了富含琥珀酰胺化蛋白的前10个代谢途径(SSupPlental图S2)。除了翻译外,赖氨酸琥珀酰胺化蛋白质在嘌呤/嘧啶代谢,糖酵解/葡糖苷,丙酮酸代谢,三羧酸循环和脂肪酸合成中高度富集。我们以前的诱变实验和异柠檬酸脱氢酶的序列对准分析,参与三羧酸循环的重要酶,表明赖氨酸琥珀酰化可能影响其酶活性(
      • 张Z.
      • 棕褐色
      • 谢Z.
      • 戴L.
      • 陈Y.
      • 赵玉。
      赖氨酸琥珀酸鉴定为新的翻译后修饰。
      )。因此,这些结果表明,蛋白质翻译和能量代谢是赖氨酸琥珀酰化可能在的两个全球生物过程。
      SIRT5,哺乳动物的偏琥珀酰基酶相对于其Desucinylation活性具有低脱乙酰化活性(
      • 彭C.
      • 卢Z.
      • 谢Z.
      • 程泽。
      • 陈Y.
      • 棕褐色
      • 罗h.
      • 张Y.
      • 他w。
      • 杨克。
      • Zwaans下班
      • Tishkoff D.
      • HO L.
      • 伦巴第D.
      • 他是
      • 戴J.
      • verdin E.
      • 你们。
      • 赵玉。
      赖氨酸丙基化基材及其调控酶的第一次鉴定。
      ,
      • 杜杰克
      • 周Y.
      • 苏X.
      • yu J.J.
      • 汗科
      • 姜河
      • kim J.
      • 哇J.
      • kim j.h.
      • Choi B.H.
      • 他B.
      • 陈W.
      • 张某。
      • CERIONE R.A.
      • Auwerx J.
      • 郝Q.
      • 林H.
      SIRT5是NAD依赖性蛋白质赖氨酸脱龙酶和度琥珀酰基酶。
      )。相反,细菌酶COBB显示出可比较的赖氨酸脱乙酰化和赖氨酸的过渡酶化活性。根据COBB的动力学参数和两种突变形式的COBB(Y92F,R95M),酶是更快的过琥珀酶(k = 0.242 ± 0.04 s−1)比脱乙酰酶(k = 0.135 ± 0.007 s−1)。但是,度假丙烯化(km. = 86 ± 11 mm)需要比脱乙酰化更高的底物浓度(km. = 15.1 ± 0.5 mm)。所以, k/km. (催化效率)用于降低(2.8×103 s−1 μm−1) 比 k/km. 用于脱乙酰化(8.9×103 s−1 μm−1)。这些数据支持蛋白质印迹数据,表明KAC和KSUCC在COBB KO中增加 大肠杆菌 细胞,表明COBB可以以类似的方式催化脱乙酰化和度法化(Fig. 6C),而当细胞用琥珀酸盐处理细胞时,可以诱导Cobb的度降解活性。
      当寻求了解新的蛋白质改性途径时,蛋白质底物的鉴定和控制修饰的调节酶是主要的初始步骤。尽管该研究已经确定了Lys琥珀酰化的主要基质和第一个已知的度假碱,Cobb,细菌,但仍然未知在原核生物中是否存在额外的度索基团。除去脱乙酰酶,乙酰转移酶,如酶PAT(
      • Starai V.J.
      • Escalante-Semerena J.C.
      鉴定乙酰化乙酰基CoA合成酶在沙门氏菌中的乙酰酯乙酰酯酶的鉴定。
      ),已在细菌中鉴定。除了乙酰化活性外,确定PAT是否具有琥珀酰化活性将是有趣的。尽管已经研究了赖氨酸乙酰化的代谢调节一段时间,但赖氨酸琥珀酰化的生物学意义仍然是特征。赖氨酸琥珀酰化数据集来自本研究,以及来自哺乳动物细胞的数据(
      • 公园J.
      • 陈Y.
      • tishkoff d.x.
      • 彭C.
      • 棕褐色
      • 戴L.
      • 谢Z.
      • 张Y.
