基于微粒的近距离连接彩易福彩的敏感血浆蛋白分析*

      检测疾病受损的组织中血液中释放的蛋白质可以促进病理病症的早期检测,差异诊断和治疗的后续行动。尽管这些前景和候选人的候选生物标志物,但近年来努力建立新的蛋白质诊断试验已经达到了有限的成功。一个重要的限制因素是检测在复杂体液中痕量水平的蛋白质的挑战。为了实现稳健,敏感和特异性的检测,我们开发了一种基于微粒的固相接近连接彩易福彩,取决于通过三种抗体分子同时识别靶蛋白,以增加特异性。在微粒上捕获后,加入固相对探针,然后洗涤,使得能够检测和鉴定血液中的罕见蛋白质分子,同时消耗少量样品。我们证明,可以容易地用于确定对目标蛋白质的单克隆抗体制剂可以容易地建立彩易福彩,其中检测到三种单独的抗体分子的目标识别,识别单独的表位。将彩易福彩与最先进的夹心ELISA进行比较,用于检测血管内皮生长因子,白细胞介素-8和白细胞介素-6,并且发现其在检测到的动态范围和最小数量的分子方面都是优异的。此外,该彩易福彩在未稀释的血浆和血清以及全血中表现出优异的性能,从而产生九种不同抗原的可比结果。因此,我们表明,固相接近结扎彩易福彩是适用于临床样本中宽动态范围的各种蛋白质生物标志物的验证。
      血浆蛋白质组的分析,其蛋白质含量,它们的修饰和相互作用,具有改善癌症等病理条件的检测,分类和预测的巨大希望(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。
      )。血清或血浆生物标志物的吸引力在于它们在整个身体中揭示疾病过程的潜力,并使用微创血液采样引导治疗和随访。
      这种乐观性通过血浆的分子复杂性而回火,并且已知血浆蛋白质的丰度在至少12个数量级变化(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。
      ),对用于研究血浆蛋白质的免疫彩易福彩构成巨大挑战。因此,需要新的彩易福彩格式,其可以在宽的动态范围内提供改善的敏感性和特异性,具有良好的精度,以评估新的蛋白质生物标志物进行血浆,血清或全血的分析。
      邻近结扎彩易福彩(PLA),
      使用的缩写是:
      pl
      近距离连接彩易福彩
      SP.
      固相
      IL.
      白细胞介素
      PSA.
      前列腺特异性抗原
      VEGF.
      血管内皮生长因子
      TNFα.
      肿瘤坏死因子α
      ICAM-1
      细胞间粘附分子-1
      GDF-15
      生长分化因子-15
      RT.
      室内温度
      Q-PCR.
      定量实时PCR
      l
      检测极限
      CT.
      循环阈值
      简历
      变异系数。
      1使用的缩写是:pl
      近距离连接彩易福彩
      SP.
      固相
      IL.
      白细胞介素
      PSA.
      前列腺特异性抗原
      VEGF.
      血管内皮生长因子
      TNFα.
      肿瘤坏死因子α
      ICAM-1
      细胞间粘附分子-1
      GDF-15
      生长分化因子-15
      RT.
      室内温度
      Q-PCR.
      定量实时PCR
      l
      检测极限
      CT.
      循环阈值
      简历
      变异系数。
      首先由Fredriksson描述 等等。 (
      • Fredriksson S.
      • 古伯格米
      • 贾维斯J.
      • olsson c.
      • Pietras K.
      • Gústafsdóttirs.m.
      • Ostman A.
      • LANDEGREN U.
      使用邻近依赖性DNA连接彩易福彩的蛋白质检测。
      )在2002年,是一种用于通过DNA连接和扩增检测蛋白质分子的免疫彩易福彩,提供高特异性和敏感性。在PLA中,通过附着短的单链DNA分子来修饰针对相同靶分分子的亲和探针对,形成所谓的PLA探针。在将一对PLA探针对靶分子的近端结合后,DNA链紧密地偏离并使其与连接器寡核苷酸杂交。然后可以通过酶联连接的DNA链,形成报告DNA分子。这种新的DNA序列可以通过敏感和特定的核酸检测技术来量化,例如定量实时PCR(Q-PCR)。第一种形式的PLA是均相彩易福彩,其中抗原在结扎之前通过DNA适体在结扎和扩增之前通过实时检测来识别。通过将抗体直接固定在PCR管的壁上,还在固体支持物上进行彩易福彩法(
      • Fredriksson S.
      • 古伯格米
      • 贾维斯J.
      • olsson c.
      • Pietras K.
      • Gústafsdóttirs.m.
      • Ostman A.
      • LANDEGREN U.
      使用邻近依赖性DNA连接彩易福彩的蛋白质检测。
      )或通过将生物素化的抗体固定在链霉蛋白涂覆的管的表面上(
      • Gustafsdottir S.M.
      • nordengrahn A.
      • Fredriksson S.
      • 瓦尔格伦P.
