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简单,可扩展,和超敏感的尖端鉴定蛋白酶基材*

  • Gerta Shema.
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    来自Leibniz-InstitutFür分析馆Wissenschaften-Isas-E.v。,Otto-Hahn-str。 6B,44227多特蒙德,德国;
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  • minh t.n. nguyen.
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    来自Leibniz-InstitutFür分析馆Wissenschaften-Isas-E.v。,Otto-Hahn-str。 6B,44227多特蒙德,德国;
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  • Fiorella A. Solari.
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    来自Leibniz-InstitutFür分析馆Wissenschaften-Isas-E.v。,Otto-Hahn-str。 6B,44227多特蒙德,德国;
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  • Stefan Loroch
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  • A. Saskia Venne.
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  • laxmikanth kollipara
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  • 阿尔伯特·斯科曼
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    来自Leibniz-InstitutFür分析馆Wissenschaften-Isas-E.v。,Otto-Hahn-str。 6B,44227多特蒙德,德国;

    MedizinischeFakultät,梅皮蒂尼斯朱府 - 中心(MPC),Ruhr-UniversitätBoochum,44801 Bochum,德国;

    阿伯丁大学苏格兰阿伯丁大学体育科学学院化学系;
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  • 史蒂文H.L.Verhelst.
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    来自Leibniz-InstitutFür分析馆Wissenschaften-Isas-E.v。,Otto-Hahn-str。 6B,44227多特蒙德,德国;

    细胞和分子医学系,鲁汶,赫斯特劳斯·49,箱子802,3000雷文,比利时;
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  • RenéP.Zahedi.
    一致
    应解决谁的通信:JGH彩易福彩组学中心,E-615,Lady Davis Institute-Jewish General医院,3755Côte-Catherine Road,蒙特利尔,魁北克,魁北克H3T 1E2。电话:514-340-8222,EXT。 27885 ..
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    来自Leibniz-InstitutFür分析馆Wissenschaften-Isas-E.v。,Otto-Hahn-str。 6B,44227多特蒙德,德国;

    Gerald Bronfman肿瘤科,犹太普通医院,麦吉尔大学,蒙特利尔,加拿大魁北克H4A 3T2;

