磷蛋白酶的年龄 - 从大数据集到蛋白质功能的推断*

  • Philippe P. Roux.
    一致
    应该解决对应的通信:Philippe Roux; Pierre thibault,
    隶属关系
    免疫学与癌症研究所,UniversitédeMontréal,P.O.盒子6128,站。中心Ville,Montréal,QuébecH3C3J7,加拿大;

    病理和细胞生物学系,UniversitédeMontréal,P.O.盒子6128,站。中心Ville,Montréal,QuébecH3C3J7,加拿大;
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  • Pierre thibault.
    一致
    Pierre thibault,
    隶属关系
    免疫学与癌症研究所,UniversitédeMontréal,P.O.盒子6128,站。中心Ville,Montréal,QuébecH3C3J7,加拿大;

    化学系,UniversitédeMontréal,P.O.盒子6128,站。中心Ville,Montréal,QuébecH3C3J7,加拿大;

    生物化学系,蒙特拉尔大学,P.O.盒子6128,站。 Centr-Ville,Montréal,Québec,加拿大H3C 3J7
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  • 作者脚注
    *这项工作是在国家科学和工程研究委员会(CAIR)的卫生研究院(CIHR),癌症研究会(CRS)和加拿大研究主席计划中的经营赠款的财政支持。免疫学和癌症研究所(IRIC)从加拿大商业化和研究中获得加拿大卓越中心的基础设施支持,加拿大创新基金会和Fonds de Rechercheduquébec - Santé(FRQS)。
      蛋白质磷酸化是信号转导的最常见的翻译后修饰之一,以响应于细胞内和细胞外刺激来控制细胞生长,增殖和存活。该修饰通过识别独特的序列基序和/或通过支架和衔接蛋白介断其功能的激酶和磷酸酶来精细协调。有关激酶底物和特异性磷测温的详细信息,以便更好地理解其病理生理作用。亲和层析和质谱(MS)敏感性的最新进展使得蛋白质磷酸化的大规模鉴定和分析,但需要适当的后续实验以确定鉴定的磷酸化位点的功能意义。在该综述中,我们为基于MS的磷脂蛋白酶分析提供了有意义的技术细节,并描述了用于选择模型系统的重要考虑和鉴定的磷酸化位点的功能表征。
      蛋白质磷酸化影响蛋白质活性并控制各种重要的细胞过程,包括细胞信号传导和代谢,以及细胞生长,分化和增殖。这种翻译后修改(PTM)
      使用的缩写是:
      GLCNAC.
      N - 乙酰葡糖胺
      LC-MS / MS
      液相色谱 - 串联质谱法
      MAPK.
      促丝糖型活化蛋白激酶
      多发性硬化症
      质谱
      女士/女士
      串联质谱
      PTM.
      翻译后修改
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      SUMO.
      小泛素相关的修饰符。
      1使用的缩写是: GLCNAC.
      N - 乙酰葡糖胺
      LC-MS / MS
      液相色谱 - 串联质谱法
      MAPK.
      促丝糖型活化蛋白激酶
      多发性硬化症
      质谱
      女士/女士
      串联质谱
      PTM.
      翻译后修改
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      SUMO.
      小泛素相关的修饰符。
      还调节蛋白质 - 蛋白质相互作用并提供框架,信号传导网络集成和中继信号(
      • Pawson T.
      信号转导的特异性:从磷酸酪氨酸-SH2结构域相互作用与复合细胞体系。
      )。蛋白激酶和来自特定基质的磷酸基团的往磷酸酶的相互作用作用,得到精致的机制,以确保对内部和外部细胞刺激的协调和选择性反应(
      • Ubersax J.A.
      • Ferrell Jr.,J.E.
      蛋白质磷酸化特异性机制。
      )。虽然磷酸化特异性蛋白质相互作用对于转换细胞内信号至关重要,但激酶和磷酸酶的突变或过表达可以扰乱蛋白质磷酸化的动态调节,许多疾病(包括癌症)遇到的情况
      • 勇敢的J.
      • 猎人T.
      癌症中蛋白激酶信号网络。
      )。这是通过RAS /丝裂剂活化蛋白激酶(MAPK)途径的组分中的功能突变的最佳举例说明,其导致各种发育障碍以及癌症(
      • Tidyman W.E.
      • Rauen K.A.
      Rasopathies:RAS / MAPK途径失调综合征的发育综合征。
      )。
      解开激酶活性和对下游底物的影响之间的连接是需要互补方法来确定基因型和表型之间的直接相互作用,功能性意义和关系的主要努力。依赖于磷酸肽和质谱(MS)仪器的亲和纯化的现代磷蛋白蛋白酶方法在改性残基的大规模鉴定,磷酸化化学计量的测定和激酶活性的相关性中发挥着关键作用。磷蛋白质提供的细节水平补充了更传统的生化方法,其中含有激酶及其活动。定量磷蛋白酶允许研究人员研究不同细胞模型系统中的异常激活的信号通路,以识别根据底物和实验范式的化学计量和持续时间而变化的磷酸化模式。在这里,我们描述了成功的基于MS的磷肝蛋白酶分析的关键技术点,并讨论了模型系统的选择和磷酸化位点的表征的重要考虑因素,以确定其功能意义。

      基于MS的磷蛋白酶分析的基础知识

      通过有效的磷酸富集技术和敏感的MS仪器实现大规模磷蛋白质分析,我们对细胞信号传导的理解已经大大促进了。远远超出了改性残留物的简单目录,目前的磷蛋白蛋白酶方法提供了分析磷酸化化学计量和蛋白质在不同细胞范式的蛋白质丰度的定量测量。磷蛋白酶分析的目前的策略通常包含四个重要步骤:细胞分级,蛋白质消化,磷酸富集,并通过液相色谱(LC)与串联MS(Fig. 1)。这些步骤可以根据所需的定量信息的类型来定制,或者例如,以特异性富含磷酸肽与特定的共识: 例如 14-3-3结合或AKT共识主题)(
      • 金杰。
      • 史密斯F.D.
      • 斯塔克C.
      • 井C.D.
      • Fawcett J.P.
      • Kulkarni S.
      • Metalnikov P.
      • O'Donnell P.
      • 泰勒P.
      • 泰勒L.
      • 邹格曼A.
      • Woodgett J.R.
      • Langeberg L.K.
      • 斯科特J.D.
      • Pawson T.
      体内蛋白质组学,功能和结构域分析,参与细胞骨骼调节和细胞组织的结合蛋白。
      ,
      • atrih A.
      • CORDOCK D.
      • SELLAR G.
      • 汤普森A.
      • Feuerstein G.
      • Ferguson M.A.
      • 黄杰特。
      使用LC-MS / MS的AKT磷酸化的化学计量定量。
      ,
      • 莫里茨A.
      • 李Y.
      • 郭阿。
      • Villen J.
      • 王Y.
      • 麦克奈尔J.
      • Kornhauser J.
      • Sprott K.
      • 周J.
      • 可能A.
      • 任吉。
      • 犀鸟P.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      AKT-RSK-S6激酶信号通过致癌受体酪氨酸激酶激活。
      )或在细胞提取物中低比例存在的改性残基( 例如 phosphotyrosine) (
      • Jedrychowski M.P.
      • Huttlin E.L.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • Gygi S.P.
      鼠磷蛋白蛋白酶各自检测平台内的HCD和CID型碎片评价。
      ,
      • Rikova K.
      • 郭阿。
      • 曾Q.
      • 可能A.
      • yu J.
      • 海克H.
      • Nardone J.
      • 韭葱。
      • Reeves C.
      • 李Y.
      • 胡Y.
      • 谭Z.
      • 斯托克斯米
      • Sullivan L.
      • 米切尔J.
      • Wetzel R.
      • 麦克奈尔J.
      • 任吉。
      • 元J.
      • bakalarski c.e.
      • Villen J.
      • Kornhauser J.M.
      • 史密斯B.
      • 李德。
      • 周X.
      • Gygi S.P.
      • GU T.L.
      • Polakiewicz R.D.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      全球磷酸赖硒信令调查鉴定肺癌中的致癌酶。
      ,
      • 赶紧J.
      • 莫里茨A.
      • 李克.A.
      • 郭阿。
      • 高斯v.l.
      • spek e.j.
      • 张H.
      • Zha x.m.
      • Polakiewicz R.D.
      • 梳理M.J.
      癌细胞中酪氨酸磷酸化的免疫亲和力分析。
      )。以下部分概述了在规划定量磷蛋白蛋白酶分析时应该考虑的实验设计的关键方面。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1基于MS的磷蛋白蛋白酶方法的示意性概述。 细胞分级,亲和纯化和定量MS分析概述。通过矩形(右下方)概述了诸如蛋白质和磷酸肽丰度的变化和磷酸化化学计量的变化的定量蛋白质组学的信息由矩形(右下)概述。蓝色和绿色圆圈描绘了来自不同细胞提取物的蛋白质丰度,阴影红色圆圈表示单个位点的磷酸化化学计量。在延长刺激期间分析磷酸化事件(>1小时),应标准化磷蛋白质结果以考虑蛋白质丰富的相对变化。

      样品制备

      定量磷蛋白酶所需的蛋白质提取物的量取决于所需的信息类型。蛋白表达测量可以用几微克蛋白质消化进行,磷蛋白酶分析通常需要50至100倍的材料以富丰磷酸肽( <5%)存在于压倒性的未修饰的肽。例如,在哺乳动物细胞上进行的大规模磷蛋白酶实验通常需要3至5mg蛋白质提取物,以鉴定超过10,000个不同的磷酸化位点。然而,用磷酸酪氨酸残基的低丰度肽的鉴定通常需要较大量的蛋白质(>20mg以成功的免疫亲和基磷酸富集富集。此外,涉及细胞刺激的实验,延伸几个小时必须测量同一提取物上的蛋白质和磷酸肽丰富,以便准确地确定磷酸化化学计量的变化(Fig. 1 )(
      • 吴R.
      • Dephoure N.
      • 哈斯W.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      正确的综合磷酸化动力学解释需要蛋白质表达变化的标准化。
      )。
      在细胞裂解和蛋白质提取的所有步骤中必须使用适当的蛋白酶和磷酸酶抑制剂以保持蛋白质和磷酸化状态的完整性,因为不同的磷酸酶抑制剂可以产生不同的磷酸肽种群(
      • Thingholm T.e.
      • Larsen M.R.
      • Ingrell C.R.
      • 卡西姆M.
      • Jensen O.N.
      基于血浆膜的基于磷蛋白蛋白酶分析及磷酸酶抑制剂治疗的影响。
      )。必须放在蛋白质隔离程序上的适当关注,以最大限度地减少细胞培养物的污染物( 例如 血清蛋白质)或与渗透压或温度变化相关的磷酸化的变化。因此,必须在低温下快速进行细胞收获和裂解( 例如 或者,或者,或者,可以在液氮中在液氮中冷冻并在-80℃下保持-80℃,在蛋白质提取和消化之前保持粒子。尽管胰蛋白酶通常用于蛋白质组学实验中的蛋白质组学实验,但是存在于这些摘要中的磷酸肽可能太小或太大而无法有效地回收和鉴定。替代酶( 例如 单独使用或与胰蛋白酶组合使用的赖氨酸内肽酶,ASP-N,谷氨酸内肽酶,胰凝乳蛋白酶可以改善序列覆盖和磷酸化位点测绘,特别是对于位于碱性蛋白质结构域内的改性残基(
      • wisniewski J.R.
      酶反应器中连续的蛋白水解消解增加了蛋白质组学和磷蛋白酶分析的深度。
      ,
      • 卞Y.
      • 歌曲C.
      • 程K.
      • 王C.
      • 魏X.
      • 朱茹
      • 陈R.
      • 王F.
      • zou h.
      通过串联消化方法改善Hela细胞磷脂蛋白酶分析的覆盖范围。
      )。

