全球epitransfriptomics分析RNA后转录修饰作为研究压力反应eptrancemocs的有效工具*

  • Rebecca E. Rose
    隶属关系
    RNA研究所,大学奥尔巴尼(Suny),奥尔巴尼,纽约12222;
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  • 曼努埃尔A. Pazos II
    隶属关系
    RNA研究所,大学奥尔巴尼(Suny),奥尔巴尼,纽约12222;
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  • M. Joan Curcio.
    隶属关系
    RNA研究所,大学奥尔巴尼(Suny),奥尔巴尼,纽约12222;

    纽约奥尔巴尼的分子遗传学实验室,纽约12208
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  • Daniele Fabris.
    一致
    应当解决谁的通信:RNA研究所,大学在奥尔巴尼(Suny),生命科学研究建筑室1109,1200华盛顿大道,奥尔巴尼,NY 12222。电话:(518)437-3364;传真:(518)442-3462;
    隶属关系
    RNA研究所,大学奥尔巴尼(Suny),奥尔巴尼,纽约12222;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了奥尔巴尼大学RNA研究所的支持,并由国家卫生大学(GM064328-14)提供支持。内容完全是作者的责任,不一定代表国家卫生研究院的官方意见。
    本文包含补充图。 S1至S7和表S1
    1所用的缩写是:Mapkmitogen-activated蛋白Kinaseptmpost-转录改性体液电池普化离子型迁移率光谱法 - mshoghyperosmolarity甘油池对齐的平行射频离子色谱仪Mastermastmass选定的时间若干分辨率与代理相比。
      同时检测装饰细胞RNA的所有转录后修饰(PTMS)可以提供有关在整个eptrAstcriptome上改变环境条件的影响的综合信息。为了捕获这种类型的信息,我们进行了通过水解总RNA提取物产生的核糖核苷酸混合物的分析S. Cerevisiae.在过度肌肉和热休克条件下生长。它们的全球PTM型材清楚地表明对这些类型的压力的细胞反应涉及特定PTM的产生的深刻变化。观察到的变化不仅概述了典型的PTM的上/下调,而且还是在正常条件下不存在的新诱导,或者消除通常存在的其他人。指向不同类别的RNA的广泛参与,许多新观察到的PTM与从事已知的基于TRNA的转化重新编码机制的PTM等于由氧化应激引起的。一些表达效应是特异性的,而其他物质不是,因此表明RNA PTMS可以在应激响应中进行多方刻录的活性,这对其进行了独特的调节途径。为了探索其信令网络,我们基于在推定的副间映射中系统缺失基于与PTM生物酶的基因的系统缺失来实现策略。结果清楚地鉴定了直接猪控制的PTM,是有众所周知的蛋白激酶途径,参与真核生物中的应力反应。已经显示出该信号传导途径的激活导致许多MRNA的稳定性和所选择的染色质重塑所选择的LNCRNA的诱导。 PTM能够改变父RNA的活性的事实表明他们可能参与旨在调节这种RNA的调节功能的反馈机制。这种诱使假设将是未来研究的目的。
      蜂窝系统的可行性大大预先识别其识别和响应各种环境条件的能力(
      • mager w.h.
      • de kruijff a.j.
      应激诱导的转录激活。
      ,
      • ruis h.
      • SchüllerC.
      酵母中的应力信号传导。
      )。外部刺激引发抵消旨在维持生长并确保存活的补偿性反应。响应于压力源的细胞适应,例如温度突然变化,渗透性条件和营养素的可用性,产生酶活性和代谢的显着变化,其被良好校准的调节控制策划(
      • 德纳尔E.
      • Ammerer G.
      • POSAS F.
      控制基因表达响应应力。
      )。由于其在蛋白质合成中的多方面活性和基因调节中的功能,RNA在细胞组分中独特地定位,以充当代谢和应力反应的调节机制之间的通信节点(
      • Costa F.F.
      nonoding rnas:丢失翻译?
      ,
      • 莫里斯k.v.
      • Mattick J.s.
      调节RNA的兴起。
      )。该原理在丝裂剂激活蛋白激酶(MAPK)的活性中实现
      使用的缩写是:
      MAPK.
      促丝糖型活化蛋白激酶
      PTM.
      转录后修改
      ESI
      电喷雾电离
      IMS-MS.
      离子迁移率光谱 - MS
      h
      Hypermolarity甘油
      轻敲
      时间并行对齐
      r
      重建离子色谱图
      掌握
      质量选定的时间解决了
      AVP.
      丰富与代理。
      在许多真核系统中诱导的途径通过热量和渗透压(
      • 联邦人M.E.
      • Hofmann G.E.
      热冲击蛋白,分子伴侣和应力反应:进化和生态生理学。
      ,
      • verghese J.
      • 亚伯拉姆j.
      • 王Y.
      • 莫拉诺K.A.
      热休克反应和蛋白质伴侣的生物学:萌芽酵母(酿酒酵母)作为模型系统。
      )。在 S. Cerevisiae.,激活高摩尔甘油(HOG)MAPK途径产生离子通道,甘油出口,通用蛋白质机械和细胞周期进展的活动的显着变化(
      • o'rourke s.m.
      • Herskowitz I.
      • o'shea e.k.
      酵母去了整个猪的过度疗法反应。
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      • Clotet J.
      • POSAS F.
      响应于Osmostress的细胞周期控制:酵母的课程。
      )。对Osmostress的转录反应包括数百mRNA的诱导和稳定(
      • Romero-Santacreu L.
      • Moreno J.
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      • Krantz M.
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      • HOHMANN S.
      将酿酒酵母的转录反应对渗透冲击Hot1P和MSN2P / MSN4P诱导诱导高渗透甘油途径依赖性基因所必需的。
      )和长度非编码RNA(LNCRNA)的特定系列的上调(
      • nadal-ricelles m.
      • sol
      • 徐Z.
      • Steinmetz L.M.
      • 德纳尔E.
      • POSAS F.
      通过应激诱导的LNCRNA控制CDC28 CDK1。
      ),以及基因表达的一般下调(
      • nadal-ricelles m.
      • sol
      • 徐Z.
      • Steinmetz L.M.
      • 德纳尔E.
      • POSAS F.
      通过应激诱导的LNCRNA控制CDC28 CDK1。
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      酵母对盐胁迫的转录反应。
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      • 喘息A.P.
      • 斯派曼P.T.
      • kao c.m.
      • Carmel-Harel O.
      • eisen m.b.
      • 斯托斯G.
      • Botstein D.
      • 棕色p.o.
      酵母细胞对环境变化的响应中的基因组表达程序。
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      • ren
      • Koh S.S.
      • 哈利比亚C.T.
      • Kanin E.
      • 詹宁斯尤。
      • Lee T.I.
      • 真正的H.L.
      • 着陆器E.S.
      • 年轻的R.A.
      酵母基因组表达反应环境变化的重塑。
      )。显着地,已显示后一类RNA诱导染色质重塑和核心占用变化,对细胞记忆和表观遗传构成具有持久的影响(
      • Karapetyan A.R.
      • 批发C.
      • kuiper r.a.
      • 冷却M.W.
      长NCRNA和mRNA的调节作用。
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      长度非编码RNA:基因组印记的课程。
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      • 刘恩
      • 潘T.
      RNA表观遗传学。
      )。
      近年来,共价修饰和核苷酸编辑越来越多地被认为是调节RNA功能的有效机制(
      • namy O.
      • lecointe f.
      • Grosjean H.
      • Rousset J.-P.
      )。天然RNA含有超过100种典型碱的含量,其在RNA改性中编目(
      • Limbach P.A.
      • CRAIN P.F.
      • McCloskey J.A.
      发明内容:RNA的改性核苷。
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      • Cantara W.A.
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      • Rozenski J.
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      • 哈里斯卡.A.
