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TNIP2是NF-κB网络中的集线蛋白,蛋白质和RNA介导的相互作用*

  • 查尔斯A.S.银行
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    监督员医学研究所,堪萨斯城,密苏里州堪萨斯城64110和
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  • Gina Boanca.
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  • Zachary T. Lee.
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  • Cassandra G. Eubanks.
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  • Gaye L. Hattem.
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  • Allison Peak.
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  • Lauren E. Weems.
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  • Juliana J.Conkright.
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  • Laurence Florens.
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  • 迈克尔·沃斯沃克
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    应当解决谁的通信:STOWERS医学研究院,1000 E. 50th St,堪萨斯城,MO 64110.电话:816-926-4457;
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    病理部门&堪萨斯城堪萨斯州堪萨斯州堪萨斯州堪萨斯州堪萨斯州堪萨斯州66160的实验室医学
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了医学研究所和国家卫生院校国家卫生研究院国家综合研究所的支持支持这项工作。内容完全是作者的责任,不一定代表国家卫生研究院的官方意见。
    本文含有补充材料。
    1所用的缩写是:活化B细胞的NF-κBnutclectO因子Kappa-Light-ChoRancer Domainap-Msaffinity纯化质谱法氯乙酰胺 - N - 羟甲基CMVCytomegalovirusDAPI4',6-二脒基-2- phenylindoleDNA / cDNADeoxyribonucleic酸/互补DNAdNSAFDistributed归一化频谱丰度FactorEABRESCRT和ALIX结合regionESCRTEndosomal分拣transportFDRFalse发现RateFPLCFast蛋白液相chromatographyHEK293THuman胚胎肾所需复合物293个细胞中表达的NF-κBKHdomainHeterogeneous核的SV40ŤantigenIκBInhibitor核糖核糖蛋白K同源Domainmudpitumultimensional蛋白质识别技术Plgempower Law全球误差Model Qpcr Cumantative聚合酶链式rna / mrnaribonicon酸/信使rnarnaseribonucleaserpreversed phasescxstrong阳离子交换Expersf21spodoptera frugiperda 21 Cellstceptris(2-羧乙基)磷素(羟甲基)氨基甲烷。
      NF-κB. 的转录因子系列是控制对环境压力的细胞反应的关键;异常核因子κ轻链 - 激活B细胞(NF-κB)信号传导特征在许多自身免疫疾病和癌症中。据报道,NF-κB信号通路的几个组分以与蛋白质TNIP2相互作用(也称为Abin2),并且TNIP2可以正面和负调节靶基因的NF-κB依赖性转录。然而,TNIP2的功能仍然难以捉摸,并且没有系统地定义与TNIP2相关联的蜂窝机械机械。在这里,我们首先使用了一种宽的Mudpit / Halo亲和纯化质谱(AP-MS)方法来映射与NF-κB转录因子相关的蛋白质网络,并建立TNIP2作为NF-κB网络中心蛋白。然后,我们将AP-MS与生化方法相结合,在更加集中的TNIP2的截断和突变形式的研究中进行生化方法,以用TNIP2的不同区域映射蛋白质关联。 NF-κB与TNIP2的N末端区域相互作用。 TNIP2的中心区域通过其TSG101亚基与内体分选复合体ESCRT-I相互作用,蛋白质为HIV-1芽的蛋白质,并且TNIP2中的单点突变体破坏了这种相互作用。 TNIP2相关蛋白的主要基因本体类别是mRNA代谢,并且在RNA的耗尽时,这些关联的几个缔合物被丢失。鉴于TNIP2与mRNA代谢蛋白的主要关联,我们使用RNA-SEQ分析了亲和纯化的TNIP2的RNA含量。令人惊讶的是,特定有限数量的MRNA与TNIP2有关。将这些RNA富集用于转录因子结合,转录因子辅因子活性和转录调节剂活性。它们包括SIN3A复合物中基因的MRNA,介质复合物,Jun,HoxC6和GATA2。我们的研究结果结合在一起,表明TNIP2的扩展作用,在TNIP2,细胞运输机械和RNA转录过程之间建立联系。
      活化B细胞(NF-κB)的核因子κ轻链增强剂
      使用的缩写是:
      NF-κB.
      核因子Kappa轻链 - 激活B细胞的增强剂
      AHD
      Abin同源域名
      AP-MS.
      亲和纯化质谱法
      cam
      氯乙酰胺 - N - 羟甲基
      CMV
      巨细胞病毒
      DAPI.
      4',6-二氨基-2-苯基吲哚
      DNA / cDNA
      脱氧核糖核酸/互补DNA
      DNSAF.
      分布式标准化光谱丰度因子
      EABR.
      Escrt和Alix绑定区域
      Escrt.
      运输所需的内体分选复合物
      FDR.
      假发现率
      FPLC.
      快速蛋白质液相色谱
      HEK293T.
      人胚胎肾293细胞表达SV40 T抗原
      IκB.
      NF-κB. 的抑制剂
      kh域名
      异质核核糖核蛋白K同源结构域
      多维蛋白质识别技术
      PLGEM.
      权力法全球错误模型
      QPCR.
      定量聚合酶链反应
      RNA / mRNA
      核糖核酸/信使RNA
      rnase.
      核糖核酸酶
      rp.
      逆阶段
      SCX.
      强阳离子交换
      Sf21
      Spodoptera rugiperda 21细胞
      TCEP.
      特里斯 (2-羧乙基)膦
      Tev.
      烟草蚀刻病毒
      特里斯
      特里斯 (羟甲基)氨基甲烷。
      信号通路用于协调对环境变化的细胞响应。源自各种来源的信号控制转录因子系列的定位(NFKB1,NFKB2,RelA和Relb),因此控制其靶基因的转录。一个NFKB1(P105)相互作用蛋白质,TNIP2(也称为ABIN2),最初在酵母上鉴定在酵母上的两个杂交筛中,用于结合NF-κB信号传导的负调节剂的伴侣,A20(也称为TNFAIP3)(
      • van Huffel S.
      • DELAEI F.
      • heyninck K.
      • de Valck D.
      • Beyaert R.
      鉴定核因子-κB激活的新型A20结合抑制剂,称为Abin-2。
      )。除了与A20的结合,TNIP2可以抑制NF-κB信号(
      • van Huffel S.
      • DELAEI F.
      • heyninck K.
      • de Valck D.
      • Beyaert R.
      鉴定核因子-κB激活的新型A20结合抑制剂,称为Abin-2。
      )。好奇地,TNIP2也可能在激活中发挥作用; TNIP2的C末端半部融合到DNA结合结构域(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      )可以易于核心(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      )在人细胞中激活报告基因的表达。一种模型提出了内源性TNIP2的N末端半部通常可以与细胞质蛋白相互作用,从而防止这种核分配,因此控制TNIP2的活化活性(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      ),但是尚未建立控制该信号的信号机制。最近的作品还表明,当通过调节激酶Chuk的过表达刺激NF-κB途径(也称为IKKα),TNIP2可以通过激活Chuk作为NF-κB靶基因的正调节剂(
      • leotoing L.
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      • Baron S.
      • Hube F.
      • 瓦伦西亚H.J.
      • Bordereaux D.
      • Demmers J. A.
      • Strouboulis J.
      • 波特五。
      A20结合核因子-κB(NF-Kappab)-2(Abin-2)的抑制剂是NF-κB(Ikappab)激酶α(Ikkalpha)介导的NF-κB转录活性的抑制剂的活化剂。
      )。
      先前已经研究了TNIP2和其他蛋白质之间的一些物理关联。重要的是,N-末端TNIP2序列是在TNIP2和NFKB1蛋白P105之间的相互作用所必需的(P105作为前体,作为NFKB1转录因子P50的前体,也是NF-κB信号传导的抑制剂)(
      • 郎V.
      • Symons A.
      • Watton S.J.
      • Janzen J.
      • Soneji Y.
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      • 豪威尔S.
      • ley s.c。
      Abin-2与TPL-2和NF-Kappa B1 P105形成三元复合物,对于TPL-2蛋白质稳定性至关重要。
      )。 TNIP2和P105一起可以形成与MAP3K8的三元复合体(也称为TPL2)(
      • 郎V.
      • Symons A.
      • Watton S.J.
      • Janzen J.
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      • 豪威尔S.
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      Abin-2与TPL-2和NF-Kappa B1 P105形成三元复合物,对于TPL-2蛋白质稳定性至关重要。
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      • bouwmeester t.
      • 鲍奇A.
      • Ruffner H.
      • Angrand P.O.
      • 贝格明·戈尔
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      • CRUCIAT C.
      • Eberhard D.
      • Gagneur J.
      • Ghidelli S.
      • HOPF C.
      • HUHSE B.
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      • Schirle M.
      • Schlegl J.
      • 施瓦布米
      • Stein M.A.
      • 鲍尔A.
      • Casari G.
      • 德鲁斯G.
      • Gavin A.c.
      • 杰克逊D.B.
      • joberty g。
      • Neubauer G.
      • 瑞克J.
      • Kuster B.
      • Superti-Furga G.
      人TNF-α/ NF-KAPPA B信号转导通路的物理和功能图。
      )。还有证据表明TNIP2可以与其他蛋白质相互作用:STK11,SMARCD1和TEK被鉴定为酵母双杂交屏幕中的TNIP2交互式(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
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      • 休斯D.P.
      • Marron M.B.
      • Brindle n.p.j.
      抗炎内皮酪氨酸激酶Tie2与新型核因子-Kappab抑制剂Abin-2相互作用。
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      • 刘W.K.
      • Chien C.Y.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      LKB1相互作用的蛋白负调节TNFalpha诱导的NF-κB活化。
      );外源共同的TNIP2和IKBKG Cop​​urify(
      • 刘W.K.
      • 日元p.f.
      • Chien C.Y.
      • Fann M.J.
      • Su J.Y.
      • Chou C.K.
      抑制剂Abin-2破坏了受体相互作用蛋白与激酶亚基Ikkgamma的相互作用,以阻断转录因子NF-κB的激活和增强凋亡。
      );和TNIP2通过泛素结合结构域(UBD)与泛素结合(
      • 瓦格纳斯。
      • Carpentier I.
      • Rogov V.
      • kreike m.
      • Ikeda F.
      • löhrf.
      • wu c-j
      • Ashwell J.D.
      • dötschv.
      • 迪克斯I.
      • Beyaert R.
      泛素结合介导Abin蛋白的NF-κB抑制潜力。
      )。目前还没有报道全面的亲和纯化质谱AP-MS分析TNIP2相关蛋白质的分析。作为更清楚地了解与其他复合物的TNIP2相互作用的架构可能会通知未来的TNIP2可能影响NF-κB信号传导的研究,我们使用了基于晕/云的蛋白质组学方法来探讨TNIP2和其他细胞蛋白之间的相互作用。
      已建立TNIP2作为NF-κB网络中心蛋白质,我们发现除NFκB1(P105)外,我们的TNIP2制剂还包含:ESCRT-I复合物的组分,220kDa蛋白YLPM1和许多RNA结合蛋白与ylpm1单独关联。为了更精确地定义与这些因素相关联的TNIP2的部件,我们使用TNIP2突变体确定关联所需的TNIP2的近似区域,从而延伸和改进TNIP2蛋白质相互作用网络。我们的研究结果表明,TNIP2通过TSG101亚基与ESCRT-I复合物相互作用 - ESCRT-I / TSG101机械涉及许多细胞过程,包括真空蛋白质分选和HIV-1病毒萌芽(
      • Garrus J.E.
      • von schwedler u.k.
      • PorniLlos O.W.
      • 莫拉姆S.G.
      • Zavitz K.H.
      • 王熟。
      • Wettstein D.A.
      • 史密斯
      • Côtém.
      • 富人R.L.
      • myszka d.g.
      • 日出quist w.i.
      TSG101和真空蛋白分选途径对于HIV-1芽是必不可少的。
      )。最后,我们确定其与ESCRT-I复合物和YLPM1(以及相关蛋白质)相关性所需的TNIP2的短区域,还将MRNA转录物与参与调节转录的蛋白质的代码一起结合。总而言之,这些发现表明NF-κB网络集线器蛋白TNIP2的扩展作用,并将未来调查的基础奠定了基础2功能。

