生物学和药物中的靶向肽测量:使用适合用途方法*的质谱基基测定显影的最佳实践*

      采用有针对性的质谱(MS)方法,如多重反应监测(MRM)研究生物学和生物医学问题在蛋白质组学群落中很好。成功的应用取决于产生唯一和自信地鉴定样品中靶肽的可靠测定的能力。不幸的是,有广泛的标准被应用于成功开发了测定。没有关于可接受标准的标准,并且对变量标准对产生的结果质量的影响很少了解的征用。描述肽的靶向MS测定的出版物通常不包含读者的足够信息,以便建立信心,即测试按预期的测试工作或能够应用自己的实验室中描述的测试。必须制定指导,以便在全球许多实验室被广泛分布和应用具有既定性能的有针对性的MS测定。要开始解决问题及其解决方案,讲习班在国家卫生研究院举行,与发展和雇用有针对性的MS测定的代表。与会者讨论了他们的实验的分析目标以及确定他们按预期制定工作的分析所需的实验证据,并正在实现所需的绩效水平。使用这种“适合目的”
      针对性质谱(MS)方法具有巨大的承诺,对生物学家和生物医学研究人员感兴趣的蛋白质,肽和改性肽水平的特异性,可重复和定量测量的变化(
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      靶心谱法测量生物医学中肽和蛋白质的定量分析。
      ,
      • Picotti P.
      • Aeberberold R.
      基于反应监测的蛋白质组学:工作流,潜在,陷阱和未来方向。
      ,
      • grebe s.k.g.
      • singh r.j.j.
      LC-MS / MS在临床实验室 - 从这里到哪里?临床。
      和其中引用)。采用针对性MS研究生物学和临床问题在生物医学群体中,假设使用目标MS方法的测量是可靠的,即它们特别识别和量化样品中靶向的分析物。在蛋白质组学领域,伞术语如“多反应监测”,“选定的反应监测”(MRM
      使用的缩写是:
      MRM.
      多重反应监测
      SRM.
      选定的反应监测
      l
      检测限制
      LOQ.
      量化限制
      lloq.
      降低量化限制。
      1使用的缩写是: MRM.
      多重反应监测
      SRM.
      选定的反应监测
      l
      检测限制
      LOQ.
      量化限制
      lloq.
      降低量化限制。
      和srm分别;术语互换使用),“绝对量化”和“目标MS”可以传达出的错误消息,即关于正在检测到的内容以及存在多少结果,结果是毫无疑问的。这肯定不是真的,并且取决于测量已经过分析验证的程度。
      目前最广泛使用的目标MS方法是MRM(
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      靶心谱法测量生物医学中肽和蛋白质的定量分析。
      ,
      • Picotti P.
      • Aeberberold R.
      基于反应监测的蛋白质组学:工作流,潜在,陷阱和未来方向。
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      • grebe s.k.g.
      • singh r.j.j.
      LC-MS / MS在临床实验室 - 从这里到哪里?临床。
      )。与发现全扫描MS / MS光谱的发现蛋白质组学实验不同,在MRM中仅监测三到五个片段离子,通常在三重四极杆MS系统上,临床和药物代谢实验室中最广泛的MS仪器。被监测的片段离子通常是最丰富而不是最序列信息的人;结果,MRM数据中几乎没有序列信息。此外,在血浆,组织或细胞裂解物等血浆,组织或细胞裂解物中,具有相同或相似的前体质量与电荷比的肽( 例如 ±1.5 in. m/z)对感兴趣的分析物可以产生许多,有时所有的三到五个片段离子对特定分析物监测,导致误报。因此,必须使用其他信息来增加目标MS实验中对分配和定量的置信度。
      与小分子,药物和代谢物的基于MS的测定发育的长而发达的历史相反(
      • grebe s.k.g.
      • singh r.j.j.
      LC-MS / MS在临床实验室 - 从这里到哪里?临床。
      ,
      • 劳森上午
      临床化学质谱范围。
      ,
      • 帕森斯H.G.
      稳定同位素在制造和诊断新陈代谢误差的管理和诊断中。
      ,
      • Brumley W.C.
      • Sphon J.A.
      调节质谱。
      ,
      • Sphon J.A.
      用质谱法用来确认动物残留物。
      ,
      • 变形J.D.
      用LC / MS / MS在地下水中测定氯乙酰胺和氯乙酰胺除去氯乙酰胺除草剂的测定。
      ,
      • Kuhara T.
      非侵入性人代谢分析,用于鉴别诊断原创性误差的新陈代谢。
      ,
      • 皮特J.J.
      • Eggington M.
      • 卡勒斯特。
      通过电喷雾串联质谱法综合筛查从原始代谢的原始误差尿液样本。
      ),关于对肽和蛋白质测定发育确定的绩效标准至关重要的共识尚未实现。这导致了一系列问题,继续困扰临床和生物学研究的可靠蛋白质组学测定的发展。例如,目前,蛋白质组学群落中应用了广泛的标准,以证明已经成功开发了测定,并且在可信地检测到感兴趣的分析并变化可靠量化。蛋白质组学科学家只能慢慢实施目标,定量测定发展的实践,这些分子群落已经学习和采用了(
      • Timmerman P.
      • Anders Kall M.
      • 戈登B.
      • Laakso S.
      • Freisleben A.
      • 哎呀
      代谢物量化的分层方法的最佳实践:欧洲生物分析论坛的意见和建议。
      ,
      • Timmerman P.
      • 徘徊c.
      • Stoellner D.
      • Jaitner B.
      • PIHL S.
      • Elsby K.
      • 亨德森N.
      • Barroso B.
      • Fischmann S.
      • 公司A.
      • Versteilen A.
      • 贝茨S.
      • Kingsley C.
      • kunz u.
      欧洲生物分析论坛关于方法建立与生物分析的生物标志物支持药物开发。
      ,
      • Timmerman P.
      • Lausecker B.
      • 巴东B.
      • 范阿姆斯特丹P.
      • Luedtke S.
      • Dijksman J.
      '大遇见小':用LC-MS(/ MS)连接肽和蛋白质生物分析的生物分析界。
      )。同样令人不安的是,在没有清楚和完整的分析方法或测定性能的情况下出版目标 - MS文件,或者审阅者和读者难以确信测试所描述的测试的测试工作困难在他们自己的实验室中,期望可以实现类似的结果。因此,我们断言强势,共识指导必须制定解决质量检测的发展,如果有针对性的蛋白质组学将产生影响,我们都希望它拥有,提供准确,可靠的已知性能指标的测定,可以广泛分布和应用许多全世界的实验室。
      首次讲话,讲习班在2013年6月18日和19日举行的问题上,在国家癌症研究所(CPTAC - 临床蛋白质组态肿瘤分析联盟)和国家心脏,肺和国家的主持下血液研究所(蛋白质组学中心)。存在来自多个社区和雇用有针对性的测定的代表,包括 体外 诊断公司,临床实验室,实验室专门从事候选生物标志物核查和生物学实验室的定量测定开发。邀请了在应用针对性的小分子的定量测量的拟目标MS方法中具有长经验的调查员审查了MRM以小分子量化的数十年的实践和应用,为原则提供了同样适用于蛋白质组学应用的基础讨论。
      要求发言者和参与者通过确定他们的实验的分析目标来使用“适合目的”方法,然后描述成功所需的性能特征(
      • 汤普森米
      • Ramsey M.H.
      质量概念和做法适用于抽样 - 探索性研究。
      ,
      • 贝瑟姆R.
      • Boyd R.K.
      痕量分析中的质谱。
      ,
      • 贝瑟姆R.
      • Boison J.
      • 大风J.
      • Heller D.
      • Lehotay S.
      • LOO J.
      • 梅耶斯。
      • 价格P.
      • 斯坦斯。
      建立质谱法的适用性。
      ,
      • 李约。
      • Devanarayan V.
      • 巴雷特Y.C.
      • Weiner R.
      • Allinson J.
      • 喷泉S.
      • 凯勒斯。
      • Weinryb I.
      • 绿色m.
      • 段L.
      • 罗杰斯J.A.
      • Millham R.
      • o'brien p.j.
      • Sailstad J.
      • 汗M.
      • 射线C.
      • 瓦格纳J.A.
      成功生物标志物测量的适应性方法开发与验证。
      ,
      • 李约。
      • FIGEYS D.
      • vasilescu J.
      生物标志物测定从发现到癌症药物开发临床研究的翻译:出现蛋白质生物标志物的定量。
      ,
      • 卡明j.
      • Raynaud F.
      • 琼斯L.
      • 糖r.
      • 潜水C.
      代表ECMC的生物分析和质量保证(BAQA)组
      抗癌药物临床试验中临床试验的适应性生物标志物方法验证。
      )。根据测量的目标,下一步试图识别实验证据( IE。 所需的“分析验证”步骤所需的“分析验证”步骤如预期工作,并正在实现所需的性能水平(包括测试的可重复性,重复性,检测性,分析特异性等程度)。有助于分析目标MS结果的计算和统计工具,包括产生响应/校准曲线,测定检测和定量限制(分别分别为LOQ)。该过程导致了下面详细描述的测定/测量的三个“层”的识别。
      还被要求参与者确定提交人需要在手稿中提供的信息,以使审阅者和读者能够清楚地了解所进行的程序,并评估报告的肽或蛋白质定量测量的可靠性。我们提出了以下这些建议的摘要。作为研讨会的后续和本报告, 分子和细胞蛋白质组学 打算为描述和/或应用有针对性的MS方法的论文的作者制定指导方针。在2004年之前,需要建立作者指引的指导方针在2004年之前与缺乏明确结果的可靠性有关的类似问题,促使期刊 分子和细胞蛋白质组学 开发和采用第一套使用质谱法发布肽和蛋白质识别数据的指南(
      • carr s.a.
      • Aeberberold R.
      • Baldwin M.
      • 伯灵名A.
      • 克劳瑟K.
      • Nesvizhski A.
      肽和蛋白质鉴定数据的出版指南的需要。
      )。这些指南,在过去几年中一再修改和更新(
      • Bradshaw R.A.
      • 伯灵名A.L.
      • 卡车。
      • Aeberberold R.
      报告蛋白质识别数据:下一代指南。
      ,
      • Chalkley R.J.
      • 克劳瑟K.R.
      • carr s.a.
      更新 MCP. 蛋白质组学出版指南。
      , ),已被其他蛋白质组学期刊全部或部分地拥抱。然后,目标是,正如现在,就是尝试确保可靠,高质量的数据和结果正在进入蛋白质组学文献。