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      • Agris P.F.
      RNA修改数据库:2011年更新。
      )和造形象(
      • 邓林霍基茨S.
      • Czerwoniec A.
      • Gajda M.J.
      • 联邦
      • Grosjean H.
      • Bujnicki J.M.
      Modomics:RNA改性途径的数据库。
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      • Machnicka M.A.
      • Milanowska K.
      • Osman Oglou O.
      • Purta E.
      • Kurkowska M.
      • Olchowik A.
      • Januszewski W.
      • Kalinowski S.
      • 邓林霍基茨S.
      • rother 3.
      • 掌舵
      • Bujnicki J.M.
      • Grosjean H.
      Modomics:RNA修改途径的数据库 - 2013更新。
      )数据库。这些转录后修饰(PTMS)由特定的生物酶产生,并具有稳定单个碱对和替代氢键图案的能力,这有助于RNA结构的令人惊讶的多样性(
      • Kowalak J.A.
      • dalluge J.J.
      • McCloskey J.A.
      • Stetter K.O.
      转录后改性在超嗜热嗜热乳渣稳定中的作用。
      ,
      • 掌舵
      转录后核苷酸改性及RNA的替代折叠。
      )。同时,观察到未改性的TRNA没有有效地与相应的氨基酰基加载,而特定的修改可防止加载不正确(
      • Giegér.
      • Sissler M.
      • Florentz C.
      TRNA身份中的普遍规则和特质特征。
      ),揭示了PTMS在蛋白质RNA识别中起主要作用。在TRNA抗ordon环中的高压核苷酸的RNA-RNA识别中观察到类似的效果,这被示出通过影响Codon-Antecon相互作用的准确性来诱导平移重新编码(
      • namy O.
      • lecointe f.
      • Grosjean H.
      • Rousset J.-P.
      )。在用过氧化氢处理时检测抗oryon回路改性的增加的发生率导致了转换重新编码是对氧化应激反应的基本机制(
      • chan c.t.y.
      • Dyavaiah M.
      • 德洛姆
      • Taghizadeh K.
      • Dedon P.C.
      • Begley T.J.
      定量系统方法揭示了在细胞应力期间TRNA修饰的动态控制。
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      • chan c.t.y.
      • pang y.l.j.
      • 邓维。
      • babu i.r.
      • Dyavaiah M.
      • Begley T.J.
      • Dedon P.C.
      TRNA修饰的重新编程控制通过密码子偏置蛋白翻译的氧化应激响应。
      )。由于几乎专用强调TRNA和RRNA作为PTMS的丰富来源,别人们对其在其他类别的其他类别中的生物功能和分布众所周知。然而,它们的酶促生物发生支持诱使PTMS可以构成调节调节RNA活性的常见反馈机制的关键要素。
      为了支持整个EpitrAstcriptomes的调查,我们开发了一种用于分析目标细胞中包含的所有PTM的新方法(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。这种方法依赖于来自样品的总RNA的提取,然后通过直接输注电喷雾电离(ESI)分析单个单核苷酸和分析(
      • yamashita m.
      • Fenn J.B.
      电喷雾离子源。自由喷射主题的另一个变化。
      )。所选工作流程避开了高分辨率色谱,以最大限度地减少可能的分离偏压,减少样品转移/操纵期间的损耗,并通过减少必要操作的数量来加快分析。高分辨率和多步串联质谱法的替代组合(MSn)(
      • solouki t.
      • PASA-TOLIC L.
      • 杰克逊G.S.
      • 关斯。
      • Marshall A.G.
      高分辨率多级MS,MS2和MS3矩阵辅助激光解吸/电离来自单个激光射击的肽的肽的FT-ICR质谱。
      ,
      • Collings B.A.
      • 坎贝尔准噶梅。
      • 毛泽东
      • 道格拉斯D.J.
      一种组合的线性离子捕集时间系统,具有改进的性能和MSN能力。
      )或离子迁移光谱法质谱(IMS-MS)(
      • 希尔赫。
      • SIEMS W.F.
      • 圣路易斯r..
      离子迁移光谱法。
      ,
      • CLEMMER D.E.
      • Jarrold M.F.
      离子迁移率测量及其在簇和生物分子中的应用。
      ,
      • 弗里尔奇G.
      • Ruotolo B.
      • Sawyer H.
      • Gillig K.
      • 拉塞尔D.
      对生物分子分析应用的离子迁移率质谱的根本介绍。
      )可以独立地使用气相破碎技术以完成单核苷酸混合物的表征具有优异的敏感性(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ,
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )。任一组合可以提供总RNA提取物中存在的任何PTM的身份和丰度,从而在整个转录组水平处提供综合和无偏的曲线。已经表明这种方法能够揭示不仅显着的差异,而且还具有在不同介质中生长的样品之间的PTM表达的微妙变化,或者从不同的生物中完全获得(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。
      在本报告中,我们采用了我们的全球分析方法来调查PTM表达和应力响应之间的广泛一般联系的可能存在,这超出了基于TRNA的平移重新编码的已知机制。初步实验旨在评估是否不同类型的应力,例如热休克和高骨肉胁迫,产生了可以归因于不同响应机制的独特PTM曲线。我们随后专注于猪途径,因为有关其在Hypermots压力反应中的作用(
      • HOHMANN S.
      • Krantz M.
      • 诺德兰德B.
      酵母osmoregulation。
      ,
      • Brewster J.L.
      • de Valoir T.
      • dwyer n.d.
      • 冬季E.
      • 古斯丁M.C.
      酵母中渗透压信号转导途径。
      ),包括MRNA和LNCRNA的良好表征诱导和稳定化(
      • Romero-Santacreu L.
      • Moreno J.
      • Pérez-ortínJ.E.
      • Alepuz P.
      酿酒酵母菌肿瘤胁迫期间MRNA稳定性的具体和全局调节。
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      • 莫林C.
      • Jauhiainen A.
      • risinger J.
      • 奈曼O.
      • Sunnerhagen P.
      mRNA稳定性改变在高骨骼应激期间稳态mRNA量的变化先行。
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      • 克服
      • Krantz M.
      • Thevelein 201.
      • HOHMANN S.
      将酿酒酵母的转录反应对渗透冲击Hot1P和MSN2P / MSN4P诱导诱导高渗透甘油途径依赖性基因所必需的。
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      • nadal-ricelles m.
      • sol
      • 徐Z.
      • Steinmetz L.M.
      • 德纳尔E.
      • POSAS F.
      通过应激诱导的LNCRNA控制CDC28 CDK1。
      )。该途径的一个关键组分是高度保守的MAPK蛋白肝术,一种对哺乳动物P38和C-JUM N-末端激酶同源的应激活化的蛋白激酶,其涉及细胞周期的多个阶段并具有重新编程基因的能力在压力存在下的表达(
      • 锡达赫
      • POSAS F.
      对高血白胁迫的反应。
      )。因此,我们首先比较从野生型获得的PTM配置文件 S. Cerevisiae. (IE。 WT)在渗透和存在的情况下识别与已知应激响应编码和非编码基因的诱导相关的可能的PTM变化(
      • nadal-ricelles m.
      • Conde N.
      • Flores O.
      • González-Vallinas J.
      • Eyras E.
      • Orozco M.
      • 德纳尔E.
      • POSAS F.
      h1通过RNA聚合酶II再分分配和染色质重塑转录的转录来绕过胁迫介导的降调。
      )。然后,我们进行了突变菌株的分析 h1 gene was deleted (即Hog1.Δ)辨别 hog1 - 从奥斯莫斯特雷斯诱导的那些没有落下的那些依赖于那些的PTM h1。最后,我们实施了一个互乱的步行策略,其中连接基因 h1 依次逐行删除PTM生物发生酶,以追溯信号级联并显示PTM表达与该应力响应通路之间的直接关系。为了获得原则证明和评估这种方法的重要性,我们探讨了推定的途径 h1RIT1,负责研究中观察到的最突出的应激诱导的修饰之一的酶。结果清楚地显示了监测单个基因缺失对整个转录组水平的PTM生物影响的更广泛影响的优点。

