上皮对间充质转换(EMT)的蛋白质组学分析显示乳腺癌细胞中蜗牛和HDAC1蛋白之间的串扰*

  • Camila de Souza Palma
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    RibeirãoPretoMedical School,RibeirãoPreto,SP /巴西,RibeirãoPrave医学院,RibeirãoPreto医学院;

    基于细胞的治疗中心,Ribeirao Preto血液中心,RibeirãoPreto医学院,圣保罗大学,RibeirãoPreto,SP /巴西;和
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  • Mariana Lopes Grassi.
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  • 卡罗莱纳·哈希关系托马斯
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  • Germano Aguiar Ferreira
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  • Daniele Albuquerque
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  • Mariana Tomazini Pinto.
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  • Fernanda Ursoli Ferreira Melo
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  • Simone Kashima
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  • Dimas Tadeu Covas
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  • 沙龙J. Pitteri
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    加利福尼亚州斯坦福大学医学院的斯坦福金加金丝雀中心,加利福尼亚州斯坦福大学94305-5101
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  • VITOR M.FAÇA.
    一致
    应解决对应的通信:部门。作者:王莹,郧阳师范高等专科学校学报JOURNAL Bandeirantes,3900-Monte Alegre,Cep 14049-900-RibeirãoPreto-SP,巴西。电话:55-16-33153210;传真:55-16-991289943;
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    RibeirãoPretoMedical School,RibeirãoPreto,SP /巴西,RibeirãoPrave医学院,RibeirãoPreto医学院;

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  • 作者脚注
    *这项工作是由Fapesp Young Scients Grant 2011 / 09740-1,CNPQ,CTC-CTC-Cepid中心,FAPESP Grant 2013/08135-2和Cisbi-Nap的支持。
    本文包含补充图。 S1至S4和表S1至S2。
    1所用的缩写是:Emtepithelial至间充质转换卤代镁羟基苯胺羟肟酸酐脱乙酰酶。
    C接收者Fapesp团契12 / 09682-4和CNPQ奖学金154138/2014-2。
    D FAPESP团契收件人13 / 08755-0。
    FAPESP奖学金收件人13/07675-3。
    CNPQ奖学金补助金的收件人授予150126/2014-0。
    FAPESP团契12 / 02518-4的收件人。
    H收件人的FAPESP奖学金11 / 21740-7。
    CNPQ奖学金授予的j接收者授予308561/2014-7。
      上皮到间充质转换(EMT)
      使用的缩写是:
      emt.
      下皮到间充质转换
      萨哈
      亚eroylanilide hydroxamic acid
      HDAC.
      组蛋白脱乙酰酶。
      0/G1阶段。此外,观察到HDAC1的下调,支持表观遗传过程在蜗牛诱导的EMT中的累积。当HDAC1活性被禁止时,MCF7不仅显然发起了EMT,而且也是上调的蜗牛,表明这两种蛋白质之间的串扰。 HDAC1抑制和蜗牛过度表达激活AKT途径。这些分子机制似乎对EMT至关重要,因此对于癌症转移至关重要。然后,对这种表观遗传过程的具体控制可以代表转移性癌症的临床管理的有效方法。
      上皮到间充质转换(EMT) is a process by which epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype through complex cellular and microenvironmental changes, such as the decrease in epithelial markers, re-expression of mesenchymal molecules, cytoskeleton reorganization, and basement membrane degradation, resulting in loss of cell-cell contact and promotion of invasive and migratory capabilities to these cells (
      • 郑H.
      • 康Y.
      emt.主稳压器的多层控制。
      ,
      • Therery J.P.
      • Acloque H.
      • 黄兰。
      • Nieto M.A.
      显上皮 - 间充质转换在发育与疾病中。
      ,
      • Kalluri R.
      • Weinberg R.A.
      上皮 - 间充质转换的基础知识。
      )。在EMT期间,发生e-cadherin(CDH1)的下调(CDH1)的间充质分子的表达和过表达,包括平均和N-钙粘蛋白,使这些分子用作EMT的分子标记物(
      • 郑H.
      • 康Y.
      emt.主稳压器的多层控制。
      )。
      emt.在胚胎发生和组织修复期间自然发生,并且也涉及癌症进展和转移(
      • Therery J.P.
      • Acloque H.
      • 黄兰。
      • Nieto M.A.
      显上皮 - 间充质转换在发育与疾病中。
      ,
      • Blabletz T.
      区分或不用于转移的路线。
      )。通过癌细胞获得的细胞间粘附和侵袭性和迁移能力的丧失允许它们与原发性肿瘤分离并入侵相邻组织或进入循环,在遥远的器官中建立次级肿瘤。反向过程(间充质到上皮过渡)需要再次将迁移细胞转化为上皮表型(
      • Kalluri R.
      • Weinberg R.A.
      上皮 - 间充质转换的基础知识。
      ,
      • 拉穆尔S.
      • 徐J.
      • derynck r.
      上皮 - 间充质转变的分子机制。
      )。几种分子过程涉及EMT诱导和调节,包括互连和独立的途径和信号分子(
      • Therery J.P.
      • Acloque H.
      • 黄兰。
      • Nieto M.A.
      显上皮 - 间充质转换在发育与疾病中。
      ,
      • Kalluri R.
      • Weinberg R.A.
      上皮 - 间充质转换的基础知识。
      ,
      • 拉穆尔S.
      • 徐J.
      • derynck r.
      上皮 - 间充质转变的分子机制。
      ,
      • Therery J.P.
      • Slememan J.P.
      复杂网络协调上皮 - 间充质转换。
      )。结果,几种细胞外基质组分和生长因子,包括转化生长因子-β(TGF-β),表皮生长因子(EGF)和肝细胞生长因子(HGF),或细胞内信号,如NFκB和WNT信号传导,触发器EMT过程(
      • 郑H.
      • 康Y.
      emt.主稳压器的多层控制。
      )。过表达一些转录因子,如蜗牛(SNAI1),SLUG(SNAI2),ZEB1,ZEB2,TWED1,GSC,FOXC1和FOXC2也可以诱导EMT 体外 (
      • Therery J.P.
      • Acloque H.
      • 黄兰。
      • Nieto M.A.
      显上皮 - 间充质转换在发育与疾病中。
      ,
      • Kalluri R.
      • Weinberg R.A.
      上皮 - 间充质转换的基础知识。
      ,
      • 拉穆尔S.
      • 徐J.
      • derynck r.
      上皮 - 间充质转变的分子机制。
      )。
      蜗牛是蜗牛系列转录因子的成员,以及主EMT监管机构之一(
      • 郑H.
      • 康Y.
      emt.主稳压器的多层控制。
      )。蜗牛过度表达足以诱导导致EMT的分子事件 体外 (
      • 芬特G.
      • LeBéchecA.
      • Muller J.
      • Muller A.
      • Moes M.
      • Yatskou M.
      • Al Tanoury Z.
      • 诗歌O.
      • vallar L.
      • Friederich E.
      SNAI1触发上皮对间充质转换期间转录事件的时间分辨分析。
      ,
      • NA. ber H.P.
      • Derabsch Y.
      • snaar-jagalska b.e.
      • 十dijke p.
      • van laar t.
      TGF-β-诱导的EMT的关键调节剂,EMT的关键调节剂足以诱导单细胞侵袭。
      )在原发性肿瘤中并且足以促进肿瘤复发 体内 (
      • 穆迪S.E.
      • 佩雷斯D.
      • 平底锅T.C.
      • Sarkisian C.J.
      • Portocarrero C.P.
      • 严厉的C.J.
      • 不TORFAMESCO K.L.
      • 加卡迪夫R.D.
      • Chodosh L.A.
      转录压缩蜗牛促进乳腺肿瘤复发。
      )。事实上,蜗牛在各种类型的肿瘤中过表达,与侵袭性,转移,复发和预后不良(
      • 布兰科M.J.
      • 莫雷诺布耶G.
      • Sarrio D.
      • Locascio A.
      • Cano A.
      • 帕拉西奥J.
      • Nieto M.A.
      牛皮癌组织学级和淋巴结状态的蜗牛表达的相关性。
      ,
      • Peinado H.
      • olmeda d。
      • Cano A.
      蜗牛,Zeb和BHLH因子在肿瘤进展中:对上皮表型的联盟?
      )。这种效果部分是由于其直接抑制细胞粘附相关基因的转录(
      • Therery J.P.
      • Acloque H.
      • 黄兰。
      • Nieto M.A.
      显上皮 - 间充质转换在发育与疾病中。
      )。通过将E2-Box DNA序列(CAGGT(G / C)ACCTG)结合到其羧基末端锌指域,蜗牛因子可以压制上皮基因的表达,例如E-Cadherin(
      • 拉穆尔S.
      • 徐J.
      • derynck r.
      上皮 - 间充质转变的分子机制。
      ,
      • NA. ber H.P.
      • Derabsch Y.
      • snaar-jagalska b.e.
      • 十dijke p.
      • van laar t.
      TGF-β-诱导的EMT的关键调节剂,EMT的关键调节剂足以诱导单细胞侵袭。
      )。蜗牛也涉及癌细胞存活,细胞周期调节,凋亡疏血,细胞粘附,神经内分泌分化和化学抑制,并发现在肿瘤的侵袭性区域中过表达(
      • Cano A.
      • Pérez-moreno M.A.
      • Rodrigo I.
      • Locascio A.
      • 布兰科M.J.
      • del Barrio M.G.
      • Portillo F.
      • Nieto M.A.
      转录因子蜗牛通过抑制E-Cadherin表达来控制上皮 - 间充质转变。
      ,
      • Sugimachi K.
      • 田纳卡S.
      • Kameyama T.
      • Taguchi K.
      • Aishima S.
      • Shimada M.
      • Sugimachi K.
      • Tsuneyoshi M.
      转录阻遏蜗牛和人肝细胞癌的进展。
      ,
      • 弗朗西C.
      • Takkunen M.
      • 戴夫N.
      • Alameda F.
      • Gómezs。
      • Rodríguezr.
      • EscrivàM.
      • 蒙特塞拉特 - 送礼B.
      • 贝罗T.
      • Garrido M.
      • Bonilla F.
      • Virtanen I.
      • Garcíade Herreros A.
      蜗牛蛋白在肿瘤 - 基质界面中的表达。
      )。
      除了由蜗牛触发的信令途径的网络和诱导和调节EMT的其他刺激之外,还涉及表观遗传机制并影响该过程。表观遗传调节机制,如DNA甲基化,微大润荷和染色质修饰,算用于癌细胞EMT和可塑性的可逆性(
      • Kiesslich T.
      • Pichler M.
      • 奈伊特D.
      上皮间充质转型的表观遗传控制在人体癌症中。
      ,
      • TAM W.L.
      • Weinberg R.A.
      癌症上皮 - 间充质可塑性的表观遗传学。
      )。注意,染色质相关组蛋白的修饰,然后对染色质构型的控制在介导几个EMT转录调节剂的活动中起着基本作用,从而实现了EMT期间发生的基因表达的广泛变化(
      • TAM W.L.
      • Weinberg R.A.
      癌症上皮 - 间充质可塑性的表观遗传学。
      ,
      • wu c.y.
      • Tsai Y.P.
      • 吴M.Z.
      • 腾科学。
      • 吴k.j.
      上皮间充质转换过程中的表观遗传重编程和转录后调节。
      )。蜗牛在管理EMT的表观遗传机制中的作用是较差的(
      • 陈杰。
      • 徐H.
      • zou x.
      • 王J.
      • 朱y
      • 陈H.
      • 沉B.
      • 邓X.
      • 周A.
      • 下巴Y.E.
      • Rauscher 3rd。,F.J.
      • 彭C.
      • 侯Z.
      蜗牛招募Ring1b以在胰腺癌细胞中介导转录抑制和细胞迁移。
      )。
      为了提高对蛋白质水平的EMT的复杂分子机制的理解,我们在乳腺腺癌细胞系MCF7中对EMT诱导期间的癌诱导期间分析了蛋白质组学改变。我们发现在蜗牛诱导的EMT中涉及表观遗传过程,通过蜗牛和组蛋白脱乙酰化酶HDAC1之间的串扰突出显示,并激活AKT途径。表观遗传过程的具体控制可能为转移性癌症有效临床管理提供机会。