      实验步骤

       材料

      抗-CPSF6兔多克隆(SAB4200258),抗标签®M小鼠单克隆(F3165)和抗α-小蛋白小鼠单克隆(T9026)抗体购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO)。抗P105(AB7971),抗TJP2(AB130663),抗TSG101(AB30871)和抗TNIP2(AB13683)兔多克隆抗体,抗GAPDH(AB9484)小鼠单克隆抗体来自Abcam(剑桥,英国) 。抗TNIP2(NBP1-32689)和抗YLPM1(NBP2-22326)兔多克隆抗体来自Novus生物学(Minneapolis,Mn)。抗Halo兔多克隆抗体(G9281)和Magne™Halotag®磁性亲和力珠购自Promega(麦迪逊,Wi)。使用以下来自Kazusa DNA研究所(Kisarazu,Chiba,Japan)的克隆:NFκB1(AB489154),NFKB2(AB384801),Rel(AB464350),Rela(AB464351),Halo-TNIP2(FHC21846)和Halo-TSG101 (FHC07226)。此外,我们使用Genecopoeia™(Rockville,MD)的Halo-Relb(前G0029-M49)和Halo-YLPM1(EX-E2833-M49)。

       用于表达亲和标记蛋白在人细胞中的载体构建

      PCDNA5-FLAG,PCDNA5-HALO和CMVD2 PCDNA5-HALO的构建已被描述(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      ,
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )。通过将PCR产物(含有FLAG标签和SGFI和PMEI限制性位点插入PCLIP的多克隆部位来构建载体PCLIP标志f 矢量(新英格兰Biolabs,Ipswich,ma),使用列出的引物 补充数据S1.
      对于描述的实验 Fig. 1,对NFKB1,NFKB2,Rela,Rela和Relb编码的ORF被亚克隆到PCDNA5-Halo中,基本上如前所述(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      )。表达Halo-TNIP2 1-195和Halo-TNIP21-346的载体(描述 Fig. 2A通过使用Halo-TNIP2(FHC21846)的现场定向诱变来构建以插入过早的止挡密码子。用TNIP2 ORF的其他区域表达HALO标签的载体(描述 Fig. 2AFig. 3)使用所述引物构建 补充数据S1 产生PCR产物,其将其亚克隆到PFN21K(卤素-TNIP2 253-429和HALO-TNIP2 196-346)或卤素-CCDNA5(Halo-TNIP2 196-429和TNIP2 Y230A)中。剪辑-TSG101(Fig. 4)和标志-TNIP2 196-429(补充图S4通过将TSG101(FHC07226)或TNIP2(FHC21846)分别编码的序列序列分别以分别编码为PCLIP-FLAP或PCDNA5标志来构建。
      图缩略图GR1.
      图。1。 与NF-κB系列转录因子相关的蛋白质的Halo / Mudpit分析。 A,用卤素标记诱饵蛋白共用的蛋白质的Mudpit分析的AP-MS工作流程。用表达卤素标记的诱饵蛋白的HEK293T细胞纯化的蛋白质单独用胰蛋白酶消化(对照)并通过Mudpit质谱法鉴定。仅考虑大多数实验样品中检测到的蛋白质。统计算法PLGEM用于实验和对照重复的定量比较,并且可能富集在实验样品中,但不能控制,并根据调整后进行分类 p 值(FDRS)。 B,内源性TNIP2与几种NF-κB家族转录因子共染。 HALO标记版本的五个NF-κB系列转录因子(NFKB1,NFKB2,REL,RELA和RELB,绿色圆圈)表示为AP-MS实验的BAITS()。用NFKB1,Rel和Rela共用TNIP2(粉红色圆圈)(FDR<0.01)。 IκB复合物的组件以蓝色显示。使用每个交互的相对平均DNSAF值构造网络布局作为Cytoscape中的“边缘加权弹簧嵌入式”模型的输入(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      )。
      图缩略图GR2.
      图2。 TNIP2相关蛋白质。 A,富含TNIP2相关蛋白质用于ESCRT-I复合物的mRNA处理因子和亚基。用瞬时转染的HEK293T细胞纯化蛋白质复合物,用卤素-TNIP2()。 TNIP2相关蛋白质(FDR<0.05)用作生物信息学发现工具David V6.7的输入(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.
      大卫生物信息学资源对大型基因清单进行了系统和综合分析。
      )。用调整后富集基因本体论术语(生物过程域) p value <使用“Treemap”的Revigo观点来看待0.05(
      • Supek F.
      • Bošnakm.
      • Škuncan。
      • ŠMUCT.
      Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
      )。每个矩形的大小反映了相关的调整后 p 价值(较小的较大区域 p 价值观)。 B, D,ESCRT-I复合物和YLPM1相关蛋白质的用TNIP2的复合物。 TNIP2相关蛋白质(FDR< 0.05, 从表达卤素-TNIP2(全长)或卤素-TNIP2196-429的细胞中纯化,瞬时将具有CMV启动子(高表达)的质粒转染,或用CMVD2启动子(低表达)控制的表达稳定地转染。相对平均DNSAF值已经从五个生物学重复(瞬态)或三个生物重复(稳定)计算;误差栏是标准偏差。 C,人体细胞中卤素-TNIP2的亚细胞定位。用以下任一剂稳定地或瞬时转染细胞: 1&3)Halo-TNIP2 1-429(全长)或 2)Halo-TNIP2 196-429。卤素标记的蛋白质已标记为用Hoechst染料或DAPI(蓝色)染色的卤素标签Tmrdirect荧光配体(红色)和DNA(核)。
      图缩略图GR3.
      图3。 TNIP2的不同区域用于与NFKB1或ESCRT-I复合物的相互作用。 A,TNIP2的特征(NP_077285.3,也称为ABIN2)包括三个Abin同源域,推定的ESCRT / Alix结合区(EABR)和泛素结合结构域(UBD)。在AP-MS实验中构建了表明七个TNIP2区域的晕标记版本,用于瞬时表达。 B,平均相对dnsaf值(见 )对于指示的猎物蛋白(FDR<0.05)与TNIP2诱饵蛋白共用 A。结果是7,3,3,5,7,5或4个生物重复的七种诱饵蛋白。 C,指示的重组卤素标记蛋白在HEK293T细胞中表达并使用卤代亲和层析,与内源相关蛋白一起纯化。使用SDS-PAGE分析eluates,并通过银染色可视化的蛋白质来确认诱饵的存在。 SDS-PAGE分馏洗脱液也通过如图所示使用特异于TSG101,YLPM1或CPSF6的抗体进行蛋白质印迹来分析。
      图缩略图GR4.
      图4。 TNIP2通过TSG101亚基与ESCRT-I复合物交互。 A,不同组的TNIP2相关蛋白与TSG101或YLPM1共用。 HEK293T细胞与所示的诱饵蛋白瞬时转染。显示出指定的猎物蛋白(FDR)显示相对平均DNSAF值(FDR<0.05),由6(TSG101)或3(YLPM1)生物重复计算。误差栏代表标准偏差。 B,TNIP2和TSG101的相互作用 体外 。裂解由编码Halo-TNIP2和/或FLAG-TSG101用于卤代亲和层析的杆状病毒的SF21细胞。通过SDS-PAGE和蛋白质通过蛋白质印迹或用Coomassie Blue R-250进行染色来分析蛋白质。用抗TNIP2多克隆抗体和IRDYE®800CW检测TNIP2标记的抗兔二抗(绿色);用抗标志(M2)单克隆抗体和IRDYE®680LT标记的山羊抗小鼠二抗(绿色)检测标记标记蛋白。注意,在纯化期间,33kDa晕标签从49kDa TNIP2蛋白切割。 C,HEK293T细胞中异位表达HALO-TNIP2和夹TSG101的亚细胞定位。用卤素-TNIP2和夹子-TSG101分配细胞。晕标记的蛋白质已用卤素标签Tmrdirect荧光配体(红色)标记,夹子标记的蛋白质,具有夹Cell505荧光配体(绿色)和用Hoechst染料(蓝色)染色的DNA(核)。 D,在活细胞中TNIP2和TSG101之间的物理相互作用。 Nanobret™蛋白质相互作用测定(
      • Machleidt T.
      • Woodroofe C.C.
      • Schwinn M.K.
      • MéndezJ.
      • 罗伯斯M.B.
      • Zimmerman K.
      • otto p.
      • Daniels D.L.
      • Kirkland T. A.
      • 木头K.V.
      纳米多元 - 一种用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用的新型BRET平台。
      使用HEK293T细胞共存TNIP2(或TNIP2 TYR230ALA)用Nanoluc®(n末端)标记为TSG101,标记为HALO标签(C Terminus)。 Nanoluc®标签(能量供体)可以将能量转移到荧光标记的光环标签(接受者)接近时(
      • Machleidt T.
      • Woodroofe C.C.
      • Schwinn M.K.
      • MéndezJ.
      • 罗伯斯M.B.
      • Zimmerman K.
      • otto p.
      • Daniels D.L.
      • Kirkland T. A.
      • 木头K.V.
      纳米多元 - 一种用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用的新型BRET平台。
      )。原始供体发光值(以相对光单元(RLU))和BRET比率计算在四个生物学复制中。