      材料和方法

       细胞提取物的制备

      酿酒酵母酿酒酵母 应变BY4741(在此定义为Wildtype,WT)以及 hog1Δ:: kanmx,ssb1Δ:: kanmxi., rit1Δ:: kanmx, 和 hog1Δ:: kanmx 根据既定程序获得的衍生物(
      • Winzeler E.A.
      • 鞋匠D.D.
      • astromoff a。
      • 梁H.
      • 安德森克。
      • 安德烈B.
      • Bangham R.
      • Benito R.
      • Boeke J.D.
      • Bussey H.
      • 楚他
      • Connelly C.
      • 戴维斯K.
      • Dietrich F.
      • 陶氏S.W.
      • El Bakkoury M.
      • 四十f.
      • 朋友S.H.
      • 麦格林E.
      • Giaver G.
      • 赫格曼J.H.
      • 琼斯T.
      • la
      • 廖H.
      • 谎言N.
      • 洛克哈特D.J.
      • Lucau-Danila A.
      • Lussier M.
      • M'rabet N.
      • 梅纳德
      • Mittmann M.
      • PAI C.
      • rebischung c.
      • Revuelta J.L.
      • Riles L.
      • 罗伯茨C.J.
      • 罗斯 - 麦克唐纳
      • Scherens B.
      • 斯奈德米
      • Sookhai-Mahadeo S.
      • 风暴R.K.
      • Véronneaus。
      • voet m.
      • Volckaert G.
      • 沃德
      • Wysocki R.
      • 日元。
      • yu K.
      • Zimmermann K.
      • Philippsen P.
      • 约翰斯顿M.
      • 戴维斯R.W.
      基因缺失和平行分析,S.酿酒酵母基因组的功能表征。
      ,
      • Giaver G.
      • 楚他
      • NI L.
      • Connelly C.
      • Riles L.
      • Véronneaus。
      • 陶氏S.
      • Lucau-Danila A.
      • 安德森克。
      • AndréB.
      • Arkin A.P.
      • astromoff a。
      • El-Bakkoury M.
      • Bangham R.
      • Benito R.
      • Brachat S.
      • Campanaro S.
      • 柯蒂斯米
      • 戴维斯K.
      • Deutschbauer A.
      • entian K.-d.
      • Flaherty P.
      • 四十f.
      • Garfinkel D.J.
      • Gerstein M.
      • 达到
      • GÜLDENERU.
      • 赫格曼J.H.
      • Hempel S.
      • 赫尔曼Z.
      • Jaramillo D.F.
      • 凯莉D.E.
      • 凯莉S.L.
      • KötterP.
      • Labonte D.
      • 羔羊D.C.
      • LAN N.
      • 梁H.
      • 廖H.
      • 刘L.
      • 罗c.
      • Lussier M.
      • 毛罗
      • 梅纳德
      • OOI S.L.
      • Revuelta J.L.
      • 罗伯茨C.J.
      • 玫瑰m.
      • 罗斯 - 麦克唐纳
      • Scherens B.
      • 谢里马克G.
      • Shafer B.
      • 鞋匠D.D.
      • Sookhai-Mahadeo S.
      • 风暴R.K.
      • Strathern J.N.
      • 瓦尔G.
      • voet m.
      • Volckaert G.
      • 王C.
      • 沃德
      • Wilhelmy J.
      • Winzeler E.A.
      • 杨Y.
      • 日元
      • 年轻人E.
      • yu K.
      • Bussey H.
      • Boeke J.D.
      • 斯奈德米
      • Philippsen P.
      • 戴维斯R.W.
      • 约翰斯顿M.
      酿酒酵母基因组的功能性分析。
      ),直接从开放生物系统(Huntsville,Al)购买。酵母菌株在酵母提取物中生长,蛋白胨,葡萄糖(YPD)培养基。将每种菌株划合到YPD琼脂上并在30℃下孵育。对于所有研究,从板中选择单个菌落,并置于含有20mL YPD的单个管中。将培养物在30或37℃下孵育,200rpm染色。光密度为600 nm(OD600)在Thermofisher Scientific(Waltham,MA)Nanodrop 2000C分光光度计上监测,直到实现大于0.3个单元的值。将未处理的液体培养物稀释至最终的0.3个OD600 并以6000×离心 g 5分钟获得含有大约相同数量的细胞的颗粒。每个样品在至少五个单独的培养物(生物重复)中并联生长,并且从它们中获得的材料提交至五个独立分析(技术复制)。评估Osmostress对RNA改性型材的可能影响, S. Cerevisiae. 生长为中期阶段,并诱导0.4 m NACL。然后将液体培养物孵育另外15分钟,因为已经发现这些条件特异性过表达〜343编码基因和〜173 LNCRNA(
      • nadal-ricelles m.
      • Conde N.
      • Flores O.
      • González-Vallinas J.
      • Eyras E.
      • Orozco M.
      • 德纳尔E.
      • POSAS F.
      h1通过RNA聚合酶II再分分配和染色质重塑转录的转录来绕过胁迫介导的降调。
      )。在所有情况下,据报道的结果是至少五个生物重复的平均值,每个生物重复都提交了五个技术重复。

       样品制备和质谱分析

      每个颗粒通过使用变性溶液(Life Technologies,Grand Island,Ny)破坏。通过使用完全RNA提取试剂盒(寿命技术)来提取总RNA,其基于典型的苯酚/氯仿程序。通过使用冷异丙醇沉淀RNA,然后用1x DNase缓冲液用DNase1(新英格兰Biolabs,Ipswich,MA)处理以除去任何剩余的DNA。随后通过乙醇沉淀脱盐过夜并在50μl的无RNA酶水(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo)中重构回收的RNA。通过260nm的UV吸光度测量来自每个样品的完整总RNA的浓度。从蛇毒液(Sigma-Aldrich)的核酸酶P1和磷酸二酯酶1用于完成RNA的消化,进入个体单核苷酸,如前所述(
      • CRAIN P.F.
      大众光谱法制备DNA和RNA的制备和酶水解。
      )。在分析之前,立即,最终样品在150米中稀释1:10m 乙酸铵和10%异丙醇。
      通过直接输注ESI在水域(MILFORD,MA)SYNAPT G2 HDMS IMS质谱仪或Thermofisher Scientific LTQ-Orbitrap VeloS质谱仪上通过直接输注ESI进行质谱分析。所有分析通过在房屋中产生的石英发射器进行纳米射线模式进行。通过使用凝胶负载管移液管尖端通常将最多5μl样品加载到每个发射器中。将不锈钢线插入发射器的后端,以供应电离电压,范围为0.9和1.2 kV。通过密切监测铵加合物和水簇的发生率来调整源温度和脱溶解条件(
      • Fabris D.
      • 特纳k.b.
      • Hagan N.A.
      )。
      在IMS-MS仪器上进行的分析提供了热图,其提供了在样品中存在的全部补充的全面表示。对于这些实验,通过在50:50水/甲醇中使用2mg / ml铯碘化铯校准仪器。这种外部校准提供了典型的~9 ppm精度(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ,
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )。为了综合混合分析,通过90ml / min流动,在〜4.40毫巴(未校准量表读数)的压力下保持三波区域2 他的180毫升/分钟。它以〜650 M / s IMS波速,40V波高,109m / s的传输波速度和2.0V传输波高。时间对齐并联(Tap)解离和质量选择的同学/异构物种的碎片碎片如前所述进行(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ,
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )。简而言之,挖掘实验涉及通过仪器的四极(Q)元件通过纳米喷雾源产生的所有离子,然后将它们注入三波区域以使其根据其到达时间的判别(tD)。对于达到在三波元件之后立即达到仪器的转移区域的所有离子进行激活。在飞行时间(TOF)分析仪中容易检测到片段,从而保留每组片段和T之间的关系D 相应的前体(s)(
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )。相比之下,涉及仅传输特定的离子群体的实验 m / z. 通过质量选择性Q.然后将可包含多种等异物/异构物质的质量选择的前体分散在三波元件中的时域中,然后在转移区域(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。因此,这些技术之间的差异是前者可以同时为样品中包含的所有可能离子提供碎片数据,而后者模拟了真正的串联MS实验,其中根据两者顺序选择前体离子的实验 m / z. 和 tD Q和三波区域的特征。
      在LTQ-orbitrap上进行的分析提供了准确的质量和碎片数据,用于确认IMS-MS实验所提供的初始任务。对于高分辨率/精度测定,通过使用包含十二烷基 - 硫酸钠,牛磺酸钠和超大的阴离子混合物来校准仪器。我们之前已经表明,这种外部校准可以提供典型的~200ppb精度(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ,
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )。对于核糖核苷酸的尺寸,这种精度水平显着降低了可能适合观察到的质量的可能元素组合物的数量,从而增加了数据解释的置信水平。串联质谱(MS / MS)(
      • MLEFFERTY F.W.
      串联质谱。
      ),多步激活实验(MSn)(
      • solouki t.
      • PASA-TOLIC L.
      • 杰克逊G.S.
      • 关斯。
      • Marshall A.G.
      高分辨率多级MS,MS2和MS3矩阵辅助激光解吸/电离来自单个激光射击的肽的肽的FT-ICR质谱。
      ,
      • Collings B.A.
      • 坎贝尔准噶梅。
      • 毛泽东
      • 道格拉斯D.J.
      一种组合的线性离子捕集时间系统,具有改进的性能和MSN能力。
      )和连续的反应监测(CRM)(
      • Tomer K.B.
      • Guenat C.R.
      • 弄脏L.J.
      四个扇区质谱仪中连续的反应监测:MS4和一个步骤。
      )如前所述进行(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ,
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )。小姐n 和CRM专门用于证实等异构/异构物质的同一性,其最初从IMS-MS测定中获得。

