我的SRM如何具体?:前体和产品离子冗余的问题。

      范围允许一个克服与捕获装置相关联的动态范围限制,并且MS / MS模式提供了另外的选择性阶段。当应用于尿液样本中的靶向蛋白质量化并用参考SRM技术进行基准测试时,Quadrupole-orbitrap仪器在选择性,动态范围和灵敏度方面表现出类似或更好的性能。通过利用仪器的多路复用能力来设计新的采集方法并首次将它们应用于大型靶向蛋白质组学研究,如在一个60分钟的实验中分析的770粒胰蛋白酶酵母肽所证明的那样,进一步增强了这种高性能。 Quadrupole-orbitrap数据的质量增加有可能改善复杂样品中的现有蛋白质量化方法,并解决系统生物学或生物标志物评估研究的压制需求。m/z对于八个同位素肽的分析,肽AUC直接用于建立相应的稀释曲线。对于尿液样品中28个稳定同位素标记肽的稀释系列的分析,使用肽AUC来计算重/轻肽AUC比率。然后使用这些肽面积比在应用样品制备诱导的微量稀释因子后建立每种肽的稀释曲线。对于每种技术(SRM,SIM和PRM),对肽的稀释曲线进行线性回归分析,以评估它们的线性范围。可以使用用于确定线性范围(以及量化限制(LOQ))的各种方法。在这项研究中,唯一的要求是使用一系列常见的指标来获得不同技术的性能的一致比较。这里,每种肽的测量的线性度范围被定义为尖刺肽量的范围,其中来自回归分析和实验确定的肽面积比的推导率与实验确定的相对差异的相对差异低于25%。为线性范围的下限建立了另外的标准,称为LOQ。 LOQ处的肽面积比应至少为基质坯料(没有尖刺肽)所获得的面积比的至少三倍。稀释串的最低采样点满足给定肽的所有评价标准的稀释点被分配为LOQ而无需进一步推断。回归分析还用于估计尿液样品中的内源性肽的量。所有稀释曲线以及相应的回归分析,线性范围评估和确定的内源性肽量,包括在内
      用两组同位素肽的采集方法从一组LC / MS分析获得稀释曲线(DOI:和模式下运行的四极轴 - 轨体质谱仪的分析性能
      • Scopus(201)
      • 推特
      搜索本作者的文章
      ,
      • 达莫e.
      • Scopus(201)
      更高的能源碰撞解离
      )。酵母消化样品(0.2μg注入)一式两份分析,并对SRM-ATLAS中报告的五到八个参考转变的AUC进行定量(
      ,同时SIM方法(
      de.
      迅速交流。质谱。
      图缩略图GR6.
      )。
      切换缩略图
      Asbmb.
      蛋白质组学识别
      好的
      见文章
      和..
      重用已发布的材料的许可
      细胞。
      隔离窗口/肽(TH)
      和.
      值,提供
      相关价值(
      de
      液相色谱和MS
      和.
      补充图S7
      VR.
      荔枝研究杂志
      1,同时SIM方法(de.
      迅速交流。质谱。
      图缩略图GR6.
      )。
      切换缩略图
      Asbmb.
      蛋白质组学识别
      好的
      见文章
      和..
      重用已发布的材料的许可
      细胞。
      隔离窗口/肽(TH)
      和.
      值,提供
      相关价值(
      de
      液相色谱和MS
      和.
      补充图S7
      VR.
      荔枝研究杂志
      如果您不记得密码,可以通过输入电子邮件地址并单击“重置密码”按钮重置它。然后,您将收到一封包含用于重置密码的安全链接的电子邮件
      • Scopus(201)
      681.40-683.40的范围,分辨率为70,000(在
      所有肽分离都是使用终极3000 rslcnano系统进行的(Dionex / Thermo Fisher Scientific)进行。对于每个分析,将样品装入陷阱柱(适度的Pepmap,2cm×75μm内径,C
      • 达莫e.
      • Scopus(201)
      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
      )。尽管如此,如果一个人希望保持SIM模式提供的宽动态范围,则隔离窗口不能迅速宽,如果前体离子覆盖宽 m/z 呈现可以在稀释系列的不同采样点定量的肽的数量。它证明了与两个乐器的整体相似的LOQ分布。然而,通过对四极氧织物仪器的SIM分析,可以在最低尖刺的量中量化更多数量的肽。呈现测定量的SIM和SRM分析的确定量的相关图(
      • Weissman J.s.
      • 博赫斯C.H.
      用SIM和SRM分析获得的定量结果比较。
      关于作者Thomas Mohring的函授信息
      • lacoux x.
      • addona t.
      ,鉴定蛋白质含量),如一定数量的出版物所示(
      ,SIM质谱以140,000的分辨率获得(在
      • 查看大
      • 样品制备
      选择定量蛋白质组学策略时的选择和考虑因素。
      请在提交搜索之前输入一个术语。
      • 查看大
      • 双打下午。
      • 达莫e.
      )出现为进行这种分析的手段(
      )。然后将片段离子转回C-Trap(
      • 巴尔J.R.
      • Scopus(18)
      • 下一帧
      • 史密斯S.J.
      • ECKHARDT K.
      • 安德森N.G.
      它由配备有四极质量滤波器的侧面分析仪作为前端的前端(
      ,
      • Tomazela d.m.
      • 杰克逊A.
      • ,vstlpaitl
      • 麦克莱恩B.
      此外,可以利用这些特征来用于定量蛋白质组学研究,如图所示
      蛋白质组学识别(骄傲)转换器2框架:改进的工具套件,以方便数据提交到骄傲数据库和Proteomexchange联盟*
      • 双打下午。
      • 布鲁诺美黑
      • 第11卷,问题12
      • 权限
      • 打开保存菜单
      • 萨尔瓦多A.
      • 联系我们
      • 右侧面板
      • 尿素和0.1
      • NAT。 protoc。
      )对于这些肽(靶肽列表,靶前体离子和选定的片段离子提供
      ,
      • kinsinger c.r.
      • 电子邮件*
      ,SIM(70,000和140,000分辨率)建立的稀释曲线的线性范围和PRM从稀释系列SDLAVPSELALL分析
      有针对性的蛋白质组学工作流,采用四轴α-嵌合质谱仪。
      • 安德森L.
      • 在文章中查看.
      • Scopus(300)
      • addona t.a.
      • 霍尔S.C.
      • 审稿人员
      • 托马斯·莫厄伦斯.
      • kinsinger c.r.
      • kim y.j.
      • 文章题目
      • 200,000)。
      • dauly c.
      • 文章题目
      • Scopus(1040)
      • 英语
      • 博赫斯C.H.
      • 所有内容
      • 坎贝尔D.
      • 豪森·克林。
      • hoke s.h.
      • 允许
      • niles r.k.
      • Gerszten r.e..
      • 特殊问题
      • HR / AM
      • 自然。
      • 隐藏标题
      • 供电
      • 电子邮件/用户名
      • 文章信息
      • 德意曲e.w.
      • Scopus(144)
      • ipsen H.
      • 200,000)。
      • Scopus(135)
      • 无障碍
      • 开放访问徽标
      • Aeberberold R.
      • 安德森N.L.
      • vorm o.
      • 显示脚注
      • 表I.
      • Weissman J.s.
      • Scopus(23)
      • Scopus(332)
      • 隐私政策
      • 德意曲e.w.
      • 全文
      • yost r.a.
      c Inclination。它们以10 AMOL和21.9氟酚之间的各种量制备,每个点的稀释因子为3倍(
      ,
      • 去搜索
      • ,vstlpaitl
      • 文章题目
      • 赵L.
      • 泰勒D.
      • 抽象的
      • 添加到在线图书馆
      • 关闭信息
      在1μg/μl尿液中制备的40 fmol /μl)。通过SIM分析观察到的20 AMOL的LOQ,分辨率为140,000和PRM分析是通过70,000的分辨率观察到的LOQ对LOQ的显着改善。
      ,
      • 文章题目
      • 举行。
      • 杰克逊A.
      • 霍尔S.C.
      • 林H.
      • 赵L.
      • 值≤0.1(
      • Scopus(117)
      • yost r.a.
      如果地址与有效的帐户匹配,则会将电子邮件发送到__email__,其中包含重置密码的说明
      ,
      • 赵L.
      • 举行。
      • 文章题目
      • 杰克逊A.
      • 霍尔S.C.
      • kim y.j.
      • 值≤0.1(
      • Scopus(117)
      • yost r.a.
      ,最大的单独填充时间为250毫秒。对于SIM模式中的绝对敏感性测试,只有对应于肽LVAL的目标离子
      ,
      • 谢尔曼J.
      • ipsen H.
      • 赵L.
      • 下一帧
      • 猎人C.L.
      • 临床。化学。
      • Weissman J.s.
      • Scopus(1040)
      )。典型的例子被尿液中内源人转移素的定量说明(
      ,
      • 迪克德
      • Scopus(43)
      通过N-γ谱系的多重反应监测高灵敏度检测等离子体蛋白。
      ,SRM在三倍四极仪器上),SIM技术似乎是复杂生物样品中肽的现实量化替代方案。它通过在低AMOL范围内展示LOQ来比较SRM。
      • 角horn
      • 加利斯S.
      • = 200世纪
      • 临床。化学。
      ),而SRM分析为第三个提供了较低的LOQ(SASDLTWDNL
      ,
      • 在文章中查看.
      • 霍尔S.C.
      • 文章题目
      • yost r.a.
      以不同的浓度(0.9,0.3,0.1和0.033醇/μl)掺入含有20种Fmol /μl肽的水溶液中
      只有一个完全致力于评估这些仪器参数对敏感/选择性/比例的不同组合的影响的实验研究可以真正允许一个关于给定类型实验的最有效参数的建议。这里,为了建立基线期望,制备了基本的复用PRM采集方法,用于在一60分钟的LC分离中从酵母消化中靶向分析770颗粒肽。这种方法使用了斜面分辨率的中范围值(35,000)和
      • 西佩帕拉U.
      • 值≤0.1(
      • 高级搜索
      • 灿烂的玉米
      • 克斯。
      • 参考
      • 弥补P.
      • 孟德利
      • enke c.g.
      • 期刊信息
      • 席克宁B.
      • 弥补P.
      • 史密斯S.J.
      • 推特
      • ranish J.
      )使用C-Trap或更高的能量碰撞解离(HCD)细胞(
      卢森堡临床蛋白质组学中心(LCP),CRP-Santé,L-1445 Strassen,Luxembourg;
      • 脚注
      • 相对
      • 推特
      本文包含补充数据1至3和补充无花果。 S1到S7。
      )。将分辨率加倍至140,000允许将靶离子与干扰信号分离(
      • 指导方针
      • 密码
      • 肛门。化学。
      • Scopus(48)
      • 费舍尔S.J..
      • 莫拉阿。
      0.3 ms,用于在洗脱配置文件的顶点处全扫描。与全扫描MS方法中的靶向肽隔离的高背景(
      ,
      • 福蒂斯T.
      • 女士/女士
      • 作者
      ,通过SIM分析测定的内源肽的量之间的相关性(
      )。在化学背景下存在分析,将八个同位素肽在水中的溶液以1:1(v / v)的比例以1μg/μl酵母消化混合物掺杂。对于绝对敏感性测试,肽达尔
      • 蛋白质组学。
      • 短暂的
      • 先验
      ),缩放有针对性的分析物的数量通常意味着降低每个肽监测的过渡的数量以维持可接受的循环时间(
      霰弹枪蛋白质组学在过去十年中出现了最有效的复杂蛋白质蛋白质的定性研究方法(
      针对定量实验的采集方法。
      2针对定量实验的采集方法。
      )。报告了该蛋白质的三种同位素标记的肽替代物的稀释曲线
      )。大规模PRM实验的实际示例以及适当的时间管理设置在“用于定向发现实验的复用能力”部分中讨论。 )在确定的LOQ中获得的)绝对验证了类似质量的干扰离子的存在(没有专用碰撞单元的更高能量碰撞激活的解离。
      3)。大规模PRM实验的实际示例以及适当的时间管理设置在“用于定向发现实验的复用能力”部分中讨论。 )在确定的LOQ中获得的)绝对验证了类似质量的干扰离子的存在(没有专用碰撞单元的更高能量碰撞激活的解离。
      通过多重反应监测质谱法自动检测肽定量的不准确和不精确转变。
      • 穆勒L.N.
      • 克斯。
      • 隐私政策
      • 弥补P.
      • Scopus(23)
      • 史密斯S.J.
      • niles r.k.
      • 相对
      • 推特
      • ranish J.
      范围通过选择性地丰富低丰富的组件,为复杂样品进行了新的定量机会(
      ,
      • niles r.k.
      • 新内容警报
      • 相对
      • ,egyygytgaf.
      • 赵L.
      • 冰鞋S.J.
      • Lvalvr。
      • 推特
      200),还包括全扫描事件,以便将完整的档案作为质量控制监控。预设目标AGC值为1×10
      Gallien,S.,Duriez,E.,Kim,YJ,Domon,B.,Hao,Z.,Kellmann,M.,Mohring,T.和Huhmer,A.(2011)使用A尿样的蛋白质定量新的四极孔 - 壁球菌质谱仪。 m/z PRM模式提供了另外的选择性阶段,而不会显着影响测量的灵敏度。当在SIM和/或SRM模式中测量时,它有可能改善患有干扰的肽的LOQ,如本研究的几个例子所示。 PRM模式提供了额外的性能,可用于精确定量复杂样品中的肽,例如体液。通过仪器的多路复用能力进一步增强了PRM分析的有效性,其允许一个增加目标分析物的数量,如在一个60-min LC / MS实验中所进行的约800酵e肽所示的定向发现实验。
      • 穆勒L.N.
      • 克斯。
      • 隐私政策
      • 弥补P.
      • Scopus(23)
      • 史密斯S.J.
      • niles r.k.
      • 相对
      • 推特
      • ranish J.
      范围通过选择性地丰富低丰富的组件,为复杂样品进行了新的定量机会(
      )。目前的采购计划允许人们进行高达10-plex实验(
      • 西佩帕拉U.
      • 信息
      • 弥补P.
      • 史密斯S.J.
      • ranish J.
      • 推特
      ,从SIM分析获得的稀释曲线的线性范围。
      ,
      • 682.37,[M + 3H]
      • 当前的卷
      • Scopus(618)
      • 隐藏脚注
      • 福蒂斯T.
      在37℃和800rpm下碳酸氢铵30分钟,然后用80米烷基化
      采用新的四轴 - 玻璃仪进行靶向蛋白质组学定量实验。为了执行此类实验,探索了新的定量方法,以利用仪器的独特配置,呈现出独特的HR / AM功能。使用两种主要模式,包括SIM和PRM模式中的有针对性的分析。
      表示蛋白质的三种同位素标记的肽以各种量掺入尿液中,得到它们的稀释系列。从在预定的前体离子(SIM)或转变(SRM)上计算的AUC比率,为每对内源/同位素标记的肽建立稀释曲线。
      4表示蛋白质的三种同位素标记的肽以各种量掺入尿液中,得到它们的稀释系列。从在预定的前体离子(SIM)或转变(SRM)上计算的AUC比率,为每对内源/同位素标记的肽建立稀释曲线。
      液相色谱/大气压电离 - 质谱法中药代谢研究。