       稳定细胞系的构建

      先前已经描述了稳定表达卤素TNIP2的FLP-IN-293细胞系的构造(
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )。根据制造商的说明,使用FLP-In™系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)构建FLP-In -293细胞系稳定表达Halo-TNIP2 196-429(手册25-0306)。简而言之,首先将编码TNIP2 196-429的DNA序列亚克隆到CMVD2 PCDNA5-HALO中,其含有潮霉素抗性基因和两个FLP重组靶(FRT)位点。将所得载体与表达FLP重组酶(POG44)的载体分配给FLP-IN-IN -293细胞(也含有FRT位点),并且细胞在含有潮霉素B的培养基中生长。卤素-TNIP2 196-429中的表达通过蛋白质印迹确认所得到的潮湿细胞的菌落。

       从人细胞制备全细胞提取物

      大约2×107 通过使用Lipofectamine LTX(Thermo Fisher Scientific)在图中编码卤素或标记标记蛋白质的DNA构建体转染HEK293T或HELA细胞。转染后收获细胞〜48小时。或者,1×108 培养稳定表达卤素标记蛋白的FLP-IN-293细胞72小时并收获。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次,并且细胞颗粒在-80℃下冷冻并解冻。然后将细胞重悬于含50μm的缓冲液中m TRIS·HCl(pH 7.5),150米 m NaCl,1%Triton®X-100,0.1%脱氧核酸钠,0.1米m 苯甲酰氨基HCl,55μm phenanthroline, 10 μm bestatin, 20 μm leupeptin, 5 μm pepstatin A, and 1 mm PMSF。然后通过26·仪表通过26·仪表的针5次,通过以21,000×以21,000×离心裂解物除去不溶性物质 g 在4°C下30分钟。然后通过700μlTBS稀释来自瞬时转染的细胞的30​​0μL全细胞提取物(50米m TRIS·HCL pH 7.4,137米m NaCl, 2.7 mm KCL);使用来自稳定细胞系的1000μL全细胞提取物而无需稀释。提取物以21,000×离心 g 在4℃下10分钟以除去不溶性材料。

       重组蛋白在昆虫细胞中的表达

      首先将编码Halo-TNIP2,FLAG-TSG101或FLAG-MCHERRY(对照)的序列括成PBacpak8(Takara Biotechnology,山景,CA)。杆状病毒表达系统(Takara Biotechnology)用于根据制造商的指示产生重组杆状病毒。在27℃下在SF-900 III III III III血清自由培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养SF21细胞。包含~1×10的烧瓶8 SF21细胞感染了所示的病毒 Fig. 4B 感染后48小时收获。将细胞溶解在10ml含有50μm的冰冷缓冲液中m HEPES-NaOH(pH 7.9),0.15 m NaCl, 5 mm MgCl2,0.2%Triton X-100,20%(v / v)甘油,0.1米m 苯甲酰氨基HCl,55μm phenanthroline, 10 μm bestatin, 20 μm leupeptin, 5 μm pepstatin A, and 1 mm PMSF。裂解物以20,000×离心 g 在4℃下持续30分钟以除去不溶性材料。

       Halo亲和纯化蛋白质复合物

      含有晕标记诱饵蛋白的全细胞提取物与由100μlMag™Halotag®珠浆料的珠子一起温育,根据制造商的指示在4°C下进行2小时。用50米的缓冲液洗涤珠子四次洗涤四次m TRIS·HCL pH 7.4,137米m NaCl, 2.7 mm KCl,0.05%Nonidet®P40。通过将珠子与含有50μm的缓冲液孵育珠粒洗脱结合的蛋白质m TRIS·HCL pH 8.0,0.5米m EDTA, 0.005 mm DTT,2个单位Actev™蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)在25°C下2小时。通过在进一步分析之前通过微生物旋转柱(Bio-Rad,Hercules,CA)离心洗脱液来除去残留的珠子。

       国旗免疫沉淀蛋白质复合物

      将含有标记标记诱饵蛋白的全细胞提取物与50μL抗标志(M2)琼脂糖珠在4℃下孵育2小时。用50米的缓冲液洗涤珠子四次洗涤四次m TRIS·HCL pH 7.4,137米m NaCl, 2.7 mm KCl,0.05%Nonidet®P40。通过在4℃下在4℃下孵育珠子过夜洗脱结合的蛋白质,含有0.3mg / ml 3×标志肽的100μlTBS。通过在进一步分析之前通过微生物旋转柱(Bio-rad)离心洗脱液来除去残留的珠粒。

       蛋白质复合物的Mudpit分析

      卤素纯化蛋白质用三氯乙酸沉淀,将所得沉淀用丙酮洗涤两次,并重新悬浮含有100米的缓冲液中的蛋白质m TRIS·HCL pH 8.5和8 m urea(
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      多维蛋白质识别技术的蛋白质组学分析。
      )。将样品与0.5米温育m Tris(2-羧乙基) - 盐酸膦(TCEP),以减少二硫键,然后用氯乙酰胺(CAM)以防止二硫键重构。然后用内蛋白酶Lys-C消化蛋白质;尿素浓度降至2 m 通过添加合适的100米m Tris·HCl pH8.5,并用胰蛋白酶进一步消化蛋白质过夜。然后将样品加载到三相熔融二氧化硅微小柱(反相(RP);强阳离子交换(SCX);反相(RP))。使用季型FPLC泵(Agilent,Santa Clara,CA)在柱中逐渐从柱中逐渐洗脱,如前所述(
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      多维蛋白质识别技术的蛋白质组学分析。
      )。使用线性离子阱(LTQ)质谱仪(Thermo Fishific)以正离子模式分析肽。内部软件包RawDisteriller v。1.0用于将生成的.law文件转换为.ms2文件。然后使用续集算法(2010年11月,2010年11月,2010年11月的国家生物技术信息,2010年11月,第27页,Rev.9)匹配MS / MS光谱(第9版)(
      • 塔巴D.
      • ENG J.
      • YALES III,J.
      )。在搜索期间没有施加酶特异性。使用+57道尔顿的静态修饰用于半胱氨酸残基,以解释羧酰胺甲基化。用于+16Da的可变搜索来解释甲硫氨酸氧化。将大规模耐受性设定为3 AMU的前体离子和0 AMU用于片段离子。随后滤出不准确的比赛,并使用DTASELECT组装在每个样品中鉴定的蛋白质清单(使用参数:0.08的最小DELTCN,最小XCorr值为1.8(单电量光谱),2.5(双电荷光谱),或3.5(三次充电光谱)或3.5(三次带电光谱),最大SP等级10,以及7个氨基酸的最小肽长度)(
      • 塔巴D. L.
      • 麦当劳W.H.
      • YALES III,JR。
      DTASELECT和对比度:用于组装和比较霰弹枪蛋白质组学蛋白质标识的工具。
      )。只考虑完全胰蛋白酶肽。使用这些选择标准,92个Mudpit运行的平均光谱FDR为0.28%±0.31%(标准偏差),平均蛋白质FDR为2.62%±1.83%(标准偏差)。相反,使用Parsimony选项除去其他其他子集的蛋白质。将通过相同一组肽(包括与设定的至少一种肽仅区分同种型)鉴定的蛋白质被分组;一个代表性登录号码用于描述集合。我们已经报道了本研究中使用的一些质谱数据以前(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      ,
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      );这里使用的所有质谱数据集的列表以及首次报告的位置的详细信息 补充表S2。已将质谱数据集沉积在PeptiDaitlas储存库中(
      • Desiere F.
      • 德意曲e.w.
      • 国王N.L.
      • nesvizhskii a.i.
      • Mallick P.
      • ENG J.
      • 陈S.
      • eddes J.
      • Loevenich S.N.
      • Aeberberold R.
      PeptidAtlas项目。
      )( www.peptidaatlas.org.)或在庞大的存储库中(http://massive.ucsd.edu),上市的标识符 补充表S2.