      • Rivera E.
      • Schallmeiner E.
      • Merza M.
      • LANDEGREN U.
      通过近距离连接检测单个微生物病原体。
      )。 PLA技术已为各种应用实施,包括可视化蛋白质 原位 (
      • SöderbergO.
      • 古伯格米
      • 贾维斯M.
      • ridderstrålek。
      • Leuchowius K.J.
      • 贾维斯J.
      • Wester K.
      • 氢干P.
      • Bahram F.
      • Larsson L.G.
      • LANDEGREN U.
      通过近距离连接直接观察单个内源性蛋白质复合物。
      ),揭示传染病(
      • Gustafsdottir S.M.
      • nordengrahn A.
      • Fredriksson S.
      • 瓦尔格伦P.
      • Rivera E.
      • Schallmeiner E.
      • Merza M.
      • LANDEGREN U.
      通过近距离连接检测单个微生物病原体。
      )和蛋白质-DNA相互作用(
      • Gustafsdottir S.M.
      • 舒尔塞曼J.
      • rada-iglesias A.
      • Schallmeiner E.
      • Kamali-Moghaddam M.
      • Wadelius C.
      • LANDEGREN U.
      通过近距离连接的DNA-蛋白相互作用的体外分析。
      ),并且在单篇(
      • 朱L.
      • Koistinen H.
      • LANDEGREN U.
      • Stenman U.H.
      前列腺特异性抗原与α1-蛋白酶抑制剂之间复合物的近距离连接测量。
      ,
      • 古伯格米
      • Gústafsdóttirs.m.
      • Schallmeiner E.
      • 贾维斯J.
      • BjarnegårdM.
      • Betsholtz C.
      • LANDEGREN U.
      • Fredriksson S.
      基于抗体的邻近连接的细胞因子检测。
      )和多重(
      • Fredriksson S.
      • 迪克森W.
      • 吉H.
      • koong a.c.
      • Mindrinos M.
      • 戴维斯R.W.
      癌症生物标志物验证的近距离连接多重蛋白质检测。
      ,
      • Fredriksson S.
      • Horecka J.
      • Brustugun O.T.
      • 舒尔塞曼J.
      • koong a.c.
      • Tibshirani R.
      • 戴维斯R.W.
      多路复用的邻近连接彩易福彩以概述与胰腺癌和卵巢癌相关的推定血浆生物标志物。
      )。
      微粒通常用作免疫反应中的固体载体(
      • Meza M.B.
      基于珠的HTS应用在药物发现中。
      ,
      • Verpoorte E.
      珠子和芯片:用于分析的新食谱。
      )捕获和分离目标分子。在这里,我们报告了一般有用的固态PLA协议(SP-PLA)的开发(Fig. 1基于络合生物材料的鲁棒和高敏感蛋白质检测的顺磁性微粒。我们使用该固相PLA检测血浆和血清中的九种不同蛋白质,展示了非常低的检测限制和宽的工作动态范围。此外,我们将SP-PLA的性能与均质相位PLA和最先进的夹心ELISA进行了比较。检测SP-PLA的灵敏度显示出明显优于ELISA的灵敏度。与先前描述的均质相位PLA相比(
      • Fredriksson S.
      • 迪克森W.
      • 吉H.
      • koong a.c.
      • Mindrinos M.
      • 戴维斯R.W.
      癌症生物标志物验证的近距离连接多重蛋白质检测。
      在没有固体载体捕获的寡核苷酸标记的抗体中在溶液中检测到蛋白质,SP-PLA同样地进行了在展示更广泛的动态范围的同时检测到的最小数量的VEGF分子。此外,我们评估了SP-PLA用于检测从两组患者获得的临床样品中的心脏标志物蛋白GDF-15的性能,每个患者组成20个个体,以及20个健康对照。彩易福彩表现出常规ELISA中测量的可用临床数据的非常好的介入相关性和协议。此外,蛋白质的水平显示在患者和对照样品之间有显着差异,支持该蛋白质作为冠状动脉疾病的标志物的价值。因此,SP-PLA非常适合于在络合物生物学材料中以低浓度存在的蛋白质分析,例如未稀释的等离子体或血清或全血。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1SP.-PLA.方法的示意图。 A,将样品与在微粒上的抗体孵育。 B,接下来,用对PLA探针对微粒洗涤并孵育。 C最后,在常见抗原的近端结合并加入连接器寡核苷酸时,将在PLA探针上连接寡核苷酸。随后通过定量实时PCR扩增和检测连接的产品,其引物由其中表示 箭头.