      目标MS测量的三层

      该组基于测量的预期目的确定了三层目标MS测定/测量(“适合目的”概念),然后工作以定义每个层所需的分析验证程度(表I.)。发言者,演示文稿和讨论组列表可用 补充材料.
      表I.三层有针对性的MS测量;每个层都列出了实验设计参数和测定特征
      表缩略图GR1.

      Tier 1

      华盛顿大学和罗素·格兰特大学安迪·霍菲纳格尔(Russell Grant),美国实验室公司围绕Tier 1.开发和应用三层测定的目标是(1)为医生或(2)提供准确,精确,临床可行的信息。(2)在人类使用的毒品开发中提供决策。在药物应用中,目标包括定量由治疗剂靶向的蛋白质,在临床前和概念研究的临床前和证明中评估目标接合(自由,复合,总计),以及测量的机械,蛋白质生物标志物,近端的目标/用于检查的行动部位药效学。根据测定数据的使用,这些测试可能需要满足1988年(CLIA),美国食品和药物管理局(FDA)或欧洲药物局(EMA)的临床实验室改善修正案的要求(例如, , 看

      行业指导:生物分析方法验证。 (2001年)美国FDA卫生和人类服务部,美国FDA,罗克维尔,MD,U.S.A.(2013年9月1日,2013年9月1日)

      ,
      )。来自这些机构和认证组织的指导,以及来自临床和实验室标准研究所的组织(http://www.clsi.org)继续发展并被澄清,特别是对于蛋白质分析的新方法,如靶向MS。这些变更和澄清是通过制药,诊断公司和监管机构之间的对话和互动,当时甚至间接地对患者的照顾(例如,见
      desilva.
      白皮书关于生物分析的最近问题和多种指南的对齐。
      )。目标是提供完整的高质量数据,以进行监管目的。
      使用稳定的同位素标记的内标在有针对性的MS实验中提供了最高水平的检测置信度和测量精度(
      desilva.
      白皮书关于生物分析的最近问题和多种指南的对齐。
      ,
      • 巴尔J.R.
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      • Cooper G.R.
      • 亨德森L.O.
      • 特纳。
      • 等等。
      同位素稀释质谱定量特定蛋白质:用载脂蛋白A-1的模型施用。
      ,
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • Kuhn E.
      • carr s.a.
      靶标质谱法对等离子体低丰度蛋白的定量,多重测定和稳定同位素稀释。
      ,
      • 伯纳米司。
      • OTT L.
      • 恩格尔S.
      • 沃森D.
      • 塞尔P.
      • Ackermann B.
      使用免疫沉淀和LC / MS / MS的大鼠血清中NTPROBNP的定量:药物诱导的心脏肥厚的生物标志物。
      ,
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • Spiegelman C.H.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.L.
      • Keshishian H.
      • 霍尔S.C.
      • 艾伦S.
      • 黑人r.k.
      • 博赫斯C.H.
      • 降低C.
      • Cardasis H.L.
      • Cusack M.P.
      • 迪克德
      • 吉布森B.W.
      • 举行。
      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
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      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
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      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
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      基于肽亲和基于质谱法的大规模定量蛋白质组学测定发育的评价。
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      • 太阳X.
      • 赵立
      • 什叶派A.A.
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      • 吴S.
      • kim J.s.
      • 琼斯N.
      • 摩尔r.j.
      • PASA-TOLIC L.
      • 卡根J.
      • 罗德兰K.D.
      • 刘涛。
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      • 营地D.G.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      无抗体的靶向质谱法,用于在人血浆/血清中毫米水平的低密度测量蛋白质的定量。
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      突变蛋白作为癌症特异性生物标志物。
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      • Keshishian H.
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      • 五个月。
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      整合血浆蛋白生物标志物的发现和验证的管道揭示了心血管疾病的候选标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
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      • Domanski D.
      • Percy A.J.
      • 杨杰。
      • 腔室A.G。
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      • Freue G.v.
      • 博赫斯C.H.
      基于MRM的人血浆中的67个推定心血管疾病生物标志物的多重定量。
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      • 潘S.
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      • 霍利斯。
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      多重靶向蛋白质组学测定血浆中的生物标志物检测:胰腺癌生物标志物案例研究。
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      • selevsek n。
      • 罗斯特H.
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      使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
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      血清和血浆中液相色谱 - 串联质谱法测量抗血清和血浆中抗血糖素自身抗体的测量。
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      序列蛋白质和肽免疫亲和力捕获全部人β神经生长因子的质谱法量化。
      )。采用小分子定量分析领域采用的这种方法称为稳定同位素稀释(
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      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
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      绝对定量蛋白质组学的同位素稀释策略。
      )。在第1层中,最佳实践将决定使用稳定的同位素标记的内部标准,用于每个目标分析物。标记的模拟蛋白也可用作内部标准,如果正确表征和验证。理想地包括内部标准以通过分析过程控制分析物的命运,这使得能够更精确的量化。测定精度可以受到样品处理的变化的强烈影响,尤其是所使用的酶消化条件(
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
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      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.L.
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      • 降低C.
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      • 吉布森B.W.
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      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
      • carr s.a.
      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
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      • kuzyk m.a.
      • 史密斯D.
      • 杨约。
      • 十字架。
      • 杰克逊上午
      • Hardie D.B.
      • 安德森N.L.
      • 博赫斯C.H.
      基于多重反应监测,多路复用,人血浆中45个蛋白的绝对定量。
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      • Shuford C.M.
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      • 蒋伏特。
      • Muddiman D.C.
      肽生产和衰减率影响蛋白质切割同位素稀释质谱(PC-IDMS)的定量精度。
      )。只有在可重复地执行这些条件时才可以获得良好的精度。通过测量来自标记的内标和内源肽中的一种或多种片段离子的峰面积比来得出的肽浓度。稳定的同位素标记的肽为它们(1)与靶向分析物中的施用(1)共洗脱,(2)片段为产生相应的,偏移肽骨架片段离子(3)具有(在没有干扰)片段离子作为内源肽的相同丰富,(4)补偿离子抑制和差的喷雾稳定性(
      • matuszewski b.k.
      • Constanzer M.L.
      • Chavez-eng C.M.
      生物流体定量LC / MS / MS分析中的基质效应:每毫升浓度小磷酸中的人血浆中三甾胺的方法。
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      • 国王R.
      • Bonfiglio R.
      • Fernandez-Metzler C.
      • 米勒 - 斯坦C.
      • olah t.
      电喷雾电离中电离抑制的机械研究。
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      • Abbatiello S.E.
      • MANI D.R.
      • Keshishian H.
      • carr s.a.
      通过多种监测质谱法自动检测肽定量测定中的不准确和不精确转变。
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      • 重新勒
      • rinner o.
      • Picotti P.
      • HüttenhainR.
      • 贝克米
      • Brusniak M.Y.
      • Hengartner M.O.
      • Aeberberold R.
      MPROPHET:用于大规模SRM实验的自动数据处理和统计验证。
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      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      )。离子抑制是由其他基质组分(脂质和其他小分子,肽,盐,盐等)引起的阴险的问题,其与电离的目的分析物共用并竞争。离子抑制导致从不同样品分析的相同量的分析物检测到的离子电流降低。理想地,内标具有与分析物的分析物和共溶液相同的结构,从而经历与分析物相同的基质诱导的抑制效果。因此,虽然因抑制而检测分析物和内标检测的敏感性(离子计数),但由于抑制而降低,但分析物与内部标记标准的比率(如果两者的信号均高于噪声)不受影响。这是一个关键点,因为定量基于使用已被证明没有干扰的前体 - 产品离子对(称为转变)的观察比的测量。虽然监测三个或更多的过渡是标准做法,但只需要使用一个过渡的过渡进行量化(提供它是无干扰的),而另一个被监测的离子用于确认身份并检测干扰。对于量化的所有受监控的转换也是可以接受的,所以没有具有显着的干扰,并且具有远高于噪声的信号。
      准确的量化通常是第1层测定的目标。用标记的胰蛋白酶肽标准的定量提供高测量精度,但不准确定量蛋白质,因为标准不考虑蛋白水解裂解效率的差异(取决于肽/蛋白质,并且通常远远小于100%),也不是这些标准受所有样品制备和清除步骤,因为衍生自蛋白质(
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • Spiegelman C.H.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.L.
      • Keshishian H.
      • 霍尔S.C.
      • 艾伦S.
      • 黑人r.k.
      • 博赫斯C.H.
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      • Cardasis H.L.
      • Cusack M.P.
      • 迪克德
      • 吉布森B.W.
      • 举行。
      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
      • carr s.a.
      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
      ,
      • rifai n。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      )。当样品加工开始时,可​​以在样品处理开始时添加标记的蛋白质或“延伸的肽”或“延伸的肽”或“翅膀”在胰蛋白酶肽分析物的N-和C Termini的天然侧翼序列中的翅膀序列的“翅膀肽”作为规范化的更强大的内部标准,更接近精确和准确的量化(
      • Neubert H.
      • Muirhead D.
      • Kabir M.
      • 格蕾丝C.
      • Cleton A.
      • arends r.
      序列蛋白质和肽免疫亲和力捕获全部人β神经生长因子的质谱法量化。
      ,
      • Shuford C.M.
      • Sederoff R.R.
      • 蒋伏特。
      • Muddiman D.C.
      肽生产和衰减率影响蛋白质切割同位素稀释质谱(PC-IDMS)的定量精度。
      ,
      • 布伦V.
      • Dupuis A.
      • Adrait A.
      • Marcellin M.
      • 托马斯D.
      • 法庭M.
      • Vandenesch F.
      • 加入J.
      同位素标记的蛋白质标准。
      ,
      • 辛格r.
      • 乌鸦F.W.
      • 孩儿N.
      • lutz w.h.
      • Lieske J.C.
      • Larson T.S.
      • Kumar R.
      一种液相色谱 - 质谱法,使用新型N-15-同位素标记的白蛋白内标进行尿白蛋白定量尿白蛋白。
      ,
      • Kito K.
      • ITO T.
      基于质谱的绝对定量蛋白质组学的基于质谱。
      ,
      • 皮卡德G.
      • 莱伯特D.
      • Louwagie M.
      • Adrait A.
      • Huillet C.
      • Vandenesch F.
      • Brululy C.
      • 加入J.
      • Jaquinod M.
      • 布伦V.
      PSAQ标准,用于准确基于MS的蛋白质量化:从概念到生物医学应用。
      )。然而,重要的是要注意使用甚至标记的重组蛋白标准的使用不能保证测量精度。建立测定的准确性需要相当大的工作,包括构建校准曲线和在接受的耐受性中的峰值恢复,其具有与样品中存在的天然蛋白分析物尽可能相同的蛋白质标准。必须证明替代蛋白对天然蛋白分析物的行为的等效蛋白质分析物的行为,以提供测定准确的信心。这些要求涉及该测定是否是基于MS的或常规免疫测定(
      • 李约。
      • Devanarayan V.
      • 巴雷特Y.C.
      • Weiner R.
      • Allinson J.
      • 喷泉S.
      • 凯勒斯。
      • Weinryb I.
      • 绿色m.
      • 段L.
      • 罗杰斯J.A.
      • Millham R.
      • o'brien p.j.
      • Sailstad J.
      • 汗M.
      • 射线C.
      • 瓦格纳J.A.
      成功生物标志物测量的适应性方法开发与验证。
      )。对于基于MS的测定,还需要使用均匀同位素标记的内标蛋白来控制消化和其他基质相关问题的可用性和使用。在许多情况下,如果不是大多数情况,由于缺乏必要的试剂,不能实现这种理想的情景。因此,虽然可以使测定可以是可重复的和可重复的,但即使对于第1层测定,也会仍然是难以捉摸的目标。
      使用明确定义的验收标准进行了分析要求的一系列实验的结果,需要向监管机构和出版物提交,以便能够评估测定的质量。除了识别针对目标的分析物(对所有三层的明显和共同的特征),必须定义测量测量的特定矩阵,因为该测定可能不可接受,以便以替代矩阵类型使用。通常应用多种测定验证标准以构建所需的置信度和可接受性,并包括测定的测定精度,准确性,特异性,分析敏感性,包括LOD,空白(LOB)的限制和量化限制(LLOQ) ,线性和平行度(