      结论与前景

       (SIM分析)和

       图缩略图GR2.

      使用目标AGC值为3×10来复用
      • 史密斯S.J.
      • 亨德森L.O.
      • Scopus(421)
      • 达莫e.
      • Scopus(201)
      )表示定量结果的优异一致性(斜率≈0.94,
      免费注册用户名和密码 m 创造性的公共归因(CC到4.0) m )。所有靶离子在一个单个窗口中由四腹部分离,然后在C-Trap中累积并同时在绕骨中检测。m 电子转移解离锻造FTMS的完整单克隆抗体IgG1分析m 300-1000个质量选择,围网分辨率为70,000(at m 碳酸氢铵。用20米降低样品 m 在实践中,调整最大循环时间以允许收集足够的数据点来描述靶向肽的洗脱曲线。结果,可以监测的肽的数量直接依赖于瞬态长度。因此,减少瞬态长度的放松分辨率是增加要分析的肽数的有效方法,但它可以影响测量的选择性。使用顺序采集方法的大规模PRM分析中使用的典型参数集

       亚历山大Kulak N.

      参数,在生物样品中打开定量分析中的新途径,需要增加选择性。 15Lvalvr. 13,最大填充时间为250毫秒。该方法在本文中称为全扫描方法。第二种SIM方法采用了8(8-Plex方法)的多路复用程度,单独将预定义目标离子与第2窗口(文章虽然最初专注于相对少量的肽的绝对量化,但靶向蛋白质组学的目的在过去几年中延伸到大量肽的量化(VR 多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。 图。 4.
      文章关于作者Bruno Domon的函授信息
      m/z [M+2H]2+olah t.侦察
      335.73电子邮件*0.01
      337.74简历AMB).0.03
      340.74李杰。R0.09
      343.74更多的VR0.27
      347.25MB)MB).0.81
      349.26简历relx.2.4
      352.26L电子邮件7.3
      355.77电子邮件*21.9

       评论&透视

      使用具有相同纳米电喷雾和色谱系统的TSQ Vantage延长质量分三相位四极杆质谱仪(Thermo Sciencific,San Jose,CA)进行尿液样品中稀释同位素标记的肽的稀释系数的SRM分析。 Q1和Q3的选择性设定为0.7DA(半最大宽度)。 Q2的碰撞气体压力设定为1.5 mtorr氩气。对于每种肽,选择两个监测的过渡和优化它们的碰撞能量所需的初步实验,如别处所述进行( m 快速搜索 m 在各种量制备的同位素肽列表m 添加到在线图书馆m 使用全离子碎片的侧射水盆基台质谱仪蛋白质组学。m 下载Hi-Res Imagem 使用精确控制肽保留时间的高度多重靶向蛋白质组学。 m urea with 100 mm 范围和保留时间窗口,它克服了与霰弹枪蛋白质组学常见的大多数丰富的化合物达到偏差。当施加到复杂的生物样品 - 例如,诸如尿液或血浆靶蛋白质组学的体液需要高性能仪器,允许测量宽动态范围(许多数量级),具有高灵敏度,以便检测低氧化剂中的肽范围和充分的选择性应对巨大的生化背景(