      实验步骤

       蛋白质和寡核苷酸

      从R购买抗原,亲和纯化的多克隆抗体,以及VEGF,IL-6,IL-8,IL-4,TNFα,PSA,P53,ICAM-1和GDF-15的生物素化形式。&D系统。从Solulink(San Diego,CA)购买寡核苷酸 - 链霉蛋白偶联物SLC1(5'-CGCATCGCGCCTTGCTGACTCGACTGACGACGGCTTGCGTG-3')和SLC2(5'-TCGTGTCTAAAAGTCCGTCGTTGTTGTGTGTGTGTCGTCGGGGTGGAAATTCGGCGGGGGGGGGGADGGGTGTGA-3')。
      向前引物(BioFWD)(5'-CatcgccctTggactacGA-3'),反向引物(BioReV)(5'-GoggaatcaAggtaacGacttag-3')和连接器寡核苷酸(5'-Tacttagacacgacacgatttagtttttttttttt-3')是从生物中获得的。用FAM洋洋珠江(5'-FAM-TGACGAACCGCTTTGCCTGA-QUENCHER-3')标记的TAQMAN探针来自Application Biosystems。

       临床样本

      在24小时内从20次患者收集等血浆样品在不稳定的心绞痛或次要心肌梗死(A组)或到达医院,从20名患者收集冠状动脉的突然总血栓闭塞,如心电图ST段抬高,激活再灌注治疗(B组)。从年龄匹配的个体中收集另外20个样品,没有冠状动脉疾病的迹象或症状。

       pl探针的制备

      在与抗体结合之前,100 nm 将每种链霉素蛋白 - 寡核苷酸缀合物的浓度分别与100n混合m Streptavidin来自 Streptomyces Avidinii (Sigma-Aldrich)在1:4与链霉抗生物素蛋白的缀合物的体积比下,然后在65℃下孵育30分钟,以在返回较低温度时改性在这些重整之前(补充图S1A)。这是为了减少每链霉蛋白四聚体的寡核苷酸部分的数量。上述处理允许我们使用4倍的链霉抗生物素蛋白 - 寡核苷酸缀合物,同时保持彩易福彩性能。热处理的寡核苷酸 - 链霉抗生物素蛋白缀合物可以在4℃下储存几个月,而不会产生负面影响。
      为了制备PLA探针和捕获抗体,将生物素化的多克隆抗体分别分三个等分试样。将一个等分试样固定在链霉蛋白涂覆的微粒上以用作捕获抗体(见下文)。另外两个与100 n分开混合m 热处理的链霉抗生物素蛋白 - 缀合的寡核苷酸SLC1或SLC2以1:1(补充图S1B)。将混合物在室温(RT)中温育1小时,以允许抗体结合链霉抗生物素蛋白 - 寡核苷酸缀合物。在使用之前,然后将PLA探针对在PLA探针混合物中以250p的最终浓度组合m for each probe.

       样本耗尽

      在分析100%血清或血浆样品之前,我们通过预孵育与涂有非特异性山羊IgG的微粒来耗尽来自潜在干扰物质的样品。每克DynaBeads®MyORE加入10 pmol生物素化山羊IgGTM值 链霉抗生物素蛋白T1微颗粒(Invitrogen),在室温下孵育1小时,恒定旋转。然后用洗涤缓冲液(1×PBS,0.05%吐温20(Sigma-Aldrich))洗涤微粒两次,并用200μL储存缓冲液(1×PBS,0.1%纯化BSA(新英格兰Biolabs)重构。为了耗尽样品,我们将每μl样品使用0.05μl的储存微粒。将微粒和样品在室温下在除去用于耗尽的微粒之前孵育3-5小时。

       微粒上的抗体固定化

      为了用特异性抗体涂覆微粒,1mg Dynabeads,用500μl洗涤缓冲液洗涤两次,合并200μl50nm (1.5μg)生物素化抗体,在旋转下在室温下孵育1小时。接下来,用500μl洗涤缓冲液洗涤微粒两次,并用200μl储存缓冲液(1×PBS,0.1%纯化的BSA(新英格兰Biolabs)重构。已经固定的抗体的微粒可以在4℃下储存长达2个月,而不会明显丧失活性。