      实验步骤

       细胞培养

      从ATCC获取细胞系。 MCF7细胞(
      • Soule H.D.
      • Vazguez J.
      • 长A.
      • 艾伯特S.
      • Brennan M.
      来自乳腺癌的胸腔积液的人细胞系。
      )在Dulbecco的修改Eagle的媒介(DMEM,Life Technologies,Inc。)培养。补充了10%胎牛血清(FBS,Thermo Scientific,Marietta,OH),100个单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素(Life Technologies ,Inc。)。 MDA-MB-231细胞(
      • Cailleaul R.
      • 年轻的R.
      • olivém.
      • Reeves w.j.
      来自胸腔积液的乳腺肿瘤细胞系。
      )在Dulbecco的改性Eagle的培养基/营养混合物F-12(DMEM / F-12,Life Technologies,Inc。)培养,其补充有10%FBS,100个单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素。

       硅胶标签

      MDA-MB-231细胞在Silac DMEM / F-12(Silac)培养TM值 高级DMEM / F12-Flex,Life Technologies,Inc。含有重赖氨酸(13C6-l - 碘碱)(0.1mg / ml)并补充有10%透析的FBS,2米M L.-glutamine,4.5 mg / ml d-Glucose,0.01%(w / v)青霉素/链霉素。为了将同位素标记的氨基酸将,将细胞孵育超过四个通道。为了检查MDA-MB-231蛋白中赖氨酸的沉重同位素的正确同位素,我们使用多种反应监测(MRM)方法来量化融合率 13C6-l-LYSINE进入肌动蛋白-β(ACTB)蛋白。此分析呈现 补充图1.

       慢病毒生产

      质粒DNA矢量PLVX-IRES-ZSGEEN(CLONTECH)承载 蜗牛 将基因或空载体(2μg)与包装构建PDR 8.91(1.5μg)转染到80%汇合293英尺(1.5μg)中,并使用Lipofectamine®2000(根据制造商的指示,Life Technologies,Inc。)。转染后6小时,培养基被新鲜培养基取代,48小时后,收集培养上清液并用于转导靶细胞。

       慢病毒感染和EMT诱导

      对于蜗牛的异位表达,将MCF7细胞接种在1×105 在6孔板上的细胞。在6μg/ ml聚苯乙烯(Sigma-Aldrich)存在下,将含有病毒的含有病毒的1-2ml培养上清液。转导后6小时,含病毒培养基被补充有10%FBS的DMEM取代,并将板孵育过夜。进行两种转导循环。为了确定转导效率,通过FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,Heidelberg,Germany),通过FACS分析测量Zsgreen荧光。通过分析每个样品至少10,000个细胞来确定ZsGreen阳性细胞的百分比。在转化后,将细胞保持在培养物中5天以诱导EMT。

       伤口愈合

      将蜗牛和控制细胞过度表达蜗牛和控制细胞的MCF7细胞在6孔板中生长至100%汇合,并使用1ml移液管尖端制备瘙痒缠绕。用PBS洗涤细胞三次,并用完整的培养基进料。图片拍摄于0,24,48小时,以监测划痕伤口的恢复。

       亚细胞分级

      通过使用亚当描述的连续洗涤剂萃取方法获得核,细胞质和膜级分 等等。 (
      • 亚当丽
      • 杨W.
      • Di Vizio D.
      • Mukhopadhyay N.K.
      • 斯丁H.
      快速制备适用于蛋白质组学分析的核耗尽的洗涤剂抗性膜级分。
      )修改。 MCF7和MDA-MB-231(1×107)用PBS洗涤细胞两次并用100μl的低渗缓冲液M裂解(50μmm HEPES, pH 7.4, 10 mm NaCl, 5 mm MgCl2,0.1米m EDTA, 1 mm Na3vo.4, 1 mm NaF, and 1 mm Na4P2O7·10H2o)含有5%v / v蛋白酶抑制剂混合物(产品编号p8340; sigma-aldrich)。将样品涡旋20 s,通过25·仪表(20次),并均质化(D-130组织均化器,生物系统,SãoJosédos,Pr,巴西)进行1分钟。此时,来自MCF7细胞的等量蛋白质诱导在含有重赖氨酸的硅胶培养的EMT /非转导和MDA-MB-231细胞(13C6-l-LYSINE)混合。通过以500×离心获得核颗粒 g 在4°C下20分钟。上清液以16,000×离心 g 在4℃下15分钟,收集,并指定为细胞质级分。用缓冲液A处理颗粒(25米m MES, 150 mm NaCl,pH6.5)并与具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的2%Triton X-100(V / V)的等体积的缓冲液A合并。孵育60分钟后,将样品以16,000×离心 g 在4°C下20分钟。收集上清液并指定膜馏分。用含有8的裂解溶液进行核颗粒的蛋白质提取 m 尿素,2%CHAP和蛋白酶抑制剂混合物。在超声波浴(独特的,SãoPaulo,SP,巴西)中,进行三个超声循环5分钟,用冷却水。将样品以20,000×离心 g 在4℃下30分钟,收集上清液并储存在-80℃。进行蛋白质印迹分析以确定富集效率。完整的实验工作流程表明 补充图2.