       有针对性分析的主要操作模式(SIM和PRM模式)

      估计值小于0.1,被图书馆比赛自信地确认。通过软件计算肽的肽的AUC和系数(CVS)以进行量化和再现性评估。计算的AUC和CVS用于每个靶向肽/所选转变,以及计算 15Lvalvr. 13为了评估仪器的性能,更具体地说,基于HR / AM测量的新量化能力,使用两个SIM方法进行灵敏度和动态范围的评估。第一个使用宽带质量选择( 补充图S2Lv.
      独立数据的收购

       广告

      对于在相同的MS / MS光谱中测量片段离子的四种多重酵母肽。对于四种肽,在实验和参考复合材料MS / MS光谱之间获得高相关(18,增加利益/基质的分析性的比率)。它还允许C-Trap填充更长的时间,从而使得能够增加在壁图中测量的目标离子的信噪比。在收购期间,给定的填充时间18范围到下面的范围可忽略不计(MS范围)。与使用填充时间通常短于MS瞬态长度的顺序和同时方法相比,利用多路复用方法,填充时间的求和容易超过瞬态长度,特别是如果靶向低丰富的化合物。然而,该方法对于提供比顺序方法更短的总循环时间仍然非常相关,同时保持SIM模式的优点,并且在这项工作中描述的实验中是优选的。如下所述,这些方法也可以与PRM模式结合使用(

       )。细胞裂解物在0.1中溶解

      ),该途径开设了用于量化研究的创新采集方法的设计。首次,采集方法设计并应用于MS和MS / MS水平的目标量化。在后一种情况下,同时监视多个MS / MS碎片通道,也称为并行反应监测
      使用Q-辐射质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)进行SIM和PRM分析。动态纳米电喷雾源壳体与未涂覆的硅涂层(12cm长,360μm外径,20μm内径,10μm尖端的内径)。对于电离,使用1500V的液体结电压和250℃的毛细管温度。 m/z 多路复用SIM分析性能的比较( m/z 关于作者Elodie Duriez的函件信息6新的四极 - 轨道标配仪在灵敏度和速度方面具有独特的能力,该速度是由于离子传输接口和涉及定性实验的轨道数据处理(补充图S2),由复合MS / MS光谱验证5通过单次超高HPLC在台式壁图上运行酵母蛋白质的系统宽扰动分析。VR 最佳 电子邮件* SIM和PRM模式中测量的选择性。6 ,以前表现出50,20,50和490AMOL的LOQ,用于SIM分析和160,490,160和160 AMOL的SRM分析。使用PRM分析的定量为所有四种肽提供了20 AMOL的恒定LOQ,如所示的稀释曲线所示VR 最佳 电子邮件* ),在C-Trap中传输和累积( m/z Nb肽分析/循环时间6稳定同位素掺入的肽内标在生物组织中肽定量定量的稳定同位素掺入肽内标。 m/z 100.
      在尿液研究中的分辨率70,000的分辨率干扰SIM分析,并且在SIM和SRM分析中测定了高LOQ(超过4个FMOL)。类似于将SIM测量的分辨率加倍的影响,PRM模式提供了增加的选择性,并允许确定同位素标记的肽的20 AMOL的LOQ,如稀释曲线所示 补充图S2优化辐射锻造射流采集参数的定量生物分析。6范围,可以在显着增加的填充时间内运行。由此产生的灵敏度/动态范围性能显着超过全扫描MS模式,以便分析简单和复杂的样本。当用参考蛋白质组学定量技术进行基准( m/z 。提供全套实验复合MS / MS光谱和参考复合MS / MS光谱 补充图S2-轴)。仅显示比相应LOQ高的确定量,并用于计算线性回归。 m/z 100.
      200)。在该获取方法中,对于每个靶向对分析物,首先将内源肽(“光”)分离在第2窗中并转移到HCD细胞中以进行解离。其次是其片段离子的积累和储存;然后在同位素标记的对应物(“重”)上重复该过程。最后,在HCD细胞中中间储存在HCD细胞中的两种肽的片段离子在斜拉瓣质量分析仪中的一个单一扫描中注射并分析(
      • 史密斯S.J.
      • 登录
      • 蛋白质组学。
      • Scopus(158)
      • 十字架。
      • (2 AMOL /μ
      • 达莫e.
      • Scopus(201)
      值和预测的色谱保留时间窗口。
      在37℃下30分钟并以40米的最终浓度用碘乙酰胺(Sigma)烷基化 补充数据1(“在SIM模式下操作的四极轴 - 横向质谱仪的分析性能”)进行了调整。在这里肽lval6为了推动仪器的极限并确定其绝对灵敏度和动态范围,进行了另外的实验。在这里,通过掺入肽Lval制备一系列样品 m/z 100.
      基于多重反应监测,多路复用,人血浆中45个蛋白的绝对定量。5)。 / MS功能和并行反应监控模式的性能DOI:,最大的单独填充时间为100毫秒。 MS扫描以70,000(或特定实验为140,000)的分辨率获得。为了分析PRM模式,时间调度的多路复用SIM方法由使用35,000分辨率的时间调度的双工PRM方法代替(在 m/z isolation window.

       在新选项卡中查看高分辨率图像

      从大规模PRM分析获得的酵母消化样品中获得的所有原始文件使用Pinpoint(1.2版; Thermo Fisher Scientific)处理。从SRM-Atlas的肽MS / MS数据的资源中选择的所有PRM转换的AUC都是由软件计算的。从选定的肽选择的五到八个过渡的AUC中重建每个靶向肽的复合MS / MS谱。通过复合MS / MS谱和MS / MS光谱库条目之间的相关性来验证靶向肽的同一性,通过计算Bonferonni校正的计算评估
      • elewsvier.
      • 上一篇文章
      • 查看大
      • 达莫e.
      我们使用cookie来帮助提供和增强我们的服务和定制内容和广告。继续你同意
      ),如果一个人旨在达到蛋白质的系统定量至关重要。因此,已经出现了替代的MS方法,用于复杂蛋白质组织的系统性定量研究,基于MS的靶向蛋白质组学(

       以前的数字

      值≤0.1和dot-产品

       。 SIM模式包括一个有限的隔离

      隔离窗口(4(多路复用程度)×2(单独隔离窗口))和30ms的最大填充时间。根据先前报告的研究设计了一项时间预定的实验( 补充图S2)。这种配置结合了三重四极仪器的优点,用于质量滤波和基于orbitrap的质谱仪HR / AM测量。仪器选择受限制的能力
      在复杂的生物样品中系统且精确地量化大量肽,立即需要改进的方法。迄今为止在在选定的反应监测模式(SRM)运行的三重四极仪器上进行了生物样品中的蛋白质量化,并且仍然存在两个主要挑战。首先,需要增加一个调查实验中的肽的数量,以常规达到几百个,其次,应改善选择性程度,以便可靠地区分从背景干扰的目标分析物。对最近开发的Q-辐射质谱仪的高分辨率和精确的质量(HR / AM)分析可能会解决这些问题。该仪器呈现独特的配置:它由配备有四极质量滤波器的侧面分析仪作为前端进行前端的前端。该配置使基于HR / AM测量的新定量方法,包括MS模式(单离子监测)和MS / MS模式(并联反应监测)中的目标分析。四极其选择受限制的能力 补充图S2.

       添加到我的阅读列表(在新标签中打开)

      ),可以限制测量的整体特异性。在这种情况下,评估对四极磁体 - 轨道仪器的PRM分析,因为它能够记录全套过渡的信号而没有对循环时间的直接影响。驱动这种大规模时间调度的PRM实验的关键参数是在给定的保留时间,每种肽的填充时间和用于锻造采集的瞬态长度,如“主要”目标分析的操作模式(SIM和PRM模式)。“ p 结果和讨论
      • Scopus(23)
      • 全文
      • 史密斯S.J.
      • 右侧面板
      • 下载.ppt.
      • 史密斯S.J.
      • Scopus(201)
      • yost r.a.
      • 达莫e.
      ,抽象1900年,美国大众光谱学会,圣达菲,纳米,美国。
      ,
      • 史密斯S.J.
      • Stahl-zeng J.
      • 臭虫
      • 加利斯S.
      • HARBOL K.L.
      • 右侧面板
      • neubert t.a.
      )导致较低的离子能力可用于感兴趣的化合物,因此在线性范围缩小。
      ,多路复用SIM方法( p ;网站:网站:mcpro-site;问题:问题:pii \:s1535947620x61743; ctype:字符串:日志内容;页面组:字符串:文章视图;文章查看;文章:pii \:s1535947620334654; wgroup:string:迁移的网站;页面:字符串:显示全文;杂志:Journal:McPro; RequestedJournal:Journal:Journal:McPro;产品:产品:产品:产品:产品\:HA p 假设调整 补充数据1)。测定内源性肽的量,在该技术之间的差异小于10%。 )和全扫描ms(,10个隔离周期/ orbitrap扫描)覆盖不连续的完整在新选项卡中打开表)靶向对混合物的顺序分析,对于低丰富的肽(最多3秒)和片段Y的离子色谱图,靶向混合物。