       固相PLA

      对于每个PLA反应,我们使用1μl抗体涂覆的微粒,其对应于5μg微粒和7.5ng抗体。除去储存缓冲液,并在5μlPLA缓冲液中重构微粒(1米M D.-biotin(Invitrogen),0.1%纯化的BSA(新英格兰Biolabs),0.05%Tween 20(Sigma-Aldrich),100 nm 山羊IgG(Sigma-Aldrich),0.1μg/μl鲑鱼精子DNA(Invitrogen),5米m EDTA,1×PBS)在将微粒与样品混合之​​前。
      在PLA缓冲液,10或100%鸡肉血清(Invitrogen),10或100%鸡等离子体(Rockland)和10%鸡肉全血(创新研究)中制备稀释系列抗原系列。通过在PLA缓冲液中稀释100%鸡血浆,血清或全血来制备10%鸡血浆,血清和全血。每个稀释系列含有阴性对照,其中没有蛋白质以确定背景噪声。
      通过将45μl用5μl微粒中的微量滴定孔混合45μl的每个样品来引发彩易福彩,然后在旋转下孵育1.5小时。接下来,使具有微粒的反应孔沉降在96孔板磁体上(PerkinElmer Life Sciences)。用洗涤缓冲液洗涤颗粒两次,并将50μlPLA探针混合物加入到每个孔中,并在室温下孵育1.5小时。此后,在96孔板磁体上再次收集微粒并用洗涤缓冲液洗涤两次。最后,50μL连接/ PCR混合物(1×PCR缓冲液(Invitrogen),2.5米m MgCl2 (Invitrogen),0.1μm 浓度的每个底漆生物糖果和生物烃,0.22μm TaqMan probe, 0.08 mm ATP, 100 nm 连接器寡核苷酸,0.2米m DNTPS(含DUTP)(FERMENS),1.5个单位的铂金 Taq. 聚合酶(Invitrogen),0.5个单位的T4 DNA连接酶(FERMENSA),0.1单位尿嘧啶N向每个孔中加入糖基酶(Fermentas),然后通过Q-PCR检测PLA DNA连接产物。含有DUTP和尿嘧啶的DNTP混合物N - Glycosyl酶用于使PCR污染的风险最小化。所用的热循环方法包括在95℃下进行2分钟的初始孵育,然后在95℃下为15 s,在60℃下为1分钟。所有Q-PCR均在MX-3000仪器(Stratagene)上进行。使用管作为固体载体的固相可以如先前由爱立信描述进行 等等。 (
      • 爱立信O.
      • 贾维斯J.
      • Schallmeiner E.
      • Howell M.
      • nong r.y.
      • 路透社H.
      • 哈恩米
      • Stenberg J.
      • Nilsson M.
      • LANDEGREN U.
      用于高性能核酸和蛋白质分析的双标签微阵列平台。
      )。

       三明治盟友

      r.&DQuantikine®ELISA试剂盒用于VEGF,IL-8,GDF-15和IL-6,除了制造商的规格,除了VEGF,IL-8和IL-6 ELISA蛋白质以10%掺入蛋白质校准剂稀释剂确保SP-PLA和ELISA之间的公平比较。关于ICAM-1,GDF-15,TNFα,IL-4和PSA的ELISA的检测限率的信息来自R&D Quantikine Elisa套件; P53的信息来自Invitrogen免疫彩易福彩试剂盒,用于检测总P53。

       数据分析

      用MXPRO软件(Stratagene)分析Q-PCR数据,并通过Microsoft Excel软件出口并进一步分析记录的CT值。使用R的双样本威尔Coxon等级和Sp-PLA彩易福彩的患者组B和SP-PLA彩易福彩的健康对照之间的差异差异的统计学意义。

       条款的定义

      l定义为对应于CT的蛋白质的浓度l = CtN − 2 × SN 在哪里 CtN 是用于背景噪音和s的平均CTN 是这个值的标准偏差。用于检测血浆和血清中蛋白质的LOD值在50μl10%血浆或血清中以蛋白质的摩尔浓度计算。
      使用下式计算各种数据点的变异系数(CV%):CV%a = SA/ 在哪里 SA 是标准偏差和 是PCR扩增子的平均数 a。使用该等式将CT值转换为开始PCR扩增子的数量 = 2(38 - CTA) 在哪里 Cta 是点的ct a。该公式假设38是将单个扩增子与荧光检测阈值施加到阈值所需的PCR循环的数量。使用以下公式计算回收:恢复(%)=测量浓度(摩尔)/尖刺浓度(摩尔)。