      通过亲和纯化来富集磷酸肽

      磷酸肽通常以低比例存在于蛋白质消化中,并且可以在宽动态范围的表达蛋白质上表现出可变的位点占用。因此,成功的磷蛋白蛋白质实验依赖于使用选择性富集技术,其增强磷酸肽的相对丰度至可检测到通过MS的水平。结合LC分级的不同分析策略( 例如 已经提出了磷肽富集之前或之后的离子交换和亲水性相互作用色谱法以增强选择性(
      • Ficarro S.B.
      • 张Y.
      • Carrasco-Alfonso M.J.
      • Garg B.
      • Adelmant G.
      • Webber J.T.
      • 卢旺目C.J.
      • 玛托J.A.
      在线纳米射线多维分馏,用于高效磷酸肽分析。
      ,
      • Villen J.
      • Gygi S.P.
      通过质谱法的全局磷酸化分析的SCX / IMAC富集方法。
      ,
      • McNulty D.E.
      • 安南R.S.
      亲水性相互作用色谱法降低了磷蛋白酶组的复杂性,提高了全局磷酸肽分离和检测。
      ,
      • GaN C.S.
      • 郭t.
      • 张H.
      • LIM S.K.
      • SZE S.K.
      静电排斥 - 亲水相互作用色谱(Erlic)与磷酸肽分离/富集的SCX-IMAC基方法对比研究。
      )。最受欢迎的磷酸富集的吸附剂方法是固定的金属亲和力色谱用Fe3+ (
      • 安德森L.
      • Porath J.
      固定化金属(Fe3 +)亲和色谱法分离磷蛋白。
      ,
      • Nuhse T.
      • yu K.
      • Salomon A.
      固定化金属离子亲和色谱法分离磷酸肽。
      ,
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      固定化金属亲和色谱法(IMAC)和质谱法富集和表征磷酸肽。
      )和金属氧化物亲和层析与TiO2 beads (
      • Ikeguchi Y.
      • Nakamura H.
      用在线前浓缩柱切换高性能阴离子交换色谱法测定二氧化尼亚州的直接浓度的含量。
      ,
      • Pinkse M.W.
      • Uitto下午
      • hilhorst m.j.
      • OOM B.
      • Heck A.J.
      使用2D-Nanolc-ESI-MS / MS和氧化钛预训柱的蛋白水解消化的雌性磷酸磷肽的Femtomole水平的选择性分离。
      )。然而,还描述了几种替代和互补方法,包括磷酸酪氨酸免疫亲和纯化(
      • Jedrychowski M.P.
      • Huttlin E.L.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • Gygi S.P.
      鼠磷蛋白蛋白酶各自检测平台内的HCD和CID型碎片评价。
      ,
      • Rikova K.
      • 郭阿。
      • 曾Q.
      • 可能A.
      • yu J.
      • 海克H.
      • Nardone J.
      • 韭葱。
      • Reeves C.
      • 李Y.
      • 胡Y.
      • 谭Z.
      • 斯托克斯米
      • Sullivan L.
      • 米切尔J.
      • Wetzel R.
      • 麦克奈尔J.
      • 任吉。
      • 元J.
      • bakalarski c.e.
      • Villen J.
      • Kornhauser J.M.
      • 史密斯B.
      • 李德。
      • 周X.
      • Gygi S.P.
      • GU T.L.
      • Polakiewicz R.D.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      全球磷酸赖硒信令调查鉴定肺癌中的致癌酶。
      ),固定化金属亲和色谱法与GA3+ (
      • Posewitz M.C.
      • Tempst P.
      固定化镓(III)磷酸肽的亲和层析。
      ),金属氧化物亲和色谱与Zro2 or Nb2O5 (
      • Ficarro S.B.
      • Parikh J.R.
      • 空白N.C.
      • 玛托J.A.
      铌(V)氧化物(NB2O5):磷蛋白酶的应用。
      ,
      • Kweon H.K.
      • 哈莎逊K.
      基于二氧化锆的磷酸化肽的选择性锆富集进行质谱分析。
      )和固定化金属亲和层析和金属氧化物亲和色谱法的组合(
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • 罗宾逊P.J.
      • Larsen M.R.
      SIMAC(来自IMAC的顺序洗脱),一种磷蛋白酶策略,用于从倍增磷酸化肽的快速分离单磷酸化。
      )。有关磷酸肽亲和介质的更多细节,可以在最近关于此主题的评论中找到(
      • Beltran L.
      • Cutillas P.R.
      磷蛋白酶磷肽富集技术的研究进展。
      ,
      • 邓恩J.D.
      • 里德G.E.
      • 瘀伤M.L.
      通过质谱法在分析之前进行磷酸肽富集的技术。
      ,
      • Engholm-Keller K.
      • Larsen M.R.
      大规模磷蛋白质中的技术和挑战。
      ,
      • 堪察州E.
      • Michnick S.
      • Thibault P.
      大规模磷蛋白酶实验的样品制备和分析策略。
      )。

      磷酸化位点的定位

      另一个重要的考虑因素涉及对来自MS / MS数据鉴定的磷酸化位点定位的置信度。磷酸化位点的定位通常基于观察包含完整磷酸化部分的序列特异性片段离子或由磷酸酯键的切割产生的。来自前体或片段离子的磷酸盐部分的迅速丧失可以产生模糊的部位定位,这种情况部分地使用电子转移解离(
      • Mikesh L.M.
      • Ueberheide B.
      • Chi A.
      • Coon J.J.
      • Syka J.E.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      ETD质谱法在蛋白质组学分析中的效用。
      )。首先描述使用电子转移解离活化的大规模磷蛋白酶术实验用于分析 大肠杆菌 和人类胚胎肾293t细胞(
      • Chi A.
      • HUTTENHOWER C.
      • geer l.y.
      • Coon J.J.
      • Syka J.E.
      • 白D.L.
      • Shabanowitz J.
      • Burke D.J.
      • troyanskaya o.g。
      • 狩猎d.f.
      蛋白质磷酸化位点分析 酿酒酵母酿酒酵母 通过电子转移解离(ETD)质谱法。
      ,
      • 莫里娜H.
      • 喇叭d.m.
      • 唐ñ。
      • Mathivanan S.
      • Pandey A.
      磷酸肽的全局蛋白质组学分析使用电子转移解离串联质谱法。
      )。尽管所获得的MS / MS光谱的质量,但在磷酸肽异构体的发生中可能会损害现场定位的信心,其可以代表所有识别的3%至6%(
      • Courcelles M.
      • Bridon G.
      • Lemieux S.
      • Thibault P.
      大规模磷蛋白质族实验中磷酸肽异构体的发生和检测。
      )。为了解决网站本地化的难度,已经开发出不同的算法,以基于数据库搜索引擎的结果提供磷酸化站点分配的概率测量。这些包括PTM得分(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      ),ascore(
      • Beausoleil S.A.
      • Villen J.
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • Gygi S.P.
      基于概率的高通量蛋白磷酸化分析和现场定位方法。
      ),磷透视(
      • 罗滕贝格B.E.
      • Pisitkun T.
      • Knepper M.A.
      • Hoffert J.D.
      磷源:用于MSN数据的开源磷酸化站点分配工具。
      ),磷斯坦(
      • 万王。
      • CRIPPS D.
      • 托马斯S.
      • 坎贝尔P.
      • Ambulos N.
      • 陈T.
      • 杨阿。
      磷斯坦:使用MS2 / MS3对信息的磷酸化站点预测的基于概率的方法。
      )和phoscalc(
      • 麦克莱恩D.
      • Burrell M.A.
      • Studholme D.J.
      • 琼斯上午
      Phoscalc:一种用于评估来自质谱仪数据的肽磷酸化位点的工具。
      )使用碰撞诱导的解离和Slomo获得的MS / MS光谱(
      • Bailey C.M.
      • 甜蜜的三个
      • Cunningham D.L.
      • Zeller M.
      • Heath J.K.
      • Cooper H.J.
      SLOMO:从ETD / ECD质谱的自动化网站定位修改。
      ),膦素(
      • Swaney D.L.
      • 温格C.D.
      • Thomson J.A.
      • Coon J.J.
      人胚胎干细胞磷脂蛋白酶通过电子转移解离串联质谱法揭示。
      )和磷光体(
      • Taus T.
      • kocher t.
      • Pichler P.
      • Paschke C.
      • 施密特A.
      • Henrich C.
      • Mechtler K.
      使用磷光体的普遍和自信的磷酸化位点定位。
      用于使用碰撞诱导的解离和电子转移解离碎片模式获得的光谱。

      定量磷蛋白质

      具有高分辨率和敏感性的MS仪器的出现与可重复的样品制备策略和数据挖掘算法相结合,为定量蛋白质组学提供了稳健的分析平台。可以使用与其非磷酸化对应物相似的定量方法来确定具有不同条件和重复的磷酸肽丰度的变化。基本上,我们区分了两种类型的定量分析,其中MS信号可用于概述磷蛋白丰度或磷酸化化学计量的相对变化(Fig. 1)。在每种情况下,离子丰度的比较可以使用本地肽(无标记)来完成(
      • Kearney P.
      • Thibault P.
      生物信息学符合蛋白质组学桥接质谱数据分析与细胞生物学之间的差距。
      )稳定同位素作为细胞培养(氧化物)中标记的氨基酸(硅酸)(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )或作为蛋白质消化后使用官能化试剂的化学标签(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      多路复用蛋白质定量 酿酒酵母酿酒酵母 使用胺反应性的等离性标记试剂。
      ,
      • 汤普森A.
      • Schafer J.
      • Kuhn K.
      • Kienle S.
      • Schwarz J.
      • 施密特G.
      • Neumann T.
      • 约翰斯通r.
      • 穆罕默德A.K.
      • 哈蒙克
      串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
      )。最近使用Silac和Isobaric Chemical标签提出了最近提高了样品复用的替代方法(
      • Mcalister G.C.
      • Huttlin E.L.
      • 哈斯W.
      • L.
      • Jedrychowski M.P.
      • 罗杰斯J.C.
      • Kuhn K.
      • 派克I.
      • 格罗罗德。
      • Blethrow J.D.
      • Gygi S.P.
      用同位素质量使用报道离子同位素增加TMT的多路复用能力。
      )。特定肽的定量也可以使用绝对定量(AQUA)进行(
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白。
      )通过掺入蛋白质消化中的已知量的同位素标记的肽。这些方法的更详细说明可以在最近发布的定量蛋白质组学评论(
      • Nilsson C.L.
      定量磷蛋白酶的进展。
      ,
      • Pimienta G.
      • Chaerkady R.
      • Pandey A.
      Silac用于全局磷肝蛋白酶分析。
      ,
      • ong s.e.
      • 福斯特L.J.
      基于质量的定量蛋白质组学的谱系方法。
      ,
      • Neilson K.A.
      • 阿里N.A.
      • Muralidharan S.
      • Mirzaei M.
      • Mariani M.
      • 阿卡松G.
      • 李阿。
      • 范斯普莱特S.C.
      • Haynes P.A.
      更少的标签,更自由:无标签定量质谱法的方法。
      )。
      磷蛋白丰度的分析必须区分与蛋白质表达相关的那些磷酸化的变化。对于涉及快速细胞刺激的实验范式(<在其中蛋白质表达仍然相对恒定,给定条件和其参考样品之间的蛋白质磷酸化的变化用作磷酸化化学计量相对变化的代理。这种方法与磷酸酪氨酸免疫亲和性富集和氧化酶组合使用,才能快速(<1分钟)刺激其配体后上皮生长因子受体磷酸化的特异性变化(
      • 邓布尔J.
      • Akimov V.
      • 奥尔森J.V.
      • Bunkenborg J.
      • Blagoev B.
      • 安德森J.S.
      非常早期细胞信号传导事件的定量蛋白质组学评估。
      )。定量磷蛋白酶也已用于鉴定其他受体的下游信号传导中间体,包括Ephb(
      • Jorgensen C.
      • 谢尔曼A.
      • 陈G.I.
      • Pascularescu A.
      • 波利亚科夫A.
      • Hsiung M.
      • 拉森B.
      • Wilkinson D.G.
      • 林德林
      • Pawson T.
      在偏见的Eph受体表达细胞分离群中的细胞特异性信息处理。
      ),Her2 / Neu(
      • Bose R.
      • 莫里娜H.
      • 帕特森A.S.
      • Bitok J.K.
      • Periasscamy B.
      • 獾J.s.
      • Pandey A.
      • COLE P.A.
      HER2 / NEU信号传导和抑制的磷肝蛋白酶分析。
      )和T细胞受体(
      • nguyen V.
      • CAO L.
      • 林J.T.
      • 丽思A.
      • yu K.
      • j
      • ulin s.p.
      • Raphael B.J.
      • leaidlaw d.h.
      • Brossay L.
      • Salomon A.R.
      一种新方法,用于定量磷蛋白沉积信号途径施加到T细胞受体活化。
      )。最近,使用Silac与TiO结合使用2 描述了由低丰度胸腺基质淋巴结蛋白细胞因子激活的信号传导途径的定量磷蛋白质分析的定量磷蛋白质抗体(
      • 钟杰。
      • 金马
      • Chaerkady R.
      • 吴X.
      • 黄T.C.
      • GetNet D.
      • 米切尔C.J.
      • Palapetta S.M.
      • Sharma J.
      • o'meally r.n.
      • COLE R.N.
      • 尤达A.
      • 莫里茨A.
      • Loriaux M.M.
      • 赶紧J.
      • weinstock d.m.
      • Tyner J.W.
      • Pandey A.
      基于Silac的磷蛋白酶透露的TSLP信号网络。
      )。
      磷酸化化学计量的精确测量显着挑战,但通常需要评估鉴定的位点的功能意义。在大规模的磷肝蛋白蛋白质实验中,这些测量需要蛋白质表达的标准化,以适当地解释磷酸化动力学(
      • 吴R.
      • Dephoure N.
      • 哈斯W.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      正确的综合磷酸化动力学解释需要蛋白质表达变化的标准化。
      )。近来的人细胞循环蛋白质组和磷脂体的定量分析使得在5000个位点上的磷酸化化学计量测定并揭示了在有丝分裂期间的基蛋白依赖性激酶1或2个基质的位点特异性上调(
      • 奥尔森J.V.
      • vermeulen M.
      • 桑塔马里亚A.
      • Kumar C.
      • 米勒M.L.
      • Jensen L.J.
      • GNAD F.
      • Cox J.
      • Jensen T.S.
      • nigg e.a.
      • 布鲁纳克斯。
      定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
      )。同位素标记和酶去磷酸化也可用于通过测量具有磷酸酶治疗的非磷酸化肽的丰度来确定磷酸化化学计量(Fig. 1)。最近展示了这一点 酿酒酵母酿酒酵母 在中记录阶段,观察到核和有丝分裂芽磷蛋白的丰富细胞溶质,核糖体和线粒体磷蛋白的低磷酸化化学计量。
      • 吴R.
      • 哈斯W.
      • Dephoure N.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      一种测量绝对蛋白质磷酸化化学物质测定的大规模方法。
      )。然而,磷酸化化学计量,蛋白质丰度和现场保护之间的正确关系还必须考虑残留物,结构蛋白质区域和蛋白质的背景守恒率(
      • Tan C.S.
      • 糟糕的G.D.
      更高化学计量的磷酸化位点更加保守。
      )。