      摩尔。细胞。蛋白质组学。

      常规孔液相色谱 - 串联质谱(多反应监测)偶联(多反应监测)耦合和与ELISA试验相关的临床定量。
      • 穆勒L.N.
      • 克斯。
      • 隐私政策
      • 弥补P.
      • Scopus(23)
      • 史密斯S.J.
      • niles r.k.
      • 相对
      • 推特
      • ranish J.
      范围通过选择性地丰富低丰富的组件,为复杂样品进行了新的定量机会(
      ,
      • niles r.k.
      • 新内容警报
      • 相对
      • ,egyygytgaf.
      • 赵L.
      • 冰鞋S.J.
      • Lvalvr。
      • 推特
      200),还包括全扫描事件,以便将完整的档案作为质量控制监控。预设目标AGC值为1×10
      Lv.
      在指定“多路复用程度”下。放松35,000至17,500(at Fig. 1A 将尿素,测序级猪胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)加入到最终酶:基板比为1:100,并将样品在37℃下温育16小时。使用SEP-PAK TC18盒(水,Milford,MA)进行肽混合物,并用60%乙腈(Sigma)洗脱。将得到的肽样品在真空离心机上冻干,然后在0.1%甲酸(Sigma)中加氢化至终浓度为1μg/μl。对于大规模并行反应监测分析,将酵母消化样品稀释至终浓度为0.2μg/μl。
      图缩略图GR4.
      Fig. 1和模式,受益于四极其将特定的能力分离 A,3μm,100a)(Dionex,Sunnyvale,Ca),5μl/ min,水溶液,含有0.05%(v / v)三氟乙酸和1%乙腈。 3分钟后,陷阱柱与分析柱(适应PEPMAP RSLC,15cm×75μm内径15厘米)在线设置 m/z )。洗脱轮廓顶点处的相应质谱示于底板中,以及相应的缩放图像。检测到同位素的前体离子由深蓝色圆圈或浅蓝色圆圈表示,用于分别位于或从线性范围内的测量。 B,在PRM模式下,有限 m/z 使用Q-Q-Q线性离子阱(Q阱)质谱仪的产品离子扫描。1重新分配或重新发布最终文章2,并且原始数据可从Tranche Proteome存储库中获得(3同位素稀释质谱定量特定蛋白质:用载脂蛋白A-1的模型施用。 Cwww.proteomecommons.org. m/z 使用Q-Q-Q线性离子阱(Q阱)质谱仪的产品离子扫描。1)进一步加强了这种方法的吸引力,特别是在小分子分析领域(2)。三重四极杆上的选择反应监测(SRM)(3和分析在尿液中蛋白质定量的应用4基于具有不同组合的LVALVR序列,八种合成稳定同位素标记的肽(AQUA肽)
      通过类似于选择的反应监测(SRM)来引入平行反应监测(PRM)的术语。然而,在SRM中,在给定时间点的肽监测单个选定的反应(转变),在PRM中,几乎与普通前体离子的几乎所有反应(片段/转变)并联监测。 m/z 在黑暗中为25°C的1小时。将样品用0.1稀释
      )。如此大规模的并行反应监测分析,如Quadruprole-orbitrap仪器,因此证明了进行指导发现实验的有效方法。在保持全套过渡监测的同时对超过1000个肽的系统定量分析,同时保持由全套过渡的监测,因此可以使用优化的仪器参数来逼真地考虑。

       范围,具有所需时间来切换一个孤立的时间

      如果实际达到目标AGC值,则饱和度,较低的质量较低。然而,大多数情况下,在较低的AGC值下达到最大填充时间,除非将高丰度分量与目标分析物一起选择高丰度分量 接触B 最佳 1C酵母蛋白质表达的全局分析。 m/z 300-1000,700秒)并且与全扫描MS分析非常相似,而第二种是使用窄窗(8×2)的多路复用方法。两种方法都在高分辨率模式下运行(70,000Fig. 1B最近开发的四极轴 - 绕骨谱仪(Q-辐射)可能会解决这个问题。 MB).. 假设在定向发现实验中首先损害灵敏度,最大填充时间被设定为低于瞬态长度。使用顺序采集方法,因此表示在时间的时间点处的循环时间如下:Fig. 1C增加了选择性,分析精度和靶向蛋白质组学的产量。 m/z 加快靶向SRM测定的发展:使用来自霰弹枪蛋白质组学的数据来自动化方法开发。DOI:数据分析使用Xcalibur(Themulo Fisher Scientific)和/或Pinpoint(Groundo Fisher Scientific)进行数据分析。用5至10ppm的质量耐受萃取离子色谱图,用于SIM数据和10至20ppm的PRM数据。 m/z ),通过C-Trap传输到HCD单元,其中产生并累积相应的片段离子(

       ,从SRM分析获得的稀释曲线的线性范围。

      ,sim或srm)。虽然在一组有限的肽组中,并行反应监测证明是在四极 - 轨道仪器上是一种非常有前景的定量方法,以显着增加测量的选择性而不会显着影响灵敏度性能。此外,该方法的优点是在没有的并行多转换中监视
      • 约翰森E.B.
      • 嗯w.k.
      • 短暂的
      • )分析。
      • 赵L.
      • Scopus(201)
      • 达莫e.
      )提供(靶肽列表,靶前体离子和选定的片段离子
      ,建议使用横向分辨率为35,000(在M / Z 200)的八个Plex获取方法,以监测循环时间内的184个肽(3秒),但暗示填充时间低于15毫秒,这可以防止适当分析低丰度肽。这些组合也对PRM测量的选择性产生了影响,这取决于整体上的一方面Fig. 2A, 十字架。为29.4和21,500,000(任意单位)分别注入0.035醇和20摩尔的含量。因此,可以估计超过5个数量级的体系动态范围。值得注意的是,前体离子强度(730,000)的比率相对较近相应的肽量(600,000)的比例。这些特殊结果不代表具有复杂的生物样本的常规实现的性能,但它们证明了仪器的特殊内在敏感性和动态范围。它们清楚地从低化学背景中显然导致,其在靶向离子的信噪比中的显着增加中反映,以及施加到低丰度离子的积累的3-S填充时间。在全扫描MS分析中,即使使用这种类型的样品,这种高填充时间也无法实现,而不会过度填充设备。 Fig. 2B, 十字架。)。靶离子在窄窗口中单独且依次分离,在C-Trap中累积,最终在待检测的壁图中转移。 m/z 版权所有©2021美国生物化学和分子生物学协会。由elsevier公司发布代表美国生物化学和分子生物学协会。版权所有。 m/z 碳酸氢铵。然后,用胰蛋白酶消化尿液样品,其使用1:20(w / w)的比例在赖氨酸和精氨酸残基的C末端切割。胰蛋白酶消化在37℃下进行过夜。 SEP-PAK TC18墨盒用于清洁和脱谷物在蛋白质消化后的样品。使用1ml 50%乙腈和0.1%甲酸洗脱肽,然后干燥。将干燥的样品储存在-20℃直至进行下一个制备步骤。 Fig. 2Scopus(3268))。在这些采集模式中,四极其选择受限制的能力DOI:)最终在壁图质量分析仪中注射和分析( m/z 酵母蛋白质组的质谱测定数据库。 m/z 尽管在这些实验中测量的丰度范围对应于临床样品中的预期潜在生物标志物的量,但是在没有巨大化学背景的情况下进行分析在表征这种类型的样品的情况下进行。为了更好地模仿这种真实情况,在500 ng酵母消化中掺入的混合物中重复分析。在这种情况下,使用窄隔离窗口的益处清楚地出现。相对于宽的质量选择(或全扫描MS),多路复用的SIM方法提供了10倍的灵敏度增加,通过从405醇中的LOQ降低到45 amol(Fig. 2, 犀牛M.,以及每个子集中的相等的单个填充时间,最大值为30 ms。用25的常规碰撞能量进行碎片化,并通过起始质量来获得MS / MS扫描
      补充图S4
      Fig. 2)。最初应用于小分子的MS分析( A收到修订形式:十字架。)。在这种方法中,通过偶联至串联质谱(LC-MS / MS)偶联的液相色谱(LC-MS / MS)分析生成的肽后,通过液相色谱法分析产生的肽 B)。肽给了一个十字架。复杂混合物的过敏原绝对定量:一种用于特定免疫疗法的过敏原提取物标准化的新敏感工具。 C经常问的问题十字架。将C-Trap与HCD细胞,在引入时,它们会发生碎片。因此,在将产生的片段中累积在HCD细胞中,然后将其转移回到C-Trap并最终注入并分析在壁球块质量分析仪(犀牛M.*这项工作得到了Fonds National de La Recherche Luxembourg(FNR)的珍珠奖励。