      结果

      我们将基于微粒的方案与爱立信描述的聚碳酸酯管进行了比较 等等。 (
      • 爱立信O.
      • 贾维斯J.
      • Schallmeiner E.
      • Howell M.
      • nong r.y.
      • 路透社H.
      • 哈恩米
      • Stenberg J.
      • Nilsson M.
      • LANDEGREN U.
      用于高性能核酸和蛋白质分析的双标签微阵列平台。
      )检测VEGF,IL-8和IL-6。结果表明,两种方案同样进行了用于检测缓冲液中的蛋白质(Fig. 2a)。两个彩易福彩的床位在低fm 所有三个分析物的范围,它们呈现出高达6个数量级的宽度动态范围。然而,基于微粒的彩易福彩,并且可以在3小时内完成显着较低的抗体,并且当使用管作为固体载体时,可以在3小时内完成彩易福彩,这可能是增强与微粒的结合动力学的结果。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2基于微粒的SP-PLA的性能和基于管的彩易福彩的比较。 a,基于微粒的比较(广场)基于管的彩易福彩(钻石)检测IL-6(I),IL-8(II)和VEGF(III)在缓冲区中。所有测量至少以三重倍增算法进行。 误差酒吧 表示SD。 b,SP-PLA检测IL-6的性能(I),IL-8(II)和VEGF(III)在缓冲区中(广场),10%血清(三角形)和10%等离子体(钻石)缓冲区的每个数据点的相应CV%值(打开正方形),10%血清(打开三角形)和10%等离子体(开放钻石)。 c,在10%等离子体中2倍稀释的IL-8以估计精度。这 y轴 显示实时PCR彩易福彩的阈值循环值;这 x轴 显示P中调查蛋白的浓度m.
      为了在更复杂的基质中进行彩易福彩性能,我们使用基于微粒的SP-PLA用于检测三种分析物,VEGF,IL-8和IL-6,在稀释系列中制备10%鸡等离子体或10%鸡血清(Fig. 2b)。鸡等离子体和血清用于代表人血浆或血清的复杂组合物,同时确保不存在研究的人靶蛋白。血浆和血清中的彩易福彩性能与缓冲液中的相当相当,证明可以通过颗粒载体上的目标捕获来避免这种生物材料中的任何干扰物质。缓冲液,10%等离子体和10%血清等彩易福彩特征,如LOD,线性范围,绕组变异,恢复和 R2 总结了 表I.。对于所有三种分析物,该彩易福彩呈现出非常低的检测和宽动态范围限制,适合于研究可能在不同样品中广泛变化的蛋白质浓度,因为往往是病理条件的情况。此外,我们通过在10%等离子体中进行2倍稀释的IL-8来评估彩易福彩的精度,范围为3.9至250 pm。结果显示在 Fig. 2c 证明彩易福彩易于辨别出小于2倍的研究蛋白质的浓度差异。
      表I.VEGF.,IL-8和IL-6检测的SP-PLA性能特征概述
      VEGF.IL.-8IL.-6
      缓冲血清等离子体缓冲血清等离子体缓冲血清等离子体
      l(F.m)1.910.75.22.82015.68.92011
      线性范围106105105106106106106106106
      分析内变异(CV%)21.37.810.624.816.121167.513.8
      R20.9980.9860.9960.9880.9900.9890.9990.9840.997
      恢复 (%)105.6100.194.899.4107.6107.1100.7113102.4
      此外,我们验证了检测未稀释(100%)鸡血浆和血清的VEGF的彩易福彩。在这里,我们使用了初始耗尽步骤来消除已被证明的未知干扰剂,以产生增加体液中的背景,但不从样品中除去感兴趣的抗原(数据未显示)。在分析之前,将样品与来自山羊的未特异性IgG的微粒一起温育。在100%血浆和血清中的彩易福彩性能非常相似,在10%稀释液中具有25%和28 f的10%稀释度m 分别用于血浆和血清(Fig. 3a),血浆和血清的优异回收率。为了确定彩易福彩是否可以在全血中表现良好的感兴趣,例如当需要快速手术时具有最小的样品制备,例如在护理点应用中。为了探讨全血的效果,我们在10%整个鸡血中测量了VEGF。使用的血液量为5μl,〜 110 120 从手指刺。我们发现彩易福彩性能不受全血存在的影响,并且用10 f的LOD检测VEGFm (Fig. 3b)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3SP.-PLA.在复杂生物样品中的性能。 a,在100%血清中比较SP-PLA的性能(打开三角形)和等离子体(开放钻石)和10%血清(三角形)和等离子体(钻石)用于检测VEGF。 b,通过全血的SP-PLA检测VEGF的检测。 误差酒吧 indicate SD.