      改进大规模研究的模型系统和范式

      一个往往被低估的因素有助于大规模研究的成功是生物系统的选择和优化。对于大多数蛋白质激酶,可以获得许多不同类型的增益和函数损失范例可用于定量磷蛋白酶(表I.)。这些包括使用细胞外激动剂与特定的药理学抑制剂联合,最近用于表征RAS / MAPK依赖性磷酸蛋白酶体(
      • Courcelles M.
      • Fremin C.
      • voisin L.
      • Lemieux S.
      • Meloche S.
      • Thibault P.
      磷酸膜动力学揭示具有广谱功能的新型ERK1 / 2映射激酶基材。
      )。在这些研究中,响应急性刺激监测磷蛋白的积累( IE。 血清或EGF)并与加入途径抑制剂以防止MAPK活化的细胞进行比较。另一种常见方法涉及使用表达途径组分的组成型活化或无活性等位基因的细胞( 例如 癌基因的表达或抑制肿瘤抑制器),导致组成型下游信号传导。结合药理学抑制剂,这种方法可以高效,但依赖于抑制剂治疗期间的基材去磷酸化,这可能在磷蛋白质中变化很大。该方法最近用于表征在MTOR下游发生的磷酸化事件(
      • HSU P.P.
      • 康S.A.
      • Rameseder J.
      • 张Y.
      • ottina K.A.
      • Lim D.
      • Peterson T.R.
      • 崔Y.
      • 灰色的N.S.
      • Yaffe M.B.
      • 玛托J.A.
      • Sabatini D.M.
      MTOR调节的磷酸酯组显示MTORC1介导的生长因子信号传导的抑制机制。
      ,
      • yu Y.
      • yoon s.o.
      • Poulogiannis G.
      • 杨Q.
      • 马X.M.
      • Villen J.
      • Kubica N.
      • 霍夫曼G.R.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      • Blenis J.
      磷蛋白酶分析将GRB10鉴定为负调节胰岛素信号传导的MTORC1底物。
      )和黑色酶B-RAF中含有激活突变的黑素瘤细胞的磷脂体(
      • 老为
      • Shabb J.B.
      • Houel S.
      • 王H.
      • couts K.L.
      • 日元c.y.
      • Litman E.S.
      • 克罗伊C.H.
      • Meyer-Arendt K.
      • Miranda J.G.
      • 棕色r.a.
      • Witze E.S.
      • Schweppe R.E.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      功能性蛋白质组学通过黑色素瘤中B-RAF信号传导鉴定磷酸化靶标。
      )。
      表I.大型磷蛋白酶研究中使用的模型系统和范式
      模型系统或范式例子优点限制
      生长因素和其他激动剂胰岛素,EGF,血清,DNA损伤剂,二甲双胍允许急性刺激以及时间研究特异性会有所不同。需要与更具体的方法(即抑制剂或RNAi)组合。
      组成型活化蛋白激酶oncogenes(例如,活化的B-RAF或PI3K)特定途径的特异性激活。通常,可以使用临床相关的突变。可能导致识别间接机制
      途径抑制剂的丧失肿瘤抑制剂(例如,TSC2,PTEN)特定途径的特异性激活。通常,可以使用临床相关的突变。可能导致识别间接机制
      药理抑制剂各种(例如,雷帕霉素,PI-103,PD184352)允许急性抑制和时间研究。可能是非常特异性的或靶向几种相关蛋白质。特异性可能是一个问题
      RNA干扰shrna或siRNA可以是高度的。可能性的可能性 体内 和一个诱导系统。可能导致识别间接机制
      药理抑制剂是急性抑制特定蛋白激酶的活性的不可或缺的工具;但是,这些工具具有不同的特异性和职能(
      • 贝恩J.
      • Mclauchlan H.
      • 艾略特M.
      • 科恩P.
      蛋白激酶抑制剂的特异性:更新。
      )。一种可行的方法是使用具有不同化学结构的第二个抑制剂验证磷蛋白蛋白酶数据,其前提是非特异性激酶基板将被排除在数据集之间的重叠之外。如果药理学抑制剂的可用性是一个问题,可以使用作用在两种不同的信号级联水平的抑制剂进行类似的比较。或者,可以认为RNA干扰或其他基因靶向策略更具体地灭活蛋白激活或感兴趣的途径。最近使用这种方法来确定肺癌细胞中罐结合激酶1的磷脂体(
      • Kim J.Y.
      • 威尔士E.A.
      • Oguz U.
      • 芳香。
      • 白y.
      • Kinose F.
      • 布朗克C.
      • remsing rix l.l.
      • 乞讨A.A.
      • rix u.
      • Eschrich S.A.
      • Komen J.m.
      • 哈拉e.b.
      肺癌细胞磷蛋白质的解剖剖析。
      )并在小鼠成纤维细胞中表征MTOR依赖的信号传导事件(
      • robitaille上午
      • 克里斯汀斯。
      • Shimobayashi M.
      • Cornu M.
      • Fava L.L.
      • Moes S.
      • prescianotto-baschong c。
      • Sauer U.
      • jenoe p.
      • 大厅M.N.
      定量磷蛋白酶揭示MTORC1激活DE NOVO嘧啶合成。
      )。虽然这些技术似乎比药理抑制剂更具体,但需要记住,他们还涉及长期下调,这增加了间接事件的可能速率。设计大规模研究时的其他重要考虑因素包括基质磷酸化的空间和时间调节。实际上,许多细胞蛋白质在特定细胞室中磷酸化或去磷酸化,并且亚细胞分级可能有利于增加相关磷酸化位点的鉴定。概况蛋白质磷酸化调节中的时间变化的能力也增加了经常依赖于对动态变化进行评估的单个时间点的数据集的质量。例如,最近施加定量磷蛋白蛋白酶的施用EGF网络的时间调节表明,哺乳动物SHC1通过多个不同磷酸化事件和蛋白质相互作用的多波进行响应(
      • 郑扬。
      • 张C.
      • 冰淇淋D.R.
      • Soliman M.A.
      • ST-Denis N.
      • Pascularescu A.
      • 泰勒L.
      • tate s.a.
      • HARDY W.R.
      • Colwill K.
      • 戴安..
      • Bagshaw R.
      • 丹尼斯J.W.
      • Gingras A.c.
      • 达利r.j.
      • Pawson T.
      支架蛋白SHC1的EGF信号传导网络的时间调节。
      )。总体而言,仔细优化生物系统的努力通常在测定设计中早期花费时间,因为原则上应该有助于鉴定磷酸化位点的表征。

      鉴定磷酸化位点的表征

      大规模磷蛋白酶研究鉴定的大量磷酸化位点成为后续实验的明显起点,旨在了解蛋白质磷酸化的调节和功能后果。然而,即使在最佳条件下,由于影响肽纯化和/或检测的几种不同因素,MS可以错过MS错失。因此,人们应该记住,磷蛋白酶筛网目前不饱和,并且鉴定磷酸化位点的未能往往不足以排除其不存在。当可能时,可行的替代方案是使用单独纯化的蛋白质进行靶向磷酸化位点测绘,以增加序列覆盖和磷酸化位点鉴定。
      由于大多数蛋白质似乎在多于一个残余物中磷酸化,并且通常由几种不同的蛋白激酶,磷酸化映射数据可以迅速变得压倒。特定蛋白质的磷酸化状态也可能取决于蜂窝环境及其环境,强调需要 在Silico. 更好地表征单个磷酸化位点的方法。在这种情况下,不同的生物信息学工具可以提供对磷酸化位点的保护( 例如 MUSCLE, ClustalW) (
      • 埃德加·克
      肌肉:高精度和高吞吐量的多个序列对齐。
      ,
      • Larkin M.A.
      • 黑板G.
      • 棕色N.P.
      • Chenna R.
      • McGettigan P.A.
      • McWilliam H.
      • Valentin F.
      • 华莱士我。
      • 威廉A.
      • Lopez R.
      • 汤普森J.D.
      • 吉布森T.J.
      • 希金斯D.G.
      Clustal W和Clustal X 2.0版。
      ),蛋白质激酶共识术( 例如 Phospho.elm,Predikin,Networkin,Scansite)(
      • gould c.m.
      • Diella F.
      • 通过A.
      • PunterVoll P.
      • 梅德隆C.
      • Chabanis-Davidson S.
      • 迈克尔斯。
      • Sayadi A.
      • Bryne J.C.
      • Chica C.
      • Seiler M.
      • Davey N.E.
      • 哈林
      • 耐候r.j.
      • 伙计A.
      • 休斯T.
      • PAS J.
      • Rychlewski L.
      • Trave G.
      • Aasland R.
      • Helmer-Citterich M.
      • 林德林
      • 吉布森T.J.
      榆树:2010年真核线性图案资源的状态。
      ,
      • 桑德斯N.F.
      • Brinkworth R.I.
      • Huber T.
      • KEMP B.E.
      • 科比B.
      predikin和predikindb:用于预测蛋白激酶肽特异性的计算框架和磷酸化位点的相关数据库。
      ,
      • 林德林
      • Jensen L.J.
      • Pascularescu A.
      • Olhovsky M.
      • Colwill K.
      • Bork P.
      • Yaffe M.B.
      • Pawson T.
      Networkin:用于探索蜂窝磷酸化网络的资源。
      ,
      • obenauerJ.C.
      • 坎特利L.C.
      • Yaffe M.B.
      Scansite 2.0:使用短序列图案的蛋白质组宽预测细胞信号传导相互作用。
      ),潜在的相互作用域名( 例如 Prodom,PFAM,Interpro)(
      • 猎人S.
      • APWEILER R.
      • Attwood T.K.
      • Bairoch A.
      • Bateman A.
      • Binns D.
      • Bork P.
      • Das U.
      • 老鹰脑油
      • Duquenne L.
      • 芬恩r.d.
      • Gough J.
      • HAFT D.
      • Hulo N.
      • Kahn D.
      • 凯莉E.
      • Laugraud A.
      • Leatunic I.
      • Lonsdale D.
      • Lopez R.
      • Madera M.
      • Maslen J.
      • Mcanulla C.
      • 麦克风J.
      • 朦胧J.
      • 米切尔A.
      • Mulder N.
      • Natale D.
      • Orengo C.
      • quinn a.f.
      • Selengut J.D.
      • SIGRIST C.J.
      • Thimma M.
      • 托马斯P.D.
      • Valentin F.
      • 威尔逊D.
      • 吴C.H.
      • 叶片C.
      Interpro:综合蛋白签名数据库。
      )和蛋白质蛋白质相互作用网络( 例如 字符串,生物格栅,完整)(
      • Chatr-aryamontri A.
      • Breitkreutz B.J.
      • Heinicke S.
      • 鲍克尔L.
      • 冬天A.
      • 斯塔克C.
      • 尼克松J.
      • Ramage L.
      • kolas n。
      • O'Donnell L.
      • 温典州T.
      • Breitkreutz A.
      • SELLAM A.
      • 陈德。
      • 昌C.
      • 铁锈J.
      • Livstone M.
      • ooughtred R.
      • Dolinski K.
      • 泰尔斯米
      BioGrid互动数据库:2013更新。
      ,
      • Franceschini A.
      • Szklarczyk D.
      • 弗里兰德尔
      • Kuhn M.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • 林J.
      • Minguez P.
      • Bork P.
      • von mering c.
      • Jensen L.J.
      串V9.1:蛋白质 - 蛋白质相互作用网络,覆盖率和集成增加。
      ,
      • Kerrien S.
      • 阿兰达B.
      • Breuza L.
      • 桥A.
      • 布雷克斯 - 卡特F.
      • 陈C.
      • Duesbury M.
      • 杜马斯米
      • Feuermann M.
      • Hinz U.
      • Jandrasits C.
      • JIMENEZ R.C.
      • kaadake J.
      • Mahadvan U.
      • 马登P.
      • Pedruzzi I.
      • pfeiffenberger E.
      • Porras P.
      • 拉吉纳州A.
      • Roechert B.
      • 果园S.
      • Hermjakob H.
      2012年完整的分子互动数据库。
      )。利用这些工具,可以若干预测是关于特异性蛋白质磷酸化的调节和功能,然后可以使用标准的生物化学和细胞生物方法进行测试。