       数据处理

      通过使用MSCONVERT将从IMS-MS或LTQ-orbitrap仪器获得的实验块变为可读文件格式(
      • Chambers M.C.
      • 麦克莱恩B.
      • Burke R.
      • Amodei D.
      • Ruderman D.L.
      • Neumann S.
      • Gatto L.
      • Fischer B.
      • 普拉特B.
      • Egertson J.
      • 霍夫克
      • Kessner D.
      • 塔斯曼N.
      • 舒尔曼N.
      • Frewen B.
      • 贝克T.A.
      • Brusniak m.y.
      • 保罗C.
      • 皱纹D.
      • 闪光灯L.
      • Kani K.
      • 成型C.
      • Seymour S.L.
      • Nuwaysir L.M.
      • Lefebvre B.
      • Kuhlmann F.
      • 罗克J.
      • rainer p.
      • Detlev S.
      • Hemenway T.
      • Huhmer A.
      • Langridge J.
      • Connolly B.
      • Chadick T.
      • 霍莉K.
      • eCkels J.
      • 德意曲e.w.
      • 莫里茨R.L.
      • 凯茨J.E.
      • agus d.b.
      • Maccoss M.
      • Tabb D.L.
      • Mallick P.
      用于质谱和蛋白质组学的跨平台工具包。
      ),然后使用以搜索RNA修改(

      .http://mods.rna.albany.edu/,

      ),造形象(

      .http://modomics.genesilico.pl/,

      )或家庭构建的数据库(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。随后通过在IMS-MS仪器上点击和主确定来确认初始数据库“命中”。在异构/等异物物种的情况下,结果通过MS进一步证实n 和LTQ-orbitrap上的CRM分析。同时,IMS-MS确定提供的初始热图数据也经受数据减少,对准和缩放以实现点点数据减法。通过使用OriginPro 9.1(Origil Lab,North Hampton,MA)以热图形式可视化结果,以易于突出样本之间PTM表达的微妙变化。
      检测物种的丰度以相对而不是绝对的术语表达,以立即欣赏在所选实验条件下的过度/欠表达。如参考文献详细讨论的那样
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ,每种物种的丰度表示为在相同样品中检测到的规范核糖核苷酸的累积丰度的百分比,定义为丰富 相对 proxy (AvP):
      AvPx=aixΣ14cri×100%


      其中 AIX. 是分析物的信号强度 x, 然而 克里斯 是四种规范核糖核苷酸中的每一个的强度。基于观察结果,规范核糖核苷酸在遗传学中而不是代谢控制,它们的总体丰度仅受修饰的存在。因此,可以将规范核糖核糖核苷酸合并在一起以作为获得以百分比表示的相对丰富的代理内部标准。在以前的工作中,使用标准添加方法来确定酵母中所选PTMS的绝对量,这使得计算相应的AVP值以确认这种方法的有效性(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。
      本报告中包含的所有AVP值是在相同实验条件(生物重复)下分别生长的至少五种不同样品中获得的结果的平均值。将从每个菌株/条件获得的数据与在30℃下在YPD中生长的野生型BY4741菌株提供的数据进行比较,如上所述,其代表了这些测定的基线。成对的双尾学生 t 试验用于评估比较的统计学意义,该统计学意义是在95%的置信水平上完成的(IE。 对应A. p 值0.05)。将测试应用于感兴趣的样本和野生型控制中检测到的每种物种。以这种方式,任何与a的变化 p 值小于0.05的值被认为是显着的,并且根据与野生型相比,表格中的表格中的不同颜色视为不同的颜色阴影。

      结果和讨论

       全球epitranscriptomics分析

      在应激下由生物体分阶的细胞响应涉及许多代谢途径的并发和协调活化。因此,调查单个PTM的命运可以在整体响应机制中仅提供其作用的有限观点。相比之下,同时监测多个PTM的能力可以为其协同活动和系统级的协调提供有价值的见解。通过能够复用PTM检测的分析策略并准确评估其相互表达水平的分析策略,可以获得这种类型的信息。在这个方向上,我们最近开发了一种获得完整PTM型材的策略,这涉及从细胞裂解物中获得的总RNA提取物的分析(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。随后通过选定的外切核酸酶消化该材料,得到在没有前端分离程序的情况下分析的单核苷酸混合物(参见材料和方法)。通过高分辨率MS分析可以容易地解决这些类型的混合物的复杂性,然后串联MS进行结构验证(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。或者,IMS-MS分析可以通过根据质量和离子迁移率行为判别分析物来完成任务。后者由离子与背景气体相互作用的概率决定,同时在中等电场行驶,这是尺寸和构象的函数(
      • 希尔赫。
      • SIEMS W.F.
      • 圣路易斯r..
      离子迁移光谱法。
      ,
      • CLEMMER D.E.
      • Jarrold M.F.
      离子迁移率测量及其在簇和生物分子中的应用。
      ,
      • 弗里尔奇G.
      • Ruotolo B.
      • Sawyer H.
      • Gillig K.
      • 拉塞尔D.
      对生物分子分析应用的离子迁移率质谱的根本介绍。
      )。互动会影响到达时间(TD)每个离子,其符合相应的质量与电荷比(m / z.)获得全面的3D图或热图。 Fig. 1 示出了代表性的热图,其中检测到的离子的相对强度 - 对应于3D图的第三维度 - 由颜色梯度表示。通过这种方式,热图可以提供样品中所有物种的综合视觉表现,这使得在不同环境条件下生长的菌株之间的立即比较(例如 Fig. 1A1B)或野生型和突变菌株(例如 Fig. 1A1C,Videfra)。
      图缩略图GR1.
      图。1。通过阴离子IMS-MS分析获得的代表性热图 S. Cerevisiae. 在ypd培养基中长大 A,30°C(wt,控制)或 B,37°C(wt37, 热休克);和 C, rit1δ菌株在30℃下生长(rit1Δ)。控制板 D,示出了包含AR(P)修改的扩展区域,其使一个能够容易地比较各个样本中的表达水平。热图的强度轴被缩放到相同的电平,以通过使用右侧提供的颜色梯度来实现直接比较。面板中的扩展区域 A 显示U /的时域实现的分离Ψ isobars.
      所描绘的数据 Fig. 1A 是从中获得的 S. Cerevisiae. 菌株BY4741,在30℃(WT对照,见材料和方法)的正常条件下生长。提供的群众信息 y 容易使用轴来搜索在RNA修改中可用的条目中编译的非还原数据库(