       凝胶消化和LC-MS / MS分析

      将50μg细胞质和核级分和30μg膜馏分溶解在30μl的Laemmli样品缓冲液中(
      • raemmli u.k.
      在噬菌体T4头部组装过程中裂解结构蛋白。
      )含有二硫醇(1mg / mg的总蛋白),煮沸5分钟以减少二硫键,并用碘乙酰胺(5mg / mg的总蛋白)烷基化。然后使用10%SDS-PAGE(Bio-rad)分离样品。将对应于每个级分的凝胶泳道切成6个〜1cm,每次洗涤,并用胰蛋白酶消化,如别处所述(
      • ThoméC.H.
      • Dos Santos G.A.
      • Ferreira G.A.
      • Scheucher P.S.
      • Izumi C.
      • Leopoldino A.M.
      • Simão上午
      • Ciancaglini P.
      • de Oliveira K.T.
      • 中国。
      • 汉尚三
      • FalcãoR.P.
      • em.
      • Greene L.J.
      • FAÇAV.M.
      用于激活T细胞系族成员2(LAT2)的接头,用于AKT信号传导的脂质筏衔接蛋白,是烷基磷脂抗白血病活性的早期介质。
      )。用0.1%甲酸,50%乙腈依次萃取胰蛋白酶肽,然后通过速度乙腈(Thermo Scientific,Marietta,OH)干燥并干燥70%乙腈。根据制造商的说明,使用Ziptiz柱(Supelco,Sigma-Aldrich)溶解在10μl5%乙腈,0.1%的甲酸中并脱盐。将样品在0.1%甲酸中在52.5%乙腈/水中洗脱,再次干燥,重新悬浮在15μl5%乙腈,0.1%甲酸中,用于LC-MS分析。使用LC-MS / MS使用LTQ-orbitrap Elite质谱仪进行样品,耦合具有终极3000 rslcnano系统(热化学)。使用内部填充的75μm内径(新物镜)×25cm-long C18柱,在600nl / min,在600nl / min的内部填充色谱法进行色谱法,其中90分钟的线性梯度为5-40%乙腈在0.1%的甲酸中。选择FT-MS扫描中的10个最丰富的10或三次带电离子的MS / MS扫描被选择用于线性离子阱中的数据依赖性分析。用计算蛋白质组学分析系统(CPA)鉴定肽和蛋白质(CPA)(
      • Rauch A.
      • Bellew M.
      • ENG J.
      • Fitzgibbon M.
      • 霍尔茨曼T.
      • 侯赛西P.
      • IGRA M.
      • 麦克莱恩B.
      • 林C.W.
      • 遏制A.
      • 方罗。
      • Faca V.
      • Gafken P.
      • 张H.
      • Whiteaker J.
      • 惠特克J.
      • D.
      • 汉尚S.
      • Paulovich A.
      • McIntosh M.W.
      计算蛋白质组学分析系统(CPA):一种可扩展,开源分析系统,用于评估和出版蛋白质组学数据和高通量生物实验。
      ),使用x!tandem search引擎(2013.2.01发布)(
      • 麦克莱恩B.
      • ENG J.K.
      • Beavis R.C.
      • McIntosh M.
      使用Tandem Search引擎开发和评估数据库评分算法的一般框架。
      )和肽先知(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )和蛋白质先知(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      )数据和蛋白质分组统计验证的算法。对人类蛋白质组数据库进行搜查(Uniprot,2014年4月,68,561条参赛作品)搜索MS数据。搜索参数为胰蛋白酶肽的参数包括最多两个错过的切割,对片段离子的大众耐​​受性0.5 da,固定用氨基甲酰化(+57.02146),可变甲硫氨酸氧化(+15.99491)和可变赖氨酸改性(+6.020129)的半胱氨酸改性。沉重和轻质氧化铝标签。仅考虑蛋白质定量才考虑蛋白质定量高于0.90和δ质量小于20ppm的前体离子的肽。蛋白质列表用蛋白质先知截止值0.90产生,基于蛋白质先知估计表示〜1%的总体蛋白质假发现率。如前所述定量蛋白质,使用Q3算法(1.22A释放)来测量氧化硅胶峰强度(
      • Faca V.
      • Coram M.
      • Phanstiel D.
      • Glukhova V.
      • 张Q.
      • Fitzgibbon M.
      • McIntosh M.
      • 汉尚S.
      用LC-MS / Ms的丙烯酰胺标记血清蛋白的定量分析。
      ,
      • Faca v.m.
      • 歌K.S.
      • 王H.
      • 张Q.
      • Krasnoselsky A.L.
      • Newcomb L.F.
      • Plentz r.r.
      • 古堡S.
      • redston m.s.
      • Pitteri S.J.
      • Pereira-Faca S.R.
      • ireton r.c。
      • Katayama H.
      • Glukhova V.
      • Phanstiel D.
      • Brenner D.E.
      • 安德森M.A.
      • Misek D.
      • Scholler N.
      • 城市N.D.
      • Barnett M.J.
      • Edelstein C.
      • Goodman G.E.
      • Thornquist M.D.
      • McIntosh M.W.
      • Depinho R.A.
      • Bardeesy N.
      • 汉尚三
      对人类搜索与胰腺肿瘤发育相关的血浆蛋白质组变化的鼠标。
      )。质谱蛋白质组学数据通过骄傲的伙伴储存库(PROSE)沉积在Proteomexchange联盟上(
      • VizcaínoJ.A.
      • 德意曲e.w.
      • 王R.
      • CSordas A.
      • Reinger F.
      • ríosd.
      • 戴安斯J.A.
      • 太阳Z.
      • Farrah T.
      • Bandeira N.
      • binz p.a.
      • Xenarios I.
      • 艾森凯母线
      • Mayer G.
      • Gatto L.
      • 坎波奥A.
      • Chalkley R.J.
      • Kraus H.J.
      • Albar J.P.
      • 马丁内斯 - 巴尔多洛姆És。
      • APWEILER R.
      • OPENN G.S.
      • 玛特L.
      • 琼斯A.R.
      • Hermjakob H.
      Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
      )使用DataSet标识符PXD002449。

       Western Blotting.

      MCF7或MDA-MB-231细胞在冷PBS中洗涤并用8次裂解 m 尿素,0.1 m Tris缓冲液含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)。在超声波浴(独特的,SãoPaulo,SP,巴西)中,进行三个超声循环5分钟,用冷却水。裂解物以20,000×离心 g 在4℃下30分钟,并将上清液称为总细胞裂解物。通过Bradford测定(Bio-rad)测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜(GE Healthcare)中。在0.05%Tween / TBS中封闭膜用5%的非脂肪干乳封闭,并与特异性抗体孵育。兔抗β-肌动蛋白(目录号4970),兔抗GAPDH(目录号2118),兔抗HDAC1(目录号2062),兔子反船尾(目录号5607),兔子反粉2/3(目录号8685),兔抗磷酸 - Smad2(Ser-465/467)/ smad3(Ser-423/425)(目录号8828),兔子反蜗牛(目录号3879),兔子抗磷酸 - AKT(SER-473)(目录号4060),兔抗AKT(目录号9272),兔抗ZO-1(TJP1)(目录号8193),兔抗LGALS1(目录号12936),兔抗SOD2(目录号13194),兔抗β-小蛋白(目录号2128),兔抗整合蛋白β1(目录号9699),小鼠抗CDC2(目录号。 9116),兔抗林(目录号2796),兔抗乙酰基 - 组蛋白H2B(Lys20)(目录No.2571),并购买辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗山羊抗兔IgG和抗小鼠IgG从细胞信令(贝弗利,MA)。兔抗Caveolin-1(C3237)购自Sigma-Aldrich,山羊抗吞并An2(AF3928)购自R.&D系统。驴防山羊IgG-HRP(SC-2033)购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。使用ECL Western印迹检测试剂(GE Healthcare)检测蛋白质抗体复合物,使用CCD相机检测信号(图像量级LAS 4000 Mini,乌普萨拉,瑞典)。

       定量实时PCR

      根据制造商的说明,使用Trizol®试剂(Invitrogen)进行总MRNA提取,并使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies,Inc。)进行逆转转录反应。通过定量PCR使用基因表达分析 塔克曼® Geneexpression测定 (Invitrogen)。对以下基因进行ABI 7500序列检测(Life Technologies,Inc。)进行PCR扩增: 蜗牛,SLUG,TWICK1,ZEB1,TGFB1,FN1,VIM,ACTA2,COL1A1,FSP1,CDH2, 和 CDH1。 GAPDH用于标准化每个样品的mRNA量。 2-ΔΔct 选择方法以计算相对基因表达水平(
      • pfaffl m.w.
      实时RT-PCR中相对量化的新数学模型。
      )。

       HDAC.抑制

      将MCF7细胞与0.5-10μgsuberoylanilide羟肟酸(Saha,Vorinostat,Sigma-Aldrich)一起温育,每24小时补充药物和培养基。培养基中,DMSO的最终浓度不超过1:10,000。

       细胞周期和增殖率

      通过根据制造商的指示监测通过流式细胞仪(Pharmingen)通过流式细胞仪检测的溴酰基脲嘌呤(BRDU)掺入细胞增殖率。

      结果

       蜗牛在MCF7细胞EMT诱导的分子,形态学和功能评估

      为了确保通过与EMT相关的MCF7乳腺癌细胞的可检测变化来支持蛋白质组学分析,我们使用形态学,分子和功能工具进行了对诱导过程的详细评估。首先,定量RT-PCR在EMT中涉及的几种基因中表现出表达变化。 Fig. 1A 表明转换的 蜗牛 在MCF7细胞中导致超过2000倍的增加 蜗牛 内源性表达水平。恰如地,水平 FN1,COL1A1, 和 CDH2 表达还增加了几个数量级。增加表达水平 vim.FSP1也观察到与间充质细胞形态和运动相关的基因。其他三个转录因子(slug,twist1., 和 ZEB1),与EMT密切相关,也受到刺激 蜗牛 过度表达。更重要的是,TFGB1是EMT程序中最重要的激活因子,呈现出在过表达蜗牛的细胞的条件培养基上检测到的基因表达上调和TGFB1蛋白(补充图3)。相反,只有轻微减少表达 CDH1 被观测到。总的来说,通过定量RT-PCR观察到的分子变化支持通过过表达的新获得的间充质特征 蜗牛 in MCF7 cells.
      图缩略图GR1.
      图。1。emt.在MCF7细胞中通过蜗牛过度表达诱导。 A,蜗牛过度表达诱导其他EMT相关转录因子的表达水平增加(sl, TWIST1, 和 ZEB1), 也 TGFB1 生长因子和间充质相关基因(FN1,Vim,Acta2,Col1A1,FSP1, 和 CDH2),如通过定量实时PCR检测到5天的转导后检测到。 酒吧 表示平均值±S.D.通过单向性方差分析评估统计学意义。 **, p < 0.01. B蜗牛过度表达诱导MCF7细胞的形态变化。对比度相和荧光显微镜。 C,伤口愈合测定表明,与非转导细胞相比,蜗牛过度表达在MCF7细胞中也增加了细胞迁移。图像均为0,24和48小时,对比度相和荧光显微镜检查。 MCF7-CTRL.,非转导; MCF7-空,用空向量转导; MCF7-SNAIL.,用载体转移表达蜗牛。
      二,相对逆显微镜观察的形态变化显示细胞形状和细胞尺寸和细胞间接触损失的变化(Fig. 1B)在MCF7细胞中蜗牛过度表达。对于几个细胞,清楚地观察到梭形成纤维细胞状形状(Fig. 1B)。当通过荧光显微镜观察细胞和过表达的Zsgreen阳性细胞,所有这些差异都更加明显 蜗牛 清楚地分离,不含细胞 - 细胞接触和增强的迁移能力(Fig. 1B)。第三,还通过伤口愈合测定来评估诱导为EMT的细胞的迁移特征。 Fig. 1C 图示了蜗牛过表达MCF7单元迁移和占据划痕空间,而控制单元仅扩展了细胞边界。荧光显微镜也突出显示Zsgreen阳性(蜗牛过度抑制细胞)在测定中取出开放空间(Fig. 1C)。