      确认体外磷酸化

      蛋白激酶可能需要蛋白质基质在细胞中的磷酸化,但也可以有助于激活另一个直接作用在基材上的激酶( IE。 在相同的信号级联内的蛋白激酶)。出于这个原因,直接的演示 体外 磷酸化是定义激酶底物关系的必要步骤。即使分析特定的磷酸化位点,优选使用全长蛋白质基质,而不是合成肽或蛋白质片段来证明磷酸化。这将有助于一种确定相关的磷酸化位点以及推定的蛋白激酶是否具有任何偏好,至少 体外。这通常通过监测放射性磷酸盐掺入来完成,但如果存在关于精确磷酸磷受体位点或靶向共有磷酸化序列的先验知识,则也可以使用磷酸特异性或磷酸基序抗体来实现。该方法也可以用于 德诺维 使用基于MS的方法鉴定磷酸化位点,但必须在解释结果期间施加谨慎,因为许多蛋白激酶是混杂的 体外 如果给予足够的时间和蛋白质底物。因此, 体外 磷酸化不足以定义给定蛋白激酶的新磷酸化位点,并且化学计量测量可能会消除特异性 相对 混杂的磷酸化事件(
      • 吴R.
      • 哈斯W.
      • Dephoure N.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      一种测量绝对蛋白质磷酸化化学物质测定的大规模方法。
      )。

      细胞中磷酸化事件分析

      表征磷酸化事件的重要且通常限制步骤是优化可靠的测定以监测 体内 磷酸化。这可能偶尔被检测为电泳迁移率,在这种情况下,检测是快速简单的,并且允许确定磷酸化化学计量。这种方法的明显限制是,并非所有磷酸化事件都会导致迁移率偏移,但据报道了几种方法以促进其检测,例如改变丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例(
      • Nishiwaki T.
      • Satomi Y.
      • Kitayama Y.
      • Terauchi K.
      • Kiyohara R.
      • 塔约T.
      • Kondo T.
      KAIC双磷酸化的顺序程序作为蓝藻昼夜节律的基础。
      )或在SDS-PAGE之前掺入磷酸盐结合分子( 例如 Phos-Tag) (
      • Kinoshita E.
      • Kinoshita-Kikuta E.
      • Koike T.
      PHOS标签SDS-PAGE系统,用于蛋白质的磷酸化分析,在中性pH条件下具有宽范围的分子量。
      )。 体内 [32P 1 - 磷酸盐标记也用于映射和表征位点特异性磷酸化,但由于其耗时和低通量性质,这种方法对于实验读数有所不适。通常优选的是磷脂特异性抗体,但不能用这种方法检测所有磷酸化位点和/或残基。识别磷酸酪氨酸的抗体已成功使用数十年,但磷素和磷酸胆碱的免疫原性较少,目前没有可比较的抗体。如上所述,磷酸基质抗体可用于通过特定类别的蛋白激酶进行磷酸化(
      • 张H.
      • Zha X.
      • 谭y。
      • 哈贝克P.V.
      • mastrangelo a.j.
      • Alessi D.R.
      • Polakiewicz R.D.
      • 梳理M.J.
      使用抗体宽反应对磷酸化基序的磷蛋白分析。
      )但是必须在使用这些工具时施加谨慎,因为对磷酸化位点的识别也可以取决于周围序列。更好的方法是使用针对类似基序的磷酸基肽抗体的组合来减少不需要的非特异性结合(
      • 莫里茨A.
      • 李Y.
      • 郭阿。
      • Villen J.
      • 王Y.
      • 麦克奈尔J.
      • Kornhauser J.
      • Sprott K.
      • 周J.
      • 可能A.
      • 任吉。
      • 犀鸟P.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      AKT-RSK-S6激酶信号通过致癌受体酪氨酸激酶激活。
      )。这可以与点定向诱变组合,以表征负责免疫反应性的磷酸化位点(
      • roux p.p.
      • Ballif B.A.
      • Anjum R.
      • Gygi S.P.
      • Blenis J.
      肿瘤促进凤球酯和活化的Ras通过P90核糖体S6激酶灭活结核硬化肿瘤抑制器络合物。
      ,
      • Manning B.D.
      • TEE A.R.
      • logsdon m.n.
      • Blenis J.
      • 坎特利L.C.
      鉴定结节硬化复合体-2肿瘤抑制剂基因产物结带蛋白作为磷酸膦酸碱基三酶/ AKT途径的靶。
      )。一旦鉴定了特定的磷酸化位点,可以产生磷酸特异性抗体并用于监测精确的磷酸化位点。虽然这些工具既昂贵又缺乏,但它们目前被视为用于监测细胞中特异性磷酸化的金标准。

      涉及蛋白激酶的表征

      如上简要提及,蛋白激酶的表征开始于分析共有识别序列。蛋白激酶预测存在许多计算工具,其可用于将鉴定的磷酸化位点与推定的蛋白激酶匹配。一旦建立,药理学抑制剂和函数丧失方法都可用于使用优选的磷酸化位点读出来确定蛋白激酶的要求。药理方法具有允许急性激酶抑制的优点,从而降低间接机制的可能性。当然,人们还必须意识到同一家族的蛋白质激酶之间的潜在冗余,这通常会使基质磷酸化的分析复杂化。互补实验可以用外源表达的蛋白激酶突变体进行,这在某些情况下已经显示出表现为显性负面等位基因。或者,可以使用其中感兴趣的蛋白质激酶耗尽或删除的细胞系来验证其含有底物磷酸化的涉及。遗传超越允许基于其表型表达的途径中的基因排序。这可用于定位特定蛋白激酶的新候选底物,但是需要更严格的方法来证明通过磷酸化直接调节。虽然激酶结构域通常不对其基材显示出显着的亲和力,但许多蛋白激酶使用专用对接图案与它们的基板相关联,例如 d - 在一些MAPK基质中发现了域(
      • Cargnello M.
      • roux p.p.
      MAPK. 及其基质的激活和功能,MAPK活化蛋白激酶。
      )。而且,蛋白激酶与其基材之间的物理相互作用的鉴定增加了该调节是直接的置信度。

      蛋白质磷酸化的功能意义

      评估大规模磷蛋白研究中鉴定的受管制磷酸化位点的生物学意义代表了重要的任务。尽管存在不同的生物信息学工具,用于确定磷酸化位点的保护及其在功能域中可能的位置,但大规模的功能分析仍然非常有限。对于大的蛋白质小区,磷酸化与蛋白质活性紧密相关,是蛋白质功能调节的关键点。蛋白质磷酸化通常诱导调节蛋白质内在功能性质的结构变化(Fig. 2)。这些变化通常是由磷酸基团和相邻氨基酸之间的破坏或创造的破坏或创造,并且它们通常涉及α-螺旋的高管残留物和骨干氮的带正电荷的胍侧链。对蛋白质磷酸化的影响的评估通常涉及位点的突变( IE。 SER / THR至ALA或TYR到PHE),以便可以确定它们的生物学意义。当磷酸化位点的突变导致功能丧失时,通常必须确保突变导致蛋白质的非特异性变化通常是重要的。也可以通过用天冬氨酸或谷氨酸残基代替磷酸化位点来产生所谓的磷酸敏感突变。尽管这些突变可以参与创造新的氢键,但它们通常不会模拟磷酸依赖性衔接蛋白的结合位点。实际上,蛋白质磷酸化的另一种常见结果是为蛋白质的磷酸依赖性结合位点产生磷酸依赖性结合位点,例如14-3-3和含有FORKhead相关的(FHA)域蛋白质( Fig. 2),其显示出磷酸化丝氨酸或苏氨酸残留物的特异性(
      • DUROCHER D.
      • Henckel J.
      • fersht a.r.
      • 杰克逊S.P.
      FHA结构域是模块化磷酸肽识别基序。
      ,
      • Yaffe M.B.
      • 催化剂K.
      • 沃林斯。
      • 鲫鱼P.R.
      • Aitken A.
      • leffers h.
      • gamblin s.j.
      • smerdon s.j.
      • 坎特利L.C.
      结构基础为14-3-3:磷酸肽结合特异性。
      )。另外的实例包括SRC同源性2(SH2)和含磷脂蛋白结合(PTP)域域的蛋白质,其在序列依赖性上下文中选择性地结合磷蛋白酶(
      • 卡万夫为
      • Turck C.W.
      • 威廉姆斯L.T.
      PTB域通过含有磷蛋白酶的序列基序结合到信号传导蛋白。
      ,
      • 莫兰姆。
      • koch c.a.
      • 安德森D.
      • ellis c.
      • 英格兰L.
      • 马丁G.S.
      • Pawson T.
      SRC同源区2结构域在信号转导中直接蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )。因为磷酸敏感突变通常不能再现对由磷酸化引起的蛋白质的变化,所以这些突变体的行为有时难以解释。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2蛋白质磷酸化的功能意义。 说明蛋白质磷酸化在介质各种生物学结果中的不同作用的示意图。 (1)当含SH2结构域的蛋白质(例如GRB2和P85)与酪氨酸磷酸化受体在质膜中结合时,可以发生磷酸化依赖性膜易位。 (2)蛋白激酶在其活化环(T环)中的磷酸化,例如用MEK,ERK和RSK是一种常见的激活机构,其依赖于激酶结构域内的结构重排。 (3)支架蛋白如14-3-3的支架蛋白的磷酸化依赖性结合可以用作某些激酶底物的细胞质锚,例如通过Akt磷酸化时FoxO1。 (4)在某些情况下,蛋白质磷酸化可以促进蛋白质稳定性,例如即时早期基因产物C-FOS的情况。 (5),(6)已经显示出某些转录因子的磷酸化促进或阻碍DNA结合,如FoxO1和C-FOS所示。 (7)所谓的序列内的某些蛋白质的磷酸化可以通过特异性泛素连接酶和随后的蛋白质体降解来促进其识别,如转录因子FoxO3和E3连接酶MDM2所示。
      如上所述,蛋白质磷酸化导致基材结构性能的变化,但也可以影响蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。这些变化可以具有不同的生物结果,例如对蛋白质亚细胞定位的影响( 例如 核易位或细胞质保留),降解和稳定性,以及内在催化活性的变化( IE。 激活或失活)(Fig. 2)。例如,位于其C-末端NLS附近的SER457的PDCD4磷酸化,显示出促进其核易位以响应于生长因子的AKT激活(
      • Palamarchuk A.
      • Efanov A.
      • Maximov V.
      • aqeilan r.i.
      • Croce C.M.
      • Pekarsky Y.
      AKT磷酸化并调节PDCD4肿瘤抑制蛋白。
      )。蛋白激酶本身是后者的非常好的实例,因为大多数通过其活化环内残留物的磷酸化而活化( IE。 T-LOOP)。蛋白质磷酸化也可以发生在遍布泛素连接酶复合物(例如SCF)识别的序列内 βtrcp. ,识别丝氨酸残基被特异性蛋白激酶磷酸化的共有(X)PS)(
      • Skowyra D.
      • Craig K.L.
      • 泰尔斯米
      • elldege s.j.
      • 哈珀J.W.
      F箱蛋白质是募集磷酸化底物的受体,以至于SCF泛素 - 连接酶复合物。
      )。蛋白质磷酸化还可以揭示或阻塞调节基材的亚细胞定位的序列,例如核排斥和定位信号( IE。 nes和nls)。或者,位于衔接子结合位点内的残基的磷酸化可以诱导与血浆膜的底物易位,例如用GRB2和PI3K的P85亚基,其含有SH2结构域,其在特定基序内与磷酸丝糖苷相互作用(
      • 莫兰姆。
      • koch c.a.
      • 安德森D.
      • ellis c.
      • 英格兰L.
      • 马丁G.S.
      • Pawson T.
      SRC同源区2结构域在信号转导中直接蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )。并发症是蛋白质底物通常在多个位点磷酸化,为蛋白质功能提供独立或协同作用。因为许多蛋白质可以通过多种蛋白激酶磷酸化,因此必须特别注意确保假设源自严格和高置信磷蛋白酶数据。