      .http://mods.rna.albany.edu/,

      )和造形象(

      .http://modomics.genesilico.pl/,

      )数据库。初始数据库“命中”包括共享相同元素组合物的许多异构/等值物种,因此不能仅基于单独的质量来歧视。但是,如前所述尿苷/假尿苷夫妇(
      • Quinn R.
      • Basanta-Sanchez M.
      • 玫瑰R.E.
      • Fabris D.
      直接输注分析非常相似或相同的元素组合物的核苷酸混合物。
      )和一系列甲基 - 鸟嘌呤产品(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ),与异构物种相关的不同结构转化为在T上易于区分的独特离子迁移行为 D 尺寸(见图 Fig. 1A 插图)。努力适当校准TD 目前正在进行不同硬件平台中的轴来实现特性TD 值作为单个PTM的唯一标识符。与此同时,我们利用在时域上分散异构/等值物种的能力,以使其单独的气相激活和碎片化。在被定义为质量选择的时间分辨(Master)解离确定(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      ),每个靶前体可以在仪器的质量选择性四极杆上分离,允许在离子迁移率元件中暂时分散,然后在转移区域中被激活,然后在飞行时间分析仪中检测随后的片段(见材料和​​方法)。
      此处可以在此示例进行这种分析,用于检测到的物种 m / z. 365.024 Fig. 1A,该临时分配给异构/异烟耦合AC4C / F.5CM通过初始数据库搜索。通过将前体离子分离在质量选择性Quadrupole中获得的到达时间分布(ATD) Fig. 2A。借助于适当的解卷积算法(参见材料和方法)进行分析,记录的信号揭示了在T上区分的两个离散组件的存在D 尽管有广泛的丰富,但仍有尺寸。通过检查通过从记录的碎片数据集中提取唯一异构体特异性片段而获得的相关重建离子色谱(RIC)来确认这些组分的标识。的确,tD ric的信号存在 m / z. 154 (Fig. 2B)匹配整个ATD中越丰富的物种(Fig. 2A),从而将此组件识别为AC4C等离。相比之下,M / Z 136的RIC上的信号(Fig. 2C)匹配较少的物种,证实了其身份作为f5cm iSobar。通过常规串联MS分开进行证实,通过损失使得共价修饰的相应核碱基部分的损失产生这些等离的碎片(参见 补充图S4)。制备中的稿件将提供独特的前体→碎片过渡,以确认在这些酵母样品中观察到的所有PTM的同一性。对于所有初始数据库“命中”进行此类分析,以完成其正面识别(参见额外代表数据的支持材料)。列入了碎片数据的PTMS 表I.A.
      图缩略图GR2.
      图2。A,在分离前体离子后获得的IMS-MS到达时间分布(ATD) m / z. 365 in A。虚线对应于原始数据,而实线是高斯拟合信号(参见材料和方法)。通过从产品离子的数据集中提取碎片而获得的重建离子色谱图(RIC) m / z. 154, B, 和 m / z. 136, C,这分别是AC的特征4C和F.5cm(见支持材料)。点标记各个信号的质心。
      表I.定量测定在A)酿酒酵母中总RNA提取物的核糖核苷酸的定量测定)30℃(WT,对照); b)37°C(wt37, 热休克); c)用0.4处理后30℃ m NaCl (WTS,osmostress); d)用0.4处理后37℃ m NaCl (WTS,37); Hog1δ在e)中生长)30°C(Hog1δ); f)37°C(HOG1δ37); g)30°C处理后0.4 m NaCl (hog1ΔS); H)37°C处理后0.4 m NACL(见材料和​​方法)
      表格缩略图FX2.
      2以质量单位(U)表达中性实验物质。
      3推定的RNA类包括:Messenger RNA(M);核糖体RNA(R);转移RNA(T);预传递RNA(Pre-T);小核RNA(SN);小核仁RNA(SNO);未知班级(?)。
      4对于每个PTM,从各个信号强度计算丰度与代理(AVP)的值,作为四个官方核糖核苷酸的强度之和的百分比(参见材料和方法)。该优选形象表示样品中每种PTM的丰度的相对测量,这是引入和验证的
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      。每个报告的价值是五种复制分析的平均值。
      5红颜色标记在WT样本中不存在新表达的PTM;蓝色标记具有表达水平的PTM,其不会从WT控制中观察到的那些显着偏离(即, p >0.05);较深/较浅的蓝色表示PTMS,水平与WT的水平偏离(即, p <0.05):较暗的蓝色表示过表达,较轻的蓝色表达式(参见材料和方法)。
      *以前对这种微生物进行了未报告的修改。
      PTM.的定量测定传统上遭受了适当标准的缺乏>100名已知的核糖核苷酸变体。我们已经表明,在标准添加方法的改进版本中,可以有效地使用纯化的外源性TRNA样品作为PTM标准的控制来源(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。根据该策略,将准确的已知量的外源性TRNA加入到总RNA提取物中,从而随后的外切核酸酶处理可以直接释放 原位 其分子中存在所需的PTM标准。提出了一种旨在确定旨在确定表达水平相对相对变化的应用,而不是绝对PTM浓度的应用。据此,采用遗传而不是代谢对照的细胞中包含的规范碱的整个补料作为代理内标,以表达检测到的PTMS的相对丰度(参见材料和方法)(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。丰富 相对 将通过该处理产生的代理(AVPS)与由通过标准添加方法获得的绝对浓度计算的相应值进行比较。这些值之间的出色匹配为此量化策略提供了必要的验证(
      • 玫瑰R.E.
      • Quinn R.
      • Sayre J.L.
      • Fabris D.
      通过电喷雾电离质谱法在全转录组水平上分析核糖核苷酸修饰。
      )。描述的IMS-MS数据 Fig. 1A 根据该处理处理,评估样品中所有PTM的相对表达水平(表I.A),无论个人标准的可用性如何(参见材料和方法)。

       热休克和渗透瘀对PTM表达的影响

      上述实验策略用于获得已受到不同类型应力的样品的全球性曲线。例如,热图 Fig. 1B 是从野生型样品获得的 S. Cerevisiae. BY4741在37°C(WT)的YPD培养基中生长37,见材料和方法),在已知诱导典型的热休克响应的条件下(
      • 莫拉诺K.A.
      • 授予C.M.
      • Moye-Rowley W.S.
      酵母菌酿酒酵母中热冲击和氧化应激的反应。
      )。这些数据与WT控制提供的视觉比较( Fig. 1A)揭示了显着的差异,通过完成样品中的PTMS鉴定(表I.B)。由WT控制的轮廓表示的基线包括共41个不同的PTMS(表I.A)。相比之下,wt37 样本显示50 ptms,其中32个也存在于WT控制中,其余18个用于这种类型的样品唯一的ptms(标记为红色 表I.B)。观察到的PTM含量的增加与先前公布的报道一致,热冲击激活引起细胞内RNA成分的宽过表达(
      • Lindquist S.
      • 克雷格e.a.
      热冲击蛋白。
      ,
      • Borkovich K.A.
      • 撒尿f.w.
      • Finkelstein D.B.
      • 南部J.
      • Lindquist S.
      HSP82是在较高温度下细胞生长的浓度下需要的必需蛋白质。
      )。在两种样品之间共同的32个PTM中,以相当的相对丰度在两者中检测到四种,而在WT中分别在和过度表达下37 (标有较深和更轻的蓝色色调 表I.B)。必须强调的是,对每种类型的样品分析至少五种生物重复以评估定量测定中的不确定性内在(参见材料和方法)。只有具有相对丰富的PTM,与WT控制的相对丰富 p value <0.05被认为是显着的并且标记为/过度表达。较小的偏差 p >0.05匹配从提交给这种分析的酵母样品获得的典型生物再现性,因此被认为是正常的实验波动(参见材料和方法)。
      以类似的方式, S. Cerevisiae. 菌株在30℃下在YPD培养基中生长,然后暴露15分钟。到一个包含0.4的环境 m NaCl (WTS,见材料和方法),诱导特征osmostress响应(
      • nadal-ricelles m.
      • sol
      • 徐Z.
      • Steinmetz L.M.
      • 德纳尔E.
      • POSAS F.
      通过应激诱导的LNCRNA控制CDC28 CDK1。
      )。同样在这种情况下,相应的热图(未示出)提供了与WT控制的结果显着不同,并且显着地从WT的结果不同37 样品也是如此。通过完成肯定识别来揭示PTM配置文件(表I.C)显示wtS 含有总共38个PTM,具有八个新表达(红色)和30个与WT控制(蓝色)共同,其中分别在7和22中,欠下和过表达(蓝色色调)。此外,八个新表达的PTMS中的七种(WT控制中不存在)也存在于WT中37,而剩下的剩余物品对于此样本是独一无二的。
      这些实验清楚地表明,对这些不同类型的压力的细胞反应涉及特定RNA PTMS的产生的深刻变化。该变化不限于常见PTMS表达水平的变化,但也包括在没有压力源的情况下先前休眠的新途径的激活。根据RNA修改中包含的信息(