       蜗牛MCF7细胞EMT诱导蛋白质组学分析

      因为在用蜗牛转导后诱导到EMT的MCF7细胞不能显着扩展,所以含有透析胎儿牛血清的常规氧化硅酸策略不适合定量分析。因此,在含有天然(“光”)赖氨酸的常规培养基中生长的EMT(以及相应对照)的混合细胞的策略,其中在重型氧化钪培养基中生长的参考细胞系(13C6 赖氨酸)被采用。作为定量蛋白质组学分析的参考细胞系,我们选择上皮乳腺癌细胞系MDA-MB-231,其代表一种晚期/转移性肿瘤阶段。使用亚细胞分馏的策略与完整的蛋白质分级组合,我们进行了两个蛋白质组学研究与MDA-MB-231重标记的细胞混合了相等的量(300μg)对照或EMT诱导的MCF7细胞。混合后,通过差动离心分馏细胞,得到富含细胞质,核或膜蛋白的亚细胞级分。通过蛋白质印迹确认亚细胞分馏的质量,使用针对每个亚细胞室的抗体(Fig. 2A)。通过SDS-PAGE进一步分馏每个亚细胞级分,将凝胶泳道切成六个带,产生总共36个级分。提出了我们的实验工作流程的示意性描述 补充图2。在 - 凝胶 胰蛋白酶消化,通过LC-MS / MS单独分析级分,收集约60,000ms / MS扫描,为4298个蛋白质(由独特的基因名称代表)提供了少于1%的假发现率(补充表1)。使用在每个亚细胞分数中鉴定的蛋白质组的基因本体分类(Fig. 2B),我们观察了不同的注释分布,表明分数之间的一些互补性。值得注意的是,来自线粒体的蛋白质在核级分中富集,而来自内质网,核膜和膜结合的囊泡的蛋白质富含膜馏分。其他亚细胞室注释,例如细胞骨架或染色体,分别富集预期的分数,细胞质和核。
      图缩略图GR2.
      图2。亚细胞分级富集细胞室并通过质谱法增加蛋白质鉴定。 A,具有特异性亚细胞室的抗体的亚细胞分级方法的蛋白质印迹验证:核,细胞质和膜。 B,基因本体论富含蛋白质的分类,富含每种亚细胞室。亚细胞室注释富含预期的级分,并且未发现代表特定细胞组分的蛋白质。
      我们的定量分析使用严格的标准来选择348差异表达的蛋白质(补充表2)。仅考虑用至少两种具有相关的定量信息的肽观察到的蛋白质,并且在至少一种亚甲基蛋白质中显示出大于2倍的变化。进行对照实验以支持我们定量方法的有效性,并呈现 补充图4。另外,为了优先考虑蛋白质以进行进一步验证,我们将蛋白质与在比较MDA-MB-231中同样差异表达的蛋白质鉴定为EMT的MCF7中差异表达的蛋白质 相对 控制MCF7(未引起EMT)。
      优先蛋白根据其表达模式聚集。如图所示 Fig. 3A,簇1和2代表分别在所有三个级分中下调或上调的蛋白质;簇3和4含有在核和细胞质分数中下调或上调的蛋白质;簇5和6分别代表核和膜级分的蛋白质或上调。相反,一些蛋白质在不同的亚甲甲醚(簇7和8)之间差异表达。值得注意的是,Itgb1(Inflyinβ1)在核和膜级分中上调,并在细胞质中下调。基于光谱计数的蛋白质丰度分布也与差异表达蛋白质有关。也如图所示 Fig. 3A,亚细胞分级显示出不同亚细胞室之间的蛋白质丰度的差异。
      图缩略图GR3.
      图3。蛋白质在蜗牛过表达MCF7细胞中差异表达。 A,从总共348个差异表达的蛋白质,65也在MCF7-蜗牛细胞和MDA-MB-231细胞中差异表达。这些蛋白质可能与侵袭性/迁移和转移表型有关。群集(左侧面板)在两个或更多个不同的亚甲泡沫中表示蜗牛上调或下调蛋白质(C1–C6)在不同的亚甲甲醚中差异表达(C7C8)。基于光谱计数估计不同亚甲蛋白之间的蛋白质丰度分布。从人蛋白阿特拉斯数据库中获得的乳腺癌和正常组织的免疫组织化学数据(右侧面板)被用作我们研究中鉴定的蛋白质表达调节的相关性的外部指标。 0-100%的规模是指免疫组织化学染色的乳腺癌样品的百分比,颜色梯度代表染色强度:高(深蓝), 中等的 (蓝色的), 低的 (浅蓝), 没有检测到 (白色的根据人类蛋白质阿特拉斯数据库,或不可用。 B,蛋白质的蛋白质印迹验证(总细胞提取物)在蜗牛过表达MCF7细胞中的亚甲蛋白中轻微改变。 C,在蜗牛过表达MCF7细胞中亚甲蛋白差异表达的蛋白质子集的蛋白质印迹验证。每个凝胶通道加载基于Bradford的定量测定的5μg总蛋白质。 MCF7-CTRL.,非转导; MCF7-空,用空向量转导; MCF7-SNAIL.,用表达蜗牛的载体转导; ns.,nucleus mcf7-snail; 纳米,核MDA-MB-231; CS,细胞质mcf7-snail; 厘米,细胞质MDA-MB-231; 小姐,膜MCF7-蜗牛; 毫米,膜MDA-MB-231; ADP.,脂肪细胞; gr,腺细胞; 迈诺,肌上皮细胞; 你好, 高的; , 中等的; lo, 低的; , 没有检测到; N / A., 无法使用。

       使用基于抗体的测定验证蛋白质组学发现

      蛋白质地图集的最新进展(
      • UhlénM.
      • björlinge.
      • agaton c.
      • Szigyarto C.A.
      • amini b.
      • 安德森E.
      • 安德森A.C.
      • Angelidou P.
      • Asplund A.
      • Asplund C.
      • 贝格尔顿L.
      • BergströmK.
      • 布鲁默H.
      • Cerjan D.
      • Ekströmm。
      • 艾菲德A.
      • Eriksson C.
      • Fagerberg L.
      • Falk R.
      • 秋天J.
      • Forsberg M.
      • björklundm.g.
      • Gumbel K.
      • 哈里米A.
      • 哈林I.
      • 哈斯滕C.
      • Hansson M.
      • Hedhammar M.
      • 赫拉克勒斯G.
      • Kampf C.
      • Larsson K.
      • Lindskog M.
      • Lodewyckx W.
      • 隆德J.
      • Lundeberg J.
      • Magnusson K.
      • MALM E.
      • Nilsson P.
      • 迷人J.
      • oksvold p.
      • 奥尔森一世。
      • Oster E.
      • ottsson J.
      • Paavilainen L.
      • 佩尔森A.
      • 里米尼R.
      • 罗伯格J.
      • Runeson M.
      • Sivertsson A.
      • sköllermoa。
      • 斯丁J.
      • Stenvall M.
      • Stysky F.
      • Strömbergs.
      • Sundberg M.
      • Tegel H.
      • Tourle S.
      • Wahlund E.
      • WaldénA。
      • 万杰。
      • wernérush.
      • 韦斯特伯格J.
      • Wester K.
      • WRETHAGEN U.
      • Xu L.L.
      • 回暖
      • Ponténf。
      基于抗体蛋白质组学的正常和癌组织的人蛋白质图集。
      )提供了从蛋白质组学数据中选择的差异表达的蛋白质的外部评价(使用正交方法)的资源已显示在正常的乳腺和/或乳腺癌组织中表达。如观察到 Fig. 3A,由蜗牛(例如HDAC1)下调的几种蛋白质在正常乳腺组织中高度表达。这些蛋白质可能代表转移抑制剂。然而,乳腺癌组织中具有强烈免疫染色的蛋白质在蜗牛过度表达期间在上调或下调的蛋白质中不规则地分布。在我们选择验证的蛋白质中,并且可能与EMT和转移相关,蛋白质地图集信息被认为是高度相关的,因为蛋白质的上调和下调可能代表癌症进展的重要过程。
      除了外部蛋白质阿特拉斯数据外,还对差异表达蛋白质的子集进行蛋白质印迹,其可商购获得高质量的抗体。在总细胞提取物中测量隔室中差异表达的蛋白质的水平。如图所示 Fig. 3B,Western印迹结果与定量蛋白质组学结果有助于一致(Fig 3A)。此外,我们选择了富集亚甲蛋白酶的蛋白质印迹验证的蛋白质子集(Fig. 3C)。 ITGB1,CDK1(基蛋白依赖性激酶1),SOD2(超氧化物歧化酶线粒体)和HDAC1(组蛋白脱乙酰酶1)显示抗体染色与调节的抗体染色,以及基于所示光谱计数的估计蛋白质量 Fig. 3A.

       蛋白质网络

      使用字符串(
      • Szklarczyk D.
      • Franceschini A.
      • 蜡厂
      • Forslund K.
      • Heller D.
      • Huerta-Cepas J.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • Santos A.
      • Tsafou K.P.
      • Kuhn M.
      • Bork P.
      • Jensen L.J.
      • von mering c.
      字符串v10:蛋白质 - 蛋白质相互作用网络,整合在生命之树上。
      ),我们进行了蛋白质网络分析,以鉴定蜗牛EMT差异表达的蛋白质中的主要相互作用和组合细胞过程。三种不同的主要细胞过程显着富集(p value <10−5)如下:1)能量代谢(氧化磷酸化); 2)细胞周期; 3)染色质结合和染色质重塑(未示出的网络)。在诸如EMT的事件期间,第一细胞过程很好地描述,因为糖酵解途径的缺乏和氧化应激在电子转移链/氧化磷酸化途径中对ATP生产和氧反应性物质的解毒(
      • 王Z.
      • 李Y.
      • Sarkar F.H.
      上皮 - 间充质转变中的反应性氧物种的信号机理使肿瘤进展中的癌症干细胞复杂化。
      )。在EMT期间,细胞循环控制以及染色质重塑尤其相关,选择两个过程中涉及的蛋白质并用于产生简化网络(Fig. 4A)。网络指示两个主要集线器,CDK1和HDAC1。 CDK1在蛋白质组学数据发现的细胞质分数中下调,并通过Western Blotting确认(Fig. 3C)。核级分也观察到较低水平的CDK1,尽管蛋白质印迹不支持在蛋白质组学数据中检测到其核上调。 HDAC1,也主要检测在核级分中,在细胞质和核级分中被下调。如这些蛋白质网络的提出,我们测试了使用流式细胞术的蜗牛过度表达是否对细胞循环具有可测量的影响。 Fig. 4B 显示G中的显着细胞0 + G1 阶段,确认对细胞周期的蜗牛控制。
      图缩略图GR4.
      图4。在蜗牛过表达MCF7细胞中差异表达蛋白质的网络分析。 A,String-DB分析表明差异表达的蛋白质涉及细胞周期和染色质重塑的过程(p < 10−5)。网络指示两个主要集线器,CDK1和HDAC1。 B,通过MCF7细胞的APC-BRDU / 7-AAD(7-氨基 - 辐射霉素D)分析细胞周期。蜗牛诱导g增加0+ G.1 人口。 MCF7-CTRL.,非转导; MCF7-空,用空向量转导; MCF7-SNAIL.,用载体转移表达蜗牛。