      我们还通过将其与最先进的ELISAS进行比较来验证了该技术。结果总结在 Fig. 4。与夹心ELISAS相比,SP-PLA能够检测三种研究抗原中每种浓度的~100倍,并且更广泛的动态范围多达2个更高的数量级。此外,SP-PLA仅需要5μL,而相应的ELISA可消耗高达100μl样品。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4SP.-PLA.与夹心ELISA检测VEGF,IL-6和IL-8的比较。 对于SP-PLA,蛋白质在10%血清中掺入(三角形)和10%等离子体(钻石)和为ELISA,在10%校准剂稀释剂中加入蛋白质,用于制造商提供的血清和等离子体()。这 主要y轴 显示SP-PLA实时PCR的阈值循环值;这 辅助y轴 显示OD为ELISA的450 nm测量。 x轴 在50μlPLA反应和200μlELISA中显示在每种蛋白质的10倍稀释液中分析的蛋白质的浓度。所有测量至少以三重倍增算法进行。 误差酒吧 indicate SD.
      我们证明了检测血清和血浆中另外六种蛋白质的彩易福彩性能:P53,ICAM-1,GDF-15,PSA,TNFα和IL-4。结果证实,用于使用针对整个蛋白质提升的多克隆抗体的多种蛋白质靶标同样良好地表现出同样良好的蛋白质靶标 Fig. 5表二)。 SP-PLA在F中展出了一个LODm 所有九种不同蛋白的范围,所有彩易福彩的动态范围延伸超过5或6个数量级。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5检测ICAM-1,GDF-15,TNFα,IL-4,PSA和P53在10%血清中具有SP-PLA(三角形)和10%等离子体(钻石)。 y轴 显示实时PCR彩易福彩的阈值循环值; x轴 显示每个抗原的浓度m.
      表二用于检测ICAM-1,GDF-15,TNFα,IL-4,PSA和P53检测的SP-PLA与ELISA之间的LOD比较
      l
      埃莉莎SP.-PLA.
      血清等离子体
      下午
      ICAM-11.9934210.0140.02
      GDF-150.0717860.050.06
      TNFα.0.0914290.160.08
      IL.-40.7142860.160.08
      PSA.1.0714290.070.009
      p531.1627910.0050.0003
      为了在实际应用中探讨SP-PLA测试,我们评估了彩易福彩的性能,用于检测从属于两种不同患者组(A和B)和20个健康对照的40名患者中获得的人血浆样品中的GDF-15。 GDF-15已成为血液生物标志物,用于复发心肌突出和非St升高急性冠状动脉综合征患者的死亡率增加(
      • 鸡蛋小吃
      • Kempf T.
      • allhoff t.
      • Lindahl B.
      • 莱克汀L.
      • 沃尔特K.C.
      生长分化因子-15用于急性胸痛患者早期风险分层。
      )。我们首先在两个单独的场合属于A组的20名患者中估计GDF-15的水平(彩易福彩1和彩易福彩2)。两种实验的彩易福彩内CV%为15-16%。线性相关系数(R2)对于20次患者组样品的GDF-15的两次测量值为0.89(Fig. 6a),反映了两个数据集之间的良好一致性。发现两种实验的茚满的CV%是35%。为了评估SP-PLA产生的结果的有效性,我们将结果与ELISA用于患者组A的结果进行了比较。线性相关系数(R2)在两种彩易福彩中的测量值之间为0.89和0.95(Fig. 6, bc),验证SP-PLA测量的值的有效性。然后,我们使用SP-PLA评估来自患者组B和20个健康对照的20个样品中GDF-15的浓度。 GDF-15被发现明显升高(p <如图所示,患者组B中的0.001,200样品氟烷量秩和测量率)与健康对照组相比较 Fig. 6d.
      图缩略图GR6.
      Fig. 6在两个独立的SP-PLA测试中和一个三明治ELISA中分析的患者样品中GDF-15的测量。 a,GDF-15通过SP-PLA在来自患者组A的20个人血浆样品中测量,在两个单独的场合(SP.-PLA.1SP.-PLA.2.)。在彩易福彩1中获得的PG / mL中GDF-15的值绘制在 y轴,而从彩易福彩2获得的值绘制在 x轴。 B.c,散点图显示ELISA与两个SP-PLA测试中的每一个之间的相关性(SP.-PLA.1SP.-PLA.2.)对于来自同一20个人血浆样品的数据。从SP-PLA获得的PG / mL中GDF-15的值绘制在 y轴,而ELISA值绘制在 x轴。 D.,箱图显示属于患者B组和健康对照的患者中GDF-15水平的差异。这 p 使用双样本WILCOXON等级和测试计算值。