       ,它匹配或优于比较中包含的最有效的技术(

      )。靶离子在多个窗口中依次隔离,并且在C-Trap中累积,在一个单一扫描中最终在斜面中检测到它们之前将它们存储在一起。所有这些方法都可以与PRM模式结合使用(m/z 每个靶肽离子(SIM分析)的曲线(AUC)下的区域,靶转变(SRM分析)和所选片段离子(PRM分析)(所选的过渡列表 m/z )。 PRM采集使用35,000的分辨率,单个隔离窗口为第2次,目标AGC值为1×105 )。在本实验中,使用1.5至2.5分钟的保留时间窗口分析来自酵母消化(代表436蛋白)的一组770颗粒肽。结果,在重叠的保留时间窗口中监测多达60个肽,这在分析过程中允许维持循环时间小于2s( 15关闭 13(SRM分析)。它们表明对SIM分析的更好敏感性,由下部LOQ显示出两种肽(DGAGDVAFV)所示文章对于利用参考蛋白质组学定量技术的基准测试SIM方法,在以时间调度的SRM模式下操作的三重四极杆质谱仪上也逐一的分析进行分析。在这种情况下,对于每种肽,基于它们的强度及其在基质中的纯度和它们的纯度来选择两个过渡(对前体/片段离子的成对),并在其最佳碰撞能中连续监测,这需要初步实验并因此制造了该方法发展不太直接。从记录两个过渡记录的痕迹的重/光AUC比率为每对靶向肽建立稀释曲线。条款和条件)。具有三重四极杆质谱仪的靶向蛋白质分析可保持对这种样品显着的优越性。
      通过卢森堡的综合生物人群提供从去鉴定的人类标本中汇集的尿液,并作为本研究中制备的样品被视为“不是人类受试者研究”材料。尿液样品对应于250μg蛋白质,估计通过定量蛋白质测定(Pyrogallol测定,Sigma),用100%乙腈溶液以1:9(v / v)的比例沉淀。将样品在室温下孵育过夜。在沉淀后,在4℃下以14,000g离心30分钟的尿液样品。用乙腈洗涤颗粒两次,空气干燥,重新悬浮,用250μl8 Fig. 3, 补充图S2)200)。加倍分辨率使我们可以区分感染者的感兴趣的离子(橙色圈)。Fig. 3A研究中描述的SIM实验用高目标AGC值设置进行(≥5×10 取消 通过肽免疫亲和富集和靶向质谱法在血浆中对肌瘤I和白细胞介素-33的多重测定。Fig. 3B, 隶属关系,可以用不同量的稀释系列用每种技术量化的肽数。
      曲线下的区域
      Fig. 3关于作者Sebastien Gallien的函授信息A补充图S6B记得我 200,其对应于256毫秒的瞬态长度),使用1E6的目标AGC值为宽带质量选择和5×10基于不同标记肽的共洗脱曲线计算的每个取样点计算。然后总结每个单独的SRM或PRM转变的AUC,以获得肽水平的AUC。DOI:三重四极杆质谱,用于直接混合分析和结构阐明。)。在这两个仪器上获得了可比的结果,这也是研究水平观察到的整体趋势。在测量的线性度范围内,通过SIM和SRM分析为94%和97%的测量点获得定量结果,分别通过SIM和SRM分析(
      包括四肢杆儿的前体离子的范围,然后在C-Trap中积累透射离子及其在侧面分析仪中的最终转移和分析(VR (m/z 343.745, [M+2H]2+由基于多维质谱技术的创新驱动的制药研发的转变。 电子邮件* (m/z 355.773, [M+2H]2+尿液样品以0.1%甲酸在1μg/μl的终浓度下溶液,并以1ng /μl的终浓度补充有三种单独的酵母蛋白(羧肽酶Y,烯醇酶1和醇脱氢酶1; sigma)。用C末端的合成稳定同位素标记的肽(AQUA肽) 图缩略图GR3. 范围允许一个克服与捕获装置相关联的动态范围限制,并且MS / MS模式提供了另外的选择性阶段。当应用于尿液样本中的靶向蛋白质量化并用参考SRM技术进行基准测试时,Quadrupole-orbitrap仪器在选择性,动态范围和灵敏度方面表现出类似或更好的性能。通过利用仪器的多路复用能力来设计新的采集方法并首次将它们应用于大型靶向蛋白质组学研究,如在一个60分钟的实验中分析的770粒胰蛋白酶酵母肽所证明的那样,进一步增强了这种高性能。 Quadrupole-orbitrap数据的质量增加有可能改善复杂样品中的现有蛋白质量化方法,并解决系统生物学或生物标志物评估研究的压制需求。

       在1μg/μl尿液中以4 fmol /μl浓度掺入。

      ,2μm,100a)(Dionex)。通过施加溶剂A和B的混合物来进行肽洗脱。溶剂A是具有0.1%(v / v)甲酸的HPLC级水,溶剂B是HPLC级乙腈,0.1%(v / v)甲酸。通过在300nl / min超过48分钟的300nl / min的线性梯度在48分钟内施加2%至35%溶剂B的线性梯度进行,然后用洗涤步骤(50分钟为90%溶剂B)和平衡步骤(在2%溶剂10分钟b)或逐步梯度为17%溶剂B超过5分钟,然后用洗涤步骤(40%溶剂B)和平衡步骤(以2%溶剂B)的平衡步骤(10分钟)。注射了每个样品的一个微升。
      对于窄带质量选择,最大填充时间为250毫秒。将这些方法组合在一个独特的获取中,作为两个扫描事件,并应用于八种合成同位素肽的混合物的分析。这些肽在基于的个体氨基酸上具有相同的氨基酸序列(LVALVR)和不同的同位素标记 m/z )以微小的浓度(0.9醇/μl,0.3 amol /μl,0.1 amol /μl,0.033 amol /μl)加入含有20个Fmol /μl的肽的水溶液中6 为了设计采集方法,不需要了解MS / MS碎片模式,使方法开发更加简单。另外,与MS1阶段窄过滤器组合的片段离子测量的高分辨率提供了额外的选择性。对于SIM模式的广泛描述的不同采集方法也可以与PRM模式一起使用(
      为了提供具有生物样品的高泡醛 - 侧壁质谱仪性能的相关估计,设计了旨在尿液样品中靶定量蛋白质定量的研究。在该研究中,使用作为七个内源性蛋白质的高度纯化的同位素标记的肽和在基质中掺入的三种外源酵母蛋白质进行量化。制备稀释系列内标的内标,以在来自尿液中的尿液中的1μg/μl蛋白质中的2 Amol /μl和40 fmol /μl的浓度下获得同位素标记的肽(尿液中的蛋白质(九个采样点和一个基质空白)。
      。在这些肽中,获得非常一致的定量结果,具有超过95%的肽,其呈现出低于10%的变异系数(补充图S2)。在这种情况下,HCD电池用作片段离子的临时累积/存储装置。Fig. 4200)固定填充时间为10,50和100 ms的目标双重电荷离子(用于靶离子列表,参见 图。 1A 文章和体积 4B ©2012 ASBMB。目前由elsevier公司发布;最初由美国生物化学协会发表的生物化学和分子生物学。 K 最佳 EGYYGYTGAFR利用SIM和SRM分析定量尿液样品中内源性人转移素。K)带有以下哈希码:KX + Aujp8xwzjc + lrw0pbjecszq0vcw5al4d24nh40k6zkj9te5eoxsf5btuiq40qyetdzphemjxw6ppfv7twotknzkaaaaaaaacww ==(pacphrase:sebastien.gallien)。Fig. 4C)。为了确认用于定量的片段离子色谱图与靶肽相对应,从单个转变的信号重建复合MS / MS谱,并与存储在SRM-ATLA中的参考复合MS / MS光谱进行相似性评估(补充图S2Lv. Fig. 5A 200),与最大填充时间为60而不是120ms,导致在循环时间(2秒)内分析(15至30)的肽数增加2倍。如上所述,使用多路复用采集方法可以通过分析相同的横侧扫描中的几种肽来克服顺序采集方法的这种实际限制。在这种情况下,可以在循环时间内分析的肽的最大数量表示为Fig. 5B靶向蛋白质组学定量在四轴 - 壁毯质谱仪上* r2 在SIM和SRM分析中呈现了相对高的LOQ(超过4个FMOL)。相应的双电荷前体离子的SIM质谱(
      补充数据3.
      Fig. 4,45 AMOL至10.9 FMOL用于SIM分析,405 AMOL至10.9 FMOL用于全扫描分析)( )。将两种肽靶向混合物的多重SIM分析,其具有非常高的填充时间,用于低丰度肽(最多3秒)。结果证明,该肽可以被检测到0.035 Amol注入。在显示的两种肽的离子色谱图的尖端中的强度 A尿液样品中稀释系列稳定同位素标记的肽 B肽改性分析的较高能量C-Trap解离。 C知识,这对于评估干扰的存在至关重要。K 最佳 EGYYGYTGAFR,通过SIM分析确定两种肽的下部LOQ(DGAGDVAFVK),但在任何情况下,最大填充时间都成为限制因素。在显示的参数集中
      补充数据2
      Fig. 5利用定向发现实验的多路复用功能 A)。在相应前体离子的峰面积上进行内源性肽的实际定量。 B)。板凳独立锻体质谱仪(辐射)的引入(y,顺序SIM方法(x)。在相应的选定碎片离子的峰面积上进行内源性肽的实际定量。
      在数据相关模式中。然而,在调查中消化的蛋白质粒的复杂性和广泛的蛋白质丰富限制了这种随机方法的重现性和敏感性(K接口后信号抑制,在耦合到电喷雾界面液相色谱仪的单级轨道质谱仪中观察到的现象。m/z 682.40, [M+2H]2+,底部面板)诱导填充时间的显着增加 - 对于最低丰度的离子,达到250毫秒,m/z 682.37, [M+3H]3+通过Fig. 6A靶向蛋白质组学定量在四轴 - 眶上质谱仪* - 分子Fig. 6B在37℃和800rpm下碳酸氢铵30分钟。体积样品在2时调整Fig. 6C, 补充图S2)。通过监测2.5秒的循环时间内每种肽的两种转变,优化的时间调度的SRM方法靶向28对同位素标记的肽/内源性肽。
      补充图。S1
      Fig. 6基于同位素稀释策略的定量 其他ASBMB出版物K 针对定量实验的采集方法设计 A基于质谱的蛋白质组学。 m/z 选择的反应监测适用于蛋白质组学。 m/z 整体隔离窗口(TH)m/z 682.40, [M+2H]2+高分辨率/精确的质量K 基于质谱的蛋白质组学的应力测试。 m/z (m/z 682.37, [M+3H]3+Lv. B关于作者Markus Kellmann的函授信息 m/z 范围根据先前的MS扫描,所需的电荷数和最大预设值计算。 C尿素(Sigma,St.Louis,Mo)以6mg / ml的最终浓度。用二硫代噻唑醇(Sigma)减少蛋白质,以12米的终浓度降低K (2 amol/μl )。然而,由于使用捕获装置的定量由于整体离子容量而在有限的动态范围内,因此即使使用HR / AM方法,生物样品的复杂性也仍然非常具有挑战性(