       HDAC.的抑制诱导蜗牛上调

      为了确定HDAC1对常规MCF7细胞具有可检测的影响,我们使用特定的化学抑制剂莎拉抑制组蛋白脱乙酰化活性。 Fig. 5A 显示与蜗牛过表达MCF7细胞中观察到的变化相当的细胞形态的变化。在HDAC抑制后,还观察到细胞增殖的一些降低,尽管没有有伤口愈合测定中的细胞迁移增加的证据(数据未显示)。为了测试这些变化是否对蜗牛调节有任何影响,我们通过萨哈进行了滴定曲线,并通过Western印迹测量蜗牛水平。如图所示 Fig 5B,蜗牛水平与Saha浓度成比例,表明HDAC1活性与蜗牛水平之间的反比相关性。有趣的是,除蜗牛过度表达外,萨哈的HDAC1的抑制还增加了ITGB1的丰度,特别是在膜馏分中(Fig 5C)。
      图缩略图GR5.
      图5。HDAC.抑制通过蜗牛上调诱导形态变化和蛋白质调节。 A,MCF7细胞用10μ处理m HDAC抑制剂SAHA 24小时显示形态变化与蜗牛过表达MCF7细胞中观察到的形态变化。 B,MCF7细胞用不同浓度的Saha处理(0.5-10μm)24小时。蜗牛上调与萨哈浓度成比例。通过较高剂量的SAHA抑制HDAC抑制对24小时治疗期间磷酸化AKT(SER-473)的水平产生了一些影响。 AKT活化在蜗牛过表达MCF7细胞中较强,而MDA-MB-231对AKT活化没有影响。 C,用10μmsaha处理24小时后MCF7亚甲蛋白蛋白质的ITGB1和蜗牛的Western印迹验证。每个凝胶通道加载基于Bradford的定量测定的5μg总蛋白质。 D,MCF7细胞用10μmsaha处理2和24小时。萨哈在治疗早期阶段(2小时)有更大的AKT活化效应。 MCF7-CTRL,未治疗; MCF7-SAHA,用HDAC抑制剂萨哈治疗; MCF7-Snail,转导与表达蜗牛的载体。

       AKT途径由蜗牛诱导的EMT激活

      如上所示,EMT的诱导通过蜗牛过度表达,并且在轻微程度上抑制了SAHA的HDAC1活性,促进了与EMT相关的变化。为了测试调节细胞周期和控制细胞生长的主要途径是否也受到影响,我们测试了AKT激活的程度。 Fig. 5B 表明HDAC1较高剂量的SAHA抑制对24小时的治疗期间磷酸化AKT(SER-473)的水平具有低效果。 Saha对治疗早期阶段的AKT激活表现出更大的影响(2小时, Fig. 5D)。蜗牛过表达MCF7细胞中的AKT活化较强,但MDA-MB-231没有显示AKT活化的指示。