      串扰和与其他翻译后修改的相互作用

      磷酸化可以正面或负面调节其他类型的PTM。阳性串扰涉及磷酸化发起另一种修饰的情况,而负串扰从同一部位的修饰或通过抑制第二种改性(Fig. 3)。蛋白质磷酸化的加工和抑制作用也可以在由不同激酶或磷酸酶改性的多个位点上发生。众所周知的实例包括在Txy基序(其中X是任何氨基酸)的MAPK的连续磷酸化(
      • Aoki K.
      • 山田M.
      • Kunida K.
      • Yasuda S.
      • Matsuda M.
      哺乳动物细胞中ERK地图激酶的加工磷酸化。
      ),N-末端的加工磷酸化( 例如 糖原合成酶激酶3)或C末端( 例如 CKI)磷酸盐的侧面,以及通过激酶CSK保守的C末端酪氨酸的磷酸化后形成无活性折叠状态的SRC酪氨酸激酶活性的抑制(
      • COLE P.A.
      • 申K.
      • 乔Y.
      • 王D.
      蛋白质酪氨酸激酶SRC和CSK:尾巴的故事。
      )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3蛋白质磷酸化和其他修饰之间的串扰。 在圆形矩形中突出显示蛋白质磷酸化对不同修饰的正面和阴性调节的实例。磷酸化之间的相互作用 O还显示出特异性SER / THR残基的-GLCNAcylation。
      磷酸化和ubiquitylation之间的串扰可能代表蛋白质修饰之间最多研究的交叉点之一(在参考文献中审查。
      • 猎人T.
      串扰的年龄:磷酸化,泛素,及以后。
      )。磷酸化可以通过影响靶蛋白结合来调节E3连接酶的活性( 例如 与E6 AP羧基末端(HECT)结构域同源)(
      • Ichimura T.
      • yamamura h.
      • Sasamoto K.
      • Tominaga Y.
      • Taoka M.
      • Kakiuchi K.
      • Shinkawa T.
      • Takahashi N.
      • Shimada S.
      • isobe t.
      14-3-3蛋白通过与NEDD4-2泛素连接酶的磷酸化依赖性相互作用调节上皮NA +通道的表达。
      )或通过引起变构激活/抑制(
      • 加拉赫E.
      • 高米
      • 刘Y.C.
      • 卡琳米
      通过磷酸化诱导的构象变化激活E3泛素连接酶瘙痒。
      ,
      • 杨C.
      • 周W.
      • Jeon M.S.
      • demydenko d。
      • 哈拉达y.
      • 周H.
      • 刘Y.C.
      通过Fyn介导的酪氨酸磷酸化对E3泛素连接酶Itch的负调节。
      )。底物磷酸化还可以在蛋白质基材上产生识别信号(磷涂体),其利用E3连接酶的结合和随后的蛋白酶体降解(
      • Cardozo T.
      • Pagano M.
      SCF泛素连接酶:洞察分子机器。
      )。例如,由F-Box蛋白的两个亚壳识别出几种磷光胶( 例如 WD40重复和富含亮氨酸的重复)包含在SKP1 / CULLIN / F-BOX E3 Ligases(
      • 猎人T.
      串扰的年龄:磷酸化,泛素,及以后。
      )。除了泛络酶之外,磷酸化还可以调节脱氢素酶的活性,如USP44所示,它增强活性并防止过早激活的促进促进复合物(
      • Stegmeier F.
      • 强奸M.
      • DRAVIAM V.M.
      • NALEPA G.
      • Sowa M.E.
      • Ang X.L.
      • 麦克唐纳3号,E.R.
      • 李米兹。
      • Hannon G.J.
      • 索勒P.K.
      • Kirschner M.W.
      • 哈珀J.W.
      • elldege s.j.
      通过拮抗泛素化和脱氮活性来调节外阴脱发。
      )。有趣的是,最近的两个大规模蛋白质组学研究描述了磷酸化和泛素酸化基材的连续富集的不同方法(
      • Mertins P.
      • 乔J.W.
      • Patel J.
      • Udeshi N.D.
      • 克劳瑟K.R.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.W.
      • Gillette M.A.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
      ,
      • Swaney D.L.
      • Beltrao P.
      • Starita L.
      • 郭阿。
      • 赶紧J.
      • 领域S.
      • krogan n.j.
      • Villen J.
      蛋白质降解中的磷酸化和泛醌串扰的全局分析。
      )揭示了激酶的新型调节机制和14-3-3个支架蛋白质通过蛋白酶体无关的泛醌(
      • Swaney D.L.
      • Beltrao P.
      • Starita L.
      • 郭阿。
      • 赶紧J.
      • 领域S.
      • krogan n.j.
      • Villen J.
      蛋白质降解中的磷酸化和泛醌串扰的全局分析。
      )。
      磷酸化也可以影响由Sublation,乙酰化或甲基化改性的相邻的赖氨酸残基。例如,在几种蛋白质中鉴定了磷酸化依赖性Sumo基序= kxxxsp(其中ψ是疏水性氨基酸和x是任何氨基酸),其是Sumo缀合和脯氨酸导向的激酶(
      • 杨X.J.
      • 格雷戈尔S.
      转录镇压和超越的经常性磷酸血管开关。
      )。通过磷酸化的阳性调节均匀地显示为几个基材,包括FEN1(
      • 郭Z.
      • Kanjanapangka J.
      • 刘恩
      • 刘S.
      • 刘C.
      • 吴Z.
      • 王Y.
      • LOH T.
      • Kowolik C.
      • jamsen J.
      • 周米
      • Truong K.
      • 陈Y.
      • 郑L.
      • 沉B.
      顺序后翻译修改程序FEN1在细胞周期进展期间降解。
      ),在其中顺序修饰重新培训泛菌靶向泛素的泛素结石酶,其通过蛋白酶体途径导致其降解(
      • Prudden J.
      • Pebernard S.
      • 拉菲G.
      • Slavin D.A.
      • Perry J.J.
      • Tainer J.A.
      • 麦格兰C.H.
      • Boddy M.N.
      基因组稳定性中的Sumo-靶向泛素连接酶。
      )。相比之下,磷酸化可以拮抗E3 Sumo连接酶的结合,如特殊的富含含量的序列结合蛋白1,其中蛋白激酶C通过蛋白激酶C磷酸化阻碍与活化统计蛋白抑制剂的相互作用,并通过Caspase 6阻止其裂解(
      • Tan J.A.
      • 宋J.
      • 陈Y.
      • Durrin L.K.
      SATB1和PIAS1的磷酸化依赖性相互作用引导SATB1的SUMO调节的胱天蛋白酶切割。
      )。
      此外,可以通过磷酸化激活诸如CALPAIN,DESINTEGRIN和DESINTEG素和金属蛋白酶(ADAM)的蛋白酶,而几种胱天蛋白酶和分离(
      • Kurokawa M.
      • Kornbluth S.
      死亡握把的木蛋白酶和激酶。
      ,
      • Lopez-Otin C.
      • 猎人T.
      激酶和癌症蛋白酶之间的调节串扰。
      )。以前的研究表明磷酸酶切割对磷酸化的功能作用表明,磷酸化主要防止胱天蛋白酶切割(
      • Kurokawa M.
      • Kornbluth S.
      死亡握把的木蛋白酶和激酶。
      ,
      • 邓肯J.S.
      • Turowec J.P.
      • Vilk G.
      • 李斯。
      • gloor g.b.
      • Litchfield D.W.
      细胞增殖和存活的调节:蛋白激酶和木蛋白酶的收敛性。
      ,
      • Tozser J.
      • Bagossi P.
      • Zahuczky G.
      • Speht S.I.
      • Majerova E.
      • COPELAND T.D.
      胱天冬酶切割位点磷酸化对蛋白水解的影响。
      )。然而,在凋亡条件下进行的最近进行的大规模蛋白质组学研究表明,Caspase切割可以暴露否则将无法进入的磷酸化位点,并且在+3裂解位点的磷酸化的磷酸化可以通过Caspase 8促进基质蛋白水解(
      • 迪克斯米。
      • 西蒙上午
      • 王C.
      • 好的 erberg E.
      • Patricelli M.P.
      • Cravatt B.F.
      Caspase切割和磷酸化之间的功能相互作用雕刻凋亡蛋白质组。
      )。
      还描述了一种复杂的相互作用用于磷酸化和附件 O - 链接 N - 乙酰甘氨酸胺(GlcNAc)至特异性Ser / Thr残基,它们可以在竞争同一部位或占据基材上的不同部位(
      • 哈特G.W.
      • Housley M.P.
      • Slawson C.
      O-连接的β-N-乙酰淀粉胺在核细胞质蛋白上循环。
      )。磷酸化会影响活性 O-GLCNAC改性酶,和 O-Glcnacylation可以调节激酶活性。最近的蛋白质组学调查强调了剧烈的变化 O-GlcNacylation在抑制糖原合酶激酶3并通过选择性抑制 O-GLCNACase活性(
      • 王Z.
      • Pandey A.
      • 哈特G.W.
      O型N-乙酰葡糖胺胺基化与糖原合成酶激酶-3依赖性磷酸化之间的动态相互作用。
      )。蛋白质显示主动循环磷酸化位点升高 O-GlCnacylation包括细胞骨架蛋白,代谢酶,激酶,转录因子和RNA处理因子。之间的相互作用 O-GLCNAC和磷酸化原则上可以用作信令网络中的逻辑门。