      行业指导:生物分析方法验证。 (2001年)美国FDA卫生和人类服务部,美国FDA,罗克维尔,MD,U.S.A.(2013年9月1日,2013年9月1日)

      ,
      ,
      desilva.
      白皮书关于生物分析的最近问题和多种指南的对齐。
      )。为相关矩阵中的每个分析物生成响应曲线和校准曲线(如上所述)以建立这些性能度量。使用不同的优选基质的不同来源,在存在溶胀,黄疸,脂质病等存在下仔细评估干扰的存在测试( 例如 来自不同个体或患者的等离子体),使用多种参考标准的样品收集(K2 EDTA和Li肝素等)的交替样品类型(血清和血浆),替代抗衡离子,通过每种肽的多重转变的过渡比监测。必须通过液相色谱和氨基酸分析(AAA)来建立内部标准和校准材料的纯度。评估各种分析变量,例如酶源,消化持续时间等的影响。根据注射到注射液的携带等携带。这些参数以及整体LC-MS仪器性能的大多数是在日常和日常和周到周的级别进行评估,以评估测定性能的稳定性。关于该过程的每个方面的指导文件可从CLSI获得( http://www.clsi.org)。此外,通常与样品一起分析具有已知或预先测量的分析物浓度的质量控制样品,以在常规使用期间确定测定性能。除了建立测定性能之外,还必须提供临床实用程序的证据,用于诊断区域中使用的测定。对于说明Tier 1测定的发展的实例,请参阅参考文献
      • 伯纳米司。
      • OTT L.
      • 恩格尔S.
      • 沃森D.
      • 塞尔P.
      • Ackermann B.
      使用免疫沉淀和LC / MS / MS的大鼠血清中NTPROBNP的定量:药物诱导的心脏肥厚的生物标志物。
      ,
      • Kushnir M.M.
      • Rockwood A.L.
      • 罗伯茨瓦尔。
      • 亚伯拉罕D.
      • Hoofnagle A.N.
      • Meikle A.W.
      血清和血浆中液相色谱 - 串联质谱法测量抗血清和血浆中抗血糖素自身抗体的测量。
      ,
      • Neubert H.
      • Muirhead D.
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      序列蛋白质和肽免疫亲和力捕获全部人β神经生长因子的质谱法量化。
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      • Lieske J.C.
      • Larson T.S.
      • Kumar R.
      一种液相色谱 - 质谱法,使用新型N-15-同位素标记的白蛋白内标进行尿白蛋白定量尿白蛋白。
      .