      .http://mods.rna.albany.edu/,

      )和造形象(

      .http://modomics.genesilico.pl/,

      )通过热冲击和热冲击激活的18个新PTM的数据库,先前已经在真核生物中描述了与osmostress相关的八种相关的3种,但不一定是酵母TRNA。用于该组PTM的代表性串联MS数据包括在支撑材料部分中,以证实其在该样品中的检测。在这方面,重要的是要注意,在不同生物和RNA类别中分布PTM的信息仍然是相当零碎的。在大多数情况下,某种PTM的出处只引用了报告其第一次检测/表征的初始研究,而不是综合调查结果。绝大多数研究传统上专注于TRNA和rRNA,不仅是因为它们丰富的PTM含量,而且还用于可用性的隔离协议。此外,目前尚不清楚是否从在应力条件下收获的样本获得了常见数据库中存在的任何分发信息。因此,包括在的源信息 表I. 应该酌情考虑。抛开这些考虑因素,非常重要的是,在应力下检测到的新PTM都不是涉及涉及基于TRNA的平移重新编码的氧化应激反应机制的那些
      • chan c.t.y.
      • Dyavaiah M.
      • 德洛姆
      • Taghizadeh K.
      • Dedon P.C.
      • Begley T.J.
      定量系统方法揭示了在细胞应力期间TRNA修饰的动态控制。
      ,
      • chan c.t.y.
      • pang y.l.j.
      • 邓维。
      • babu i.r.
      • Dyavaiah M.
      • Begley T.J.
      • Dedon P.C.
      TRNA修饰的重新编程控制通过密码子偏置蛋白翻译的氧化应激响应。
      )。该观察表明,新激活的途径的相当大量可能依赖于非常不同的机制。
      仔细检查WT中表达的新PTMS 透露,七个与wt共同37 样品,但是1和11分别是前者或后者的独特,从而指向涉及PTM生物发生的不同应答途径的存在。很好地确定,热应力根据热休克蛋白(HSP)的突出表达激活响应,通过限制蛋白质变性来发挥其保护作用(
      • 掌舵
      转录后核苷酸改性及RNA的替代折叠。
      ,
      • 阿特金森B.
      • C。
      • 瓦尔登D.B.
      )。然而,已经表明,猪途径也可以在较高温度下激活(
      • kamada y.
      • 荣美
      • piotrowski J.
      • Levin D.E.
      蛋白激酶C活化映射酿酒酵母酿酒酵母的C激酶途径介导热休克反应的新颖方面。
      ),从而提高各个信号传导途径可以紧密地交织的可能性。如果证明是正确的,这一假设将为我们的实验中的热休克和Osmostress引起的七种常见PTM提供了一个很好的解释。
      除了在WT控制中不存在的新PTMS诱导外,应力条件以不同方式影响现有PTM的表达水平。实际上,在WT中,现有PTM的相对丰度显着增加37 和 WTS 分别在WT控制上(IE。 展示 p <0.05)。相比之下,在相同的样品中,14和7种现有的PTM显着降低,而4个和一个在标准分析条件下不再可检测到的。同样在这种情况下,可以容易地分类各种PTM,其具有应力特异性的独特组。在wt的20个下调修改中37,14在wt中显示了相同的行为s。与此同时,在wt的32种上调/独特的37,20在wt中显示了相同的行为s。然而,在某些情况下,变化方向在两个样本中都不匹配,如图1所示6与对照相比,在Osmostress下调节,但在热冲击下消失,或者甲基 - 一种具有精确相反的法定的异构体(表I.)。压力条件下特异性PTM的消失特别有趣,并表明它们可能对细胞反应可能不是必不可少的可能性,并且它们的功能可以通过其他应激特异性PTMS有效接收。从这些初始实验中出现的图像清楚地排除了PTM生物发生可能由单个调节途径控制的观点,但建议替代是多个单独控制的存在。

       鉴定猪依赖表达途径

      毫不含糊地识别猪控制下的应激诱导的PTM,我们分析了一个 hog1δ应变,其缺乏应力激活的蛋白激酶肝术,响应Osmostress重新编程的基因表达的母系调节剂。这 hog1Δ突变体首先在30℃下生长,以在没有应激的情况下鉴定其基线曲线,这包括在WT对照中诱导四种新的PTMS(表I.E)。随后在37℃下生长突变菌株(即Hog1.Δ37)并用0.4处理 m NaCl at both 30 °C (hog1ΔS)和37°C(即Hog1.Δ37,S)。样品显示了在相应的环境条件下在WT中观察到的大多数PTM的复合曲线,以及在WT中不存在的独特新的新的PTM(分别用不同的蓝色色调标记),或者 表I.F-一世 H)。
      根据消除的过程检查专门在应力条件下观察到的新激活的PTM,以确定其推定的监管关系(总结 表二)。特别地,突变诱导的任何新表达的PTMS的消除(IE。 在WT控制中缺席)被解释为猪控制的证据。可以在此处说明消除过程背后的推理,用于新表达的何人5你修改。这种物种在WT控制中不存在,但在WT中存在37,wt.S,以及双重压力的wt37,S 样品(参见材料和方法),从而将其状态巩固其作为应力诱导的PTM的状态。与此同时,这个物种在所有的所有物种都毫不犹豫地缺席 hog1Δ样品无论条件如何,这表明其表达与猪途径有关。相比之下,我6a和ncm5在wt中观察到的修改37 和 WTS 未被突变消除,从而表明其应激诱导的生物发生与猪途径无关。
      表二概述在WT,或SSB1δ或Rit1δ突变体中表达的新PTM或RIT1δ突变体在控制或应力条件下。此表仅包括两者中标记为红色的PTM 表I. 和1S(附加突变株的完整数据提供在支撑材料中)
      表格缩略图FX3.
      2推定的RNA类包括:核糖体RNA(R);转移RNA(T);未知班级(?)。
      3wt, hog1δ, ssb1δ,且 rit1在正常条件下在30℃下在30℃下(无下标)在30℃下生长δ菌株; 37°C(37下标);处理后30°C 0.4 m NACL(S下标);和37°C处理后0.4 m NACL(S,37下标)(见 材料和方法)。
      4红颜色标记在WT样本中不存在新表达的PTM。
      *以前对这种微生物进行了未报告的修改。
      值得注意的是,尽管通过热休克和鸵鸟部触发了这些PTM的生产,但其他人对任何类型的压力都显示出突出的特异性。例如,仅在WT中检测到xS 样本(以及与此发现一致,在双重强调的wt中37,S)赢得奥斯莫斯特塞诱导的状态和 hog1 - 依赖。其分析样本中的重现性和丰度对其意义造成了疑问。同时,发现10个推定的PTMS被热休克诱导和 hog1 - 依存,但只有一个是热休克诱导的 hog1-独立的 (表二)。最后,F.5只有在当时观察到 hog1Δ突变体受到更高的温度,从而表明可以激活替代机制的热响应机制,这可以补偿消除肝素激酶。