      结论和观点

      虽然在50年前发现了第一蛋白激酶,但过去十年已经看到鉴定的磷酸化位点的数量是指数增加。这主要是由于LC-MS / MS和磷酸富集策略的最新进展,现在允许具有精确和灵敏度的磷酸化位点的快速鉴定。尽管有这些成就,但比较研究表明,将需要进一步改进MS仪器和其他分析工具以进行饱和时间。这是最近关于MAPK信号传导的磷脂蛋白酶研究的最佳举例说明,所述MAPK信号传导使用互补技术平台并鉴定了磷酸化基板的不同子集(
      • Courcelles M.
      • Fremin C.
      • voisin L.
      • Lemieux S.
      • Meloche S.
      • Thibault P.
      磷酸膜动力学揭示具有广谱功能的新型ERK1 / 2映射激酶基材。
      ,
      • 老为
      • Shabb J.B.
      • Houel S.
      • 王H.
      • couts K.L.
      • 日元c.y.
      • Litman E.S.
      • 克罗伊C.H.
      • Meyer-Arendt K.
      • Miranda J.G.
      • 棕色r.a.
      • Witze E.S.
      • Schweppe R.E.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      功能性蛋白质组学通过黑色素瘤中B-RAF信号传导鉴定磷酸化靶标。
      ,
      • 锅C.
      • 奥尔森J.V.
      • Daub H.
      激酶抑制剂对定量磷蛋白酶揭示信号网络的全局影响。
      )。虽然似乎通过使用不同的定量磷蛋白酶组织的不同策略可以减少这些限制,但磷酸肽的绝对定量和磷酸化化学计量的测定需要进一步的发展。
      尽管当前可用的大量定量磷蛋白质数据数据,但验证仍然相当有限,并且只有非常小的磷酸化位点与特定的生物学功能有关。未来的主要目标将是从磷酸化地点的大型磷酸化地点移动到挑战生物学相关磷酸化事件的挑战任务。与整合不同 - 型磁场的生物信息学和计算生物学的进一步进展应提供有关激酶调节磷酸化事件的有用信息。磷蛋白酶数据也可用于理解信号传导途径与磷酸化的时空调节所需的磷酸雌激素,以在系统生物学水平处破译复合电路所需的磷酸化。另一个重要的研究领域是不同类型的PTM之间的串扰的表征。虽然泛醌和磷酸化之间的串扰合理地理解,但是关于磷酸化和其他类型的PTM之间的潜在串扰,例如Sublation,糖基化,甲基化和乙酰化。显然,所选择的磷酸化位点及其激酶的详细生化和细胞生物学分析对于阐明其调节功能是重要的。因此,可以对寻找更好的工具来验证和功能表征由磷蛋白酶研究产生的磷酸化位点的更好的工具。

      致谢

      我们感谢Drs。 Sylvain Meloche,Jacob Galan和Evgeny Kanshin(Universitédemontréal),有价值的见解和建议。