      Tier 2

      BRAD Ackerman,Eli Lilly和Susan Abbatiello,广泛的研究所带来了对第2层测定的目标和要求的讨论。制定了第2层测定以测量蛋白质,肽和修饰的表达水平的变化,例如由于扰动而导致的磷酸化,例如药物治疗和疾病的非临床目的(
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • Kuhn E.
      • carr s.a.
      靶标质谱法对等离子体低丰度蛋白的定量,多重测定和稳定同位素稀释。
      ,
      • 伯纳米司。
      • OTT L.
      • 恩格尔S.
      • 沃森D.
      • 塞尔P.
      • Ackermann B.
      使用免疫沉淀和LC / MS / MS的大鼠血清中NTPROBNP的定量:药物诱导的心脏肥厚的生物标志物。
      ,
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • Spiegelman C.H.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.L.
      • Keshishian H.
      • 霍尔S.C.
      • 艾伦S.
      • 黑人r.k.
      • 博赫斯C.H.
      • 降低C.
      • Cardasis H.L.
      • Cusack M.P.
      • 迪克德
      • 吉布森B.W.
      • 举行。
      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
      • carr s.a.
      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
      ,
      • Picotti P.
      • Bodenmiller B.
      • 穆勒L.N.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • Abbatiello S.E.
      • Burgess M.
      • Kuhn E.
      • 林C.W.
      • 教皇M.E.
      • 拉扎维M.
      • 安德森N.L.
      • Pearson T.W.
      • carr s.a.
      • Paulovich A.G.
      基于肽亲和基于质谱法的大规模定量蛋白质组学测定发育的评价。
      ,
      • Shi T.
      • fillmore t.l.
      • 太阳X.
      • 赵立
      • 什叶派A.A.
      • Hossain M.
      • 谢F.
      • 吴S.
      • kim J.s.
      • 琼斯N.
      • 摩尔r.j.
      • PASA-TOLIC L.
      • 卡根J.
      • 罗德兰K.D.
      • 刘涛。
      • 唐克。
      • 营地D.G.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      无抗体的靶向质谱法,用于在人血浆/血清中毫米水平的低密度测量蛋白质的定量。
      ,
      • 王Q.
      • Chaerkady R.
      • 吴j.
      • Hwang H.J.
      • Papadopoulos N.
      • Kopelovich L.
      • Maitra。一种。
      • Matthaei H.
      • eShleman J.R.
      • Hruban R.H.
      • Kinzler K.W.
      • Pandey A.
      • Vogelstein B.
      突变蛋白作为癌症特异性生物标志物。
      ,
      • addona t.a.
      • 施X.
      • Keshishian H.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.
      • Gillette M.A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 沉d.
      • 刘易斯G.D.
      • Farrell L.A.
      • 五个月。
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      整合血浆蛋白生物标志物的发现和验证的管道揭示了心血管疾病的候选标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      ,
      • Domanski D.
      • Percy A.J.
      • 杨杰。
      • 腔室A.G。
      • 山J.S.
      • Freue G.v.
      • 博赫斯C.H.
      基于MRM的人血浆中的67个推定心血管疾病生物标志物的多重定量。
      ,
      • 潘S.
      • 陈R.
      • 品牌R.E ..
      • 霍利斯。
      • Tamura Y.
      • Gafken P.R.
      • Milless B.P.
      • Goodlett D.R.
      • 赶紧J.
      • brentnall t.a.
      多重靶向蛋白质组学测定血浆中的生物标志物检测:胰腺癌生物标志物案例研究。
      ,
      • Huttenhain R.
      • SOSTE M.
      • selevsek n。
      • 罗斯特H.
      • Sethi A.
      • Carapito C ..
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • Kusebauch U.
      • 莫里茨R.L.
      • Nimeus-Malmstrom E.
      • rinner o.
      • Aeberberold R.
      使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
      ,
      • Kushnir M.M.
      • Rockwood A.L.
      • 罗伯茨瓦尔。
      • 亚伯拉罕D.
      • Hoofnagle A.N.
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      血清和血浆中液相色谱 - 串联质谱法测量抗血清和血浆中抗血糖素自身抗体的测量。
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      • Shuford C.M.
      • Sederoff R.R.
      • 蒋伏特。
      • Muddiman D.C.
      肽生产和衰减率影响蛋白质切割同位素稀释质谱(PC-IDMS)的定量精度。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      ,
      • 布伦V.
      • Dupuis A.
      • Adrait A.
      • Marcellin M.
      • 托马斯D.
      • 法庭M.
      • Vandenesch F.
      • 加入J.
      同位素标记的蛋白质标准。
      ,
      • 辛格r.
      • 乌鸦F.W.
      • 孩儿N.
      • lutz w.h.
      • Lieske J.C.
      • Larson T.S.
      • Kumar R.
      一种液相色谱 - 质谱法,使用新型N-15-同位素标记的白蛋白内标进行尿白蛋白定量尿白蛋白。
      ,
      • Kito K.
      • ITO T.
      基于质谱的绝对定量蛋白质组学的基于质谱。
      ,
      • Beynon R.J.
      • Doherty M.K.
      • 普拉特准
      • Gaskell S.J.
      替代拟肽人工QCAT蛋白的蛋白质组学中的多路复用绝对量化。
      )。样品可以是模型系统,例如细胞系或非人体动物或患者衍生材料,包括组织和生物流体,其中目标是测量蛋白质或改性肽( 例如 磷酸 - ,甲基 - ,乙酰基或普发肽,肽有关的生长,发育,遗传或化学扰动的生物学研究。第2层测定的另一个主要焦点是减少衍生自发现实验的候选生物标志物蛋白质的初始列表,该候选生物标志物蛋白质与真正反映疾病存在,阶段或反应的子集(
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • Spiegelman C.H.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.L.
      • Keshishian H.
      • 霍尔S.C.
      • 艾伦S.
      • 黑人r.k.
      • 博赫斯C.H.
      • 降低C.
      • Cardasis H.L.
      • Cusack M.P.
      • 迪克德
      • 吉布森B.W.
      • 举行。
      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
      • carr s.a.
      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
      ,
      • 王Q.
      • Chaerkady R.
      • 吴j.
      • Hwang H.J.
      • Papadopoulos N.
      • Kopelovich L.
      • Maitra。一种。
      • Matthaei H.
      • eShleman J.R.
      • Hruban R.H.
      • Kinzler K.W.
      • Pandey A.
      • Vogelstein B.
      突变蛋白作为癌症特异性生物标志物。
      ,