    Segal癌症彩易福彩组学中心,戴维斯州德国郑省综合医院,麦吉尔大学,蒙特利尔,魁北克,加拿大。
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  • 作者脚注
    *本研究得到了雷德尔·韦斯特省雷伯林·克里林·墨水的北德拉德 - 韦斯特林根·斯滕斯·韦斯滕·沃德尔·韦斯特森Wissenschaft und Forschung,Bundesministeriumfürbildungund forschung和ku Leuven(C12 / 16/020至SV)。
    本文含有补充材料。
      蛋白酶位于许多疾病的中心,因此,蛋白酶及其基材是重要的药物靶标,以估计5-10%的所有药物在发育中所代表。质谱是用于发现新型蛋白酶基材的不可或缺的工具,特别是通过代表内源蛋白N末端的所谓的N-末端肽的彩易福彩组富集。组合分数对角线色谱(CoFradic)等方法
      使用的缩写是:CoFradic,组合分数对角线色谱; Chafra. 小费 ,基于电荷的分数对角线色谱法 小费 格式; SCX,强阳离子交换色谱; Chafradic,基于电荷的分数对角线色谱法;尾巴,末端胺胺同位素标记的基材; Teab,三乙基碳酸氢铵; BCA,双子胆碱酸测定; TNC,理论净充电。
      1使用的缩写是:CoFradic,组合分数对角线色谱; Chafra. 小费 ,基于电荷的分数对角线色谱法 小费 格式; SCX,强阳离子交换色谱; Chafradic,基于电荷的分数对角线色谱法;尾巴,末端胺胺同位素标记的基材; Teab,三乙基碳酸氢铵; BCA,双子胆碱酸测定; TNC,理论净充电。
      而且,后来,末端胺同位素标记的基材(尾部)揭示了蛋白酶基材和共有的基序的许多见解。我们提出了一种基于基于电荷的分数对角线色谱(Chafradic)的N-末端肽富集的替代和简单方案,并且仅需要良好建立的彩易福彩化学和移液管尖端。使用ITRAQ-8-Plex,我们平均量化了每种样品/通道仅4.3μg的唯一N-末端肽,允许鉴定蛋白水解靶标和共有矩阵。这种高灵敏度甚至可以允许在未来与临床样本(如针活检)合作。我们应用了我们研究Staurosporine诱导的细胞凋亡的动态的方法。我们的数据证明了1.5小时,3小时和6小时后的特定途径的策划调节,其中许多重要的稳态球员已经在1.5小时后瞄准。我们另外观察到通过蛋白水解和磷酸化对拼接机械的早期多级调节。这可能反映各种凋亡基因的替代剪接变体的已知作用,这似乎是Staurosporine诱导的细胞凋亡的驱动力。
      蛋白水解在通过调节彩易福彩功能和活性和活性术后,在维持细胞稳态中起着至关重要的作用,并且其失呼率下潜许多疾病如癌症和阿尔茨海默氏症(
      • vögtlef.n.
      • Wortelkamp S.
      • Zahedi R.P.
      • Becker D.
      • 莱德利C.
      • Gevaert K.
      • Kellermann J.
      • voos w.
      • 镰刀A.
      • Pfanner N.
      • Meisinger C.
      对线粒体N-彩易福彩组的全局分析鉴定了对彩易福彩稳定性至关重要的加工肽酶。
      ,
      • Quirós下午
      • Langer T.
      • lópez-otínc。
      对健康,老化和疾病的线粒体蛋白酶的新作用。
      ,
      • lópez-otínc。
      • 猎人T.
      激酶和癌症蛋白酶之间的调节串扰。
      )。通过蛋白水解裂解,产生新的彩易福彩n末端。鉴定这些所谓的Neo N Termini是理解哪一步,旨在理解哪些彩易福彩是特定蛋白酶的基质,并揭示健康和疾病的调节蛋白水解网络。此外,它还允许鉴定蛋白酶切割基序,这对于显影蛋白酶抑制剂或化学彩易福彩组学工具很重要。
      作为彩易福彩N末端,更重要的是,新的NeT末端在彩易福彩组中显着低,已经开发了用于富集N-末端肽的特异性方法,然后进行质谱(n-轨液),以使系统覆盖蛋白酶底物和切割模式(
      • agard n.j.
      • 井J.A.
      彩易福彩组物鉴定方法彩易福彩鉴定。
      )。几种方法,即组合分数对角线色谱(CoFradic)(
      • Gevaert K.
      • 潮气米
      • 玛特L.
      • van damme J.
      • Staes A.
      • 托马斯G.R.
      • vandekerckhove J.
      探索彩易福彩谱和分析彩易福彩处理的质谱法鉴定分选N-末端肽。
      ),解溶酶N-末端标记和富集(
      • 马尔斯斯。
      • 特立尼达J.C.
      • 巴克D.T.
      • 萨利A.
      • 伯灵名A.L.
      • 井J.A.
      彩易福彩N末端特异性标记对凋亡中蛋白水解裂解位点的全局测序。
      ),后来,末端胺胺同位素标记的基材(尾部)(
      • Kleifeld O.
      • Doucet A.
      • auf dem keller u.
      • Prudova A.
      • 席克宁o.