      • Zwaans下班
      • Skinner M.E.
      • 伦巴第D.B.
      • 赵玉。
      SIRT5介导的赖氨酸Desuccinylation影响不同的代谢途径。
      ),为研究这种修改的生物学功能提供基础。

      致谢

      我们感谢Hao Luo博士进行技术援助。作者承认,在本文的修订过程中,蛋白质组学研究将筛选赖氨酸琥珀酸基底 e Coli., S. Cerevisiae.,Hela和小鼠肝细胞由Choudhary和同事发表(
      • Weinert B.T.
      • Scholz C.
      • 瓦格纳S.A.
      • Iesmantavicius V.
      • 苏D.
      • 丹尼尔J.A.
      • C.
      赖氨酸琥珀酰化是在原核生物和真核生物中经常发生的修饰,并与乙酰化广泛重叠。
      )。

      补充材料

      参考

        • 杨X.J.
        • Seto E.
        帽子和HDAC:从结构,功能和调节到新的治疗和预防策略。
        oncogene。 2007; 26: 5310-5318
        • Finkel T.
        • 邓C.X.
        • 斯多斯洛拉夫斯基r.
        SIRTUIN生物学和生理学的最新进展。
        自然。 2009; 460: 587-591
        • 芬利L.W.
        • 卡拉克省A.
        • 李杰。
        • Souza A.
        • egia a。
        • 张继夫
        • Teruya-Feldstein J.
        • 更多的ira p.i.
        • Cardoso S.M.
        • 克兰克C.B.
        • Pandolfi P.P.
        • Haigis M.C.
        SIRT3通过HIF1Alpha稳定化反对癌细胞代谢的重编程。
        癌细胞。 2011; 19: 416-428
        • 史密斯B.C.
        • 定居B.
        • Hallows W.C.
        • Craven M.W.
        • 丹努准
        通过肽阵列和机器学习确定的SIRT3基质特异性。
        ACS Chem。 BIOL。 2011; 6: 146-157
        • Hebert A.S.
        • Ditenhafer-Reed K.E.
        • yu w.
        • Bailey D.J.
        • Selen E.S.
        • Boersma M.D.
        • 卡森J.J.
        • Tonelli M.
        • 气球A.J.
        • Higbee A.J.
        • Westphall M.S.
        • Pagliarini D.J.
        • Prolla T.A.
        • assadi-porter f.
        • 罗伊斯。
        • 丹努准
        • Coon J.J.
        卡路里限制和SIRT3触发线粒体蛋白乙酰胺的全球重新编程。
        摩尔。细胞。 2013; 49: 186-199
        • Hirschey M.D.
        • Shimazu T.
        • Huang J.Y.
        • Schwer B.
        • verdin E.
        SIRT3调节线粒体蛋白乙酰化和中间代谢。
        冷泉哈布。 Symp。量子。 BIOL。 2011; 76: 267-277
        • 伦巴第D.B.
        • tishkoff d.x.
        • Zwaans下班
        蛋白质乙酰化的线粒体调节。
        在: Cadenas E. Orrenius S. Packer L. 在健康和疾病中的线粒体信号传导。 泰勒和弗朗西斯, 伦敦2012: 269-298
        • Starai V.J.
        • CERIC I.
        • COLE R.N.
        • Boeke J.D.
        • Escalante-Semerena J.C.
        活性赖氨酸脱乙酰化乙酰-CoA合成酶的SiR2依赖性活化。
        科学。 2002; 298: 2390-2392
        • 赵某。
        • 徐W.
        • 江W.
        • yu w.
        • 林Y.
        • 张T.
        • 姚杰。
        • 周L.
        • 曾Y.
        • 李H.
        • 李Y.
        • 施J.
        • W.
        • 汉考克三。
        • 秦立
        • Chin J.
        • 杨P.
        • 陈X.
        • 雷Q.
        • 熊Y.
        • 关卡。
        蛋白质赖氨酸乙酰化对细胞代谢的调节。
        科学。 2010; 327: 1000-1004
        • Shahbazian M.D.
        • 格兰斯坦M.