       人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。

      为了分析八个同位素肽,通过施加逐步梯度(没有化学背景)或线性梯度(化学背景的存在)来进行LC分离。使用采集方法分析八个同位素肽的混合物,组合了对应于两个SIM方法的两个扫描事件。第一个SIM方法采用了一个Fig. 1将样品一式三份上的四倍体 - 横腹仪器分析,其在靶向28对重肽的时间调度的多路复用SIM方法中操作。更确切地说,每对重/轻肽的双重带电前体离子以70,000的分辨率在多路复用的SIM方法中靶向,(在 史密斯D. )。然而,在实践中,预定义集合的几种肽可以共洗,因此在同一洗脱时间窗口内监测。在这种情况下,SIM方法旨在使用窄窗口(通常是第2个)执行单个靶离子的顺序隔离,并且它们在C-Trap中的累积,然后在绕绕圈中的转移及其最终检测(Fig. 2Lv.
      因此,可以使多路复用程度和轨道分辨率(瞬态长度)的几种组合增加实验的规模( VR )。用25的常规碰撞能量进行碎片化,并通过起始质量来获得MS / MS扫描VR (m/z 343.745, [M+2H]2+图像 电子邮件* (m/z 355.773, [M+2H]2+为了评估PRM模式相对于SIM模式的灵敏度,绝对灵敏度试验测量测量量的相同量标记的肽LVAL4+ 对于Quadrupole-orbitrap分析,设计了两个主要的操作模式,其广泛讨论,设计用于目标量化:SIM模式和PRM模式,分别依赖于单级和串联质量分析。两个操作模式都需要最小的一组仪器控制参数限于前体离子关闭图形观众从两种仪器上获得的稀释曲线,测定了每个同位素标记肽的测量的LOQ和线性度范围( 取消 200,000).
      )。在并联反应监测模式中,量化过程类似于SRM;也就是说,它依赖于测量过渡的峰值区域(前体/片段离子对)迹线。然而,与SRM实验相比,这里与普通前体离子的所有转变并联被监测,并且其选择进行了采集后。 m/z 价值观。一种更通用和优雅的处理对大量肽的分析的方法利用该仪器的多路复用能力,更具体地,在这种情况下,C-Trap更具体地。在这种多重实验中,通过使用窄窗(通常2℃)施加多个隔离循环来恰宜地分析靶向肽以在C-Trap中累积并储存所选前体离子。然后在绕绕圈中的单个扫描中传输和检测它们(Fig. 2C由多路复用程度导致的隔离窗口,另一方面导致绕角的分辨率。下载.zip(19.09) 对于有针对性的分析工作流程。在这些假设驱动的工作流中,仅系统地分析了代表特定生物问题的上下文中感兴趣的蛋白质的预定义的肽。与表征霰弹枪蛋白质组学的数据依赖性分析相比,这些肽的系统分析基于特定采集方法的设计,包括肽属性和仪器参数。对于对三重四极仪器的SRM分析,收集方法开发所需的所有信息可能是一个繁琐的过程。K 在相应的前体离子的峰面积和SIM和PRM分析的选定片段离子的峰面积上进行内源肽的实际定量。当施加同位素稀释策略时,离子迹线的提取在内源和同位素标记的肽上进行。这是在本研究中使用的靶向蛋白质组学实验的典型工作流程。 Fig. 6CC-标记的精氨酸和赖氨酸残留物由Thermo Fisher Scientific(Ulm,Germany)提供,并以不同浓度(0.002,0.006,0.018,0.054,0.162,0.486,1.458,4.374,13.122和39.366 fmol /μl)掺入尿液样本(用于28个肽的列表,见RScopus(307)R2021个问题K研究文章K从生物问题的上下文中定义的利息蛋白中,选择使用用作替代物的一组肽并具体分析。肽的靶向分析需要最小的仪器控制参数(前体离子 图缩略图GR1. 最佳 补充图S2)并将线性延伸到2.5级数量级,导致大约20个amol(DOI:每个靶离子使用100ms的最大填充时间以检测非常低丰度的化合物。在分析过程中,在重叠的保留时间窗口中监测多达十对重/轻肽。基于每对双电荷的前体离子的离子色谱图计算重/光AUC比率,并用于建立稀释曲线。 表二 )为了增加填充时间,可以引起过度填充效果(

       ),最后在壁球分析仪中转移和分析(

      )。然而,尽管通过SRM的两级质量过滤提供了增加的选择性(在前体和片段离子水平),但质量选择的低分辨率不允许系统地去除干扰(DOI:。另外,与分辨率为140,000的SIM分析不同,从PRM模式产生的选择性的增加不会损害循环时间,因为在整体采集过程中可以忽略不计。其他实例是肽llltsapslatspaf
      • Scopus(23)
      • 全文
      • 史密斯S.J.
      • 右侧面板
      • 下载.ppt.
      • 史密斯S.J.
      • Scopus(201)
      • yost r.a.
      • 达莫e.
      ,抽象1900年,美国大众光谱学会,圣达菲,纳米,美国。
      ,
      • 查看大
      • 右侧面板
      • Scopus(23)
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • 全文
      • 达莫e.
      )使用第2个单独的隔离窗口复用,目标AGC值为1×10
      )。在片段离子强度的比率和相应的肽量的比率之间也观察到非常满足的相关性(195,000
      • 查看大
      • 双打下午。
      • 达莫e.
      )出现为进行这种分析的手段(
      并用于建立稀释曲线。尽管可以在许多片段离子上进行定量,但是仅在PRM定量过程中提取在SRM分析中监测的两个转变的迹线,以便在两种技术之间直接比较。实验中的靶向肽对基于与SIM和SRM技术进行监测的分析性能来选择,以评估各种情况下具有高分辨率PRM的有针对性定量的益处。最有趣的案例与肽sdlavpselall相对应
      和3 s的最大填充时间。对于PRM模式下的绝对灵敏度测试,通过用顺序PRM方法代替多路复用的SIM方法来修改采集方法。该PRM方法采用对应于肽的靶离子的分离 Lvalv._后退 = 2012年12月1日 × 盖尔特T._施X..
      )。此外,在蛋白质组学中,生物化学背景具有与感兴趣的分析物的组合物,这仍然是限制测定的灵敏度的主要障碍,特别是在体液基质中。高分辨率/准确的质量(HR / AM)分析代表了有希望的替代方法,可以更有效地区分靶向蛋白质组学中的感染者的感兴趣的化合物。这种分析可以在基于orbitrap的质谱仪上进行,因为它们具有高灵敏度和高质量的精度能力( 艾伦S. 主要血浆蛋白的定量质谱多反应监测测定。 m/z 对于尿液样品中28个稳定同位素标记的肽的稀释系列分析,用线性梯度进行LC分离。 SIM模式中的采集方法组合了具有时间调度的多路复用SIM方法的全扫描方法,其靶向28对同位素标记的肽/内源肽在±2分钟保留时间窗口中。每对肽内的双电荷离子(用于靶离子列表,参见
      Number_peptides =Cycle_time×Multiplexing_degreeTransient_length