      参考

        • Pawson T.
        信号转导的特异性:从磷酸酪氨酸-SH2结构域相互作用与复合细胞体系。
        细胞。 2004; 116: 191-203
        • Ubersax J.A.
        • Ferrell Jr.,J.E.
        蛋白质磷酸化特异性机制。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2007; 8: 530-541
        • 勇敢的J.
        • 猎人T.
        癌症中蛋白激酶信号网络。
        Curr。拍摄。遗传。开发。 2011; 21: 4-11
        • Tidyman W.E.
        • Rauen K.A.
        Rasopathies:RAS / MAPK途径失调综合征的发育综合征。
        Curr。拍摄。遗传。开发。 2009; 19: 230-236
        • 金杰。
        • 史密斯F.D.
        • 斯塔克C.
        • 井C.D.
        • Fawcett J.P.
        • Kulkarni S.
        • Metalnikov P.
        • O'Donnell P.
        • 泰勒P.
        • 泰勒L.
        • 邹格曼A.
        • Woodgett J.R.
        • Langeberg L.K.
        • 斯科特J.D.
        • Pawson T.
        体内蛋白质组学,功能和结构域分析,参与细胞骨骼调节和细胞组织的结合蛋白。
        Curr。 BIOL。 2004; 14: 1436-1450
        • atrih A.
        • CORDOCK D.
        • SELLAR G.
        • 汤普森A.
        • Feuerstein G.
        • Ferguson M.A.
        • 黄杰特。
        使用LC-MS / MS的AKT磷酸化的化学计量定量。
        J.蛋白质组。 2010; 9: 743-751
        • 莫里茨A.
        • 李Y.
        • 郭阿。
        • Villen J.
        • 王Y.
        • 麦克奈尔J.
        • Kornhauser J.
        • Sprott K.
        • 周J.
        • 可能A.
        • 任吉。
        • 犀鸟P.
        • 坎特利L.C.
        • Gygi S.P.
        • 赶紧J.
        • 梳理M.J.
        AKT-RSK-S6激酶信号通过致癌受体酪氨酸激酶激活。
        SCI。信号。 2010; 3: ra64
        • Jedrychowski M.P.
        • Huttlin E.L.
        • 哈斯W.
        • Sowa M.E.
        • RAD R.
        • Gygi S.P.
        鼠磷蛋白蛋白酶各自检测平台内的HCD和CID型碎片评价。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (M111.009910)
        • Rikova K.
        • 郭阿。
        • 曾Q.
        • 可能A.
        • yu J.
        • 海克H.
        • Nardone J.
        • 韭葱。
        • Reeves C.
        • 李Y.
        • 胡Y.
        • 谭Z.
        • 斯托克斯米
        • Sullivan L.
        • 米切尔J.
        • Wetzel R.
        • 麦克奈尔J.
        • 任吉。
        • 元J.
        • bakalarski c.e.
        • Villen J.
        • Kornhauser J.M.
        • 史密斯B.
        • 李德。
        • 周X.
        • Gygi S.P.
        • GU T.L.
        • Polakiewicz R.D.
        • 赶紧J.
        • 梳理M.J.
        全球磷酸赖硒信令调查鉴定肺癌中的致癌酶。
        细胞。 2007; 131: 1190-1203
        • 赶紧J.
        • 莫里茨A.
        • 李克.A.
        • 郭阿。
        • 高斯v.l.
        • spek e.j.
        • 张H.
        • Zha x.m.
        • Polakiewicz R.D.
        • 梳理M.J.
        癌细胞中酪氨酸磷酸化的免疫亲和力分析。
        NAT。 Biotechnol。 2005; 23: 94-101
        • 吴R.
        • Dephoure N.
        • 哈斯W.
        • Huttlin E.L.
        • 翟德
        • Sowa M.E.
        • Gygi S.P.
        正确的综合磷酸化动力学解释需要蛋白质表达变化的标准化。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (M111.009654)
        • Thingholm T.e.
        • Larsen M.R.
        • Ingrell C.R.
        • 卡西姆M.
        • Jensen O.N.
        基于血浆膜的基于磷蛋白蛋白酶分析及磷酸酶抑制剂治疗的影响。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 3304-3313
        • wisniewski J.R.
        酶反应器中连续的蛋白水解消解增加了蛋白质组学和磷蛋白酶分析的深度。
        肛门。化学。 2012; 84: 2631-2637
        • 卞Y.
        • 歌曲C.
        • 程K.
        • 王C.
        • 魏X.
        • 朱茹
        • 陈R.
        • 王F.
        • zou h.
        通过串联消化方法改善Hela细胞磷脂蛋白酶分析的覆盖范围。
        J.蛋白质组。 2012; 11: 2828-2837
        • Ficarro S.B.
        • 张Y.
        • Carrasco-Alfonso M.J.
        • Garg B.
        • Adelmant G.
        • Webber J.T.
        • 卢旺目C.J.
        • 玛托J.A.
        在线纳米射线多维分馏,用于高效磷酸肽分析。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (O111.011064)
        • Villen J.
        • Gygi S.P.
        通过质谱法的全局磷酸化分析的SCX / IMAC富集方法。
        NAT。 protoc。 2008; 3: 1630-1638
        • McNulty D.E.
        • 安南R.S.
        亲水性相互作用色谱法降低了磷蛋白酶组的复杂性,提高了全局磷酸肽分离和检测。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2008; 7: 971-980
        • GaN C.S.
        • 郭t.
        • 张H.
        • LIM S.K.
        • SZE S.K.
        静电排斥 - 亲水相互作用色谱(Erlic)与磷酸肽分离/富集的SCX-IMAC基方法对比研究。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 4869-4877
        • 安德森L.
        • Porath J.
        固定化金属(Fe3 +)亲和色谱法分离磷蛋白。
        肛门。生物学习。 1986; 154: 250-254
        • Nuhse T.
        • yu K.
        • Salomon A.
        固定化金属离子亲和色谱法分离磷酸肽。
        Curr。 protoc。摩尔。 BIOL。 2007; (第18章,单元18.13)
        • Thingholm T.e.
        • Jensen O.N.
        固定化金属亲和色谱法(IMAC)和质谱法富集和表征磷酸肽。
        方法mol。 BIOL。 2009; 527 ( xi. ): 47-56
        • Ikeguchi Y.
        • Nakamura H.
        用在线前浓缩柱切换高性能阴离子交换色谱法测定二氧化尼亚州的直接浓度的含量。
        肛门。 SCI。 1997; 13: 479-483
        • Pinkse M.W.
        • Uitto下午
        • hilhorst m.j.
        • OOM B.
        • Heck A.J.
        使用2D-Nanolc-ESI-MS / MS和氧化钛预训柱的蛋白水解消化的雌性磷酸磷肽的Femtomole水平的选择性分离。
        肛门。化学。 2004; 76: 3935-3943
        • Posewitz M.C.
        • Tempst P.
        固定化镓(III)磷酸肽的亲和层析。
        肛门。化学。 1999; 71: 2883-2892
        • Ficarro S.B.
        • Parikh J.R.
        • 空白N.C.
        • 玛托J.A.
        铌(V)氧化物(NB2O5):磷蛋白酶的应用。
        肛门。化学。 2008; 80: 4606-4613
        • Kweon H.K.
        • 哈莎逊K.
        基于二氧化锆的磷酸化肽的选择性锆富集进行质谱分析。
        肛门。化学。 2006; 78: 1743-1749
        • Thingholm T.e.
        • Jensen O.N.
        • 罗宾逊P.J.
        • Larsen M.R.
        SIMAC(来自IMAC的顺序洗脱),一种磷蛋白酶策略,用于从倍增磷酸化肽的快速分离单磷酸化。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2008; 7: 661-671
        • Beltran L.
        • Cutillas P.R.
        磷蛋白酶磷肽富集技术的研究进展。
        氨基酸。 2012; 43: 1009-1024
        • 邓恩J.D.
        • 里德G.E.
        • 瘀伤M.L.
        通过质谱法在分析之前进行磷酸肽富集的技术。
        质谱。录 2009; 29: 29-54
        • Engholm-Keller K.
        • Larsen M.R.
        大规模磷蛋白质中的技术和挑战。
        蛋白质组学。 2013; 13: 910-931
        • 堪察州E.
        • Michnick S.
        • Thibault P.
        大规模磷蛋白酶实验的样品制备和分析策略。
        Semin。细胞开发。 BIOL。 2012; 23: 843-853
        • Mikesh L.M.
        • Ueberheide B.
        • Chi A.
        • Coon J.J.
        • Syka J.E.
        • Shabanowitz J.
        • 狩猎d.f.
        ETD质谱法在蛋白质组学分析中的效用。
        Biochim。 Biophys。 acta。 2006; 1764: 1811-1822
        • Chi A.
        • HUTTENHOWER C.
        • geer l.y.
        • Coon J.J.
        • Syka J.E.
        • 白D.L.
        • Shabanowitz J.
        • Burke D.J.
        • troyanskaya o.g。
        • 狩猎d.f.
        蛋白质磷酸化位点分析 酿酒酵母酿酒酵母 通过电子转移解离(ETD)质谱法。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2007; 104: 2193-2198
        • 莫里娜H.
        • 喇叭d.m.
        • 唐ñ。
        • Mathivanan S.
        • Pandey A.
        磷酸肽的全局蛋白质组学分析使用电子转移解离串联质谱法。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2007; 104: 2199-2204
        • Courcelles M.
        • Bridon G.
        • Lemieux S.
        • Thibault P.
        大规模磷蛋白质族实验中磷酸肽异构体的发生和检测。
        J.蛋白质组。 2012; 11: 3753-3765
        • 奥尔森J.V.
        • Blagoev B.
        • GNAD F.
        • MACEK B.
        • Kumar C.
        • Mortensen P.
        全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
        细胞。 2006; 127: 635-648
        • Beausoleil S.A.
        • Villen J.
        • 格柏S.A.
        • 赶紧J.
        • Gygi S.P.
        基于概率的高通量蛋白磷酸化分析和现场定位方法。
        NAT。 Biotechnol。 2006; 24: 1285-1292
        • 罗滕贝格B.E.
        • Pisitkun T.
        • Knepper M.A.
        • Hoffert J.D.
        磷源:用于MSN数据的开源磷酸化站点分配工具。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 3054-3059
        • 万王。
        • CRIPPS D.
        • 托马斯S.
        • 坎贝尔P.
        • Ambulos N.
        • 陈T.
        • 杨阿。
        磷斯坦:使用MS2 / MS3对信息的磷酸化站点预测的基于概率的方法。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 2803-2811
        • 麦克莱恩D.
        • Burrell M.A.
        • Studholme D.J.
        • 琼斯上午
        Phoscalc:一种用于评估来自质谱仪数据的肽磷酸化位点的工具。
        BMC RES。笔记。 2008; 1: 30
        • Bailey C.M.
        • 甜蜜的三个
        • Cunningham D.L.
        • Zeller M.
        • Heath J.K.
        • Cooper H.J.
        SLOMO:从ETD / ECD质谱的自动化网站定位修改。
        J.蛋白质组。 2009; 8: 1965-1971
        • Swaney D.L.
        • 温格C.D.
        • Thomson J.A.
        • Coon J.J.
        人胚胎干细胞磷脂蛋白酶通过电子转移解离串联质谱法揭示。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2009; 106: 995-1000
        • Taus T.
        • kocher t.
        • Pichler P.
        • Paschke C.
        • 施密特A.
        • Henrich C.
        • Mechtler K.
        使用磷光体的普遍和自信的磷酸化位点定位。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 5354-5362
        • Kearney P.
        • Thibault P.
        生物信息学符合蛋白质组学桥接质谱数据分析与细胞生物学之间的差距。
        J. Bioinform。计算。 BIOL。 2003; 1: 183-200
        • ong s.e.
        • Blagoev B.
        • Kratchmarova I.
        • 克里斯滕森D.B.
        • 斯丁H.
        • Pandey A.
        细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 376-386
        • 罗斯P.L.
        • 黄玉。
        • Marchese J.N.
        • 威廉姆斯B.
        • 帕克克。
        • 哈桑斯。
        • Khainovski N.
        • Pillai S.
        • 丹尼尔斯S.
        • Purkayastha S.
        • Juhasz P.
        • 马丁斯。
        • Bartlet-Jones M.
        • 雅各布森A.
        • Pappin D.J.
        多路复用蛋白质定量 酿酒酵母酿酒酵母 使用胺反应性的等离性标记试剂。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2004; 3: 1154-1169
        • 汤普森A.
        • Schafer J.
        • Kuhn K.
        • Kienle S.
        • Schwarz J.
        • 施密特G.
        • Neumann T.
        • 约翰斯通r.
        • 穆罕默德A.K.
        • 哈蒙克
        串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
        肛门。化学。 2003; 75: 1895-1904
        • Mcalister G.C.
        • Huttlin E.L.
        • 哈斯W.
        • L.
        • Jedrychowski M.P.
        • 罗杰斯J.C.
        • Kuhn K.
        • 派克I.
        • 格罗罗德。
        • Blethrow J.D.
        • Gygi S.P.
        用同位素质量使用报道离子同位素增加TMT的多路复用能力。
        肛门。化学。 2012; 84: 7469-7478
        • 格柏S.A.
        • 赶紧J.
        • STEMMAN O.
        • Kirschner M.W.
        • Gygi S.P.
        通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2003; 100: 6940-6945
        • Nilsson C.L.
        定量磷蛋白酶的进展。
        肛门。化学。 2012; 84: 735-746
        • Pimienta G.
        • Chaerkady R.
        • Pandey A.
        Silac用于全局磷肝蛋白酶分析。
        方法mol。 BIOL。 2009; 527 (x): 107-116
        • ong s.e.
        • 福斯特L.J.
        基于质量的定量蛋白质组学的谱系方法。
        方法。 2003; 29: 124-130
        • Neilson K.A.
        • 阿里N.A.
        • Muralidharan S.
        • Mirzaei M.
        • Mariani M.
        • 阿卡松G.
        • 李阿。
        • 范斯普莱特S.C.
        • Haynes P.A.
        更少的标签,更自由:无标签定量质谱法的方法。
        蛋白质组学。 2011; 11: 535-553
        • 邓布尔J.
        • Akimov V.
        • 奥尔森J.V.
        • Bunkenborg J.
        • Blagoev B.
        • 安德森J.S.
        非常早期细胞信号传导事件的定量蛋白质组学评估。
        NAT。 Biotechnol。 2007; 25: 566-568
        • Jorgensen C.
        • 谢尔曼A.
        • 陈G.I.
        • Pascularescu A.
        • 波利亚科夫A.
        • Hsiung M.
        • 拉森B.
        • Wilkinson D.G.
        • 林德林
        • Pawson T.
        在偏见的Eph受体表达细胞分离群中的细胞特异性信息处理。
        科学。 2009; 326: 1502-1509
        • Bose R.
        • 莫里娜H.
        • 帕特森A.S.
        • Bitok J.K.
        • Periasscamy B.
        • 獾J.s.
        • Pandey A.
        • COLE P.A.
        HER2 / NEU信号传导和抑制的磷肝蛋白酶分析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2006; 103: 9773-9778
        • nguyen V.
        • CAO L.
        • 林J.T.
        • 丽思A.
        • yu K.
        • j
        • ulin s.p.
        • Raphael B.J.
        • leaidlaw d.h.
        • Brossay L.
        • Salomon A.R.
        一种新方法,用于定量磷蛋白沉积信号途径施加到T细胞受体活化。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 2418-2431
        • 钟杰。
        • 金马
        • Chaerkady R.
        • 吴X.
        • 黄T.C.
        • GetNet D.
        • 米切尔C.J.
        • Palapetta S.M.
        • Sharma J.
        • o'meally r.n.
        • COLE R.N.
        • 尤达A.
        • 莫里茨A.
        • Loriaux M.M.
        • 赶紧J.
        • weinstock d.m.
        • Tyner J.W.
        • Pandey A.
        基于Silac的磷蛋白酶透露的TSLP信号网络。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11 (M112.017764)
        • 奥尔森J.V.
        • vermeulen M.
        • 桑塔马里亚A.
        • Kumar C.
        • 米勒M.L.
        • Jensen L.J.
        • GNAD F.
        • Cox J.
        • Jensen T.S.
        • nigg e.a.
        • 布鲁纳克斯。
        定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
        SCI。信号。 2010; 3: ra3
        • 吴R.
        • 哈斯W.
        • Dephoure N.
        • Huttlin E.L.
        • 翟德
        • Sowa M.E.
        • Gygi S.P.
        一种测量绝对蛋白质磷酸化化学物质测定的大规模方法。
        NAT。方法。 2011; 8: 677-683
        • Tan C.S.
        • 糟糕的G.D.
        更高化学计量的磷酸化位点更加保守。