       实验设计与统计理由

      相对于对照样品(FDR)相对于对照样品,具有高概率的蛋白质列表(FDR<如前所述产生0.05)(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      ,
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )。简而言之,我们首先使用对比度和NSAF7软件来使用光谱计数计算DNSAF值,并生成存在的蛋白质列表>50%的实验重复。然后我们使用PLGEM信号噪声方法,以便在实验中富集列表中的哪些蛋白质,但不在对照样品中(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      ,
      • Pavelka N.
      • 四分之四的M.L.
      • Swanson S.K.
      • Pelizzola M.
      • Ricciardi-Castagnoli P.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录组织与定量霰弹枪蛋白质组学数据之间的统计相似性。
      )。根据PLGEM计算假发现速率(FDRS) p 使用Benjamini和Hochberg方法来纠正多种比较的值(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率:多次测试的实用和强大的方法。
      )。每个实验使用至少三种生物重复(补充表S2)。对于使用瞬时转染的细胞的实验,每个诱饵使用的生物重复数如下:11(卤素控制); 5(Halo-rel); 6(Halo-Rela); 5(Halo-Relb); 5(Halo-NFKB1); 5(Halo-NFKB2); 5(Halo-TNIP2); 4(Halo-TNIP2 196c); 6(Halo-TSG101); 3(Halo-ylpm1); 3(Halo-YLPM1 Y230A); 3(Halo-TNIP2 1-346); 5(Halo-TNIP2 1-195); 7(Halo-TNIP2 196-346); 5(Halo-TNIP2 253-429); 3(Halo TNIP2 196-346 +苯并酶)。对于使用稳定转染的细胞的实验,每个诱饵使用的生物重复的数量如下:4(对照); 3(Halo-TNIP2 CMVD2); 4(Halo-TNIP2 196C CMVD2)。当Mudpit质谱运行失败时(4个样品:卤素控制#1; Halo-TNIP2#4; Halo-TNIP2(稳定)#3;和Halo-TNIP2 Y230A#2),或者当较少检测到对应于诱饵蛋白的500mS / MS光谱(Halo-TNIP21-195#1)。 Mudpit运行失败发生在堵塞(3个样本)或在运行期间用质谱仪达到柱子的末端时,在柱子中未对准时发生错误(1个样品)。

       荧光显微镜

      对于使用瞬时转染的细胞的实验,HEK293T细胞将细胞接种到玻璃底部培养皿(MATTEK,ASHLAND,MA)上并用所示的晕标记或夹标签构建体进行转染(Fig. 2CFig. 4C)。在生长期间荧光标记的蛋白质荧光标记的蛋白质,用卤素标签Tmrdirect配体(Promega),用夹子-Cell505配体(新英格兰Biolabs),或根据制造商的说明用两个配体。实验 Fig. 2 C行3. ,在成像之前固定细胞在含有4%多聚甲醛,200米的溶液中进行固定m 在室温下蔗糖和1×PBS 10分钟;然后用1×PBS洗涤细胞两次。 DNA用DAPI(固定细胞)或Hoechst染料(活细胞)染色。使用Ultraview旋转盘共聚焦显微镜(Perkin Elmer,W​​altham,MA)收集图像。

       纳米二氧雷测定

      通过将NaNOMuc-TNIP2供体质粒(1:20比率),纳米ret对照载体,纳米克雷特对照载体或控制PSPORPORT6,以0.1μLX-Tremegene HP(Roche,Indianapolis, IN)苯酚红和血清免费DMEM(LONZA,巴塞尔,瑞士)的脂质,最终体积为20μL。将转染混合物分配到384W白色不透明的组织培养物处理的微孔板(康宁,康宁,NY)中并在室温下孵育20分钟。将293T(ATCC,Manassas,VA)细胞悬浮在苯酚红色的浓度为250,000个细胞/ ml中,并将含有20%炭剥离的FBS(康宁)和20μl的血清免费DMEM分配到每个孔中。将细胞在37℃和5%CO温育2 for at least 24 h.
      将纳米ret 618配体(promega)稀释至200 nm 在将2μL纳米ret 618配体或DMSO对照中加入每个孔之前,在酚醛红色和血清免费DMEM中。将细胞在37℃温育°C和5%CO2 for 4 h. A 30 μm 在向每个孔中加入20μL之前,在酚红色和血清自由DMEM中制备纳米多元纳米轧烷溶液(Promega)。将板置于板振动器上,在室温下温和搅拌5分钟。然后将平板在室温下温育5分钟以允许平衡。使用时间分辨的荧光强度模式在Envirision多媒体读卡器上读取平板,其中460 nm 发射滤波器(供体信号)(PerkinElmer),Chroma Et610LP发射滤波器(受体信号)和发光双镜(PerkinElmer)。

       RNA下拉测定

      大约1×108 瞬时转染的HEK293T细胞在含有50米的300μl冰冷缓冲液中裂解裂解m TRIS·HCl(pH 7.5),150米 m NaCl,1%Triton®X-100,0.1%脱氧核酸钠,0.1米m 苯甲酰氨基HCl,55μm phenanthroline, 10 μm bestatin, 20 μm leupeptin, 5 μm pepstatin A, 1 mm PMSF, 1 mm Dithiothreitol,和0.4u /μlRNaseout™(Thermo Fisher Scientific)。然后将裂解物通过26号针5次,以21,000×离心 g 在4℃下30分钟,用700μLTBS稀释所得上清液(50米m TRIS·HCL pH 7.4,137米m NaCl, 2.7 mm KCL)。如上所述,使用Halotag®磁性亲和力珠粒从900μL全细胞提取物中纯化蛋白质复合物;用2个含有50米的100μl缓冲液中的2个单元Actev™蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)洗脱复合物m TRIS·HCL pH 8.0,0.5米m EDTA, and 0.005 mm DTT和40个单位的RNaseout™。根据制造商的说明,使用RNEASY®Mini套件(Qiagen,Germantown,MD)由100μL全细胞提取物或90μL卤素纯化样品制备总RNA。在RNA纯化期间除去残留的DNA,用DNase I.使用IScript TM逆转录超混合物(Bio-rad)逆转录RNA,通过PCR分析所得的cDNA,然后通过琼脂糖凝胶电泳进行分析(Fig. 5B)或使用Myiq™实时检测系统(Bio-Rad)的QPCR(Fig. 5C)。用于分析cDNA的PCR引物列于 补充数据S1。基本上如前所述进行RNA测序(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      )。测序的文库与Tophat对齐UCSC HG19参考基因组(
      • 金D.
      • ertea G.
      • Trapnell C.
      • Pimentel H.
      • Kelley R.
      • Salzberg S.L.
      TOPHAT2:在存在插入,缺失和基因融合的情况下,转录om的精确对准。
      )。 RNA-SEQ数据集已沉积在登录号下的NCBI Geo(基因表达式Omnibus)存储库中: GSE79656. .
      图缩略图GR5.
      图5。 用TNIP2复合物的mRNA的共用。 A,在核酸酶存在下纯化TNIP2络合物。 HEK293T瞬时转染HEK293T细胞的裂解物与HALO-TNIP2196-346进行卤素亲和色谱法(三种生物重复)或没有(七种生物重复)的内切酶苯并酶®。通过Mudpit分析eluates,并绘制指定的猎物蛋白的相对平均dnsaf值()。误差栏是标准偏差。 B,TNIP2复合物包含KHDRBS1相关的MRNA。在RNA酶抑制剂存在下,将用Halo-TNIP2 196-429或单独的卤素对照(单独标签)转染的HEK293T细胞的裂解物在RNA抑制剂存在下进行卤代亲和层析。从洗脱液中纯化总RNA并逆转录。通过PCR分析所得cDNA的CDNA,通过PCR进行KHDRBS1相关的MRNA,其次如上所述(
      • Paronetto M.P.
      • Achsel T.
      • Massiello A.
      • Chalfant C.E.
      • 制定C.
      RNA结合蛋白SAM68调节BCL-X的替代剪接。
      )(KHDRBS1也称为SAM68)。使用的引物的细节正在进行中 . C,mRNA与TNIP2 196-346区特异性。卤素纯化的蛋白质复合物从用指示的蛋白质转染的HEK293T细胞(三种生物重复)纯化。从这些纯化中提取的RNA被逆转录并通过定量PCR使用用于所述BCL2L1和GAPDH的两个转录物变体的底漆进行分析 。在类似纯化中检测到蛋白质NFKB1,TSG101,YLPM1和CPSF6的相对量(另见 B)显示为比较。

      结果

        NF-κB. 系列转录因子的Halo / Mudpit分析

      以前,我们开发了一种工作流程,我们使用卤素/ MUDPIT AP-MS(亲和纯化质谱)分析来研究REARA相关蛋白质(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      )(此工作流程概述 Fig. 1 一种- 修改版本 Fig. 1A 在我们以前的工作中(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      )在这里显示为清晰度)。为了开发所有NF-κB转录因子之间的蛋白质相互作用网络,我们进一步表达HEK293T细胞中其他NF-κB转录因子(NFKB1,NFKB2,RelB)的晕标记版本。通过使用卤素亲和色谱法从细胞中纯化的蛋白质复合物通过如上所述(NF-κBHALO/ MUDPIT分析中鉴定的蛋白质列表,以及我们之前首次报道了哪些纯化的描述(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      ),被列入 补充表S2)。我们使用五种诱饵蛋白构建的NF-κB蛋白质相互作用网络如图所示 Fig. 1B,并揭示了几种与NF-κB转录因子中的多种蛋白质相关的蛋白质。在网络中心蛋白中,我们鉴定了IκB蛋白(NFKBIA,NFKBIB和NFKBIE),其据报道,通过在细胞质中螯合它们来归结并抑制NF-κB二聚体(
      • baeuerle p.a.
      • Baltimoire D.
      IκB. :NF-κB转录因子的特异性抑制剂。
      )。与Bouwmeester先前的研究一致 等等。 (
      • bouwmeester t.
      • 鲍奇A.
      • Ruffner H.
      • Angrand P.O.
      • 贝格明·戈尔
      • 克劳兰克K.
      • CRUCIAT C.
      • Eberhard D.
      • Gagneur J.
      • Ghidelli S.
      • HOPF C.
      • HUHSE B.
      • Mangano R.
      • Michon A.M.
      • Schirle M.
      • Schlegl J.
      • 施瓦布米
      • Stein M.A.
      • 鲍尔A.
      • Casari G.
      • 德鲁斯G.
      • Gavin A.c.
      • 杰克逊D.B.
      • joberty g。
      • Neubauer G.
      • 瑞克J.
      • Kuster B.
      • Superti-Furga G.
      人TNF-α/ NF-KAPPA B信号转导通路的物理和功能图。
      ),我们还在我们的卤素-NFKB1,卤素 - rel和Halo-Rela的制剂中鉴定了一种网络中心蛋白TNIP2(也称为Abin2或Flip1)(Fig. 1B)。尽管先前已被证明TNIP2与未处理的NFKB1(P105)相互作用(
      • 郎V.
      • Symons A.
      • Watton S.J.
      • Janzen J.
      • Soneji Y.
      • Beinke S.
      • 豪威尔S.
      • ley s.c。
      Abin-2与TPL-2和NF-Kappa B1 P105形成三元复合物,对于TPL-2蛋白质稳定性至关重要。
      )可以调节NFκB活动(
      • 刘W.K.
      • Chien C.Y.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      LKB1相互作用的蛋白负调节TNFalpha诱导的NF-κB活化。
      ),TNIP2和其他细胞组分之间的相互作用尚未完全表征。