      讨论

      通过研究免疫组织化学,质谱或其他蛋白质组学方法或基于相应转录物的表达,通过研究受影响的组织或基于相应转录物的表达来鉴定为人类疾病的潜在生物标志物的蛋白质分子的潜在生物标志物。这激励了在可能导致其释放的可能导致疾病过程的表述中搜索这些相同的蛋白质,但经常检测的敏感性不足(
      • 汉尚三
      • Pitteri S.J.
      • Faca v.m.
      采矿血浆蛋白质组癌生物标志物。
      )。因此,在处理复杂的生物材料时,需要提供高灵敏度和高特异性的方法(
      • De Jager W.
      • rijkers g.t.
      基于固相和基于珠的细胞因子免疫彩易福彩:比较。
      ,
      • elshal m.f.
      • McCoy J.P.
      多重胎圈阵列彩易福彩:性能评估和对ELISA敏感性的比较。
      )。本研究的目的是建立一种用于检测复杂生物样品中的蛋白质的一般和直接方法,其水平过低待检测到标准方法。为此,我们将PLA技术的优势与夹心免疫彩易福彩(
      • Meza M.B.
      基于珠的HTS应用在药物发现中。
      ,
      • De Jager W.
      • rijkers g.t.
      基于固相和基于珠的细胞因子免疫彩易福彩:比较。
      ,
      • elshal m.f.
      • McCoy J.P.
      多重胎圈阵列彩易福彩:性能评估和对ELISA敏感性的比较。
      )创建敏感和特定的免疫彩易福彩。我们在本文中报告了SP-PLA,一种基于微粒的PLA的开发,其中固体支持物允许靶分子浓缩并除去来自复杂生物样品的潜在干扰剂,然后扩增连接的报告者DNA链敏感蛋白质检测。用于在缓冲液中进行的单杂蛋白检测中进行SP-PLA进行SP-PLA的两种不同的固体支持物。我们具有初步数据,表明基于微粒的方案在多重蛋白质分析中具有不同的优点,其中不同的抗体固定在单独的微粒上。
      S. Darmanis和R. Y. nong,未发表的数据。
      此外,基于微粒的方案可用于在必要时分析更大的样品体积。
      SP.-PLA.在低f中始终表现出非常低的检测限m 范围,较大的线性动态范围高达6个级,CV%在7到25%之间。此外,在标准方案中仅使用5-μl样品等分试样,该特征在检查诸如Biobank材料的有价值和有限的样本方面具有重要的特征。对于各种靶蛋白同样良好地进行,并且我们观察到九个不同分析物的含量非常低,从小细胞因子分子到较大的蛋白质。
      与夹心ELISA相比,SP-PLA提供大约100倍的敏感性。据报道,用于免疫PCR彩易福彩的类似敏感性,其中单个寡核苷酸 - 抗体缀合物用于检测通过另一抗体捕获的靶分子(
      • SIMS P.W.
      • Vasser M.
      • 黄W.L.
      • 威廉姆斯下午
      • 孟Y.G.
      使用实时聚合酶链反应检测免疫聚合酶链反应。
      )。我们预计,通过消除由于非特异性染色的可检测试剂或相关靶分子的交叉反应检测,通过消除背景信号来进一步提高检测特异性的识别三个表位的要求。多重结合的要求还有助于分析更复杂的靶结构,例如具有后翻译后修饰和二元或三元蛋白质相互作用的蛋白质。此外,附着的DNA链的特定连接的要求具有允许允许检测反应的重要优势,以限制为同源的抗体组在添加到彩易福彩中的大量试剂中。由此,彩易福彩可以避免在经常夹层彩易福彩复用时观察到的非同源抗体对之间的交叉反应的迅速增加的风险(
      • 王家博士
      多路复用蛋白质测量:蛋白质和抗体阵列的技术和应用。
      )。因此,PLA方法是对在一个样品中同时询问的大量分析物的彩易福彩。还将SP-PLA与Fredriksson的出版数据进行了比较 等等。 (
      • Fredriksson S.
      • 迪克森W.
      • 吉H.
      • koong a.c.
      • Mindrinos M.
      • 戴维斯R.W.
      癌症生物标志物验证的近距离连接多重蛋白质检测。
      )。虽然在多路复用中进行了本出版物中描述的彩易福彩,但它们的性能类似于单独的单次彩易福彩。与均匀相位双重相比(
      • Fredriksson S.
      • 迪克森W.
      • 吉H.
      • koong a.c.
      • Mindrinos M.
      • 戴维斯R.W.
      癌症生物标志物验证的近距离连接多重蛋白质检测。
      )或三倍(
      • Schallmeiner E.
      • oksanen E.
      • 爱立信O.
      • SpångbergL.
      • eriksson s。
      • Stenman U.H.
      • Pettersson K.
      • LANDEGREN U.
      通过三粘合剂邻近连接彩易福彩的敏感蛋白质检测。
      )识别PLA,SP-PLA同样适用于检测VEGF。同源相位PLA呈现出几种有吸引力的特征。该彩易福彩仅使用1μl样品,与5μL的SP-PLA样品相比,使其高度适用于样品量有限的应用中;与SP-PLA相比,使用甚至较少量的抗体;并且在不洗涤步骤的情况下进行彩易福彩,从而简化了程序和避免了可变性的来源。 SP-PLA的独特优点在于其适用于分析复杂的生物学材料,例如未稀释的血浆或血清甚至全血,这可能是在均质PLA的情况下抑制。此外,SP-PLA已被证明是稳健且易于设置的,并且可以在从合适的生物素化的多克隆抗体制剂开始的工作日内建立新的彩易福彩。通过针对整个靶蛋白升高的单个抗血清可以方便地实现对三种抗体分子的目标识别的要求,以确保几种表位对靶蛋白的特异性结合。或者,可以使用如前所述的三种单克隆抗体组的适当组合进行彩易福彩(
      • Schallmeiner E.
      • oksanen E.
      • 爱立信O.
      • SpångbergL.
      • eriksson s。
      • Stenman U.H.
      • Pettersson K.
      • LANDEGREN U.
      通过三粘合剂邻近连接彩易福彩的敏感蛋白质检测。
      )。到目前为止,我们已经建立了SP-PLA检测,用于检测超过46种不同的蛋白质,结果。
      SP.-PLA.已成功地用于估计临床血浆样品中冠状病标记的水平。该彩易福彩表现出非常好的再现性,低血管内CV%,并且令人满意的绕组CV%。此外,在不同场合的相同样品上进行的彩易福彩与彼此相同良好,并且使用ELISA对相同样品测量的水平。然而,SP-PLA将在临床环境中经常应用SP-PLA进一步发展。
      这里存在的彩易福彩室的进一步改善,例如减少彩易福彩时间,同时保持敏感性,并且当必须在甚至更低浓度下检测到靶分子时,允许使用相当大的样品。内部控制的使用将有助于提高再现性。此外,如本文所讨论的,SP-PLA方法是对高多重免疫彩易福彩的承诺,其中大组靶分子在最小的样品等分试样中被同时询问,用于诊断和研究目的。
      总之,我们已经表明,SP-PLA是一种稳健且高灵敏的蛋白质检测技术。它适用于临床应用,其中蛋白质需要在低浓度下量化,并在微小样品等分试样中分析生物库样品。此外,SP-PLA机制表现出高度多路复用免疫彩易福彩的发育的优异潜力。

      致谢

      我们感谢Katerina Pardali和Mikaela Friedman对稿件的批判性评论。我们还感谢乌普萨拉大学医院的Lars Wallentin有关这项研究的建议,并请咨询临床样本。