        NAT。方法。 2012; 9: 317
        • Courcelles M.
        • Fremin C.
        • voisin L.
        • Lemieux S.
        • Meloche S.
        • Thibault P.
        磷酸膜动力学揭示具有广谱功能的新型ERK1 / 2映射激酶基材。
        摩尔。系统。 BIOL。 2013; 9: 669
        • HSU P.P.
        • 康S.A.
        • Rameseder J.
        • 张Y.
        • ottina K.A.
        • Lim D.
        • Peterson T.R.
        • 崔Y.
        • 灰色的N.S.
        • Yaffe M.B.
        • 玛托J.A.
        • Sabatini D.M.
        MTOR调节的磷酸酯组显示MTORC1介导的生长因子信号传导的抑制机制。
        科学。 2011; 332: 1317-1322
        • yu Y.
        • yoon s.o.
        • Poulogiannis G.
        • 杨Q.
        • 马X.M.
        • Villen J.
        • Kubica N.
        • 霍夫曼G.R.
        • 坎特利L.C.
        • Gygi S.P.
        • Blenis J.
        磷蛋白酶分析将GRB10鉴定为负调节胰岛素信号传导的MTORC1底物。
        科学。 2011; 332: 1322-1326
        • 老为
        • Shabb J.B.
        • Houel S.
        • 王H.
        • couts K.L.
        • 日元c.y.
        • Litman E.S.
        • 克罗伊C.H.
        • Meyer-Arendt K.
        • Miranda J.G.
        • 棕色r.a.
        • Witze E.S.
        • Schweppe R.E.
        • resing K.A.
        • ahn n.g.
        功能性蛋白质组学通过黑色素瘤中B-RAF信号传导鉴定磷酸化靶标。
        摩尔。细胞。 2009; 34: 115-131
        • 贝恩J.
        • Mclauchlan H.
        • 艾略特M.
        • 科恩P.
        蛋白激酶抑制剂的特异性:更新。
        生物学习。 j。 2003; 371: 199-204
        • Kim J.Y.
        • 威尔士E.A.
        • Oguz U.
        • 芳香。
        • 白y.
        • Kinose F.
        • 布朗克C.
        • remsing rix l.l.
        • 乞讨A.A.
        • rix u.
        • Eschrich S.A.
        • Komen J.m.
        • 哈拉e.b.
        肺癌细胞磷蛋白质的解剖剖析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2013; 110: 12414-12419
        • robitaille上午
        • 克里斯汀斯。
        • Shimobayashi M.
        • Cornu M.
        • Fava L.L.
        • Moes S.
        • prescianotto-baschong c。
        • Sauer U.
        • jenoe p.
        • 大厅M.N.
        定量磷蛋白酶揭示MTORC1激活DE NOVO嘧啶合成。
        科学。 2013; 339: 1320-1323
        • 郑扬。
        • 张C.
        • 冰淇淋D.R.
        • Soliman M.A.
        • ST-Denis N.
        • Pascularescu A.
        • 泰勒L.
        • tate s.a.
        • HARDY W.R.
        • Colwill K.
        • 戴安..
        • Bagshaw R.
        • 丹尼斯J.W.
        • Gingras A.c.
        • 达利r.j.
        • Pawson T.
        支架蛋白SHC1的EGF信号传导网络的时间调节。
        自然。 2013; 499: 166-171
        • 埃德加·克
        肌肉:高精度和高吞吐量的多个序列对齐。
        核酸RES。 2004; 32: 1792-1797
        • Larkin M.A.
        • 黑板G.
        • 棕色N.P.
        • Chenna R.
        • McGettigan P.A.
        • McWilliam H.
        • Valentin F.
        • 华莱士我。
        • 威廉A.
        • Lopez R.
        • 汤普森J.D.
        • 吉布森T.J.
        • 希金斯D.G.
        Clustal W和Clustal X 2.0版。
        生物信息学。 2007; 23: 2947-2948
        • gould c.m.
        • Diella F.
        • 通过A.
        • PunterVoll P.
        • 梅德隆C.
        • Chabanis-Davidson S.
        • 迈克尔斯。
        • Sayadi A.
        • Bryne J.C.
        • Chica C.
        • Seiler M.
        • Davey N.E.
        • 哈林
        • 耐候r.j.
        • 伙计A.
        • 休斯T.
        • PAS J.
        • Rychlewski L.
        • Trave G.
        • Aasland R.
        • Helmer-Citterich M.
        • 林德林
        • 吉布森T.J.
        榆树:2010年真核线性图案资源的状态。
        核酸RES。 2010; 38: D167-D180
        • 桑德斯N.F.
        • Brinkworth R.I.
        • Huber T.
        • KEMP B.E.
        • 科比B.
        predikin和predikindb:用于预测蛋白激酶肽特异性的计算框架和磷酸化位点的相关数据库。
        BMC生物信息学。 2008; 9: 245
        • 林德林
        • Jensen L.J.
        • Pascularescu A.
        • Olhovsky M.
        • Colwill K.
        • Bork P.
        • Yaffe M.B.
        • Pawson T.
        Networkin:用于探索蜂窝磷酸化网络的资源。
        核酸RES。 2008; 36: D695-D699
        • obenauerJ.C.
        • 坎特利L.C.
        • Yaffe M.B.
        Scansite 2.0:使用短序列图案的蛋白质组宽预测细胞信号传导相互作用。
        核酸RES。 2003; 31: 3635-3641
        • 猎人S.
        • APWEILER R.
        • Attwood T.K.
        • Bairoch A.
        • Bateman A.
        • Binns D.
        • Bork P.
        • Das U.
        • 老鹰脑油
        • Duquenne L.
        • 芬恩r.d.
        • Gough J.
        • HAFT D.
        • Hulo N.
        • Kahn D.
        • 凯莉E.
        • Laugraud A.
        • Leatunic I.
        • Lonsdale D.
        • Lopez R.
        • Madera M.
        • Maslen J.
        • Mcanulla C.
        • 麦克风J.
        • 朦胧J.
        • 米切尔A.
        • Mulder N.
        • Natale D.
        • Orengo C.
        • quinn a.f.
        • Selengut J.D.
        • SIGRIST C.J.
        • Thimma M.
        • 托马斯P.D.
        • Valentin F.
        • 威尔逊D.
        • 吴C.H.
        • 叶片C.
        Interpro:综合蛋白签名数据库。
        核酸RES。 2009; 37: D211-D215
        • Chatr-aryamontri A.
        • Breitkreutz B.J.
        • Heinicke S.
        • 鲍克尔L.
        • 冬天A.
        • 斯塔克C.
        • 尼克松J.
        • Ramage L.
        • kolas n。
        • O'Donnell L.
        • 温典州T.
        • Breitkreutz A.
        • SELLAM A.
        • 陈德。
        • 昌C.
        • 铁锈J.
        • Livstone M.
        • ooughtred R.
        • Dolinski K.
        • 泰尔斯米
        BioGrid互动数据库:2013更新。
        核酸RES。 2013; 41: D816-D823
        • Franceschini A.
        • Szklarczyk D.
        • 弗里兰德尔
        • Kuhn M.
        • Simonovic M.
        • 罗斯A.
        • 林J.
        • Minguez P.
        • Bork P.
        • von mering c.
        • Jensen L.J.
        串V9.1:蛋白质 - 蛋白质相互作用网络,覆盖率和集成增加。
        核酸RES。 2013; 41: D808-D815
        • Kerrien S.
        • 阿兰达B.
        • Breuza L.
        • 桥A.
        • 布雷克斯 - 卡特F.
        • 陈C.
        • Duesbury M.
        • 杜马斯米
        • Feuermann M.
        • Hinz U.
        • Jandrasits C.
        • JIMENEZ R.C.
        • kaadake J.
        • Mahadvan U.
        • 马登P.
        • Pedruzzi I.
        • pfeiffenberger E.
        • Porras P.
        • 拉吉纳州A.
        • Roechert B.
        • 果园S.
        • Hermjakob H.
        2012年完整的分子互动数据库。
        核酸RES。 2012; 40: D841-D846
        • Nishiwaki T.
        • Satomi Y.
        • Kitayama Y.
        • Terauchi K.
        • Kiyohara R.
        • 塔约T.
        • Kondo T.
        KAIC双磷酸化的顺序程序作为蓝藻昼夜节律的基础。
        Embo J. 2007; 26: 4029-4037
        • Kinoshita E.
        • Kinoshita-Kikuta E.
        • Koike T.
        PHOS标签SDS-PAGE系统,用于蛋白质的磷酸化分析,在中性pH条件下具有宽范围的分子量。
        蛋白质组学。 2012; 12: 192-202
        • 张H.
        • Zha X.
        • 谭y。
        • 哈贝克P.V.
        • mastrangelo a.j.
        • Alessi D.R.
        • Polakiewicz R.D.
        • 梳理M.J.
        使用抗体宽反应对磷酸化基序的磷蛋白分析。
        J. Biol。化学。 2002; 277: 39379-39387
        • roux p.p.
        • Ballif B.A.
        • Anjum R.
        • Gygi S.P.
        • Blenis J.
        肿瘤促进凤球酯和活化的Ras通过P90核糖体S6激酶灭活结核硬化肿瘤抑制器络合物。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2004; 101: 13489-13494
        • Manning B.D.
        • TEE A.R.
        • logsdon m.n.
        • Blenis J.
        • 坎特利L.C.
        鉴定结节硬化复合体-2肿瘤抑制剂基因产物结带蛋白作为磷酸膦酸碱基三酶/ AKT途径的靶。
        摩尔。细胞。 2002; 10: 151-162
        • Cargnello M.
        • roux p.p.
        MAPK. 及其基质的激活和功能,MAPK活化蛋白激酶。
        微生物。摩尔。 BIOL。录 2011; 75: 50-83
        • DUROCHER D.
        • Henckel J.
        • fersht a.r.
        • 杰克逊S.P.
        FHA结构域是模块化磷酸肽识别基序。
        摩尔。细胞。 1999; 4: 387-394
        • Yaffe M.B.
        • 催化剂K.
        • 沃林斯。
        • 鲫鱼P.R.
        • Aitken A.
        • leffers h.
        • gamblin s.j.
        • smerdon s.j.
        • 坎特利L.C.
        结构基础为14-3-3:磷酸肽结合特异性。
        细胞。 1997; 91: 961-971
        • 卡万夫为
        • Turck C.W.
        • 威廉姆斯L.T.
        PTB域通过含有磷蛋白酶的序列基序结合到信号传导蛋白。
        科学。 1995; 268: 1177-1179
        • 莫兰姆。
        • koch c.a.
        • 安德森D.
        • ellis c.
        • 英格兰L.
        • 马丁G.S.
        • Pawson T.
        SRC同源区2结构域在信号转导中直接蛋白质 - 蛋白质相互作用。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 1990; 87: 8622-8626
        • Palamarchuk A.
        • Efanov A.
        • Maximov V.
        • aqeilan r.i.
        • Croce C.M.
        • Pekarsky Y.
        AKT磷酸化并调节PDCD4肿瘤抑制蛋白。
        癌症res。 2005; 65: 11282-11286
        • Skowyra D.
        • Craig K.L.
        • 泰尔斯米
        • elldege s.j.
        • 哈珀J.W.
        F箱蛋白质是募集磷酸化底物的受体,以至于SCF泛素 - 连接酶复合物。
        细胞。 1997; 91: 209-219
        • Aoki K.
        • 山田M.
        • Kunida K.
        • Yasuda S.
        • Matsuda M.
        哺乳动物细胞中ERK地图激酶的加工磷酸化。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2011; 108: 12675-12680
        • COLE P.A.
        • 申K.
        • 乔Y.
        • 王D.
        蛋白质酪氨酸激酶SRC和CSK:尾巴的故事。
        Curr。拍摄。化学。 BIOL。 2003; 7: 580-585
        • 猎人T.
        串扰的年龄:磷酸化,泛素,及以后。
        摩尔。细胞。 2007; 28: 730-738
        • Ichimura T.
        • yamamura h.
        • Sasamoto K.
        • Tominaga Y.
        • Taoka M.
        • Kakiuchi K.
        • Shinkawa T.
        • Takahashi N.
        • Shimada S.
        • isobe t.
        14-3-3蛋白通过与NEDD4-2泛素连接酶的磷酸化依赖性相互作用调节上皮NA +通道的表达。
        J. Biol。化学。 2005; 280: 13187-13194
        • 加拉赫E.
        • 高米
        • 刘Y.C.
        • 卡琳米
        通过磷酸化诱导的构象变化激活E3泛素连接酶瘙痒。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2006; 103: 1717-1722
        • 杨C.
        • 周W.
        • Jeon M.S.
        • demydenko d。
        • 哈拉达y.
        • 周H.
        • 刘Y.C.
        通过Fyn介导的酪氨酸磷酸化对E3泛素连接酶Itch的负调节。
        摩尔。细胞。 2006; 21: 135-141
        • Cardozo T.
        • Pagano M.
        SCF泛素连接酶:洞察分子机器。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2004; 5: 739-751
        • Stegmeier F.
        • 强奸M.
        • DRAVIAM V.M.
        • NALEPA G.
        • Sowa M.E.
        • Ang X.L.
        • 麦克唐纳3号,E.R.
        • 李米兹。
        • Hannon G.J.
        • 索勒P.K.
        • Kirschner M.W.
        • 哈珀J.W.
        • elldege s.j.
        通过拮抗泛素化和脱氮活性来调节外阴脱发。
        自然。 2007; 446: 876-881
        • Mertins P.
        • 乔J.W.
        • Patel J.
        • Udeshi N.D.
        • 克劳瑟K.R.
        • MANI D.R.
        • Burgess M.W.
        • Gillette M.A.
        • Jaffe J.D.
        • carr s.a.
        通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
        NAT。方法。 2013; 10: 634-637
        • Swaney D.L.
        • Beltrao P.
        • Starita L.
        • 郭阿。
        • 赶紧J.
        • 领域S.
        • krogan n.j.
        • Villen J.
        蛋白质降解中的磷酸化和泛醌串扰的全局分析。
        NAT。方法。 2013; 10: 676-682
        • 杨X.J.
        • 格雷戈尔S.
        转录镇压和超越的经常性磷酸血管开关。
        摩尔。细胞。 2006; 23: 779-786
        • 郭Z.
        • Kanjanapangka J.
        • 刘恩
        • 刘S.
        • 刘C.
        • 吴Z.
        • 王Y.
        • LOH T.
        • Kowolik C.
        • jamsen J.
        • 周米
        • Truong K.
        • 陈Y.
        • 郑L.
        • 沉B.
        顺序后翻译修改程序FEN1在细胞周期进展期间降解。
        摩尔。细胞。 2012; 47: 444-456
        • Prudden J.
        • Pebernard S.
        • 拉菲G.
        • Slavin D.A.
        • Perry J.J.
        • Tainer J.A.
        • 麦格兰C.H.
        • Boddy M.N.
        基因组稳定性中的Sumo-靶向泛素连接酶。
        Embo J. 2007; 26: 4089-4101
        • Tan J.A.
        • 宋J.
        • 陈Y.
        • Durrin L.K.
        SATB1和PIAS1的磷酸化依赖性相互作用引导SATB1的SUMO调节的胱天蛋白酶切割。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2010; 30: 2823-2836
        • Kurokawa M.
        • Kornbluth S.
        死亡握把的木蛋白酶和激酶。
        细胞。 2009; 138: 838-854
        • Lopez-Otin C.
        • 猎人T.
        激酶和癌症蛋白酶之间的调节串扰。
        NAT。癌症。 2010; 10: 278-292
        • 邓肯J.S.
        • Turowec J.P.
        • Vilk G.
        • 李斯。
        • gloor g.b.
        • Litchfield D.W.
        细胞增殖和存活的调节:蛋白激酶和木蛋白酶的收敛性。
        Biochim。 Biophys。 acta。 2010; 1804: 505-510
        • Tozser J.
        • Bagossi P.
        • Zahuczky G.
        • Speht S.I.
        • Majerova E.
        • COPELAND T.D.
        胱天冬酶切割位点磷酸化对蛋白水解的影响。
        生物学习。 j。 2003; 372: 137-143
        • 迪克斯米。
        • 西蒙上午
        • 王C.
        • 好的 erberg E.
        • Patricelli M.P.
        • Cravatt B.F.
        Caspase切割和磷酸化之间的功能相互作用雕刻凋亡蛋白质组。
        细胞。 2012; 150: 426-440
        • 哈特G.W.
        • Housley M.P.
        • Slawson C.
        O-连接的β-N-乙酰淀粉胺在核细胞质蛋白上循环。
        自然。 2007; 446: 1017-1022
        • 王Z.
        • Pandey A.
        • 哈特G.W.
        O型N-乙酰葡糖胺胺基化与糖原合成酶激酶-3依赖性磷酸化之间的动态相互作用。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2007; 6: 1365-1379
        • 锅C.
        • 奥尔森J.V.
        • Daub H.
        激酶抑制剂对定量磷蛋白酶揭示信号网络的全局影响。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 2796-2808