       一种在应力响应监管网络中将PTM生物生成的策略

      这些实验提供的结果清楚地表明,热量和渗透胁迫对PTM生物发生的影响未被单一调节途径介导,而是导致更复杂的监管网络的协调活性。在 S. Cerevisiae. (萌芽酵母),对应力下基因表达的广泛调查导致了鉴定响应于特异性刺激而持续上调或下调的基因(
      • 陈德。
      • Toone w.m.
      • Mata J.
      • Lyne R.
      • 烧伤
      • Kivinen K.
      • Brazma A.
      • 琼斯N.
      • BÄHLERJ.
      裂变酵母对环境压力的全局转录反应。
      )。这些基因被定义为特定的环境应激反应基因(SESR, 方案1)(
      • 喘息A.P.
      • 斯派曼P.T.
      • kao c.m.
      • Carmel-Harel O.
      • eisen m.b.
      • 斯托斯G.
      • Botstein D.
      • 棕色p.o.
      酵母细胞对环境变化的响应中的基因组表达程序。
      )。在 S. Pombe. (裂变酵母),而是常见的基因组定义为核心环境应激反应基因(CESR)几乎所有类型的压力(
      • 喘息A.P.
      • 斯派曼P.T.
      • kao c.m.
      • Carmel-Harel O.
      • eisen m.b.
      • 斯托斯G.
      • Botstein D.
      • 棕色p.o.
      酵母细胞对环境变化的响应中的基因组表达程序。
      )。在这种情况下,中心集线器集成了各种压力源提供的刺激并坐标坐标。通过热量和渗透压激活的PTM的检测表明,在观察到的应激诱导的PTM生物发生中可能存在类似的组织 S. Cerevisiae..
      图缩略图FX4.
      方案1。裂变和萌芽酵母中应激基因的调节。在前者中,不同的应力共享环境应激反应基因(CESR)的常见核心,而胁迫特异性的环境反应基因(SESR)在后者占主导地位(
      • 喘息A.P.
      • 斯派曼P.T.
      • kao c.m.
      • Carmel-Harel O.
      • eisen m.b.
      • 斯托斯G.
      • Botstein D.
      • 棕色p.o.
      酵母细胞对环境变化的响应中的基因组表达程序。
      ,
      • 陈德。
      • Toone w.m.
      • Mata J.
      • Lyne R.
      • 烧伤
      • Kivinen K.
      • Brazma A.
      • 琼斯N.
      • BÄHLERJ.
      裂变酵母对环境压力的全局转录反应。
      )。
      为了测试这种可能性,我们设计了一种使用基因缺失菌株来追溯推定调节途径的策略。该策略需要对网络的组成和架构进行有效假设的先决条件,以指导选择要消除的基因。例如, 方案2.A 描绘了涉及典型细胞反应的基因的组织,对热休克和Osmostress S. Cerevisiae.,从丰富的可用信息中推断出来(
      • vanacloig-pedros E.
      • Bets-Plasencia C.
      • Pascual-ahuir A.
      • Proft M.
      盐胁迫适应初始阶段的协调基因调节。
      ,
      • 锡达赫
      • POSAS F.
      对高血白胁迫的反应。
      ,
      • Winkler A.
      • arkind c.
      • Mattison C.P.
      • 伯克尔州A.
      • Knoche K.
      • OTA I.
      热应激激活酵母高渗透热甘油丝酯激活蛋白激酶途径,蛋白酪氨酸磷酸酶在热应激下是必需的。
      ,
      • Fassler J.s.
      • 西A.H.
      酿酒酵母SLN1途径的遗传与生化分析。
      ,
      • 你是
      • Ingram P.
      • 雅各布森M.D.
      • 厨师E.
      • McDonagh A.
      • Thorne T.
      • Lenardon M.D.
      • moura a.p.d.
      • Romano M.C.
      • Thiel M.
      • stumpf m.
      • gow n.a.
      • Haynes K.
      • Grebogi C.
      • Stark J.
      • 布朗A.J.
      真菌渗透胁迫适应长期记忆的系统生物学分析。
      ,
      • Fassler J.s.
      • 西A.H.
      神经糖胺磷酸酯蛋白质在真菌双组分信号转导途径中。
      ,
      • Sharifian H.
      • Lampert F.
      • Stojanovski K.
      • 碑。
      • 迷山。
      • 邮政厂R.
      • Lee S.S.
      • Koeppl H.
      • POSAS F.
      • 佩塞特S.
      • 彼得M.
      并行反馈回路控制猪MAPK信号传导级联的基础活动。
      )。相比之下, 方案2.B 通过使用Cytoscape服务器来检查遗传和蛋白质 - 蛋白质相互作用的数据库以及转录和转录后调节网络(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      ,
      • Cline M.S.
      • Smoot M.
      • Cerami E.
      • Kuchinsky A.
      • Landys N.
      • 工人C.
      • 圣诞r.
      • Avila-Campilo I.
      • 克里塞米
      • B.
      • 汉斯普尔K.
      • Isserlin R.
      • Kelley R.
      • Killcoyne S.
      • Litia S.
      • Maere S.
      • 莫里斯j.
      • ono K.
      • 帕夫洛维奇V.
      • pico a.r.
      • vailaya A.
      • 王p.-l.
      • 阿德勒A.
      • Conklin B.R.
      • 引擎盖L.
      • Kuiper M.
      • 砂光机C.
      • Schmulevich I.
      • Schwikowski B.
      • 华纳G.J.
      • IDEKER T.
      • 糟糕的G.D.
      使用Cytoscape整合生物网络和基因表达数据。
      ,
      • smoot m..
      • ono K.
      • Ruscheinski J.
      • 王p.-l.
      • IDEKER T.
      Cytoscape 2.8:数据集成和网络可视化的新功能。
      )。广泛应激响应互乱的特定子部分描绘了一个推定的网络连接所建立的应力 - 反应途径的必要组分,例如猪和各种热休克基因,对负责形成靶PTM的生物发生酶,其列入modomics数据库(

      .http://modomics.genesilico.pl/,

      )。值得注意的是,虽然组织了既定的反应基因(方案2.A)完全符合不同刺激的平行,主要独立途径的普遍视图,下游区域覆盖PTM表达的推定调节(方案2.B2C)假设一个更复杂的架构,其特征在于多次交叉。杂物图清楚地表明基因如 h1FUS3 可以提供热休克和Osmostress信号通道之间的高级集成,而 SSA1, SSB1, SSB2, SSE1, 和 HSP82 可以提供额外的低级集成和PTM生产的微调。众所周知的蛋白质的蛋白质基因码,已知预防聚集,促进蛋白质折叠到其天然状态,并溶解和重叠聚集蛋白(
      • Borkovich K.A.
      • 撒尿f.w.
      • Finkelstein D.B.
      • 南部J.
      • Lindquist S.
      HSP82是在较高温度下细胞生长的浓度下需要的必需蛋白质。
      ,
      • Mayer M.P.
      • Bukau B.
      HSP70伴侣:细胞功能和分子机制。
      )。通常,这些热休克伴侣与涉及信号转导,细胞周期调节,细胞分化和细胞死亡的煤层酮密切合作。在应力下,真核系统严重依赖于HSP70伴侣,例如HSP82,以稳定死亡诱导突变,例如由癌症繁殖的突变(
      • Borkovich K.A.
      • 撒尿f.w.
      • Finkelstein D.B.
      • 南部J.
      • Lindquist S.
      HSP82是在较高温度下细胞生长的浓度下需要的必需蛋白质。
      ,
      • Mayer M.P.
      • Bukau B.
      HSP70伴侣:细胞功能和分子机制。
      )。
      图缩略图FX5.
      计划2。A,建立了响应高血压应激和热休克的基因之间的关系。 B,推定的副间网络连接与PTM生物酶的建立应力 - 反应基因。 C,已知的生物发生酶(红色盒子),用于感兴趣的选择PTM(蓝色)。箭头表示经过验证的功能关系。垂直线表示可能的功能链接。水平线表示可能的共表达。浅蓝色箭头和盒子识别 h1SSB1RIT1 通过基因缺失证实的途径。
      基于该地图,我们已经开始系统调查所选择的基因缺失菌株,以证实负责PTM调节的推定信号传导途径。大多数兴趣的PTM是在热休克或渗透塞中引起的11种,发现是 hog1 - 依赖(表二)。从中获得的结果 ssb1δ突变体表明,在强调状态下发现了19个PTM ssb1 - 表明该途径可以确实是作用为负责对PTM生物发生中涉及的多种酶促方法的下游开始的集成枢纽。大多数这些PTM由位于这些建立的应力 - 响应途径下游的基因控制的事实似乎排除了它们可能参与的感测机制,其通常位于上游。另外,也发现了WT中出现的两种PTM,但不是在任何特定的应力状态下,也是如此 ssb1 - 依赖(表二)。此外,即使在没有的情况下,也发现总共八种PTMS表达 SSB1 表明这一点 SSB1 不能成为唯一负责信号传导PTM生物生物的枢纽。
      回到所提出的地图的下一步包括分析菌株,其中缺失特异性生物酶。案子 RIT1 gene (方案2.C),似乎直接连接到 SSB1 (方案2.B),可以在这里提供举例说明可能的结果。已知RIT1酶通过将2'-O-核糖基磷酸酯基团加入腺嘌呤来催化AR(P)的形成(