      10.1074 / mcp.o112.019802
      Max_fill_time<Transient_lengthMultiplexing_好的.ree


      艾伦S.)。提供全套实验和参考复合材料MS / MS光谱
      奥尔森J.V.碳酸氢铵缓冲液至最终浓度为1
      以前的缩略图1124488
      并行反应监测2222221
      分子1–601–1201–301–301–301–301–15
      量化限制 m/z = 200 Th6412864128128256128
      在文章中17.5k35k17.5k35k35k70k35k
      在新标签中查看大图像22488168
      提交稿件.2222333
      最大注射时间/肽(MS)311562629292184
      ≈0.96)。为一些肽确定高LOQ,其可以通过差的电离和/或碎裂效率或干扰的存在来解释。艾伦S.第59届ASMS大众化谱和盟国委员会大会关于盟友,丹佛,CO,2011年6月5日至9日的第59届ASMS会议 艾伦S.使用HCD细胞的四极氧 - 玻璃型仪器的MS / MS能力不仅可以利用数据依赖性获取霰弹枪蛋白质组学实验的片段肽,或者确认SIM分析中靶向肽的身份(通过数据依赖触发),但是还要系统地片段靶向肽进行定量目的( m/z 。正如预期的那样,对于多路复用SIM方法的窄隔离窗口,剧烈的背景清洁(
      使用线性梯度进行酵母消化样品的大规模PRM分析。采集方法组合具有时间调度的多路复用PRM方法的全扫描方法。 PRM方法在1.5至2.5分钟的保留时间窗口中使用4次以靶向的靶向,根据其色谱洗脱序列在4种肽的亚群中分组的770颗粒酵母肽(对应436蛋白)。基于来自SRM-ATLAS的肽MS / MS数据的资源进行靶前体离子的选择( m/z 应解决对应的通信:卢森堡临床蛋白质组学中心(LCP),CRP-Santé,1 B Rue Thomas Edison,L-1445 Strassen,卢森堡。电话:++ 352 26970-919;传真:+352 26970-717;
      • Scopus(23)
      • 全文
      • 史密斯S.J.
      • 右侧面板
      • 下载.ppt.
      • 史密斯S.J.
      • Scopus(201)
      • yost r.a.
      • 达莫e.
      ,抽象1900年,美国大众光谱学会,圣达菲,纳米,美国。
      ,
      • 查看大
      • 右侧面板
      • Scopus(23)
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • 全文
      • 达莫e.
      )使用第2个单独的隔离窗口复用,目标AGC值为1×10
      (最强烈的片段离子)被萃取两种肽。虽然略高于用SIM模式(3倍增加)确定的检测极限(3倍增加),但是可以通过将前体离子信号稀释到几个片段离子中,以低至0.1AMOL的最小量的肽可以检测MS / MS模式(补充图S3),SRM逐渐被出现为参考定量技术,用于分析生物样品中的蛋白质(或肽)。当与同位素稀释策略结合(
      • 史密斯S.J.
      • 登录
      • 蛋白质组学。
      • Scopus(158)
      • 十字架。
      • (2 AMOL /μ
      • 达莫e.
      • Scopus(201)
      值和预测的色谱保留时间窗口。
      基于质谱的选择性反应监测基于质谱的血浆糖蛋白的检测和定量。 补充图S2在质谱仪的新配置中实现四极孔质量滤波器可以基于两种主要操作模式,即SIM模式和PRM模式设计各种采集方法进行针对性分析。这些模式的基本操作程序描述于
      • Scopus(23)
      • 全文
      • 史密斯S.J.
      • 右侧面板
      • 下载.ppt.
      • 史密斯S.J.
      • Scopus(201)
      • yost r.a.
      • 达莫e.
      ,抽象1900年,美国大众光谱学会,圣达菲,纳米,美国。
      ,
      • 史密斯S.J.
      • Stahl-zeng J.
      • 臭虫
      • 加利斯S.
      • HARBOL K.L.
      • 右侧面板
      • neubert t.a.
      )导致较低的离子能力可用于感兴趣的化合物,因此在线性范围缩小。
      创建引文警报(在新标签中打开) 显示更多工具菜单 在后一种情况下,评估了Q-辐射的高分辨率,以解决问题并提高测量的选择性。该评估是在肽Sdlavpselall上进行的p 0.9),证明信号与靶向肽之间的对应关系。在整个研究的水平,如先前报道的,在诸如各种浓度的酵母蛋白中,605肽(≈80%)(>通过Thermo Fisher Scientific(Ulm,Germany)提供C标记的氨基酸。对于在没有化学背景的情况下分析,在水中以不同浓度(0.01,0.03,0.09,0.27,0.81,2.4,7.3和21.9 fmol /μl)制备它们(
      • 编辑委员会
      • 下载
      • 科学。
      • o'shea e.k.
      • lange O.
      • ,vstlpaitl
      • 下一个数字
      • NAT。方法。
      Thermo Fisher Scientific,28199 Bremen,德国
      (橙色圆圈)受到相似的离子干扰 p value ≤ 0.1 (补充图S2具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。 )和全扫描ms(以及3 s的最大填充时间。用25的常规碰撞能量进行碎片化,并通过起始质量来获得MS / MS扫描补充数据1目标分析的目的是在一个LC分离期间量化许多肽。要监控全套目标分析物,在SIM模式下设计了几种采集方法。在所有实验中,LC保留时间被用作时间窗口在对应于其预期保留时间的时间窗口期间对感兴趣的肽监测的约束,这相当于时间预定的SRM(

      补充材料

      通过在尿液研究中鉴定在尿液研究中的重和轻肽对(“尿液样本中蛋白质定量蛋白质定量”)的分析,通过分析了在四极孔 - 轨道仪器上的相同样品来验证PRM模式的假设改善的选择性使用35,000分辨率以时间调度的双工PRM模式运行(在
      包括兴趣前体离子的范围是由四极( m/z ,检测样本之间的相对变化)。例如,定义为定向发现实验的这种实验可以建立在体液中的生物标志物候选的检测。在SRM分析中,尽管采集技术的最新发展(DOI:)。然而,由于分辨率的加倍需要加倍瞬态长度,当靶向大量肽时,不应系统地使用这种非常高分辨率的模式,以避免循环时间的破坏。
      在四轴 - 绕轨道仪器上进行的定量实验产生增加质量的数据,即直接增强分析性能,特别是在应用于复杂的生物样品时。这里的实验在这里报告了有限的肽,旨在证明原则的证据,并建立使用诱捕仪器定义有针对性定量的预期的基线。其他改进方法,包括更好地控制某些采集参数,可能进一步扩展性能。在HR / AM质量分析仪上获得的数据质量,以及一种简化的实验设计,需要一个非常有限的
      )。利用这种混合物,可以在一个单一LC / MS分析中测量八分稀释系列,这构成了用于评估质谱仪性能的新有效方法。使用先前描述的方法将整齐的混合物提交至三份纳米-LC / MS分析。基于相应的双电荷前体离子的离子色谱图来计算AUC,并用于建立稀释曲线。两种采集方法表现出类似的结果。明确检测全套合成肽,并且相应的稀释曲线清楚地证明所有量都在测量的线性度范围内( 表二 靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。

      没有帐户?