      • addona t.a.
      • 施X.
      • Keshishian H.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.
      • Gillette M.A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 沉d.
      • 刘易斯G.D.
      • Farrell L.A.
      • 五个月。
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      整合血浆蛋白生物标志物的发现和验证的管道揭示了心血管疾病的候选标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      ,
      • Domanski D.
      • Percy A.J.
      • 杨杰。
      • 腔室A.G。
      • 山J.S.
      • Freue G.v.
      • 博赫斯C.H.
      基于MRM的人血浆中的67个推定心血管疾病生物标志物的多重定量。
      ,
      • 潘S.
      • 陈R.
      • 品牌R.E ..
      • 霍利斯。
      • Tamura Y.
      • Gafken P.R.
      • Milless B.P.
      • Goodlett D.R.
      • 赶紧J.
      • brentnall t.a.
      多重靶向蛋白质组学测定血浆中的生物标志物检测:胰腺癌生物标志物案例研究。
      ,
      • Huttenhain R.
      • SOSTE M.
      • selevsek n。
      • 罗斯特H.
      • Sethi A.
      • Carapito C ..
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • Kusebauch U.
      • 莫里茨R.L.
      • Nimeus-Malmstrom E.
      • rinner o.
      • Aeberberold R.
      使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
      ,
      • Kushnir M.M.
      • Rockwood A.L.
      • 罗伯茨瓦尔。
      • 亚伯拉罕D.
      • Hoofnagle A.N.
      • Meikle A.W.
      血清和血浆中液相色谱 - 串联质谱法测量抗血清和血浆中抗血糖素自身抗体的测量。
      ,
      • Neubert H.
      • Muirhead D.
      • Kabir M.
      • 格蕾丝C.
      • Cleton A.
      • arends r.
      序列蛋白质和肽免疫亲和力捕获全部人β神经生长因子的质谱法量化。
      ,
      • rifai n。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
      ,
      • 布伦V.
      • 马萨隆C.
      • 加入J.
      • Dupuis A.
      绝对定量蛋白质组学的同位素稀释策略。
      ,
      • 布伦V.
      • Dupuis A.
      • Adrait A.
      • Marcellin M.
      • 托马斯D.
      • 法庭M.
      • Vandenesch F.
      • 加入J.
      同位素标记的蛋白质标准。
      ,
      • 辛格r.
      • 乌鸦F.W.
      • 孩儿N.
      • lutz w.h.
      • Lieske J.C.
      • Larson T.S.
      • Kumar R.
      一种液相色谱 - 质谱法,使用新型N-15-同位素标记的白蛋白内标进行尿白蛋白定量尿白蛋白。
      ,
      • Kito K.
      • ITO T.
      基于质谱的绝对定量蛋白质组学的基于质谱。
      ,
      • 皮卡德G.
      • 莱伯特D.
      • Louwagie M.
      • Adrait A.
      • Huillet C.
      • Vandenesch F.
      • Brululy C.
      • 加入J.
      • Jaquinod M.
      • 布伦V.
      PSAQ标准,用于准确基于MS的蛋白质量化:从概念到生物医学应用。
      ,
      • Kuhn E.
      • Whiteaker J.R.
      • MANI D.R.
      • 杰克逊上午
      • 赵L.
      • 教皇M.E.
      • 史密斯D.
      • Rivera K.D.
      • 安德森N.L.
      • 冰鞋S.J.
      • Pearson T.W.
      • Paulovich A.G.
      • carr s.a.
      用于多重反应监测质谱法的自动化,多重肽免疫亲和富集的实验室间评价,用于定量血浆中蛋白质的多重反应监测质谱。
      ,
      • Paulovich A.G.
      • Whiteaker J.R.
      • Hoofnagle A.N.
      • 王P.
      生物标志物发现与临床验证的界面:蛋白质生物标志物管道的焦油坑。
      ,
      • 甜蜜木e.r.
      • 刘兰兹。
      • Xiang Y.
      • 陈Y.
      • 托马斯C.E.
      • Rajyaguru N.
      • kaufman l.m.
      • Ochoa J.E.
      • Hazlehurst L.
      • Pinilla-ibarz J.
      • 柳叶刀J.
      • 张G.L.
      • 哈拉E.
      • Shibata D.
      • Yeatman T.
      • Smalley K.S.M.
      • 道尔顿W.S.
      • 黄娥
      • 斯科特E.
      • 绽放G.C.
      • Eschrich S.A.
      • Komen J.m.
      反应监测质谱测定的数据库,用于阐明癌症治疗反应的影响。
      )。实现这一般需要转换到比在发现 - 即MRM和相关目标MS方法中使用的更精确,可再现的,定量和较高的吞吐量方法( 例如 平行反应监测(
      • 加利斯S.
      • Duriez E.
      • Crone C.
      • Kellmann M.
      • Moehring T.
      • Domon B.
      靶向蛋白质组学定量对四轴 - 眶谱法质谱仪。
      )) - 并应用该方法在比Discovey中使用的更大和独立的样本集中测量一组定义的分析物。生物标志物发现过程中的这一步骤称为“验证”(
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      靶心谱法测量生物医学中肽和蛋白质的定量分析。
      ,
      • rifai n。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
      )。在生物标志物研究的情况下,需要特别注意统计实验设计,并使用随机化,复制和阻塞,以避免引入系统偏差,并最大限度地提高实验检测组之间真正的定量变化的能力(
      • oberg a.l.
      • Vitek O.
      定量质谱型蛋白质组学实验的统计设计。
      )。
      Tier 2测定需要具有高选择性,高可重复性和足够的可重复性和敏感性,以检测和量化靶向的分析物,并使分析能够在实验室中标准化,(表I.)。分析性能的表征必须严格地确定满足上述标准,以促进跨实验室的转移和实施,并帮助启用可能具有价值临床相关性的这些测定的可能翻译。与Tier 1测定的分析,其中构建了极良好的特征和分析验证的测定以测量已知感兴趣的临床医生和药物显影剂的一些分析物,在数千次样本中,通常使用Tier 2测定在实验中分析的分析物源于文学,发现蛋白质组学或转录分析实验的少得多,并且可能几乎没有与治疗或疾病的既定相关联。 Tier 2测定经常高度复用,靶向单个测定中的数百至数百个分析物。
      监管机构和期刊都没有为第2层测定的分析验证要求提供指导,但参与者在应有附近的达成共识,以及提交人的需要确定用于建立其表现的步骤和做法测定。在第2层测定的分析验证的要求镜像从最低要求开始的第1层,从而稳定同位素标记的每个和每种分析物肽的内标肽。除了稳定的同位素标记的胰蛋白皮肽,标记的粘附体肽(
      • Beynon R.J.
      • Doherty M.K.
      • 普拉特准
      • Gaskell S.J.
      替代拟肽人工QCAT蛋白的蛋白质组学中的多路复用绝对量化。
      ),“翼”肽,其他延长序列或全长蛋白(如上所述)也可用于改善精度,如果可用(
      • Neubert H.
      • Muirhead D.
      • Kabir M.
      • 格蕾丝C.
      • Cleton A.
      • arends r.
      序列蛋白质和肽免疫亲和力捕获全部人β神经生长因子的质谱法量化。
      ,
      • Shuford C.M.
      • Sederoff R.R.
      • 蒋伏特。
      • Muddiman D.C.
      肽生产和衰减率影响蛋白质切割同位素稀释质谱(PC-IDMS)的定量精度。
      ,
      • 布伦V.
      • Dupuis A.
      • Adrait A.
      • Marcellin M.
      • 托马斯D.
      • 法庭M.
      • Vandenesch F.
      • 加入J.
      同位素标记的蛋白质标准。
      ,
      • 辛格r.
      • 乌鸦F.W.
      • 孩儿N.
      • lutz w.h.
      • Lieske J.C.
      • Larson T.S.
      • Kumar R.