       TNIP2与ESCRT-I复合物和mRNA处理因素相关联

      在我们的NF-κB网络中鉴定TNIP2作为中心蛋白,我们希望研究TNIP2和其他蛋白质组之间的关联。我们最近确定了98个蛋白质(FDR<0.05)与从瞬时转染的HEK293T细胞纯化的Halo-TNIP2相关(
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )(因为清楚起见) 补充表S3)。我们现在分析了与这些蛋白质相关的基因本体论术语,以鉴定具有常见生物学功能的蛋白质组,发现许多TNIP2相关蛋白涉及蛋白质转运和mRNA代谢(Fig. 2A)。具体地,除了NFKB1,含有TNIP2纯化:内体分选复合复合体的亚基Escrt-i(
      • Garrus J.E.
      • von schwedler u.k.
      • PorniLlos O.W.
      • 莫拉姆S.G.
      • Zavitz K.H.
      • 王熟。
      • Wettstein D.A.
      • 史密斯
      • Côtém.
      • 富人R.L.
      • myszka d.g.
      • 日出quist w.i.
      TSG101和真空蛋白分选途径对于HIV-1芽是必不可少的。
      ,
      • STUCHELL M.D.
      • Garrus J.E.
      • MüllerB.
      • 史密斯
      • 渴亚的
      • 麦肯尼·罗
      • kräusslichh-g
      • 莫拉姆S.G.
      • 日出quist w.i.
      转运(ESCRT-I)所需的人内体分选复合物及其在HIV-1萌芽中的作用。
      ,
      • Stefani F.
      • 张L.
      • 泰勒斯。
      • Donovan J.
      • Rollinson S.
      • Doyotte A.
      • 朗希尔K.
      • 奔西j.
      • 皮革棕色S.
      • 伍德曼P.
      Ubap1是一种专用的ESCRT-I复合物的组成部分,对于MVB分类至关重要。
      ,
      • 伊斯特曼S.W.
      • Martin-Serrano J.
      • 钟W.
      • 臧T.
      • Bieniasz P.D.
      人VPS37C的鉴定,运输所需的内体分选复合物的组分 - 对于病毒芽来说重要。
      ,
      • bache k.g.
      • Slagsvold T.
      • Cabezas A.
      • rosendal k.r.
      • Raiborg C.
      • 捷卡H.
      生长调节蛋白HCRP1 / HVPS37A是哺乳动物ESCRT-I的亚基,并介导受体下调。
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      • 莫提塔E.
      • 桑德林V.
      • 阿拉姆S.
      • Eckert D.
      • Gygi S.
      • 日出quist w.i.
      人MVB12蛋白作为Escrt-I亚基的鉴定,其在HIV芽中起作用。
      )及其相关的蛋白质pdcd6ip(
      • Martin-Serrano J.
      • Yarovoy A.
      • Perez-Caballero D.
      • Bieniasz P.D.
      通过使用替代衔接蛋白,发散逆转录的后期萌芽结构域募集血泡蛋白质分选因子。
      )(也称为Alix)和TBK1(
      • 大Q.
      • 杨X.
      • 徐Y.
      • 高G.
      • 郑G.
      • 唐H.
      Tank结合激酶1通过靶向运输 - I所需的内体分选复合物衰减PTAP依赖性逆转录病毒萌芽。
      );核YLPM1蛋白(也称为ZAP3)及其相关的RNA结合蛋白KHDRBS1(也称为SAM68)(
      • ulke-leméea。
      • Trinkle-Mulcahy L.
      • 南部
      • 伯恩斯坦N.K.
      • 莫里斯N.
      • 格洛弗米
      • Lamond A.I.
      • moorhead g.b.g.
      核PP1相互作用蛋白ZAP3(ZAP)是一种推定的核苷激酶,其与SAM68,CIA,NF110 / 45和HNRNP-g复合。
      ); RNA剪接因子KHSRP(也称为KSRP)(
      • 闵H.
      • Turck C.W.
      • Nikolic J.M.
      • 黑色D.L.
      一种新的调节蛋白,KSRP,通过内含内剪接增强剂介导外显子夹杂物。
      );核基质蛋白质matr3(也与RNA结合)(
      • Salton M.
      • 麋鹿r.
      • BORODINA T.
      • 达维多夫A.
      • yaspo m-l
      • 洛珀林E.
      • Shiloh Y.
      matrin 3结合并稳定mRNA。
      );和参与聚腺苷酸的RNA转录物的蛋白质(包括CPSF6和CPSF7)(
      • 施y.
      • di giammartino d.c.
      • 泰勒D.
      • Sarkeshik A.
      • 米W.J.
      • YALES III,J.R.
      • 弗兰克J.
      • Manley J.L.
      人前MRNA 3 +加工复合物的分子结构。
      )( Fig. 2B )。
      尽管亲和力标记诱饵蛋白的瞬态过度表达通常用于调查蛋白质相互作用,但是Gibson和同事已经表明,由过表达诱饵(例如不正确的蛋白质定位)引起的问题可以被工程细胞系抵消,该工程细胞系稳定表达诱饵蛋白在类似于类似的水平的诱饵蛋白质内源性蛋白质(
      • 吉布森T.J.
      • Seiler M.
      • Veitia R.A.
      瞬态过度表达的特性。
      )。我们以前在较弱的CMVD2启动子接近内源水平的控制下在HEK293细胞中构建了在HEK293细胞中稳定表达HALO-TNIP2的细胞系(补充图。S1),并且还鉴定了从这些细胞纯化的复合物亲和力中存在的蛋白质(
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )(我们已经复制了这个之前的分析 补充表S3 为了清楚起见)。与瞬时转染的细胞一样,在这些细胞中稳定表达卤素TNIP2,我们检测到ESCRT-I复合物的NFKB1,亚基,但PDCD6IP,但我们检测到较低水平的MOT3,并且未能检测到其他RNA处理蛋白质和YLPM1用瞬时过表达的TNIP2(Fig. 2B )。
      与瞬时过表达的卤素-TNIP2和稳定表达的卤素-TNIP2共用的蛋白质之间的这些差异与Chien和Codorkers提出的TNIP2局部化模型一致(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      ,
      • 刘W.K.
      • Chien C.Y.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      LKB1相互作用的蛋白负调节TNFalpha诱导的NF-κB活化。
      )。他们提出了调节TNIP2的定位:TNIP2通常在细胞质中(它们表明TNIP2通常可以通过其N末端和FLNA之间的相互作用在细胞质中被隔离(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      ));他们发现去除TNIP2的N末端导致部分重核化对核(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      ,
      • 刘W.K.
      • Chien C.Y.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      LKB1相互作用的蛋白负调节TNFalpha诱导的NF-κB活化。
      )。与之一致我们发现,而我们的全长稳定表达卤素TNIP2主要在细胞质中检测到(Fig. 2C 1),我们构建的TNIP2突变体缺乏N末端(Halo-TNIP2 196-429),部分地定位于细胞核(Fig. 2C 2)。此外,我们注意到我们瞬时转染的细胞中的过度表达(全长)Halo-TNIP2具有少量核卤素TNIP2(Fig. 2C 3)在一些似乎以特别高水平表达蛋白质的细胞中。这些观察结果与Chien提出的模型一致 等等。 (
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      ),TNIP2随着条件的变化重新定位于细胞核,并且可以解释为什么只在卤素-TNIP2部分核的条件下鉴定一些TNIP2相关蛋白。为了进一步测试这个想法,我们分析了稳定表达TNIP2版本的细胞缺少N末端(Halotnip2 196-429),以测试YLPM1是否再次与诱饵共用(Fig. 2 D, 补充表S3)。与全长Halo-TNIP2相反,使用CMVD2启动子的Halo-TNIP2 196-429不仅与ESCRT-I复合物兼容,还稳定地表达:YLPM1; YLPM1相关蛋白KHSRP,MOTR3,SFPQ,壬二和PSPC1;和cpsf6 / 7(Fig. 2D)。部分核TNIP2196-429和YLPM1 / YLPM1相关蛋白质之间的这种关联也与人体细胞中报告的YLPM1(和相关蛋白)的核定位(www.proticinatlas.org. (
      • 贝格尔顿L.
      • björlinge.
      • oksvold p.
      • Fagerberg L.
      • Asplund A.
      • szigyarto ca-k
      • 佩尔森A.
      • ottsson J.
      • wernérush.
      • Nilsson P.
      • Lundberg E.
      • Sivertsson A.
      • 纳瓦尼S.
      • Wester K.
      • Kampf C.
      • 回暖
      • Ponténf。
      • UhlénM.
      基于抗体的表达型材的基因中心蛋白质图集。
      )))。