      讨论

      emt.诱导复杂的细胞和微环境变化,即在癌症中,肿瘤细胞增强的侵入性和迁移能力。一些因素被认为是EMT的主监管机构,包括蜗牛(
      • 郑H.
      • 康Y.
      emt.主稳压器的多层控制。
      ,
      • 拉穆尔S.
      • 徐J.
      • derynck r.
      上皮 - 间充质转变的分子机制。
      ,
      • 芬特G.
      • LeBéchecA.
      • Muller J.
      • Muller A.
      • Moes M.
      • Yatskou M.
      • Al Tanoury Z.
      • 诗歌O.
      • vallar L.
      • Friederich E.
      SNAI1触发上皮对间充质转换期间转录事件的时间分辨分析。
      ,
      • NA. ber H.P.
      • Derabsch Y.
      • snaar-jagalska b.e.
      • 十dijke p.
      • van laar t.
      TGF-β-诱导的EMT的关键调节剂,EMT的关键调节剂足以诱导单细胞侵袭。
      ,
      • 穆迪S.E.
      • 佩雷斯D.
      • 平底锅T.C.
      • Sarkisian C.J.
      • Portocarrero C.P.
      • 严厉的C.J.
      • 不TORFAMESCO K.L.
      • 加卡迪夫R.D.
      • Chodosh L.A.
      转录压缩蜗牛促进乳腺肿瘤复发。
      )。这种转录因子的过度表达在几种肿瘤类型中发现,与肿瘤侵袭性相关(
      • 布兰科M.J.
      • 莫雷诺布耶G.
      • Sarrio D.
      • Locascio A.
      • Cano A.
      • 帕拉西奥J.
      • Nieto M.A.
      牛皮癌组织学级和淋巴结状态的蜗牛表达的相关性。
      ,
      • Peinado H.
      • olmeda d。
      • Cano A.
      蜗牛,Zeb和BHLH因子在肿瘤进展中:对上皮表型的联盟?
      ),促进肿瘤复发(
      • 穆迪S.E.
      • 佩雷斯D.
      • 平底锅T.C.
      • Sarkisian C.J.
      • Portocarrero C.P.
      • 严厉的C.J.
      • 不TORFAMESCO K.L.
      • 加卡迪夫R.D.
      • Chodosh L.A.
      转录压缩蜗牛促进乳腺肿瘤复发。
      )。在这里,我们寻求使用蛋白质组学来识别EMT的其他调节因子,依赖于乳腺腺癌细胞系MCF7中的蜗牛过度表达,因为蜗牛相关的EMT中的主要蛋白贡献者可能代表减少转移和癌症进展的目标。
      在用蜗牛进行MCF7细胞成功转导后,我们在蛋白质组学分析之前对EMT过程进行了详细表征。在过表达蜗牛的MCF7细胞中检测到的形态学和功能变化与间充质表型相合作。伤口愈合测定表明蜗牛过度抑制细胞的迁移能力增加,因为它们彼此分离并迅速占据划痕空间。
      转导MCF7细胞的最初非常低的水平显示出超过2000倍 蜗牛 基因表达。增加了间充质相关基因的表达 FN1,COL1A1,CDH2,VIM, 和 FSP1 还有转录因子 sl, TWIST1, 和 ZEB1 也被证明。这些基因被认为是EMT的分子签名的一部分,因此确认采集间充质表型(
      • Blick T.
      • Widodo E.
      • Hugo H.
      • Waltham M.
      • 莱堡米。
      • neve r.m.
      • 汤普森e.w.
      人乳腺癌细胞系中的上皮间充质转变性状。
      )。更重要的是,增加了表达 TGFB1 蜗牛过度表达的条件培养基中TGFB1蛋白的基因和检测。转录因子蜗牛和slug在乳腺癌中激活转化生长因子-β信号通路(
      • Dhasarathy A.
      • Phadke D.
      • MAV D.
      • 沙拉。
      • 韦德P.A.
      转录因子蜗牛和SLUG在乳腺癌中激活转化生长因子-β信号通路。
      ),而TGF-β细胞产生也刺激蜗牛,SLUG和ZEB1的表达增加(
      • Gupta P.
      • Srivastava S.K.
      HER2介导的TGFβ的Novo生产导致蜗牛驱动的上皮 - 间充质转换和乳腺癌转移。
      )。这种特殊的正反馈回路对于持续的EMT非常重要,但正如我们在此表明​​,额外的跨谈途径在EMT中也变得明显(
      • 拉穆尔S.
      • 徐J.
      • derynck r.
      上皮 - 间充质转变的分子机制。
      ,
      • Lindsey S.
      • Langhans S.A.
      上皮 - 间充质转换期间致癌信号通路串扰。
      )。
      为了揭示由蜗牛过度表达诱导的EMT期间的详细和定量蛋白质组改变,我们基于亚甲基富集和凝胶-LC-MS / MS的组合施加完整的蛋白质分级方法(
      • ThoméC.H.
      • Dos Santos G.A.
      • Ferreira G.A.
      • Scheucher P.S.
      • Izumi C.
      • Leopoldino A.M.
      • Simão上午
      • Ciancaglini P.
      • de Oliveira K.T.
      • 中国。
      • 汉尚三
      • FalcãoR.P.
      • em.
      • Greene L.J.
      • FAÇAV.M.
      用于激活T细胞系族成员2(LAT2)的接头,用于AKT信号传导的脂质筏衔接蛋白,是烷基磷脂抗白血病活性的早期介质。
      ,
      • 散渣米
      亚细胞结构水平的蛋白质组分析。
      )。基于标准氧化硅酸蛋白质组学分析策略的定量分析与蜗牛过度抑制细胞不相容,因为发生了细胞增殖的显着降低。为了允许详细且准确的定量分析,依赖于从重质赖氨酸标记的MDA-MB-231细胞系中依赖于用重赖氨酸的细胞系,在蛋白质分级之前添加到对照MCF7和蜗牛过表达MCF7细胞中。该方法是Super-Silac方法的适应(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • ostasiewicz p.
      • wisniewski J.R.
      用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
      ),其应用的理由是希望将侵略性和迁移的MDA-MB-213细胞进行比较,代表乳腺癌的先进阶段,具有MCF7细胞,代表肿瘤进展的早期阶段通过EMT。因此,与MCF7-SNAIN / MCF7-COOMES比较的具有相似调节的蛋白质和MDA-MB-231 / MCF7-对照初始优先考虑并可能与EMT诱导细胞的侵袭性,迁移和转移表型相关。
      蛋白质组学策略还允许在每种富集的亚颗粒中的蛋白质进行微分定量。几种实施例显示了单一级分中蛋白质的显着富集,支持亚细胞分馏的重要性,以清楚地证明蛋白质调节。就不同细胞室中治疗差异蛋白质丰度的潜在细胞过程而言,我们突出了核 - 细胞质,膜 - 细胞质转移或蛋白质转运的其他细胞事件。在文献中描述,蛋白质定位具有高度动态并确保适当的细胞生理学,因为蛋白质可以具有不同的功能和不同细胞位置的相互作用(
      • 王S.C.
      • 挂米。
      细胞质/核穿梭和肿瘤进展。
      )。在EMT期间,该过程也非常重要,并且蜗牛是这样的示例,因为通过信令途径启动的翻译后修改控制其本地化和降级,因此其活动(
      • 周B.P.
      • 邓杰。
      • 夏W.
      • 徐J.
      • 李开。
      • Gunduz M.
      • 挂米。
      GSK-3β介导的蜗牛对磷酸化控制上皮 - 间充质转换的双重调节。
      )。
      在我们的蛋白质组学数据中观察到的许多差异表达的蛋白质已经被描述为与EMT和肿瘤进展相关的。其中,通过蛋白质阿特拉斯数据库中的免疫组化,在乳腺癌和正常乳腺组织的临床样本中测量了几种蛋白质。备注,其中一些蛋白质在正常乳腺组织中非常丰富,例如MOTR3(MITRIN-3),CPSF7(切割和多腺苷酸特异性因子亚基7),DX39B(抗乳糖组RNA Helicate DDX39B)和HDAC1(组蛋白脱乙酰酶1) ,并且所有在EMT期间都在调节,也是MDA-MB-231的侵袭性表型。 MOTR3在转录中起作用,可以与其他核基质蛋白相互作用,并与mRNA结合(
      • Salton M.
      • 麋鹿r.
      • BORODINA T.
      • 达维多夫A.
      • Yaspo M.L.
      • 洛珀林E.
      • Shiloh Y.
      matrin 3结合并稳定mRNA。
      )。 CPFS7是在预-mRNA 3'-处理中起关键作用的裂解因子IM复合物的组分,结合切割和多腺苷酸的RNA基材,是miR-26b的靶标,这是癌症行为的有效调节剂雌激素受体阳性癌症(
      • verghese e.t.
      • 德里·
      • 绿色c.a.
      • Holliday D.L.
      • lu x.
      • 纳什C.
      • Speirs V.
      • Thorne J.L.
      • Thygesen H.H.
      • 邹格曼A.
      • 船体M.A.
      • 哈比上午
      • 休斯T.A.
      miR-26b在来自ER阳性乳腺癌的癌相关成纤维细胞中下调,导致细胞迁移和侵袭。
      )。 DX39B(BAT1)是TREX综合体的一部分,涉及综合脾胃核导出,并与乳腺癌侵略性相关联(
      • 郭科
      • Hakimi M.A.
      • Baillat D.
      • 陈X.
      • 游行M.J.
      • Klein-Szanto A.J.
      • Cooch N.S.
      • Godwin A.K.
      • Shiekhattar R.
      将转录伸长率和信使RNA的出口连接到转移性乳腺癌。
      ,
      • Masuda S.
      • Das R.
      • 程H.
      • 伤害E.
      • 多尔南德
      • 芦苇r.
      在拼接期间将人Trex复合物募集到mRNA。
      )。 HDAC1广泛地与几种过程的表观遗传调节,特别是在癌症中(
      • Lakshmaiah K.C.
      • 雅各布L.A.
      • Aparna S.
      • Lokanatha D.
      • Saldanha S.C.
      癌症与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的表观遗传疗法。
      )。实际上,HDAC1最近被描述为转移阻遏物(
      • 锣C.
      • lv x.b.
      • 刘B.
      • 棕褐色
      • 聂岁
      • 苏F.
      • 刘Q.
      • 姚H.
      • 歌曲E.
      BRMS1L通过诱导FZD10的表观遗传沉默来抑制乳腺癌转移。
      )。总之,这些数据表明,重要的核酸过程正在调节蜗牛过度表达,并可作为EMT甚至肿瘤阻遏物。
      当我们展示 Fig. 4A,染色质结合/重塑和细胞周期控制是我们数据集中改变的主要蛋白质网络。通过HDAC1和CDK1之间的链接,在我们的数据中建议了这两个重要的蜂窝过程之间的相关性。有证据表明CDK1是负责一些HDAC1结合伴侣的磷酸化的激酶(
      • 郭H.
      • 弗里德曼A.D.
      通过细胞周期蛋白依赖性激酶的RUNX1的磷酸化降低了与HDAC1和HDAC3的直接相互作用。
      )但是更多信息在文献中稀缺。因此,我们在独立地评估了蜗牛对细胞周期和表观遗传控制的影响。
      蜗牛在一定程度上负责降低细胞增殖。我们观察到蜗牛过表达后细胞增殖能力降低,然后通过伤口愈合测定进一步验证。从Brdu Incorporation测定中获得另外的结果,展示了G的细胞骤停0/G1 阶段。已经证明,尽管蜗牛减少了肿瘤生长,但它也促进了侵袭性和对细胞死亡的抵抗力(
      • Barrallo-Gimeno A.
      • Nieto M.A.
      蜗牛基因作为细胞运动和生存的诱导剂:在发育和癌症中的影响。
      )。蜗牛从早期损害到晚期的过渡1 通过维持低水平的细胞周期蛋白D并且可以阻挡g1通过维持高水平P21来转换。通过激活PI3K / AKT途径,蜗牛还促进对细胞周期停滞的致命作用。对间充质表型的转化意味着细胞骨架的深度重组可能与高增殖状态不相容(
      • Vega S.
      • 莫拉莱斯A.V.
      • OcañaO.H.
      • 瓦尔德斯F.
      • Fabregat I.
      • Nieto M.A.
      蜗牛阻断细胞周期并赋予对细胞死亡的抵抗力。
      )。有趣的是,淋巴细胞迁移和肝癌细胞入侵仅发生在g1 phase (
      • Vega S.
      • 莫拉莱斯A.V.
      • OcañaO.H.
      • 瓦尔德斯F.
      • Fabregat I.
      • Nieto M.A.
      蜗牛阻断细胞周期并赋予对细胞死亡的抵抗力。
      )。因此,即使细胞分裂的增加对于肿瘤形成和进展至关重要,细胞增殖对于肿瘤恶性肿瘤不重要。
      在我们的数据中,我们观察到,MCF7细胞中的蜗牛过表达和HDAC抑制诱导AKT的磷酸化。用萨哈治疗也呈现了对蜗牛水平的剂量依赖性影响。除了促进对细胞死亡的抗性外,AKT活性还参与了其他几种细胞过程,例如氧化应激的调节(
      • Azad M.B.
      • 陈Y.
      • 吉布森S.B.
      反应性氧(ROS)对自噬调节:对癌症进展和治疗的影响。
      )。实际上,在我们的蛋白质组学分析中调节的主要细胞过程之一是氧化磷酸化(数据未示出),其也可以解释和/或增强蜗牛过表达MCF7细胞中的高水平AKT磷酸化,即使在培养5天后也可以在5天后解释和/或加强蜗牛过表达MCF7细胞中的高水平磷酸化。以相同的方式,莎哈处理细胞中的Akt激活可以与氧化应激有关。几份报告表明,HDAC抑制剂可以刺激反应性氧物种产生,这又可以通过抑制磷酸酶和三素同源物(PTEN)来激活AKT(
      • Azad M.B.
      • 陈Y.
      • 吉布森S.B.
      反应性氧(ROS)对自噬调节:对癌症进展和治疗的影响。
      )。
      蜗牛对EMT和癌症期间的表观遗传变化的影响尚不清楚。虽然蜗牛能够对其转录靶标产生长持久的影响,但证明它以瞬时方式与靶促进剂结合。这可能是由募集额外的辅助因子来引起从其结合位点释放蜗牛,或者可以通过染色质修饰自身释放(
      • javaid s.
      • 张继夫
      • 安德森E.
      • 黑J.C.
      • Wittner B.S.
      • Tajima K.
      • D.T.
      • smolen g.a.
      • Zubrowski M.
      • Desai R.
      • Maheswaran S.
      • ramaswamy s.
      • Whetstine J.R.
      • Haber D.A.
      动态染色质修饰在蜗牛-1的诱导表达后维持上皮间充质转变。
      )。证据表明,蜗牛与阻遏物配合物相互作用,可以导致二价组蛋白修饰,使受影响的基因易受再激活(
      • Kiesslich T.
      • Pichler M.
      • 奈伊特D.
      上皮间充质转型的表观遗传控制在人体癌症中。
      )。注意,蜗牛可以招募SIN3A-HDAC1-HDAC2复合物,以促进其镇压(
      • Peinado H.
      • Ballestar E.
      • Esteller M.
      • Cano A.
      蜗牛通过募集SIN3A /组蛋白脱乙酰化酶1(HDAC1)/ HDAC2复合物培养E-Cadherin镇压。
      )。结果表明,HDAC失活也可以通过蜗牛上调诱导EMT,促进其乙酰化,从而抑制其泛素(
      • 江省
      • 王H.S.
      • 张F.
      • 张库克斯。
      • 刘Z.C.
      • 方罗。
      • 王H.
      • Cai S.H.
      • 杜杰克
      通过蜗牛的上调,组蛋白脱乙酰化酶抑制剂诱导上皮 - 间充质转变促进癌症进展。
      )。除了通过转录后调节诱导蜗牛上调,HDAC1抑制还可以促进蜗牛转录表达和核易位(
      • 江省
      • 王H.S.
      • 张F.
      • 张库克斯。
      • 刘Z.C.
      • 方罗。
      • 王H.
      • Cai S.H.
      • 杜杰克
      通过蜗牛的上调,组蛋白脱乙酰化酶抑制剂诱导上皮 - 间充质转变促进癌症进展。
      )。在这里,我们展示了相反的过程。蜗牛过度表达在EMT诱导期间降低HDAC1。值得注意的是,不仅是HDAC1和蜗牛之间观察到的串扰,而且HDAC1和蜗牛也上调了重要的癌症进展效果,例如ITGB1(图。 3.C5C)。事实上,ITGB1活动和上调与癌症恶性和不同癌症类型的侵略性相关(
      • 张L.
      • 邹W.
      整合素β1的抑制减少了卵巢癌细胞的恶性肿瘤,并通过FAK / Stat1信号通路增强了抗癌治疗。
      ,
      • Kurozumi A.
      • 转到了。
      • Matsushita R.
      • Fukumoto I.
      • 加藤米
      • Nishikawa R.
      • Sakamoto S.
      • Enokida H.
      • NA. kagawa M.
      • ichikawa t.
      • Seki N.
      肿瘤抑制microRNA-223通过靶向前列腺癌中的ITGA3 / ITGB1信号传导来抑制癌细胞迁移和侵袭。
      )。尽管有关EMT规则的表观遗传机制的所有信息,但仍然是染色质调节剂和组蛋白标记如何调节该过程的缺点(
      • wu c.y.
      • Tsai Y.P.
      • 吴M.Z.
      • 腾科学。
      • 吴k.j.
      上皮间充质转换过程中的表观遗传重编程和转录后调节。
      )。
      总之,通过过表达MCF7乳腺癌细胞中蜗牛转录因子的EMT诱导的蛋白质组学研究表明氧化磷酸化,细胞周期控制和染色质修饰中的重要改变。这些研究结果在一起反映了EMT期间发生的复杂过程网络,加强了合作和共同调节过程的想法,如此在此证明蜗牛的逆调控之间的串扰 相对 HDAC1。详细了解这种过程可以帮助设计癌症转移抑制的新策略,可能增加患者生命跨度和生活质量。