      一种液相色谱 - 质谱法,使用新型N-15-同位素标记的白蛋白内标进行尿白蛋白定量尿白蛋白。
      ,
      • Kito K.
      • ITO T.
      基于质谱的绝对定量蛋白质组学的基于质谱。
      ,
      • 皮卡德G.
      • 莱伯特D.
      • Louwagie M.
      • Adrait A.
      • Huillet C.
      • Vandenesch F.
      • Brululy C.
      • 加入J.
      • Jaquinod M.
      • 布伦V.
      PSAQ标准,用于准确基于MS的蛋白质量化:从概念到生物医学应用。
      )。用于使用标记的内标的基本标准与第1层相同,特别是在监测每个分析物的身份中提供置信度,以提高测量精度,并帮助补偿抑制效果。
      与Tier 1测定不同,Tier 2测定的目标不一定是在肽或蛋白质水平处提供实际浓度。相反,Tier 2 MRM测定也可用于精确且持续测量 相对的 样本中大量有针对性分析物的级别的变化。对于使用Tier 2测定的分析物的相对定量,如果适当验证,可以放宽对已知量的高度纯化的肽的需要,从而降低标记的肽合成的成本,主要由纯化成本和氨基酸分析驱动。然而,使用未纯化的肽将损害测定测定的LOD和LOQ的能力。仍然必须用LC-MS,LC-UV和/或MALDI-TOF-MS分析未纯化的肽,以证明已经合成了正确的序列,并且所需产物是优势物种。
      与Tier 1测定一样,进行多种测定验证步骤,以建立所需的信心和接受测定(表格1)。这些包括生成相关矩阵中的每个分析物的响应或校准曲线,并测试多种源或矩阵的多个不同池中的干扰( 例如 使用在不同比例中混合的相同细胞系的不同培养物或细胞系池的生物复制。这些实验通常在最少的完整过程(不是技术)三次的过程中进行,以测量再现性。 Tier 2的分析验证还包括测定精度的测量,线性范围的定义,并且当使用纯化和量化标记的参考肽时,测定LOD和LLOQ。例如,存在用于建立这些度量的许多可接受的统计方法,见
      • Linnet K.
      评估方法比较研究的回归程序。
      ,
      • Currie L.A.
      定性检测和定量测定的限制。
      ,
      • Linnet K.
      • Kondratovichm M.
      部分非参数方法,用于确定检测限。
      ,
      • MANI D.R.
      • Abbatiello S.E.
      • carr s.a.
      多反应监测质谱(MRM-MS)测定对定量蛋白质组学的统计表征。
      ,并且更重要的是,这些分析的开发人员恰好是他们所做的而不是使用规定的方法。存在高内源性分析物水平使得LLOQ的测定困难。已建立的做法是使用替代物种的类似矩阵。或者,可以使用所谓的“反向”曲线在正确的矩阵中运行。在这种方法中,以固定量加入光肽,同时改变响应曲线中重肽的量(
      • 李W.
      • 科恩L.H.
      没有真正空白基质的生物流体中内源分析物的定量。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 林C.
      • 闫诗
      • Paulovich A.G.
      序列多路复用分析物定量使用肽免疫亲和富集偶联至质谱法。
      ,
      • Kuhn E.
      • 罗斯J.
      • Abbatiello S.E.
      • MANI D.R.
      • carr s.a.
      )。还测量日期和日常变异性,以评估完成分析物测量所需时间所需的测定性能的稳定性。使用系统适用性检查以确保分析平台的充分和持续性能,还应在分析之前,期间和之后进行整体LC-MS仪器性能进行评估。
      • Abbatiello S.E.
      • MANI D.R.
      • 席克宁B.
      • 麦克莱恩B.
      • Zimmerman L.J.
      • 冯X.
      • Cusack M.P.
      • SEDRANSK N.
      • 霍尔S.C.
      • addona t.
      • 艾伦S.
      • 迪克德
      • Ghosh M.
      • 举行。
      • Hedrick V.
      • Inerowicz H.D.
      • 杰克逊A.
      • Keshishian H.
      • kim J.W.
      • Lyssand J.S.
      • 莱利C.P.
      • Rudnick P.
      • Sadowski P.
      • Shaddox K.
      • 史密斯D.
      • Tomazela D.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 惠特威尔C.A.
      • 你j.
      • 张某。
      • kinsinger c.r.
      • Mesri M.
      • Rodriguez H.
      • 博赫斯C.H.
      • 降低C.
      • 费舍尔S.J.
      • 吉布森B.W.
      • Liebler D.
      • Maccoss M.
      • neubert t.a.
      • Paulovich A.
      • Regnier F.
      • 冰鞋S.J.
      • Tempst P.
      • 王米
      • carr s.a.
      LC-MRM-MS中仪器性能定量评估系统适用性方案的设计,实现和多站点评估。
      )。如何进行定量,并且必须清楚地描述使用每个分析物的过渡或转变。与Tier1相比,不需要对每个分析物的多种不同的参考标准。可以参考可以在参考文献中找到第2层测定的发展的实例
      • 伯纳米司。
      • OTT L.
      • 恩格尔S.
      • 沃森D.
      • 塞尔P.
      • Ackermann B.
      使用免疫沉淀和LC / MS / MS的大鼠血清中NTPROBNP的定量:药物诱导的心脏肥厚的生物标志物。
      ,
      • addona t.a.
      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • 冰鞋S.J.
      • MANI D.R.
      • 双打下午。
      • Spiegelman C.H.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.L.
      • Keshishian H.
      • 霍尔S.C.
      • 艾伦S.
      • 黑人r.k.
      • 博赫斯C.H.
      • 降低C.
      • Cardasis H.L.
      • Cusack M.P.
      • 迪克德
      • 吉布森B.W.
      • 举行。
      • Hiltke T.
      • 杰克逊A.
      • 约翰森E.B.
      • kinsinger c.r.
      • 李杰。
      • Mesri M.
      • neubert t.a.
      • niles r.k.
      • Pulcoripher T.C.
      • Ransohoff D.
      • Rodriguez H.
      • Rudnick p.a.
      • 史密斯D.
      • Tabb D.L.
      • TEGELER T.J.
      • variyath上午
      • Vega-Montoto L.J.
      • 华兰人A.
      • Waldemarson S.
      • 王米
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 安德森N.L.
      • 费舍尔S.J.
      • Liebler D.C.
      • Paulovich A.G.
      • Regnier F.E.
      • Tempst P.
      • carr s.a.
      多站点评估对血浆中蛋白质蛋白质的多重反应监测测量的精度和再现性。
      ,
      • addona t.a.
      • 施X.
      • Keshishian H.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.
      • Gillette M.A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 沉d.
      • 刘易斯G.D.
      • Farrell L.A.
      • 五个月。
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      整合血浆蛋白生物标志物的发现和验证的管道揭示了心血管疾病的候选标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      ,
      • Huttenhain R.
      • SOSTE M.
      • selevsek n。
      • 罗斯特H.
      • Sethi A.
      • Carapito C ..
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • Kusebauch U.
      • 莫里茨R.L.
      • Nimeus-Malmstrom E.
      • rinner o.
      • Aeberberold R.
      使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      ,
      • Neubert H.
      • 大风J.
      • Muirhead D.
      在线高流量肽免疫亲和性富集和纳米射线LC-MS / MS:用于总唾液肽/胃蛋白原的测定发育。
      ,
      • 李W.
      • nemirovskiy O.
      • 喷泉S.
      • mathews w.r.
      • Szekely-klepser G.
      免疫亲和LC-MS / MS测定的临床验证用于定量胶原II型新腔肽的定量:人尿中基质金属蛋白酶活性和骨关节炎的生物标志物。
      .