       NFKB1和ESCRT-I与TNIP2的不同区域相关联

      TNIP2是三种同源蛋白质(也称为abins)之一,最初在酵母双杂交筛网中鉴定为TNFAIP3的结合伴侣(A20)(
      • Verstrepen L.
      • Carpentier I.
      • Verhelst K.
      • Beyaert R.
      abins:Nf-κB和凋亡信号的A20结合抑制剂。
      ,
      • heyninck K.
      • de Valck D.
      • 万民贝尔格尔W.
      • van criekinge w。
      • COLLERAS R.
      • 菲尔德W.
      • 哈贝克
      • Beyaert R.
      通过干扰RIP-或TRAF2介导的转移信号,锌指蛋白A20抑制TNF诱导的NF-κB依赖性基因表达,并直接结合新的NF-κB抑制蛋白Abin。
      )。三种蛋白质的同源性患者称为Abin同源域(AHD)。 429个氨基酸TNIP2蛋白含有三个AHD结构域,以及泛素结合结构域或UBD(Fig. 3A)。 TNIP2还含有与蛋白质CEP55内的Escrt-和Alix结合区域(EABR)具有同源性的区域。在CEP55中,该EABR区域介导CEP55与内体分选复合复合体Escrt-i的TSG101亚基之间的相互作用(
      • 莫提塔E.
      • 桑德林V.
      • Chung H-Y
      • 莫拉姆S.G.
      • Gygi S. P.
      • Rodesch C.K.
      • 日出quist w.i.
      人类Escrt和Alix蛋白与中间体的蛋白质和细胞因子的功能相互作用。
      ,
      • 李H.H.
      • elia n。
      • Ghirlando R.
      • Lippincott-Schwartz J
      • Hurley J.
      在CEP55中由非规范卷绕线圈瞄准ESCRT机械的阵地。
      )。尽管如此,TNIP2与ESCRT-I复合物之间的相互作用先前没有经验化特征。确定了许多与全长TNIP2蛋白共用的因素,我们寻求定义TNIP2的区域,这对这些因素与TNIP2之间的关联更重要。要执行此操作,我们首先将TNIP2 ORF的区域的区域括起来的晕标记版本 Fig. 3A 进入HEK293T细胞中表达的哺乳动物表达载体(Halo-TNIP21-429和Halo-TNIP2 253-429构建体也用于先前的研究(
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )))。以前突出显示的蛋白质与与TNIP2相互作用(Fig. 2),与这些各种TNIP2突变体一致纯化的那些(FDR<0.05)描述于 Fig. 3B。列出了每个TNIP2突变分析的TNIP2相关因子的完整列表 补充表S4 (再次包括我们先前报道的蛋白质分析,在该表中为清楚起见,哈洛TNIP2 1-429和Halo-TNIP2 253-429(
      • 银行C.A.S.
      • Boanca G.
      • 李Z.T.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      蛋白质与克隆疤痕相互作用:假阳性蛋白质 - 蛋白质相互作用的来源。
      )))。与先前表征在NFKB1和TNIP2之间的特征相互作用一致(
      • 郎V.
      • Symons A.
      • Watton S.J.
      • Janzen J.
      • Soneji Y.
      • Beinke S.
      • 豪威尔S.
      • ley s.c。
      Abin-2与TPL-2和NF-Kappa B1 P105形成三元复合物,对于TPL-2蛋白质稳定性至关重要。
      )内源性NFκ1未与缺少N-末端195氨基酸的TNIP2突变体共用(Fig. 3B,车道5-7)但与包含这些氨基酸的突变体合并(Fig. 3B,车道1-4)。为了测试TNIP2内的注释EABR区域是否对于TNIP2和ESCRT-I复合之间的关联非常重要,我们构建了一个点突变体,Halo-TNIP2 TYR230ala。李和同事(
      • 李H.H.
      • elia n。
      • Ghirlando R.
      • Lippincott-Schwartz J
      • Hurley J.
      在CEP55中由非规范卷绕线圈瞄准ESCRT机械的阵地。
      )已经确定了Tyr187 在CEP55的EABR中作为CEP55与ESCRT机械相互作用的关键残留物。我们确定了Tyr.230 作为TNIP2的EABR内的等同残留物(概述 补充数据S1)。 Halo-TNIP2 TYR230ALA未能与ESCRT-I复合物联系(Fig. 3B,泳道2)。这与TNIP2的EABR区域与ESCRT-I复合物之间的物理相互作用一致。此外,我们观察到随着哈洛-TNIP2 TYR共用的YLPM1 /相关蛋白数量的减少,但不是完全丧失 230与Halo-TNIP2相比(比较 Fig. 3B,车道12)。在TNIP2中的151个氨基酸区,其包括与ESCRT-I复合物和YLPM1和其相关的RNA结合蛋白相关的EABR(Halo-TNIP2196-346)(Fig. 3B,泳道5)和不包含EABR但确实包括两个Abin同源域(Halo-TNIP2 253-429)的重叠区域,既不挂钩ESCRT-I复合物也不绑定YLPM1。这表明TNIP2 196-252内的区域是TNIP2和ESCRT-I和YLPM1之间的关联所必需的(Fig. 3B, lane 6 )。
      为了提供额外的证据,TNIP2的不同区域对其与NFKB1和ESCRT-I复合物的关联非常重要,我们再次纯化与我们各种TNIP2诱饵相关的蛋白质,并且这次使用SDS-PAGE和可视化蛋白质通过银将eluate分离染色或蛋白质印迹(Fig. 3C)。如前所述,我们在包含区域TNIP2 1-195中的TNIP2净化中检测到NFKB1(Fig. 3C Lanes 1-4),我们检测到TNIP2 196-346区域TNIP2的纯化中的TSG101(ESCRT-I亚基),YLPM1和CPSF6(Fig. 3C Lanes 1,3,5,7)。通过质谱法(TJP2)在TNIP2络合物中未检测到未检测到的蛋白质的对照实验表明我们在我们的Western印迹分析中没有发现蛋白质(补充图S2 )。
      为了进一步验证我们的结果,我们使用不同的细胞类型或不同的纯化方法进行了另外的类似实验。首先,我们在HeLa细胞中表达Halo-TNIP2或Halo-TNIP2 196-429,并进行了晕圈下拉实验(补充图S3)。与HEK293T细胞提取物一样,我们发现在HeLa细胞提取物中,用全长和截短的TNIP2的截短版本为内源性的YLPM1。同样符合我们的HEK293T细胞观察,我们检测到NFKB1(P105)与全长TNIP2共用,但不使用TNIP2 196-429。其次,我们在HEK293T细胞中表达了FLAG-TNIP2 196-429,并进行了标志COIMMUNOCHIPIPITIP实验(补充图S4)。与Halo-TNIP2 196-429,YLPM1和TSG101一起使用,与Flag-TNIP2 196-429共用。

       TNIP2与ESCRT-I Subunit TSG101交互

      如我们观察到与ESCRT-I复合物的TNIP2联合通过突变EABR内的单个氨基酸而破坏,我们想调查TNIP2是否与ESCRT-I亚单元进行物理相互作用。李和同事先前曾在CEP55的EABR域之间表现出直接的互动,而ESCRT-I亚基TSG101(
      • 李H.H.
      • elia n。
      • Ghirlando R.
      • Lippincott-Schwartz J
      • Hurley J.
      在CEP55中由非规范卷绕线圈瞄准ESCRT机械的阵地。
      ),因此我们决定检查TNIP2是否与TSG101类似地与ESCRT-I亚基同意。我们首先询问重组TSG101是否可以与人体细胞中ESCRT-I复合物的其他组分相关联。使用在HEK293T细胞中表达的重组卤素-TSG101,我们能够拉下我们观察到与TNIP2共用的其他ESCRT-I子单元(Fig. 4 一种, 紫色酒吧)。我们没有任何其他TNIP2相关蛋白质,其我们专注于用Halo-TSG101共用。此外,当我们使用Halo-ylpm1作为AP-MS研究的诱饵时,我们发现内源Escrt-i没有用ylpm1合作。有趣的是,我们确实识别了卤素 - YLPM1纯化中的许多其他TNIP2相关蛋白,我们现在称为YLPM1相关蛋白(Fig. 4 一种, 红色棒)。这些包括:含有RNA结合蛋白KHSRP和KHDRBS1的KH结构域(
      • Briata P.
      • 陈C.
      • Giovarelli M.
      • Pasero M.
      • Trabucchi M.
      • 拉莫斯A.
      • Gherzi R.
      KSRP,单一蛋白质的许多功能。
      ,
      • Bielli P.
      • busàr.
      • Paronetto M.P.
      • 制定C.
      RNA结合蛋白SAM68是人类癌症中的多功能球员。
      )和核ParaSpeckle组件PSPC1,Nono和SFPQ(
      • 福克斯A.H.
      • Lamond A.I.
      paraSpeckle。
      ),与MOTR3一起(MITR3也以先前发现的SFPQ / NONO(
      • 张Z.
      • carmichael g.g.
      细胞核中dsRNA的命运:P54(NRB) - 致癌复合物介导比例的A-to-I编辑RNA的核保留。
      )))。观察到Halo-TSG101与人体细胞中Escrt-I复合物的组分之间的关​​联,我们决定检查重组TSG101和TNIP2蛋白是否可以在不存在可能介导相互作用的其他人蛋白质的情况下相互作用。我们用重组杆状病毒感染了SF21昆虫细胞,用于单独编码Flag-TSG101和Halo-TNIP2,或单独使用Flag-TSG101,并使得到的全细胞提取物至卤素亲和纯化(Fig. 4B)。 FLAG-TSG101用Halo-TNIP2共用(lane 3); TSG101和TNIP2之间的相互作用似乎是直接的,因为在我们的TNIP2 / TSG101制剂中仅检测到TEV蛋白酶和非常少量的其他蛋白质( lane 5)。在对照实验中,SF21细胞表达的Flag-MCHerry没有特别用Halo-TNIP2捏( 补充图S5)。除了使用生化方法询问TNIP2和TSG101是否可以在昆虫细胞提取物中相互作用,我们使用NaNobRet™蛋白质 - 蛋白质相互作用系统(
      • Machleidt T.
      • Woodroofe C.C.
      • Schwinn M.K.
      • MéndezJ.
      • 罗伯斯M.B.
      • Zimmerman K.
      • otto p.
      • Daniels D.L.
      • Kirkland T. A.
      • 木头K.V.
      纳米多元 - 一种用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用的新型BRET平台。
      )在活细胞中询问TNIP2和TSG101之间的相互作用。首先,我们确认将CoEx压痕TNIP2和TSG101归入HEK293T细胞中的细胞质(Fig. 4C)。其次,我们表达了Nanoluc®标记的TNIP2(或TNIP2 TYR230Ala作为一种对照),与荧光标记的TSG101-卤素(或未标记的TSG101-Halo作为对照)一起,并在HEK293T细胞中测试生物发光共振能量转移(纳米键)(
      • Machleidt T.
      • Woodroofe C.C.
      • Schwinn M.K.
      • MéndezJ.
      • 罗伯斯M.B.
      • Zimmerman K.
      • otto p.
      • Daniels D.L.
      • Kirkland T. A.
      • 木头K.V.
      纳米多元 - 一种用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用的新型BRET平台。
      )。我们检测了Nanoluuc®-TNIP2和Nanoluc®-TNIP2 TYR的类似水平的供体发光水平230ALA样品(Fig. 4D)。我们检测到TNIP2和TNIP2 TYR之间的TSG101-HALO荧光团(BRET比)的能量转移减少230阿拉样本。这与活细胞中TNIP2和TSG101之间的相互作用一致,在TNIP2 TYR之间具有减少的亲和力230ALA和TSG101。这两种布雷特比率大于在对照样品中检测到的那些具有未标记的TSG101(Fig. 4D)。我们使用RPE-1细胞重复纳米级实验并获得类似的结果(补充图S6)。连胜,昆虫细胞表达蛋白的共素和细胞中蛋白质之间的共振能量转移表明TNIP2和TSG101之间的直接相互作用。