        特异性特异性组蛋白乙酰化和脱乙酰化的功能。
        安努。 Rev. Biochem。 2007; 76: 75-100
        • 罗斯S.Y.
        • 丹努准
        • Allis C.D.
        组蛋白乙酰转移酶。
        安努。 Rev. Biochem。 2001; 70: 81-120
        • 顾w.
        • 罗德尔r.g.
        通过P53 C-末端结构域的乙酰化激活P53序列特异性DNA结合。
        细胞。 1997; 90: 595-606
        • 隆堡C.
        • 瓜迪奥拉A.
        • 邵罗。
        • kawaguchiy。
        • ITO A.
        • 尼克松A.
        • Yoshida M.
        • 王X.F.
        • 姚明。
        HDAC.6是微管相关的脱乙酰酶。
        自然。 2002; 417: 455-458
        • 史密斯B.C.
        • Hallows W.C.
        • 丹努准
        SIRTUINS的机制和分子探针。
        化学。 BIOL。 2008; 15: 1002-1013
        • Imai S.
        • 瓜伦特L.
        十年的NAD依赖性SIR2家族脱乙酰酶:对代谢疾病的影响。
        趋势药学。 SCI。 2010; 31: 212-220
        • 李克。
        • 工人J.L.
        组蛋白乙酰转移酶复合物:一种尺寸不适合所有。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2007; 8: 284-295
        • Frye R.A.
        原核和真核siR2样蛋白的系统发育分类。
        生物学习。 Biophys。 res。安排。 2000; 273: 793-798
        • 彭C.
        • 卢Z.
        • 谢Z.
        • 程泽。
        • 陈Y.
        • 棕褐色
        • 罗h.
        • 张Y.
        • 他w。
        • 杨克。
        • Zwaans下班
        • Tishkoff D.
        • HO L.
        • 伦巴第D.
        • 他是
        • 戴J.
        • verdin E.
        • 你们。
        • 赵玉。
        赖氨酸丙基化基材及其调控酶的第一次鉴定。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (M111.012658.)
        • 杜杰克
        • 周Y.
        • 苏X.
        • yu J.J.
        • 汗科
        • 姜河
        • kim J.
        • 哇J.
        • kim j.h.
        • Choi B.H.
        • 他B.
        • 陈W.
        • 张某。
        • CERIONE R.A.
        • Auwerx J.
        • 郝Q.
        • 林H.
        SIRT5是NAD依赖性蛋白质赖氨酸脱龙酶和度琥珀酰基酶。
        科学。 2011; 334: 806-809
        • 科恩T.
        • 姚明。
        ACK-知识可逆乙酰化。
        SCI。 Stke。 2004; 2004: pe42
        • 科恩H.Y.
        • 拉莫斯。
        • Bitterman K.J.
        • he
        • imahiyerobo t.a.
        • 米勒C.
        • Frye R.
        • Ploegh H.
        • 凯斯勒光明
        • sinclair d.a.
        CBP和PCAF通过CBP和PCAF的Ku70末端的乙酰化对抗Bax介导的凋亡。
        摩尔。细胞。 2004; 13: 627-638
        • Michishita E.
        • 公园J.Y.
        • Burneskis J.M.
        • 巴雷特J.C.
        • 堀川I.
        进化的保守和非经受性的植物蛋白质的局部典型和功能。
        摩尔。 BIOL。细胞。 2005; 16: 4623-4635
        • 金S.C.
        • Sprung R.
        • 陈Y.
        • 徐Y.
        • 球H.
        • PEI J.
        • 诚龙
        • Kho Y.
        • 肖H.
        • 肖L.
        • 格兰顿N.V.
        • 白云
        • 杨X.J.
        • 赵玉。
        蛋白质组学调查显示的赖氨酸乙酰化的基材和功能多样性。
        摩尔。细胞。 2006; 23: 607-618
        • 陈Y.
        • 赵W.
        • 杨杰斯。
        • 程泽。
        • 罗h.
        • 卢Z.
        • 棕褐色
        • 顾w.