      Tier 3

      布鲁诺美黑,卢森堡临床蛋白质组学中心和Ruth Huttenhain,UCSF(以前的埃希尔)LED讨论了第3层测量的目标和要求。在仍然使用针对每个分析物的标记的内标使用的情况下,仍然使用目标MS方法的三级测量,同时使用目标MS接近。结果,Tier 3测量最适合于生物系统中的蛋白质,蛋白质形式或肽的比较,半定量测量。缺乏每个分析物的内标需要使用额外的色谱和质谱信息来建立对靶向分析物的鉴定和测量的信心。目前正在使用的证据层在下面更详细地描述。当适当使用有关肽的肽的所有可用信息时,Tier 3测量是强大而强大的,代表更精细的吞吐量,以便对无标记的半定量发现进行的,但是对于目标检测和测量有更好的可重复性(
      • addona t.a.
      • 施X.
      • Keshishian H.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.
      • Gillette M.A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 沉d.
      • 刘易斯G.D.
      • Farrell L.A.
      • 五个月。
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      整合血浆蛋白生物标志物的发现和验证的管道揭示了心血管疾病的候选标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      )。然而,没有内部标准可以减少对测量和半量化的身份的置信度,并且不能计算抑制效果,这限制了测量精度和精度,只有相同的原因才能粗略地估计丰富的变化估计在免费发现实验的情况下,它受到限制(见
      • Bantscheff M.
      • Lemeer S.
      • Savitski m.m.
      • Kuster B.
      蛋白质组学中的定量质谱:2007年至今的批判性评论更新。
      和其中引用)。 LC-MS系统的性能的运行变化可以通过监测来占据尖刺的参考肽的MS信号的变化,或者在分析的样品中未经内源地存在未存在的蛋白质( 例如 序列独特 大肠杆菌 肽或蛋白质掺入哺乳动物基质中,(
      • 张H.
      • 刘Q.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.
      • Slebos R.J.
      • 拉赫曼J.
      • Kikuchi T.
      • 广告P.P.
      • Carbone D.P.
      • Billheimer D.
      • Liebler D.C.
      通过液相色谱 - 多反应监测质谱法的肽和蛋白质定量方法。
      )),但这种参考材料不补偿上述分析物特异性效果。 Tier 3测量不能被认为是真正的定量,并且与发现蛋白质组学实验一样,来自这种测量的观察通常需要额外的研究来验证结果。
      对于Tier 1和2测定的分析验证,对于第3层目标MS测量是不可能的。相反,通过增加的证据层,包括(1)每个分析物的整个监测片段离子的完全共同洗脱或重叠,通过增加的证据层来建立对分析物鉴定和定量的可靠性的置信度。每组监测片段离子的重叠有助于建立它们来自同一物种而不是来自不同但几乎共同洗脱的分析物; (2)与每个分析物的真实标准光谱相比,对分析物的M / Z和前体离子的相对比的同意; (3)观察到的分析物对预测或先前观察到的正宗肽保留的相关性; (4)跨多个生物或全过程的结果的可重复性重复。在没有一个或多个这些层的情况大大降低了结果的可靠性。为了满足标准2,所有靶向分析物都需要来自MS / MS光谱或来自下面的色谱图书馆的参考相对离子丰度测量,以确定产生的片段离子,并且必须观察到自信状态已经检测到特定分析物。识别信心随着前体和产物离子的质量和分辨率的增加,以及监测的片段离子的数量并与参考光谱进行比较。具有高分辨率的仪器,准确的质量能力开始用于定量实验(MRM样),并且前体和碎片的精确质量测量显着提高了分析的置信度(
      • Rochat B.
      • Peduzzi D.
      • 麦克伦J.
      • Favre A.
      • Kotelat E.
      • Favrat B.
      • 天梭J.D.
      • Angelillo-Scherrer A.
      • Bromirski M.
      • Waldvogel S.
      利用LC-HRMS验证血管素定量血管素定量,并使用新的肝素同种型发现。
      ,
      • Jaffe J.D.
      • 王Y.
      • 陈苗
      • 张继夫
      • Huether R.
      • Kryukov G.v.
      • Bhang H.E.
      • 泰勒J.E.
      • 胡米
      • ENGLUND N.P.
      • yan f.
      • 王Z.
      • 麦克唐纳第3号,R.E.
      • 魏L.
      • 马杰。
      • Easton J.
      • yu z.
      • deaeaumount r.
      • Gibaja V.
      • Venkatesan K.
      • Schlegel R.
      • 卖家W.R.
      • 敏锐
      • 刘杰。
      • Caponigro G.
      • Barretina J.
      • Cooke V.G.
      • mullighan c.
      • carr s.a.
      • 下降J.R.
      • Garraway L.A.
      • Stegmeier F.
      全球染色质谱揭示小儿急性淋巴细胞白血病中的NSD2突变。
      )。可以从存储在公共数据存储库(如GPM)中的先前发现实验获得参考光谱(
      • Fenyöd。
      • Eriksson J.
      • Beavis R.
      使用全球蛋白质组机器的质谱蛋白鉴定。
      ),peptidaitlas(
      • 德意曲e.w.
      PeptidAtlas项目。
      ), 自豪 (
      • VizcaínoJ.A.
      • CôtéR.G.
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • ríosd.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      )和策划MS / MS光谱的集合,如SRMATLAS(
      • Picotti P.
      • 林H.
      • 坎贝尔D.
      • 德意曲e.w.
      • Mirzaei H.
      • ranish J.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      酵母蛋白质组的质谱测定数据库。
      ,
      • HüttenhainR.
      • 苏里诺瓦S.
      • Ossola R.
      • 太阳Z.
      • 坎贝尔D.
      • Cerciello F.
      • 什因·罗斯
      • Bausch-Fluck D.
      • Rosenberger G.
      • 陈杰。
      • rinner o.
      • Kusebauch U.
      • Hajdúchm.
      • 莫里茨R.L.
      • Wollscheid B.
      • Aeberberold R.
      N-糖蛋白SRMATLAS:用于临床应用的一致和复用蛋白质定量的N-晶体料的质谱测定的资源。
      )。然而,重要的是要记住碎片方法的差异( 例如 碰撞刺激 相对 所使用的共振激发和碰撞能量可以对肽片段的相对比具有显着影响,防止使用比率匹配作为识别的标准。因此,最佳参考光谱将导出在同一LC-MS平台上的发现蛋白质组学实验或对未标记的合成肽标准的分析,并在与待分析的样品的完全分析条件下。越来越多地,数据无关的方法用于三级分析(
      • venable J.D.
      • 董M.Q.
      • Wohlschlegel J.
      • 迪林A.
      • yates j.r.
      串联质谱法定量分析复合肽混合物的自动化方法。
      ,
      • 黄X.
      • 刘M.
      • nold m.j.
      • 田C.
      • 傅克。
      • 郑杰。
      • Geromanos S.J.
      • 丁S.J.
      使用稳定同位素标记和数据独立采集的定量蛋白质组学分析软件。
      ,
      • Gillet L.C.
      • Navarro P.
      • 塔特S.
      • 罗斯特H.
      • selevsek n。
      • 重新勒
      • Bonner R.
      • Aeberberold R.
      由数据独立获取产生的MS / MS光谱的有针对性的数据提取:一致和准确的蛋白质组分析的新概念。
      ,
      • Egertson J.D.
      • Kuehn A.
      • Merrihew G.E.
      • Bateman N.W.
      • 麦克莱恩B.X.
      • 婷婷。
      • 坎特伯雷J.D.
      • 沼泽下午
      • Kellmann M.
      • Zabrouskov V.
      • 吴C.C.
      • maccoss m.j.
      多路复用MS / MS,用于改进数据独立的采集。
      ,
      • Panchaud A.
      • Scherl A.
      • Shaffer S.A.
      • von haller p.d.
      • kulasekara h.d.
      • 米勒S.I.
      • Goodlett D.R.
      前体习得独立于离子数:如何深入进入蛋白质组学海洋。
      )。这些实验是使用的 m/z 选择窗口的碎片宽度为4-25 da,导致高度复杂,重叠的MS / MS光谱。这些属性严重限制了使用标准序列分配软件来建立身份,再次需要参考光谱的可用性进行识别。
      向每个样品中添加保留时间标准能够在不同的色谱条件下的实验中和/或获得的肽保留次数相关,包括不同的柱,梯度,温度和流速(
      • eScher C.
      • 重新勒
      • 麦克莱恩B.
      • Ossola R.
      • 赫罗特F.
      • 谢尔顿J.
      • maccoss m.j.
      • rinner o.
      使用IRT,归一化的保留时间,用于更具靶向肽的测量。
      )。使用归一化的保留时间与标准肽的使用提供了更高的对测量的分析物的身份的置信度较高,特别是当没有使用每个分析物的标记肽标准时,特别是当使用相对较窄的RT窗口进行更高的复用分析时。使用阳性识别和保留时间对准的其他方法也可用于增加测量靶肽的置信度。
      说明Tier 3测量的开发和应用的一些例子可以在参考文献中找到
      • Picotti P.
      • rinner o.
      • Stallmach R.
      • Dautel F.
      • Farrah T.
      • Domon B.
      • 文字H.
      • Aeberberold R.
      用于蛋白质和蛋白质素的选定反应监测测定的高通量产生。
      ,
      • 张H.
      • 刘Q.
      • Zimmerman L.J.
      • 火腿A.J.
      • Slebos R.J.
      • 拉赫曼J.
      • Kikuchi T.
      • 广告P.P.
      • Carbone D.P.
      • Billheimer D.
      • Liebler D.C.
      通过液相色谱 - 多反应监测质谱法的肽和蛋白质定量方法。
      ,
      • 汤。
      • 啤酒l.a.
      • Barnhart K.T.
      • Speicher D.W.
      使用基于凝胶的无标记多反应监测快速验证候选血清生物标志物。
      ,
      • Sherrod S.D.
      • Myers M.v.
      • 李米
      • Myers J.s.
      • 木匠K.L.
      • 麦克莱恩B.
      • maccoss m.j.
      • Liebler D.C.
      • 火腿A.J.
      通过伪选择的反应监测与内部参考肽的无标记定量蛋白质修饰。
      。此外,一些公布的研究已经使用了第3层测量来帮助选择来自Discovery蛋白质组学研究的目标,用于Tier 2测定发育(例如,参见
      • addona t.a.
      • 施X.
      • Keshishian H.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.
      • Gillette M.A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 沉d.
      • 刘易斯G.D.
      • Farrell L.A.
      • 五个月。
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      整合血浆蛋白生物标志物的发现和验证的管道揭示了心血管疾病的候选标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
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      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      )。

      用于分析验证,分析和存储MRM数据的工具和软件

      最近审查了用于分析MRM数据的有用开源工具(

      Colangelo,Cm,Chung,L.,Bruce,C.,Cheung,KH(20130年大规模MRM蛋白质组集设计和分析软件工具审查。方法61,287-298。10.1016 / J.YMET.2013.05。 004. 2013年5月21日epub

      ,
      • Brusniak M.Y.
      • 楚C.S.
      • Kusebauch U.
      • Sartain M.J.
      • 瓦特J.D.
      • 莫里茨R.L.
      用于分析所选反应监测技术获取的LC-MS数据的电流生物信息解的评估。
      )和新工具正在快速推出。需要这些工具来减少对越来越大量的目标MS数据越来越大量的劳动密集型和易于识别的需求,并在实验室内和跨越实验室中实现高质量,可重复的数据分析结果。奥尔德大学,普通大学,曼尼博士和卢卡斯雷士斯,Biognosys讨论了华盛顿大学的系统生物学研究所和Brendan Maclean研究所的统计数据分析方法和Eric Deutsch探讨了对试验发展的软件工具数据基础。这些演示文稿的目标是描述在每个层中积极使用的方法和工具,而不是推荐一个特定工具。存在许多单独的软件包,促进了测定开发,分析测定验证,数据出口,峰集成,数据质量评估,脱杆菌统计分析和项目管理。每个供应商的仪器特有的软件作为仪器数据分析软件的一部分提供。专有的数据分析,减少和存储的第二方工具也可用于目标MS数据(例如Indigo Biosystems()http://www.indigobio.com/)和数据创新(http://www.datainnovations.com/)。这些工具通常由临床和诊断实验室使用,从而生成需要高分辨率可靠性和数据安全性的非常大量的数据。 FDA还开发了用于测试,开发或制造医疗设备的软件测试和验证的指导(

      软件验证的一般原则;工业和FDA工作人员的最终指导。发布的文件:2002年1月11日。本文件取代了文件草案,“软件验证的一般原则,1997年6月9日的第1.1版。 http://www.fda.gov/downloads/RegulatoryInformation/Guidances/ucm126955.pdf