       TNIP2与mRNA成绩单相关联

      先前据报道了许多TNIP2相关蛋白质结合RNA,因此我们研究了它们在我们与RNA的相互作用的结果中可能存在其中一些这些蛋白质中的一些蛋白质。为了测试这一点,我们使用TNIP2 196-346截断突变体,我们早先观察到与ESCRT-I,YLPM1相关蛋白质和CPSF6 / 7相关联。当我们在Benzonase®存在下纯化Halo-TNIP2 196-346相关的蛋白质时,一种消化DNA和RNA的内切核酸酶,我们检测到所示的诱饵蛋白 Fig. 5A (浅灰色棒)。在用苯共酶进行纯化后检测到ESCRT-I复合物的亚基的相对量没有显着变化(Fig. 5A)。相反,虽然YLPM1本身仍然用Benzonase®治疗的卤素-TNIP2络合物将其含量减少,但在苯并酶处理的卤素-TNIP2纯化中检测到一些YLPM1相关蛋白(特别是KHDRBS1)。这将与例如通过与RNA相互作用相关的KHDRBS1与TNIP2相关联。观察到在Benzonase®存在下纯化的TNIP2 196-346相关的KHDRBS1的量减少,我们决定测试TNIP2的制剂,用于存在已知的KHDRBS1相关的RNA转录物。先前已发现KHDRBS1与编码细胞凋亡调节剂的MRNAS(
      • Paronetto M.P.
      • Achsel T.
      • Massiello A.
      • Chalfant C.E.
      • 制定C.
      RNA结合蛋白SAM68调节BCL-X的替代剪接。
      ),所以我们首先测试了样品,据报告的Bcl-2家族mRNA转录物报告为与KHDRBS1相关联(
      • Paronetto M.P.
      • Achsel T.
      • Massiello A.
      • Chalfant C.E.
      • 制定C.
      RNA结合蛋白SAM68调节BCL-X的替代剪接。
      )。在RNase抑制剂存在下纯化Halo-TNIP2 196-429,并通过逆转录分析从亲和纯化样品中提取的RNA,然后通过PCR(RT-PCR)(Fig. 5B);我们检测到与BCL2L1,BCL2L11和BCL2 mRNA转录物一致的PCR产物(Fig. 5B)。检测到与TNIP2 196-420共用的mRNA转录物,我们寻求进一步定义TNIP2的哪个区域可能足以其与RNA相关性。从亲和纯化的卤素-TNIP21-429,Halo-TNIP21-195,Halo-TNIP2196-346和Halo-TNIP2 253-429中的溶解RNA和Halo-TNIP2 253-429中的再分离RNA,以及仅表达Halo标签的对照。由于我们之前检测到TNIP2 196-429样本中的BCL2L1转录物,我们设计了对两种BCL2L1转录物变体特异的QPCR引物(描述 补充数据S1),以及家务基因GAPDH。当我们通过QPCR分析样品时,我们发现Halo-TNIP21-195,卤素-TNIP2 253-429或卤素对照纯化样品中非常低的水平或没有RNA(Fig. 5C)。相比之下,我们检测到通过全长卤素 - TNIP2纯化的样品中适度的mRNA水平对应的产品,并在卤素-TNIP2 196-346纯化样品中较大量的mRNA(Fig. 5C)。足以纯化mRNA转录物的TNIP2 196-346的区域也足以纯化ESCRT-I复合物(包括TSG101),YLPM1和相关蛋白质,以及RNA处理因子CPSF6和CPSF7,但不是NFKB1(Fig. 5C )。

       TNIP2相关的转录物代码用于控制转录的因素

      随着我们在TNIP2纯化中检测到GAPDH转录物,我们推理TNIP2相关的RNA可能不限于BCL2家族蛋白的转录物。一种可能性是TNIP2相关的非特别转录的RNA物种;或者,TNIP2可能与这些RNA的特定子集相关联。为了解决此问题,我们用Halo-TNIP2 196-346(下拉RNA)的RNA的样品测序,以及在蛋白质纯化之前由一部分全细胞提取物制备的RNA样品(输入RNA)。我们鉴定了314种RNA物种,与输入RNA相比纯化样品纯化样品(P. adj. < 0.01, log2 折叠变化(下拉/输入)>2,平均fpkm(下拉)> 20, 补充表S6)。对于与转录因子结合有关的GO术语,这组RNA被显着富集(Fig. 6 一种, 6B),也含有BCL2L11,我们最初通过QPCR鉴定。为了证实这些发现,我们重复了我们的分析,但是这次我们将Halo-TNIP2 196-346比较了Halo-Control下拉样品的纯化RNA,而不是输入RNA样品(补充表S6)。我们鉴定了一种类似的368种RNA物种,再次富集与转录因子结合有关的GO术语,两种分析方法鉴定了290种RNA物种(补充表S6)。提供了与基因本体术语“转录因子结合”相关的mRNA物种的列表 Fig. 6B。包括在该列表中是SIN3A复杂亚基SAP18和SAP30的MRNAS编码,介质复合亚基MED13和MED30,Homeobox蛋白HOXC6,由Jun ProTo-oncogene编码的转录因子和转录因子GATA2。我们通过QPCR确认了Halo-TNIP2 196-346纯化样品中的SAP30和GATA2转录物的存在(补充图S7 )。
      图缩略图GR6.
      图6。 卤素-TNIP2 196-346与RNA的测序分析。 A,在RNA测序后,将314 rNA鉴定为富含卤素-TNIP2 196-346纯化,与使用DESEQ2文库(
      • 爱M.I.
      • Huber W.
      • 安德斯S.
      使用DESEQ2的RNA-SEQ数据的折叠变化和分散的适度估计。
      )(P. adj. < 0.01, log2 折叠变化(下拉/输入)>2,平均fpkm(下拉)>20)。使用David V6.7分析与这些RNA相关的基因本体论术语(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.
      大卫生物信息学资源对大型基因清单进行了系统和综合分析。
      )。用调整后富集基因本体论术语(分子功能域) p value <使用“Treemap”的Revigo观点来看待0.05(
      • Supek F.
      • Bošnakm.
      • Škuncan。
      • ŠMUCT.
      Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
      )。 B,TNIP2相关的mRNA物种具有相关基因本体术语“转录因子结合”(GO:0008134)。 C,TNIP2相关MRNA的细胞丰度的分布。测序从用卤素TNIP2 196-346(输入RNA)转染的细胞的全细胞提取物的全细胞提取物的RNA测序,并计算为评估不同RNA物种的细胞丰度的平均FPKM值。 RNA根据FPKM值填充(x 轴)每个箱子中的RNA种类数量 y 轴。显示了所有RNA物种(灰度)或314 TNIP2 196-346相关RNA(绿杆)的子集的数据。 D,分析Halo-TNIP2 196-346下拉的GATA2 RNA序列。使用综合基因组浏览器产生GATA2 RNA序列的平均深度图谱(
      • Nicol J.W.
      • Helt G.A.
      • Blanchard Jr,
      • Raja S.G.A.
      • loraine a.e.
      集成基因组浏览器:用于分发和探索基因组数据集的免费软件。
      )。 这 y 这些配置文件的轴表示从晕控制(灰柱)或晕泡TNIP2 196-346样品(绿杆)的三个生物复制在每个位置对齐的注释数。结果显示了从全细胞提取物(输入)纯化的RNA和来自卤素纯化样品的RNA(卤素下拉)的结果。还显示了HALO-TNIP2 196-346样品的下拉/输入深度图比例(红色/棕色棒)。
      我们之前已经表明,蛋白质纯化中的常见蛋白质污染物倾向于是在细胞中高度表达的蛋白质(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      )。对于在洗涤期间没有充分移除的非特异性RNA污染物,这也可能是如此。为了评估我们的TNIP2相关的RNA是否仅仅是非特异性的更丰富的RNA物种的群体,我们将全部细胞提取物中所有RNA的RNA丰度分布进行了比较(Fig. 6C 灰色条)随着RNA丰度的分布为TNIP2 196-346相关的RNA( Fig. 6C 绿棍)。 TNIP2相关的RNA不是在细胞中更丰富的RNA,因此可能不仅仅是具有高细胞丰度的RNA污染物。除了鉴定与TNIP2相关的转录物之外,我们研究序列的分布在几个TNIP2相关转录物中,以评估这些转录物是否与全细胞提取物中的特征不同。为其中一个,GATA2,IN中显示深度图 Fig. 6D (Gata2具有最大的日志值2 TNIP2 196-346下拉/控制下拉下分析折叠变化)。最重要的TNIP2 196-346富集的GATA2序列似乎对应于GATA2转录物外显子(以及特异性的转录变体3中存在的外显子)。这与TNIP2和拼接GATA2转录物之间的关联一致(Fig. 6D lower graph).