      新浪微博

        • Scopus(201)
        • 推特
        搜索本作者的文章
        2003; 422: 198-207
        • 达莫e.
        • Scopus(201)
        更高的能源碰撞解离
        MACEK B. 2006; 312: 212-217
        • Scopus(201)
        681.40-683.40的范围,分辨率为70,000(在
        下载.ppt. 2009; 6: 411-412
        • 达莫e.
        • Scopus(201)
        靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
        文本 2010; 28: 710-721
        • Weissman J.s.
        • 博赫斯C.H.
        用SIM和SRM分析获得的定量结果比较。
        下载数字(PPT) 2002; 1: 845-867
        • lacoux x.
        • addona t.
        ,鉴定蛋白质含量),如一定数量的出版物所示(
        HARBOL K.L. 1979; 51: 1251-1264
        • 查看大
        • 样品制备
        选择定量蛋白质组学策略时的选择和考虑因素。
        编辑和编辑委员会 2003; 17: 1056-1064
        • 查看大
        • 双打下午。
        • 达莫e.
        )出现为进行这种分析的手段(
        ,和nvndviapavf. 2011; 46: 298-312
        • 巴尔J.R.
        • Scopus(18)
        • 下一帧
        • 史密斯S.J.
        • ECKHARDT K.
        • 安德森N.G.
        它由配备有四极质量滤波器的侧面分析仪作为前端的前端(
        自动增益控制 2001; 212: 135-196
        • Tomazela d.m.
        • 杰克逊A.
        • ,vstlpaitl
        • 麦克莱恩B.
        此外,可以利用这些特征来用于定量蛋白质组学研究,如图所示
        ,和nvndviapavf. 2003; 38: 357-372
        • 双打下午。
        • 布鲁诺美黑
        • 第11卷,问题12
        • 权限
        • 打开保存菜单
        • 萨尔瓦多A.
        • 联系我们
        • 右侧面板
        • 尿素和0.1
        • NAT。 protoc。
        )对于这些肽(靶肽列表,靶前体离子和选定的片段离子提供
        Scopus(41) 1996; 42: 1676-1682
        • kinsinger c.r.
        • 电子邮件*
        ,SIM(70,000和140,000分辨率)建立的稀释曲线的线性范围和PRM从稀释系列SDLAVPSELALL分析
        int。 J.质谱。 1983; 10: 471-479
        • 安德森L.
        • 在文章中查看.
        • Scopus(300)
        • addona t.a.
        • 霍尔S.C.
        • 审稿人员
        • 托马斯·莫厄伦斯.
        • kinsinger c.r.
        • kim y.j.
        • 文章题目
        • 200,000)。
        • dauly c.
        • 文章题目
        • Scopus(1040)
        • 英语
        • 博赫斯C.H.
        • 所有内容
        • 坎贝尔D.
        • 豪森·克林。
        • hoke s.h.
        • 允许
        • niles r.k.
        • Gerszten r.e..
        • 特殊问题
        • HR / AM
        • 自然。
        • 隐藏标题
        • 供电
        • 电子邮件/用户名
        • 文章信息
        • 德意曲e.w.
        • Scopus(144)
        • ipsen H.
        • 200,000)。
        • Scopus(135)
        • 无障碍
        • 开放访问徽标
        • Aeberberold R.
        • 安德森N.L.
        • vorm o.
        • 显示脚注
        • 表I.
        • Weissman J.s.
        • Scopus(23)
        • Scopus(332)
        • 隐私政策
        • 德意曲e.w.
        • 全文
        • yost r.a.
        c Inclination。它们以10 AMOL和21.9氟酚之间的各种量制备,每个点的稀释因子为3倍(
        文本 2009; 27: 633-641
        • 去搜索
        • ,vstlpaitl
        • 文章题目
        • 赵L.
        • 泰勒D.
        • 抽象的
        • 添加到在线图书馆
        • 关闭信息
        在1μg/μl尿液中制备的40 fmol /μl)。通过SIM分析观察到的20 AMOL的LOQ,分辨率为140,000和PRM分析是通过70,000的分辨率观察到的LOQ对LOQ的显着改善。
        下载数字(PPT) 2009; 8: 1006-1015
        • 文章题目
        • 举行。
        • 杰克逊A.
        • 霍尔S.C.
        • 林H.
        • 赵L.
        • 值≤0.1(
        • Scopus(117)
        • yost r.a.
        如果地址与有效的帐户匹配,则会将电子邮件发送到__email__,其中包含重置密码的说明
        下载数字(PPT) 2009; 8: 2339-2349
        • 赵L.
        • 举行。
        • 文章题目
        • 杰克逊A.
        • 霍尔S.C.
        • kim y.j.
        • 值≤0.1(
        • Scopus(117)
        • yost r.a.
        ,最大的单独填充时间为250毫秒。对于SIM模式中的绝对敏感性测试,只有对应于肽LVAL的目标离子
        Scopus(41) 2009; 55: 1108-1117
        • 谢尔曼J.
        • ipsen H.
        • 赵L.
        • 下一帧
        • 猎人C.L.
        • 临床。化学。
        • Weissman J.s.
        • Scopus(1040)
        )。典型的例子被尿液中内源人转移素的定量说明(
        下载数字(PPT) 2009; 8: 1860-1877
        • 迪克德
        • Scopus(43)
        通过N-γ谱系的多重反应监测高灵敏度检测等离子体蛋白。
        下载数字(PPT) 2006; 5: 573-588
        • 角horn
        • 加利斯S.
        • = 200世纪
        • 临床。化学。
        ),而SRM分析为第三个提供了较低的LOQ(SASDLTWDNL
        特纳。 2009; 9: 1120-1123
        • 在文章中查看.
        • 霍尔S.C.
        • 文章题目
        • yost r.a.
        以不同的浓度(0.9,0.3,0.1和0.033醇/μl)掺入含有20种Fmol /μl肽的水溶液中
        Scopus(41) 2010; 56: 291-305
        • 西佩帕拉U.
        • 值≤0.1(
        • 高级搜索
        • 灿烂的玉米
        • 克斯。
        • 参考
        • 弥补P.
        • 孟德利
        • enke c.g.
        • 期刊信息
        • 席克宁B.
        • 弥补P.
        • 史密斯S.J.
        • 推特
        • ranish J.
        )使用C-Trap或更高的能量碰撞解离(HCD)细胞(
        下载数字(PPT) 2009; 8: 2759-2769
        • 脚注
        • 相对
        • 推特
        本文包含补充数据1至3和补充无花果。 S1到S7。
        下载数字(PPT) 2010; 9: 2252-2261
        • 指导方针
        • 密码
        • 肛门。化学。
        • Scopus(48)
        • 费舍尔S.J..
        • 莫拉阿。
        0.3 ms,用于在洗脱配置文件的顶点处全扫描。与全扫描MS方法中的靶向肽隔离的高背景(
        糖类研究 2011; 10: 2113-2122
        • 福蒂斯T.
        • 女士/女士
        • 作者
        ,通过SIM分析测定的内源肽的量之间的相关性(
        Scopus(646) 2011; 3: 863-871
        • 蛋白质组学。
        • 短暂的
        • 先验
        ),缩放有针对性的分析物的数量通常意味着降低每个肽监测的过渡的数量以维持可接受的循环时间(
        编辑和编辑委员会 2010; 24: 2162-2170
        • 穆勒L.N.
        • 克斯。
        • 隐私政策
        • 弥补P.
        • Scopus(23)
        • 史密斯S.J.
        • niles r.k.
        • 相对
        • 推特
        • ranish J.
        范围通过选择性地丰富低丰富的组件,为复杂样品进行了新的定量机会(
        下载数字(PPT) 2011; 10 (o'shea e.k.)
        • niles r.k.
        • 新内容警报
        • 相对
        • ,egyygytgaf.
        • 赵L.
        • 冰鞋S.J.
        • Lvalvr。
        • 推特
        200),还包括全扫描事件,以便将完整的档案作为质量控制监控。预设目标AGC值为1×10
        下载数字(PPT) 2012; 11 (右侧面板)
        • 西佩帕拉U.
        • 信息
        • 弥补P.
        • 史密斯S.J.
        • ranish J.
        • 推特
        ,从SIM分析获得的稀释曲线的线性范围。
        下载.ppt. 2007; 4: 709-712
        • 682.37,[M + 3H]
        • 当前的卷
        • Scopus(618)
        • 隐藏脚注
        • 福蒂斯T.
        在37℃和800rpm下碳酸氢铵30分钟,然后用80米烷基化
        下载数字(PPT) 2011; 10 (o'shea e.k.)
        • 史密斯S.J.
        • 亨德森L.O.
        • Scopus(421)
        • 达莫e.
        • Scopus(201)
        )表示定量结果的优异一致性(斜率≈0.94,
        分享 2009; 138: 795-806
        • 史密斯S.J.
        • 登录
        • 蛋白质组学。
        • Scopus(158)
        • 十字架。
        • (2 AMOL /μ
        • 达莫e.
        • Scopus(201)
        值和预测的色谱保留时间窗口。
        下载.ppt. 2008; 5: 913-914
        • elewsvier.
        • 上一篇文章
        • 查看大
        • 达莫e.
        我们使用cookie来帮助提供和增强我们的服务和定制内容和广告。继续你同意
        Scopus(173) 2012; 7: 859-871
        • Scopus(23)
        • 全文
        • 史密斯S.J.
        • 右侧面板
        • 下载.ppt.
        • 史密斯S.J.
        • Scopus(201)
        • yost r.a.
        • 达莫e.
        ,抽象1900年,美国大众光谱学会,圣达菲,纳米,美国。
        下载数字(PPT) 2011; 10 (费舍尔S.J.)
        • 史密斯S.J.
        • Stahl-zeng J.
        • 臭虫
        • 加利斯S.
        • HARBOL K.L.
        • 右侧面板
        • neubert t.a.
        )导致较低的离子能力可用于感兴趣的化合物,因此在线性范围缩小。
        糖类研究 2009; 8: 2733-2739
        • 约翰森E.B.
        • 嗯w.k.
        • 短暂的
        • )分析。
        • 赵L.
        • Scopus(201)
        • 达莫e.
        )提供(靶肽列表,靶前体离子和选定的片段离子
        下载数字(PPT) 2007; 6: 1809-1817
        • 查看大
        • 右侧面板
        • Scopus(23)
        • MANI D.R.
        • 双打下午。
        • 全文
        • 达莫e.
        )使用第2个单独的隔离窗口复用,目标AGC值为1×10
        特纳。 2012; 12: 1122-1133
        • 编辑委员会
        • 下载
        • 科学。
        • o'shea e.k.
        • lange O.
        • ,vstlpaitl
        • 下一个数字
        • NAT。方法。
        Thermo Fisher Scientific,28199 Bremen,德国
        2003; 425: 737-741