      致谢

      我们感谢Robert A. Weinberg博士,Leonardo Rodrigues,以及Tathiane Maistro Malta,Whitehey生物医学研究所,剑桥,MA,提供用于蜗牛过度表达的慢病毒载体。

      补充材料

      参考

        • 郑H.
        • 康Y.
        emt.主稳压器的多层控制。
        oncogene。 2014; 33: 1755-1763
        • Therery J.P.
        • Acloque H.
        • 黄兰。
        • Nieto M.A.
        显上皮 - 间充质转换在发育与疾病中。
        细胞。 2009; 139: 871-890
        • Kalluri R.
        • Weinberg R.A.
        上皮 - 间充质转换的基础知识。
        J. Clin。投资。 2009; 119: 1420-1428
        • Blabletz T.
        区分或不用于转移的路线。
        NAT。癌症。 2012; 12: 425-436
        • 拉穆尔S.
        • 徐J.
        • derynck r.
        上皮 - 间充质转变的分子机制。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2014; 15: 178-196
        • Therery J.P.
        • Slememan J.P.
        复杂网络协调上皮 - 间充质转换。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2006; 7: 131-142
        • 芬特G.
        • LeBéchecA.
        • Muller J.
        • Muller A.
        • Moes M.
        • Yatskou M.
        • Al Tanoury Z.
        • 诗歌O.
        • vallar L.
        • Friederich E.
        SNAI1触发上皮对间充质转换期间转录事件的时间分辨分析。
        生物学习。 Biophys。 res。安排。 2009; 385: 485-491
        • NA. ber H.P.
        • Derabsch Y.
        • snaar-jagalska b.e.
        • 十dijke p.
        • van laar t.
        TGF-β-诱导的EMT的关键调节剂,EMT的关键调节剂足以诱导单细胞侵袭。
        生物学习。 Biophys。 res。安排。 2013; 435: 58-63
        • 穆迪S.E.
        • 佩雷斯D.
        • 平底锅T.C.
        • Sarkisian C.J.
        • Portocarrero C.P.
        • 严厉的C.J.
        • 不TORFAMESCO K.L.
        • 加卡迪夫R.D.
        • Chodosh L.A.
        转录压缩蜗牛促进乳腺肿瘤复发。
        癌细胞。 2005; 8: 197-209
        • 布兰科M.J.
        • 莫雷诺布耶G.
        • Sarrio D.
        • Locascio A.
        • Cano A.
        • 帕拉西奥J.
        • Nieto M.A.
        牛皮癌组织学级和淋巴结状态的蜗牛表达的相关性。
        oncogene。 2002; 21: 3241-3246
        • Peinado H.
        • olmeda d。
        • Cano A.
        蜗牛,Zeb和BHLH因子在肿瘤进展中:对上皮表型的联盟?
        NAT。癌症。 2007; 7: 415-428
        • Cano A.
        • Pérez-moreno M.A.
        • Rodrigo I.
        • Locascio A.
        • 布兰科M.J.
        • del Barrio M.G.
        • Portillo F.
        • Nieto M.A.
        转录因子蜗牛通过抑制E-Cadherin表达来控制上皮 - 间充质转变。
        NAT。细胞生物。 2000; 2: 76-83
        • Sugimachi K.
        • 田纳卡S.
        • Kameyama T.
        • Taguchi K.
        • Aishima S.
        • Shimada M.
        • Sugimachi K.
        • Tsuneyoshi M.
        转录阻遏蜗牛和人肝细胞癌的进展。
        临床癌症Res。 2003; 9: 2657-2664
        • 弗朗西C.
        • Takkunen M.
        • 戴夫N.
        • Alameda F.
        • Gómezs。
        • Rodríguezr.
        • EscrivàM.
        • 蒙特塞拉特 - 送礼B.
        • 贝罗T.
        • Garrido M.
        • Bonilla F.
        • Virtanen I.
        • Garcíade Herreros A.
        蜗牛蛋白在肿瘤 - 基质界面中的表达。
        oncogene。 2006; 25: 5134-5144
        • Kiesslich T.
        • Pichler M.
        • 奈伊特D.
        上皮间充质转型的表观遗传控制在人体癌症中。
        摩尔。临床。 oncol。 2013; 1: 3-11
        • TAM W.L.
        • Weinberg R.A.
        癌症上皮 - 间充质可塑性的表观遗传学。
        NAT。 Med。 2013; 19: 1438-1449
        • wu c.y.
        • Tsai Y.P.
        • 吴M.Z.
        • 腾科学。
        • 吴k.j.
        上皮间充质转换过程中的表观遗传重编程和转录后调节。
        趋势类型。 2012; 28: 454-463
        • 陈杰。
        • 徐H.
        • zou x.
        • 王J.
        • 朱y
        • 陈H.
        • 沉B.
        • 邓X.
        • 周A.
        • 下巴Y.E.
        • Rauscher 3rd。,F.J.
        • 彭C.
        • 侯Z.
        蜗牛招募Ring1b以在胰腺癌细胞中介导转录抑制和细胞迁移。
        癌症res。 2014; 74: 4353-4363
        • Soule H.D.
        • Vazguez J.
        • 长A.
        • 艾伯特S.
        • Brennan M.
        来自乳腺癌的胸腔积液的人细胞系。
        J. Natl。癌症inst。 1973; 51: 1409-1416
        • Cailleaul R.
        • 年轻的R.
        • olivém.
        • Reeves w.j.
        来自胸腔积液的乳腺肿瘤细胞系。
        J. Natl。癌症inst。 1974; 53: 661-674
        • 亚当丽
        • 杨W.
        • Di Vizio D.
        • Mukhopadhyay N.K.
        • 斯丁H.
        快速制备适用于蛋白质组学分析的核耗尽的洗涤剂抗性膜级分。
        BMC细胞BIOL。 2008; 9: 30
        • raemmli u.k.
        在噬菌体T4头部组装过程中裂解结构蛋白。
        自然。 1970; 227: 680-685
        • ThoméC.H.
        • Dos Santos G.A.
        • Ferreira G.A.
        • Scheucher P.S.
        • Izumi C.
        • Leopoldino A.M.
        • Simão上午
        • Ciancaglini P.
        • de Oliveira K.T.
        • 中国。
        • 汉尚三
        • FalcãoR.P.
        • em.
        • Greene L.J.
        • FAÇAV.M.
        用于激活T细胞系族成员2(LAT2)的接头,用于AKT信号传导的脂质筏衔接蛋白,是烷基磷脂抗白血病活性的早期介质。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11: 1898-1912
        • Rauch A.
        • Bellew M.
        • ENG J.
        • Fitzgibbon M.
        • 霍尔茨曼T.
        • 侯赛西P.
        • IGRA M.
        • 麦克莱恩B.
        • 林C.W.
        • 遏制A.
        • 方罗。
        • Faca V.
        • Gafken P.
        • 张H.
        • Whiteaker J.
        • 惠特克J.
        • D.
        • 汉尚S.
        • Paulovich A.
        • McIntosh M.W.
        计算蛋白质组学分析系统(CPA):一种可扩展,开源分析系统,用于评估和出版蛋白质组学数据和高通量生物实验。
        J.蛋白质组。 2006; 5: 112-121
        • 麦克莱恩B.
        • ENG J.K.
        • Beavis R.C.
        • McIntosh M.
        使用Tandem Search引擎开发和评估数据库评分算法的一般框架。
        生物信息学。 2006; 22: 2830-2832
        • nesvizhskii a.i.
        • 凯勒阿。
        • Kolker E.
        • Aeberberold R.
        用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
        肛门。化学。 2003; 75: 4646-4658
        • 凯勒阿。
        • nesvizhskii a.i.
        • Kolker E.
        • Aeberberold R.
        经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
        肛门。化学。 2002; 74: 5383-5392
        • Faca V.
        • Coram M.
        • Phanstiel D.
        • Glukhova V.
        • 张Q.
        • Fitzgibbon M.
        • McIntosh M.
        • 汉尚S.
        用LC-MS / Ms的丙烯酰胺标记血清蛋白的定量分析。
        J.蛋白质组。 2006; 5: 2009-2018
        • Faca v.m.
        • 歌K.S.
        • 王H.
        • 张Q.
        • Krasnoselsky A.L.
        • Newcomb L.F.
        • Plentz r.r.
        • 古堡S.
        • redston m.s.
        • Pitteri S.J.
        • Pereira-Faca S.R.
        • ireton r.c。
        • Katayama H.
        • Glukhova V.
        • Phanstiel D.
        • Brenner D.E.
        • 安德森M.A.
        • Misek D.
        • Scholler N.
        • 城市N.D.
        • Barnett M.J.
        • Edelstein C.
        • Goodman G.E.
        • Thornquist M.D.
        • McIntosh M.W.
        • Depinho R.A.
        • Bardeesy N.
        • 汉尚三
        对人类搜索与胰腺肿瘤发育相关的血浆蛋白质组变化的鼠标。
        Plos med。 2008; 5: e123
        • VizcaínoJ.A.
        • 德意曲e.w.
        • 王R.
        • CSordas A.
        • Reinger F.
        • ríosd.
        • 戴安斯J.A.
        • 太阳Z.
        • Farrah T.
        • Bandeira N.
        • binz p.a.
        • Xenarios I.
        • 艾森凯母线
        • Mayer G.
        • Gatto L.