        • 赵玉。
        定量乙酰胺分析显示SIRT1在调节不同底物和细胞途径方面的作用。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11: 1048-1062
        • C.
        • Kumar C.
        • GNAD F.
        • Nielsen M.L.
        • rehman m.
        • Walther T.C.
        • 奥尔森J.V.
        赖氨酸乙酰化靶标复合物并共调节主要细胞功能。
        科学。 2009; 325: 834-840
        • 张克。
        • 郑S.
        • 杨杰斯。
        • 陈Y.
        • 程泽。
        综合分析蛋白质赖氨酸乙酰化 大肠杆菌.
        J.蛋白质组。 2013; 12: 844-851
        • 张Z.
        • 棕褐色
        • 谢Z.
        • 戴L.
        • 陈Y.
        • 赵玉。
        赖氨酸琥珀酸鉴定为新的翻译后修饰。
        NAT。化学。 BIOL。 2011; 7: 58-63
        • 公园J.
        • 陈Y.
        • tishkoff d.x.
        • 彭C.
        • 棕褐色
        • 戴L.
        • 谢Z.
        • 张Y.
        • Zwaans下班
        • Skinner M.E.
        • 伦巴第D.B.
        • 赵玉。
        SIRT5介导的赖氨酸Desuccinylation影响不同的代谢途径。
        摩尔。细胞。 2013; 50: 919-930
        • 谢Z.
        • 戴J.
        • 戴L.
        • 棕褐色
        • 程泽。
        • 吴y.
        • Boeke J.D.
        • 赵玉。
        赖氨酸琥珀酰化和组蛋白的赖氨酸丙基化。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11: 100-107
        • 张继夫
        • Sprung R.
        • PEI J.
        • 棕褐色X.
        • 金斯。
        • 朱H.
        • 刘C.F.
        • 格兰顿N.V.
        • 赵玉。
        赖氨酸乙酰化是一种高度丰富和进化的改变的改性 大肠杆菌.
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 215-225
        • 王Q.
        • 张Y.
        • 杨C.
        • 熊H.
        • 林Y.
        • 姚杰。
        • 李H.
        • 谢L.
        • 赵W.
        • 姚y。
        • Z.B.
        • 曾R.
        • 熊Y.
        • 关卡。
        • 赵某。
        • 赵G.P.
        代谢酶的乙酰化坐标坐标碳源利用和代谢助焊剂。
        科学。 2010; 327: 1004-1007
        • 马Q.
        • 木头t.k.
        原核生物中的蛋白质乙酰化增加了应力阻力。
        生物学习。 Biophys。 res。安排。 2011; 410: 846-851
        • Mertins P.
        • 乔J.W.
        • Patel J.
        • Udeshi N.D.
        • 克劳瑟K.R.
        • MANI D.R.
        • Burgess M.W.
        • Gillette M.A.
        • Jaffe J.D.
        • carr s.a.
        通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
        NAT。方法。 2013; 10: 634-637
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • Perkins D.N.
        • Pappin D.J.
        • 皱褶D.M.
        • Cottrell J.s.
        使用质谱数据搜索序列数据库来搜索基于概率的蛋白质识别。
        电泳。 1999; 20: 3551-3567
        • 陈Y.
        • kwon s.w.
        • 金S.C.
        • 赵玉。
        用串联质谱进行蛋白质序列数据库鉴定的肽的手动评估综合方法。
        J.蛋白质组。 2005; 4: 998-1005
        • Colaert N.
        • 赫尔森K.
        • 玛特L.
        • vandekerckhove J.
        • Gevaert K.
        通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
        NAT。方法。 2009; 6: 786-787
        • 黄达W.
        • 谢尔曼B.T.
        • LEMPICKI R.A.
        生物信息学富集工具:大型基因清单综合功能分析的路径。
        核酸RES。 2009; 37: 1-13
        • ashburner m.
        • 球C.A.
        • 布莱克J.A.
        • Botstein D.
        • 巴特勒H.
        • 樱桃准晚
        • 戴维斯A.P.
        • Dolinski K.
        • 德怀特S.S.
        • EPPIG J.T.
        • 哈里斯M.A.