      补充材料

      参考

        • 安德森N.L.
        • 安德森N.G.
        人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 845-867
        • Fredriksson S.
        • 古伯格米
        • 贾维斯J.
        • olsson c.
        • Pietras K.
        • Gústafsdóttirs.m.
        • Ostman A.
        • LANDEGREN U.
        使用邻近依赖性DNA连接彩易福彩的蛋白质检测。
        NAT。 Biotechnol。 2002; 20: 473-477
        • Gustafsdottir S.M.
        • nordengrahn A.
        • Fredriksson S.
        • 瓦尔格伦P.
        • Rivera E.
        • Schallmeiner E.
        • Merza M.
        • LANDEGREN U.
        通过近距离连接检测单个微生物病原体。
        临床。化学。 2006; 52: 1152-1160
        • SöderbergO.
        • 古伯格米
        • 贾维斯M.
        • ridderstrålek。
        • Leuchowius K.J.
        • 贾维斯J.
        • Wester K.
        • 氢干P.
        • Bahram F.
        • Larsson L.G.
        • LANDEGREN U.
        通过近距离连接直接观察单个内源性蛋白质复合物。
        NAT。方法。 2006; 3: 995-1000
        • Gustafsdottir S.M.
        • 舒尔塞曼J.
        • rada-iglesias A.
        • Schallmeiner E.
        • Kamali-Moghaddam M.
        • Wadelius C.
        • LANDEGREN U.
        通过近距离连接的DNA-蛋白相互作用的体外分析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2007; 104: 3067-3072
        • 朱L.
        • Koistinen H.
        • LANDEGREN U.
        • Stenman U.H.
        前列腺特异性抗原与α1-蛋白酶抑制剂之间复合物的近距离连接测量。
        临床。化学。 2009; 55: 1665-1671
        • 古伯格米
        • Gústafsdóttirs.m.
        • Schallmeiner E.
        • 贾维斯J.
        • BjarnegårdM.
        • Betsholtz C.
        • LANDEGREN U.
        • Fredriksson S.
        基于抗体的邻近连接的细胞因子检测。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2004; 101: 8420-8424
        • Schallmeiner E.
        • oksanen E.
        • 爱立信O.
        • SpångbergL.
        • eriksson s。
        • Stenman U.H.
        • Pettersson K.
        • LANDEGREN U.
        通过三粘合剂邻近连接彩易福彩的敏感蛋白质检测。
        NAT。方法。 2007; 4: 135-137
        • Fredriksson S.
        • 迪克森W.
        • 吉H.
        • koong a.c.
        • Mindrinos M.
        • 戴维斯R.W.
        癌症生物标志物验证的近距离连接多重蛋白质检测。
        NAT。方法。 2007; 4: 327-329
        • Fredriksson S.
        • Horecka J.
        • Brustugun O.T.
        • 舒尔塞曼J.
        • koong a.c.
        • Tibshirani R.
        • 戴维斯R.W.
        多路复用的邻近连接彩易福彩以概述与胰腺癌和卵巢癌相关的推定血浆生物标志物。
        临床。化学。 2008; 54: 582-589
        • Meza M.B.
        基于珠的HTS应用在药物发现中。
        药物讨论。今天。 2000; 5: 38
        • Verpoorte E.
        珠子和芯片:用于分析的新食谱。
        实验室芯片。 2003; 3: 60n-68n.
        • 爱立信O.
        • 贾维斯J.
        • Schallmeiner E.
        • Howell M.
        • nong r.y.
        • 路透社H.
        • 哈恩米
        • Stenberg J.
        • Nilsson M.
        • LANDEGREN U.
        用于高性能核酸和蛋白质分析的双标签微阵列平台。
        核酸RES。 2008; 36: e45
        • 鸡蛋小吃
        • Kempf T.
        • allhoff t.
        • Lindahl B.
        • 莱克汀L.
        • 沃尔特K.C.
        生长分化因子-15用于急性胸痛患者早期风险分层。
        欧元。心J. 2008; 29: 2327-2335
        • 汉尚三
        • Pitteri S.J.
        • Faca v.m.
        采矿血浆蛋白质组癌生物标志物。
        自然。 2008; 452: 571-579
        • De Jager W.
        • rijkers g.t.
        基于固相和基于珠的细胞因子免疫彩易福彩:比较。
        方法。 2006; 38: 294-303
        • elshal m.f.
        • McCoy J.P.
        多重胎圈阵列彩易福彩:性能评估和对ELISA敏感性的比较。
        方法。 2006; 38: 317-323
        • SIMS P.W.
        • Vasser M.
        • 黄W.L.
        • 威廉姆斯下午
        • 孟Y.G.
        使用实时聚合酶链反应检测免疫聚合酶链反应。
        肛门。生物学习。 2000; 281: 230-232
        • 王家博士
        多路复用蛋白质测量:蛋白质和抗体阵列的技术和应用。
        NAT。 Rev.药物讨论。 2006; 5: 310-320