        • 坎波奥A.
        • Chalkley R.J.
        • Kraus H.J.
        • Albar J.P.
        • 马丁内斯 - 巴尔多洛姆És。
        • APWEILER R.
        • OPENN G.S.
        • 玛特L.
        • 琼斯A.R.
        • Hermjakob H.
        Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
        NAT。 Biotechnol。 2014; 32: 223-226
        • pfaffl m.w.
        实时RT-PCR中相对量化的新数学模型。
        核酸RES。 2001; 29: e45
        • UhlénM.
        • björlinge.
        • agaton c.
        • Szigyarto C.A.
        • amini b.
        • 安德森E.
        • 安德森A.C.
        • Angelidou P.
        • Asplund A.
        • Asplund C.
        • 贝格尔顿L.
        • BergströmK.
        • 布鲁默H.
        • Cerjan D.
        • Ekströmm。
        • 艾菲德A.
        • Eriksson C.
        • Fagerberg L.
        • Falk R.
        • 秋天J.
        • Forsberg M.
        • björklundm.g.
        • Gumbel K.
        • 哈里米A.
        • 哈林I.
        • 哈斯滕C.
        • Hansson M.
        • Hedhammar M.
        • 赫拉克勒斯G.
        • Kampf C.
        • Larsson K.
        • Lindskog M.
        • Lodewyckx W.
        • 隆德J.
        • Lundeberg J.
        • Magnusson K.
        • MALM E.
        • Nilsson P.
        • 迷人J.
        • oksvold p.
        • 奥尔森一世。
        • Oster E.
        • ottsson J.
        • Paavilainen L.
        • 佩尔森A.
        • 里米尼R.
        • 罗伯格J.
        • Runeson M.
        • Sivertsson A.
        • sköllermoa。
        • 斯丁J.
        • Stenvall M.
        • Stysky F.
        • Strömbergs.
        • Sundberg M.
        • Tegel H.
        • Tourle S.
        • Wahlund E.
        • WaldénA。
        • 万杰。
        • wernérush.
        • 韦斯特伯格J.
        • Wester K.
        • WRETHAGEN U.
        • Xu L.L.
        • 回暖
        • Ponténf。
        基于抗体蛋白质组学的正常和癌组织的人蛋白质图集。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2005; 4: 1920-1932
        • Szklarczyk D.
        • Franceschini A.
        • 蜡厂
        • Forslund K.
        • Heller D.
        • Huerta-Cepas J.
        • Simonovic M.
        • 罗斯A.
        • Santos A.
        • Tsafou K.P.
        • Kuhn M.
        • Bork P.
        • Jensen L.J.
        • von mering c.
        字符串v10:蛋白质 - 蛋白质相互作用网络,整合在生命之树上。
        核酸RES。 2015; 43: D447-D452
        • 王Z.
        • 李Y.
        • Sarkar F.H.
        上皮 - 间充质转变中的反应性氧物种的信号机理使肿瘤进展中的癌症干细胞复杂化。
        Curr。干细胞res。它。 2010; 5: 74-80
        • Blick T.
        • Widodo E.
        • Hugo H.
        • Waltham M.
        • 莱堡米。
        • neve r.m.
        • 汤普森e.w.
        人乳腺癌细胞系中的上皮间充质转变性状。
        临床。 Exp。转移。 2008; 25: 629-642
        • Dhasarathy A.
        • Phadke D.
        • MAV D.
        • 沙拉。
        • 韦德P.A.
        转录因子蜗牛和SLUG在乳腺癌中激活转化生长因子-β信号通路。
        Plos一个。 2011; 6: e26514
        • Gupta P.
        • Srivastava S.K.
        HER2介导的TGFβ的Novo生产导致蜗牛驱动的上皮 - 间充质转换和乳腺癌转移。
        摩尔。 oncol。 2014; 8: 1532-1547
        • Lindsey S.
        • Langhans S.A.
        上皮 - 间充质转换期间致癌信号通路串扰。
        正面。 oncol。 2014; 4: 358
        • 散渣米
        亚细胞结构水平的蛋白质组分析。
        欧元。 J. Biochem。 2003; 270: 589-599
        • 盖尔特T.
        • Cox J.
        • ostasiewicz p.
        • wisniewski J.R.
        用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
        NAT。方法。 2010; 7: 383-385
        • 王S.C.
        • 挂米。
        细胞质/核穿梭和肿瘤进展。
        安。 n.y.Acad。 SCI。 2005; 1059: 11-15
        • 周B.P.
        • 邓杰。
        • 夏W.
        • 徐J.
        • 李开。
        • Gunduz M.
        • 挂米。
        GSK-3β介导的蜗牛对磷酸化控制上皮 - 间充质转换的双重调节。
        NAT。细胞生物。 2004; 6: 931-940
        • Salton M.
        • 麋鹿r.
        • BORODINA T.
        • 达维多夫A.
        • Yaspo M.L.
        • 洛珀林E.
        • Shiloh Y.
        matrin 3结合并稳定mRNA。
        Plos一个。 2011; 6: e23882
        • verghese e.t.
        • 德里·
        • 绿色c.a.
        • Holliday D.L.
        • lu x.
        • 纳什C.
        • Speirs V.
        • Thorne J.L.
        • Thygesen H.H.
        • 邹格曼A.
        • 船体M.A.
        • 哈比上午
        • 休斯T.A.
        miR-26b在来自ER阳性乳腺癌的癌相关成纤维细胞中下调,导致细胞迁移和侵袭。
        J. Pathol。 2013; 231: 388-399
        • 郭科
        • Hakimi M.A.
        • Baillat D.
        • 陈X.
        • 游行M.J.
        • Klein-Szanto A.J.
        • Cooch N.S.
        • Godwin A.K.
        • Shiekhattar R.
        将转录伸长率和信使RNA的出口连接到转移性乳腺癌。
        癌症res。 2005; 65: 3011-3016
        • Masuda S.
        • Das R.
        • 程H.
        • 伤害E.
        • 多尔南德
        • 芦苇r.
        在拼接期间将人Trex复合物募集到mRNA。
        基因开发。 2005; 19: 1512-1517
        • Lakshmaiah K.C.
        • 雅各布L.A.
        • Aparna S.
        • Lokanatha D.
        • Saldanha S.C.
        癌症与组蛋白脱乙酰酶抑制剂的表观遗传疗法。
        J. Cancer Res。它。 2014; 10: 469-478
        • 锣C.
        • lv x.b.
        • 刘B.
        • 棕褐色
        • 聂岁
        • 苏F.
        • 刘Q.
        • 姚H.
        • 歌曲E.
        BRMS1L通过诱导FZD10的表观遗传沉默来抑制乳腺癌转移。
        NAT。安排。 2014; 5: 5406
        • 郭H.
        • 弗里德曼A.D.
        通过细胞周期蛋白依赖性激酶的RUNX1的磷酸化降低了与HDAC1和HDAC3的直接相互作用。
        J. Biol。化学。 2011; 286: 208-215
        • Barrallo-Gimeno A.
        • Nieto M.A.
        蜗牛基因作为细胞运动和生存的诱导剂:在发育和癌症中的影响。
        发展。 2005; 132: 3151-3161
        • Vega S.
        • 莫拉莱斯A.V.
        • OcañaO.H.
        • 瓦尔德斯F.
        • Fabregat I.
        • Nieto M.A.
        蜗牛阻断细胞周期并赋予对细胞死亡的抵抗力。
        基因开发。 2004; 18: 1131-1143
        • Azad M.B.
        • 陈Y.
        • 吉布森S.B.
        反应性氧(ROS)对自噬调节:对癌症进展和治疗的影响。
        Antioxid。氧化还原信号。 2009; 11: 777-790
        • javaid s.
        • 张继夫
        • 安德森E.
        • 黑J.C.
        • Wittner B.S.
        • Tajima K.
        • D.T.
        • smolen g.a.
        • Zubrowski M.
        • Desai R.
        • Maheswaran S.
        • ramaswamy s.
        • Whetstine J.R.
        • Haber D.A.
        动态染色质修饰在蜗牛-1的诱导表达后维持上皮间充质转变。
        细胞代表。 2013; 5: 1679-1689
        • Peinado H.
        • Ballestar E.
        • Esteller M.
        • Cano A.
        蜗牛通过募集SIN3A /组蛋白脱乙酰化酶1(HDAC1)/ HDAC2复合物培养E-Cadherin镇压。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2004; 24: 306-319
        • 江省
        • 王H.S.
        • 张F.
        • 张库克斯。
        • 刘Z.C.
        • 方罗。
        • 王H.
        • Cai S.H.
        • 杜杰克
        通过蜗牛的上调,组蛋白脱乙酰化酶抑制剂诱导上皮 - 间充质转变促进癌症进展。
        Biochim。 Biophys。 acta。 2013; 1833: 663-671
        • 张L.
        • 邹W.
        整合素β1的抑制减少了卵巢癌细胞的恶性肿瘤,并通过FAK / Stat1信号通路增强了抗癌治疗。
        摩尔。 Med。代表。 2015; 12: 7869-7876
        • Kurozumi A.
        • 转到了。
        • Matsushita R.
        • Fukumoto I.
        • 加藤米
        • Nishikawa R.
        • Sakamoto S.
        • Enokida H.
        • NA. kagawa M.
        • ichikawa t.
        • Seki N.
        肿瘤抑制microRNA-223通过靶向前列腺癌中的ITGA3 / ITGB1信号传导来抑制癌细胞迁移和侵袭。
        癌症sci。 2016; 1: 84-94