        • 山D.P.
        • ISSEL-TARVER L.
        • Kasarskis A.
        • 刘易斯S.
        • Matese J.C.
        • Richardson J.E.
        • Ringwald M.
        • 鲁宾上午
        • Sherlock G.
        基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
        NAT。遗传。 2000; 25: 25-29
        • Kanehisa M.
        • goto s.
        Kegg:Kyoto Encyclopedia的基因和基因组。
        核酸RES。 2000; 28: 27-30
        • 芬恩r.d.
        • 泰特J.
        • 朦胧J.
        • Coggill P.C.
        • Sammut S.J.
        • Hotz H.R.
        • CERIC G.
        • Forslund K.
        • 艾迪S.R.
        • Sonnhammer E.L.
        • Bateman A.
        PFAM蛋白质家族数据库。
        核酸RES。 2008; 36: D281-D288
        • Jensen L.J.
        • Kuhn M.
        • 斯塔克米
        • Chaffrons。
        • CREEVEY C.
        • Muller J.
        • Doerks T.
        • 朱利安P.
        • 罗斯A.
        • Simonovic M.
        • Bork P.
        • von mering c.
        String 8-蛋白质的全球视图及其在630个生物中的功能相互作用。
        核酸RES。 2009; 37: D412-D416
        • Shannon P.
        • Markiel A.
        • ozier O.
        • Baliga N.S.
        • 王J.T.
        • Ramage D.
        • amin n.
        • Schwikowski B.
        • IDEKER T.
        Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
        Genome Res。 2003; 13: 2498-2504
        • 奥尔森J.V.
        • vermeulen M.
        • 桑塔马里亚A.
        • Kumar C.
        • 米勒M.L.
        • Jensen L.J.
        • GNAD F.
        • Cox J.
        • Jensen T.S.
        • nigg e.a.
        • 布鲁纳克斯。
        定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
        SCI。信号。 2010; 3: ra3
        • Agirrezabala X.
        • 弗兰克J.
        翻译中的伸长率作为核糖体,TRNA和伸长因子EF-G和EF-TU之间的动态相互作用。
        Q Rev. Biophys。 2009; 42: 159-200
        • 杨X.J.
        赖氨酸乙酰化和溴琼瓜:一种用于信令的新伙伴关系。
        生物。 2004; 26: 1076-1087
        • KouzaridesT.
        染色质修饰及其功能。
        细胞。 2007; 128: 693-705
        • 哈特G.W.
        • Slawson C.
        • Ramirez-Correa G.
        • Lagerlof O.
        o-glcnacylation和磷酸化之间的交叉谈论:信号传导,转录和慢性疾病中的作用。
        安努。 Rev. Biochem。 2011; 80: 825-858
        • 戴维斯C.
        • Bussiere D.E.
        • 金色的B.L.
        • Porter S.J.
        • Ramakrishnan V.
        • 白色s.w.
        核糖体蛋白S5和L6:高分辨率晶体结构和蛋白质合成和抗生素抗性的作用。
        J.Mol。 BIOL。 1998; 19: 873-888
        • Starai V.J.
        • Escalante-Semerena J.C.
        鉴定乙酰化乙酰基CoA合成酶在沙门氏菌中的乙酰酯乙酰酯酶的鉴定。
        J.Mol。 BIOL。 2004; 340: 1005-1012
        • Weinert B.T.
        • Scholz C.
        • 瓦格纳S.A.
        • Iesmantavicius V.
        • 苏D.
        • 丹尼尔J.A.
        • C.
        赖氨酸琥珀酰化是在原核生物和真核生物中经常发生的修饰,并与乙酰化广泛重叠。
        细胞代表。 2013; 4: 842-851
        • Weinert B.T.
        • Iesmantavicius V.
        • 瓦格纳S.A.
        • SchölzC.
        • Gammesson B.
        • Beli P.
        • nyströmt。
        • C.R.
        '乙酰磷酸酯是赖氨酸乙酰化的关键决定因素 大肠杆菌。'。
        分子Cell. 2013; vol 51 (no. 2): 265-272