      .http://modomics.genesilico.pl/,

      )。典型的衬底由引发剂Trmet(I)的腺嘌呤64表示,该腺嘌呤64防止其在酵母中蛋白质合成的伸长步骤期间使用(
      • Aströms.u.
      • ByströmA.S.
      RIT1,一种介导引发剂和细长TRNA辨别的TRNA骨干修饰酶。
      ,
      • Aströms.u.
      • Nordlund M.E.
      • erickson f.l.
      • 汉根尤。
      • ByströmA.S.
      编码引发剂TRNA特异性修饰酶的零型基因的无效等位基因之间的遗传相互作用及编码酿酒酵母中的翻译因子的基因。
      )。我们的数据表明,在热休克期间,该PTM在WT应变中唯一地表达,并且都是 hog1- 和 ssb1 - 依赖。当。。。的时候 rit1检查δ突变体(参见例如从中获得的热图 rit1δ在正常生长条件下, Fig. 1C),没有压力可以检测到AR(p),从而证实 RIT1 对该PTM的生产是必不可少的。此外,在研究中突变体提供的上下文中,这种结果证实了推定 h1SSB1RIT1 途径作为AR(P)的信号控制(标记为浅蓝色) 方案2.B2C)。令人惊讶的是,仔细检查 rit1Δ的全球性型材揭示了既有九种PTM hog1-ssb1-依赖(表二),它可能将它们放在同样之下 h1SSB1RIT1 监管途径。另外,另外三个没有 hog1- 或者 ssb1 - 发现了 rit1 - 依赖。这些观察结果表明 RIT1 本身可以作为控制网络中的额外集线器。大多数的事实 rit1 - 依赖性PTM不涉及腺嘌呤修饰规则,AR(P)本身可能用作其直接生物合成前体的可能性。替代假设可能是激活的 RIT1 可能导致尚未鉴定的其他生物酶的共表达。在这个方向上,必须注意,12个应激诱导的PTM是 rit1 - 依赖性,Ar(p)是唯一一种具有已知生物酶的一种。考虑到酵母基因组中没有分配功能的大量基因,功能连杆 RIT1 活化可以为进一步研究提供旨在鉴定缺失的生物酶的进一步研究的基础。

      结论

      监测eptransfriptomic概况 S. Cerevisiae. 作为不同实验变量的功能,明确表明PTM生物发生受环境条件的深刻影响。通过增加温度或盐浓度的增加,易于激活许多新PTM的产生提供了非常强的证据,以便在应力反应中的广泛含义。该发现与已知的所选的TRNA修改的作用一致,该作用已知参与由氧化应激触发的平移重新编码(
      • chan c.t.y.
      • Dyavaiah M.
      • 德洛姆
      • Taghizadeh K.
      • Dedon P.C.
      • Begley T.J.
      定量系统方法揭示了在细胞应力期间TRNA修饰的动态控制。
      ,
      • chan c.t.y.
      • pang y.l.j.
      • 邓维。
      • babu i.r.
      • Dyavaiah M.
      • Begley T.J.
      • Dedon P.C.
      TRNA修饰的重新编程控制通过密码子偏置蛋白翻译的氧化应激响应。
      )。然而,我们研究中观察到的大部分激活的修改都不知道涉及这些类型的机制。 PTM型材的直接比较已经清楚地揭示了胁迫特异性修饰,以及非特异性的,这可能是更通用的细胞反应的一部分。这些观察结果支持存在涉及PTM活动的替代机制,这可能包括不同类别的RNA的广泛参与。
      通过研究建立应力响应信令和PTM激活之间的关系,我们设计了一种涉及评估基因缺失对细胞中所有PTMS表达的同时效应。这种系统生物学方法受到了可用的基因组和功能数据的丰富的启发 S. Cerevisiae.。在可以描述为互蛋白酶的互动术语中,系统地消除了与已知的响应基因连接引用的生物发生酶的基因,以回到从可用信息推断的推定的监管网络。初步结果使我们能够清楚地区分PTM,这些PTM落在猪控制下方的猪群中。 HOG途径由级联的地图激酶组成,这是对对OSMOSTRESS的响应的级联,但也与平行热冲击控制有脆弱的通信(
      • vanacloig-pedros E.
      • Bets-Plasencia C.
      • Pascual-ahuir A.
      • Proft M.
      盐胁迫适应初始阶段的协调基因调节。
      ,
      • 锡达赫
      • POSAS F.
      对高血白胁迫的反应。
      ,
      • Winkler A.
      • arkind c.
      • Mattison C.P.
      • 伯克尔州A.
      • Knoche K.
      • OTA I.
      热应激激活酵母高渗透热甘油丝酯激活蛋白激酶途径,蛋白酪氨酸磷酸酶在热应激下是必需的。
      ,
      • Fassler J.s.
      • 西A.H.
      酿酒酵母SLN1途径的遗传与生化分析。
      ,
      • 你是
      • Ingram P.
      • 雅各布森M.D.
      • 厨师E.
      • McDonagh A.
      • Thorne T.
      • Lenardon M.D.
      • moura a.p.d.
      • Romano M.C.
      • Thiel M.
      • stumpf m.
      • gow n.a.
      • Haynes K.
      • Grebogi C.
      • Stark J.
      • 布朗A.J.
      真菌渗透胁迫适应长期记忆的系统生物学分析。
      ,
      • Fassler J.s.
      • 西A.H.
      神经糖胺磷酸酯蛋白质在真菌双组分信号转导途径中。
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      在建立应力和选定的PTMS之间的直接联系后,下一个挑战将是鉴定这种PTMS在细胞响应中起作用的实际角色。这种重要的任务受到其分发的局部知识,他们在tRNA和rRNA外的局部知识,以及对公众提供的广泛基因组/转录组数据的注释没有注释。对于实现这一目标,我们目前正在开发能够确定含有特异性PTM的RNA类别的技术,母体物种的身份以及修饰的序列位置。该信息将有助于询问可用的转录组数据,这将通过建议与父RNA相关的已知功能的可能的相关性来导致可测试的假设。该信息还将指导基于敏感核苷酸的突变的策略实施,或者涉及含有改性的RNA的沉默,旨在测试它们对表型代谢和表观遗传状态的影响。结果将提供有价值的见解,对PTMS在压力反应中的功能,更广泛地,将有望推动重新评估其整体生物意义。

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