      )。现在也越来越强大,高度灵活,更容易适应的供应商 - 中性软件也在广泛使用。这些包,如幻照片(
      • 重新勒
      • rinner o.
      • Picotti P.
      • HüttenhainR.
      • 贝克米
      • Brusniak M.Y.
      • Hengartner M.O.
      • Aeberberold R.
      MPROPHET:用于大规模SRM实验的自动数据处理和统计验证。
      )( http://www.mprophet.org/)和天际线(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
      • 芬尼G.L.
      • Frewen B.
      • 肯尼尔·
      • Tabb D.L.
      • Liebler D.C.
      • maccoss m.j.
      天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
      , //skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view),通过用户反馈和适应不断更新和优化。感兴趣的读者被引用引用引用和引用的网站,以便详细说明每个工具所做的。
      Skyline是MRM测定的供应商 - 中性工具,用于MRM测定的开发和数据收集,可实现肽和过渡选择,碰撞能量优化,方法出口,峰值检测和峰集成。大多数研讨会参与者表明它们是积极的天际线用户。特定于供应商的软件还提供上述功能,并且供应商每次都努力使数据在该平台上获取的数据,并且提供用于分析的工具尽可能有效地完成工作( 例如 来自安捷伦的Masshunter;来自sciex的多谜;从Thermo的精确点)。地平线(带有它的相关包装称为全景),旨在整合和制作整体工作流程,以实现数据采集和数据分析。目前,从供应商或开源的单个包没有完成所有分析层所需的任务,因此需要使用多个包。
      统计数据分析使用非供应商提供的工具,直到最近,需要使用多种工具,包括JMP,SAS,Excel和/或开源工具等商业产品,如R,如R以确定变异系数(CV),回归斜率和截距(具有置信区间),干扰检测和LOD和LOQ并在各种图中可视化结果。审计 (
      • Abbatiello S.E.
      • MANI D.R.
      • Keshishian H.
      • carr s.a.
      通过多种监测质谱法自动检测肽定量测定中的不准确和不精确转变。
      ,
      • MANI D.R.
      • Abbatiello S.E.
      • carr s.a.
      多反应监测质谱(MRM-MS)测定对定量蛋白质组学的统计表征。
      ),Quasar(

      http://genepattern.broadinstitute.org/gp/pages/index.jsf?lsid=QuaSAR。请注意,您必须在GenePattern网站上注册以访问。注册是免费的

      )和msstats(扩展以前开发的包srmstats的r包(
      • 苏里诺瓦S.
      • HüttenhainR.
      • chang c.y.
      • Espona L.
      • Vitek O.
      • Aeberberold R.
      自动化的选择反应监测数据分析工作流程,用于大规模靶向蛋白质组学研究。
      ))最近开发了简化和简化这些任务的开源工具。 Quasar和SRMSTATS都可用作天际线内的外部工具(//skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view)。 Tier 3中使用的可免费测量的有用工具包括MproShet(
      • 重新勒
      • rinner o.
      • Picotti P.
      • HüttenhainR.
      • 贝克米
      • Brusniak M.Y.
      • Hengartner M.O.
      • Aeberberold R.
      MPROPHET:用于大规模SRM实验的自动数据处理和统计验证。
      ),天际线和srmstats。程序幻灯片以明显不同的方式操作,采用“诱饵转变”来模拟识别置信度并确定干扰的存在。为了利用这种方法,可以在每次运行中获取对每种肽的用户定义诱饵转换的数据。当使用每个分析物的标记肽时,Mprophet更像是传统方法,以确定识别和干扰的置信度。 MPROCHET方法也适用于数据独立采集,目前在Spectronaut(http://www.biognosys.ch/hrm-mrm-tools/spectronaut.html )。
      研讨会的参与者同意,原始数据和加工结果都应公开可用。为了获得社区的最大利益,结果应该是(1)的形式,使得易于理解的测定措施以及它是多么可靠的,并且(2)很容易被转移并用于在自己的实验室中配置测定/测量。构建肽/蛋白质目标目标的测定所需的所有关键信息的公共可行性以及QC数据展示测定的性能将促进世界各地的研究人员的可靠MRM测定,以及转换到一级的分析临床和临床 体外 诊断实验室。在这方面正在进行激烈的开发活动,其中一些有用的数据存储库的第一个示例,用于MRM数据具有上述能力(
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • Kreisberg R.
      • 太阳Z.
      • 坎贝尔D.S.
      • 门多萨L.
      • Kusebauch U.
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      • 什因·罗斯
      • selevsek n。
      • Aeberberold R.
      • 莫里茨R.L.
      Passel:PeptidAtlas SRM实验库。
      )和全景(//panoramaweb.org)。临床蛋白质组学肿瘤分析联盟是靶向癌症相关蛋白和修饰肽的MRM测定门户(http://proteomics.cancer.gov/programs/cptacnetwork)。全景作为CPTAC测定门户的后端,允许科学家寻找肽和蛋白质的测定细节。该门户将清楚地定义测定细节(SOP)以及每个测定的质量指标,包括进行的分析验证研究的结果。

      针对MS实验的报告结果的指导

      还要求研讨会参与者考虑提交人员需要在他们的手稿中提供哪些信息,以使审阅者和读者能够清楚地了解所做的和评估报告的肽或蛋白质定量测量的可靠性。作者的指导方针已经到位用于定量发现蛋白质组学研究(),但这些指南没有明确地解决有针对性的MS分析。努力已经开始定义需要提供用于定量蛋白质组学实验的最低信息,包括涉及靶向MS分析的蛋白质组学实验。这些努力在很大程度上重点关注将数据归入自豪感(
      • Martínez-bartolomés。
      • 德意曲e.w.
      • binz p.a.
      • 琼斯A.R.
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      • Albar J.P.
      报告蛋白质组学中定量质谱实验的指导。
      )。提供此类信息,需要在多个自由形式文本字段中进行手动输入信息,通常被认为是繁重的。因此,遵守性低,所提供的信息通常不完整。描述该研究的已发布的稿件仍然是关于如何进行实验的最佳信息来源以及为什么。在期刊上越来越高的认可,除了要求原始数据的沉积之外,他们还需要更多地尝试确保在他们发布的论文中报告的实验结果是可靠和可重复的,并且统计数据使用的分析方法是合适的(
      • 罗素J.F.
      如果一份工作值得这样,值得做两次。 自然 (2013)496:7和编辑人员。降低我们的IRREPRODUICIBIBIBIBITY。
      )。如果没有清楚地证明生物学重复性,请重复有针对性的MS研究结果的有效性(以及通过延长,所有科学效果)都是开放的问题。
      虽然参与者的时间不足,但参与者完全制定一系列作者指导方针,但一些适用于所有有针对性的MS分析的一般建议。一个引导委托人是作者需要提供足够的实验细节,以便可以通过其他方式复制工作,无论层。为此,作者可能需要在论文中提供更广泛的实验部分。必须描述实验设计的所有细节,包括如何构建测定/测量,对每个分析物实现的测定性能,如何进行分析验证,以及如何评估干扰。作者应该描述他们如何或为什么选择采用的分析验证水平,并解释了鉴于实验的目标以及可能使用结果的目标是如何适应的。用于测定性能的所有分析验证数据应包括在发布中作为补充,以便允许读者独立评估测定质量。作者需要详细描述用于数据分析和量化的方法,包括所有所采用的所有统计方法以及正在做的假设。简单地说明使用某种分析包不足。鼓励作者始终使用标准命名,以了解有关验证和质量评估的关键术语。如上所述,有一致的一致意见,原始数据应在公共存储库中提供,以及包含所选肽的所有肽的参考光谱的方法,监测的过渡列表以及所有仪器参数(停留时间,碰撞能量等)。 Skyline文件再次突出显示为提供此信息的简化方法。
      工作组的更详细建议是向提交雇用有针对性的MS方法的文件提交一套提交文件的准则草案。在公众评论后,这些期刊将在随后的问题上呈现。

      总结和结论

      会议与会者确定了由实验的分析目标和每个使用“适合目的”方法的分析目标定义的目标MS测量的三个“层”。在每个层内,还定义了确定报告的测试所需的实验证据和分析验证步骤,并确定了所需的测试和实现所需的性能水平。讨论了用于分析目标MS结果的计算和统计工具。在最高级别的最高级别,在第1层和2中的基于基于MS的测定有两个属性,共同区分它们从发现实验中区分:(1)能够反复测量内部的样品/实验中的兴趣分析物和(2)的能力用于自信检测和精确量化的每个分析物的标准。三级测量,可用于早期生物学研究,可实现跨实验相同的分析物集的可重复测量,但这并不采用内部标准来准确或精确测量水平。这些方法不构成测定,而是涉及发现蛋白质组学的不同方式。虽然会议的重点是在三重四极其仪器上使用MRM的良好成立的目标MS方法,但是一些发言者讨论了使用新的数据采集和分析方法,例如数据独立分析(
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      )。由于其较大的分析物特异性,高分辨率,精确的质量分析和平行反应监测特别令人兴趣的是针对性测定的靶向显影,从具有相似前体和产物离子质量的分析物的潜在干扰减少,以及更大的动态范围的潜力。与传统的MRM方法一样,采用这些方法的论文必须包含适当和适当的数据,结果表明已经满足了测量所需的性能度量。

      致谢

      我们感谢国家癌症研究所(CPTAC - 临床蛋白质组学肿瘤分析联盟)和NIH的全国心脏,肺和血液研究所(蛋白质组学中心),以得到对会议的强大支持。

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