      讨论

      该研究将ESCRT-I复合物的亚基与YLPM1相关因子一起鉴定为与TNIP2相关的蛋白质,NF-κB转录因子相互作用网络中的枢纽蛋白(Fig. 7)。我们还表明ESCRT-I复合物通过亚基TSG101与TNIP2相互作用,并且ESCRT-I复合物和YLPM1相关因子均在TNIP2的中心区域中与氨基酸序列相关联(Fig. 7)。该区域不包括TNIP2的N末端,这是TNIP2 / NFKB1交互所必需的(
      • 郎V.
      • Symons A.
      • Watton S.J.
      • Janzen J.
      • Soneji Y.
      • Beinke S.
      • 豪威尔S.
      • ley s.c。
      Abin-2与TPL-2和NF-Kappa B1 P105形成三元复合物,对于TPL-2蛋白质稳定性至关重要。
      )。该中央TNIP2区域还将MRNA与蛋白质的代码一起用作转录因子,例如GATA2,或作为转录辅因子,例如介质复合物的亚基。符合此,TNIP2制剂中发现的许多YLPM1相关因子是RNA加工蛋白。由于RNA介导的相互作用,其中一些蛋白质可能会用TNIP2与TNIP2共用(Fig. 7)。这些发现结合在一起,在NF-κB网络中心蛋白质TNIP2,ESCRT-I复合物之间建立了一个链接,以及编码转录调节剂的不同的MRNA(Fig. 7 )。
      图缩略图GR7.
      图7。 TNIP2与ESCRT-I复合物的相互作用和YLPM1相关蛋白的模型。 A,扩展TNIP2蛋白质相互作用网络。网络显示TNIP2和NF-κB转录因子之间的关联(引入 B已经扩展以描绘TNIP2和TSG101 / ESCRT-1复合物之间的附加关联,以及TNIP2和YLPM1 / YLPM1相关蛋白质之间。 B,TNIP2与其他因素相互作用的可能模型。 NFKB1与TNIP2的N末端相互作用。通过TSG101募集到TNIP2的EABR区域的EACRT-I,其结合依赖于氨基酸Y.230。对TNIP2的YLPM1招募可能有一些依赖于ESCRT-I的结合。可以通过与RNA的相互作用募集一些因素来募集到TNIP2。
      以前,我们使用过的亲和纯化质谱(AP-MS)方法,该方法使用与Mudpit质谱耦合的Halo标签,以研究蛋白质与两个NF-κB因子,Rela和NFKB1相关(
      • 银行C.A.S.
      • 李Z.T.
      • Boanca G.
      • Lakshminarasimhan M.
      • Groppe B.D.
      • 温Z.
      • 哈伊姆G.L.
      • Seidel C.W.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      转录因子蛋白网络中基因表达的控制。
      )。虽然AP-MS研究已被广泛用于映射细胞蛋白之间的相互作用网络(
      • KöcherT.
      • Superti-Furga G.
      基于质谱的功能蛋白质组学:从分子机到蛋白质网络。
      ),映射以转录因子为中心的互动网络尤为具有挑战性(
      • Giambruno R.
      • 格里比亚F.
      • Stukalov A.
      • KNOLL C.
      • Planyavsky M.
      • Rudashevskaya E.L.
      • 大歌j.
      • Superti-Furga G.
      • Bennett K.L.
      转录因子复合物蛋白质组学分析的亲和纯化策略。
      ),所以我们首先使用了广泛的光环/ Mudpit方法来扩展NF-κB转录因子交互网络。生成该扩展网络,其中包括所有五种NF-κB家族蛋白,我们选择TNIP2作为网络中心蛋白,以便更加集中的后续研究,以在亚蛋白分辨率下映射TNIP2关联。 Giambruno和同事建议使用多个互补的AP-MS策略作为提高检测交互的效率和可靠性的方式(
      • Giambruno R.
      • 格里比亚F.
      • Stukalov A.
      • KNOLL C.
      • Planyavsky M.
      • Rudashevskaya E.L.
      • 大歌j.
      • Superti-Furga G.
      • Bennett K.L.
      转录因子复合物蛋白质组学分析的亲和纯化策略。
      )。因此,为了帮助了解TNIP2在细胞中的作用更清楚,我们以几种方式检查了TNIP2相关蛋白。首先,我们使用在相对高水平的Halo-TNIP2中瞬时转染的细胞;其次,我们使用稳定表达在接近内源水平的Halo-TNIP2的细胞;第三,我们使用了一系列TNIP2截断突变体来映射交互域。
      当我们分析从瞬时转染的细胞纯化的TNIP2相关蛋白质在相对较高的水平下从瞬时转染的细胞群中纯化时,我们发现这些样品富集了蛋白质YLPM1的复合物ESCRT-1的亚基,以及参与RNA的蛋白质加工 ( Fig. 2A2B)。尚未报道TNIP2和YLPM1或TNIP2和RNA处理蛋白之间的关联。此外,虽然TNIP2包含保守的EA​​BR域(Escrt和 A LIX. b 配合 region),其与蛋白质cep55中的区域同源,与Escrt-i结合(
      • 李H.H.
      • elia n。
      • Ghirlando R.
      • Lippincott-Schwartz J
      • Hurley J.
      在CEP55中由非规范卷绕线圈瞄准ESCRT机械的阵地。
      ),TNIP2与ESCRT-I复合物之间的关联的经验证据也没有报道。
      为了确定卤素-TNIP2表达水平是否影响蛋白质与TNIP2相关的蛋白质的补体,我们重复稳定表达与内源性TNIP2蛋白质的水平的卤素-TNIP2的实验(瞬时转染的细胞可以接受多个DNA编码拷贝诱饵蛋白导致诱饵表达高)。在这些较低水平的卤素-TNIP2表达中,我们仍然在TNIP2纯化中发现了ESCRT-I复合物的NFKB1和亚基,但我们不能再检测与TNIP2相关的YLPM1或YLPM1相关的RNA结合蛋白。我们假设这可能是因为哈洛-TNIP2本地化的差异。此前,刘和同事提出了一种模型,其中TNIP2通常在细胞质中隔离,但在某些生理条件下,进入细胞核并与核蛋白相互作用(
      • 刘W.K.
      • Chien C.Y.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      LKB1相互作用的蛋白负调节TNFalpha诱导的NF-κB活化。
      )。与此思想一致,尽管我们主要在细胞质中检测到稳定表达的卤素-TNIP2,但我们观察到在相对高水平下表达卤素TNIP2的一些瞬时转染的细胞似乎在细胞核中含有一些卤素 - TNIP2(Fig. 2C)。这些瞬时转染的细胞中的核卤素TNIP2池可以与核yLPM1相关联。由于先前的研究已经确定没有N末端的TNIP2突变体可以定位于细胞核(
      • Chien C.Y.
      • 刘W.K.
      • Chou C.K.
      • Su J.Y.
      A20结合蛋白Abin-2在介导转录共同中发挥意外功能。
      ),我们接下来在接近内源水平稳定地表达Halo-TNIP2 196-421,推理该TNIP2突变体可以再次与YLPM1缔合。实际上,当我们分析与稳定表达TNIP2 196-421相关的蛋白质时,我们再次检测到YLPM1和其他YLPM1相关蛋白(Fig. 2D )。
      有趣的是,我们的Halo-TNIP2和Halo-YLPM1纯化均含有核心ParaSpecle蛋白Nono,SFPQ和PSPC1(Fig. 7)。 ParaSpeckles是通过控制RNA转录物的核保留来影响基因表达的核RNP结构(
      • 福克斯A.H.
      • Lamond A.I.
      paraSpeckle。
      )。除了这些paraSpecle蛋白外,包括含有氨基酸196-346的中央区域的TNIP2突变体也与mRNA转录物相关。与此类转录物的关联似乎是特异性的,例如用该组TNIP2相关的MRNA富集物种具有术语“转录因子结合”。这些包括用于DNA结合转录因子的MRNAS,例如GATA2,JUM和HOXC6,以及编码的MRNA,其复合物的亚基,其用作像素中的转录共觉器,或者作为SIN3A络合物等核心容器。 TNIP2可能在协调这些MRNA的转录后处理方面具有作用。
      总之,我们的工作揭示了TNIP2和YLPM1之间的关联,以及许多RNA加工蛋白质和不同的MRNA。我们还通过其TSG101亚基在TNIP2和ESCRT-I复合物之间建立了一种物理相互作用,通过其TSG101亚基(Fig. 7)。 Escrt-I是及其TSG101亚基特别证明是将HIV-1病毒RNA从晚期内体释放到细胞溶溶胶(
      • Garrus J.E.
      • von schwedler u.k.
      • PorniLlos O.W.
      • 莫拉姆S.G.
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      • 王熟。
      • Wettstein D.A.
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      • Côtém.
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      TSG101和真空蛋白分选途径对于HIV-1芽是必不可少的。
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      Escrt. -I亚单位TSG101控制病毒RNA的内体 - 细胞溶溶胶释放。
      )。这表明一些潜在的研究进入TNIP2功能途径,这有助于确定NF-κB信号传导途径是否使用TNIP2来影响RNA转录物的细胞内传输或处理和可能本地化。

      致谢

      我们感谢Drs。 Mihaela Sardiu和Stephanie Kong的批判阅读手稿,以及Danette Daniels博士在该项目过程中提供技术支持。可以从STOWERS原始数据存储库访问此稿件的原始数据 http://www.stowers.org/research/publications/LIBPB-811.

      补充材料

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