      • Kaidhan R.K.
      • 斯塔尔A.E.
      • 福斯特L.J.
      • Kizhakkedathu J.n.
      • 总体上行
      复合样品中末端胺的同位素标记鉴定彩易福彩N-末端和蛋白酶切割产物。
      )开创了N-术语的领域。 CoFradic和Tails利用彩易福彩N末端(和Lys残基)的特定标记作为富集程序的初始步骤。在彩易福彩水解裂解作为共同的自下而上彩易福彩组学策略的一部分时,该标记允许定量N-末端肽,但也将它们区分离出与内部肽的内部肽产生 体外 消化。两种方法已用于许多研究,为蛋白酶及其基材提供了新的洞察力(
      • vögtlef.n.
      • Wortelkamp S.
      • Zahedi R.P.
      • Becker D.
      • 莱德利C.
      • Gevaert K.
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      • voos w.
      • 镰刀A.
      • Pfanner N.
      • Meisinger C.
      对线粒体N-彩易福彩组的全局分析鉴定了对彩易福彩稳定性至关重要的加工肽酶。
      ,
      • Prudova A.
      • Serrano K.
      • Eckhard U.
      • 堡垒N.
      • 奉献d.v.
      • 总体上行
      人血小板的尾部N-术语揭示了储存的普及金属蛋白酶依赖性蛋白水解加工。
      ,
      • Prudova A.
      • Gocheva V.
      • auf dem keller u.
      • Eckhard U.
      • Olson o.c.
      • Akkari L.
      • 巴特勒G.S.
      • 堡垒N.
      • lange p.f.
      • 标记J.C.
      • Joyce J.A.
      • 总体上行
      尾部N-术语和彩易福彩组学显示彩易福彩降解占据胰腺肿瘤中的组织蛋白酶的蛋白水解加工。
      ,
      • Gawron D.
      • ndah E.
      • Gevaert K.
      • van damme p.
      位置彩易福彩组学揭示了N-末端彩易福彩常规稳定性的差异。
      )。然而,可能由于技术和(特别是过去)数据分析方面的挑战,仍然有限地将全世界普遍存在筛选彩易福彩基材的实验室数量。
      我们最近介绍了一种替代的基于HPLC的N-末端肽富集的策略,基于电荷的分数对角线色谱(ChaFradic)(
      • venne A.S.
      • vögtlef.n.
      • Meisinger C.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      综合N-末端彩易福彩组学的高度敏感,具体和直接策略揭示了线粒体肽酶ICP55的未知基材。
      )。该方法取决于肽的分离在pH 2.7的不同电荷 - 状态级分中,其中溶液中的肽的净电荷主要由正面(Arg,Lys,他的残留物和自由N末端)的数量和负面(例如 磷酸化)带电群体(Fig. 1 A )(
      • Ballif B.A.
      • Villen J.
      • Beausoleil S.A.
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      显影小鼠脑的磷肝蛋白酶分析。
      )。虽然为N-ingrinomics研究提供了高灵敏度,但该方案需要具有自动分级的专用,高度可重复的HPLC系统,其与成本和维护费用相关。因此,我们将该方法提前进入对倾斜尖端的电荷基数对角线色谱(Chafra 小费 )。 Chafra. 小费 只需要完善的彩易福彩化学和最小的设备:用纤维素玻璃料,强阳离子交换色谱(SCX)珠和常见缓冲液的移液管尖端。我们证明基于尖端的方法是有效和可重复的,并且与ITRAQ-8-Plex标记结合,它允许在八个样品中量化超过2,000个N-末端肽,仅使用每种条件的4.3μg彩易福彩/渠道。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1(A)pH 2.7的完全胰蛋白肽的理论净电荷(TNC)通常是+2。他残留物或错过的裂解导致TNC,N-末端乙酰化以降低TNC。 ( B)基于TNC的肽的分馏可以缩放到细胞裂解物的量而不损害分离功率和(C)也适用于Itraq标记的肽。 (D)对于Chafra. 小费 ,免费彩易福彩N末端和赖氨酸用ITRAQ / TMT标记彩易福彩水平;用胰蛋白酶汇集样品并消化。肽根据其TNC在尖端上分离。每个收集的级分是乙酰化的,从而通过1.在基于第二尖端的分级中,除去具有减少的TNC的内肽,并收集N-末端肽用于随后的LC-MS分析。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      评估尖端中肽分离的性能和可扩展性的实验(Fig. 1)使用相同的Hela消化等分试样进行技术三次含量(参见 补充方法 有关详细信息)。数据表示为三个相应复制的手段(Fig. 1B,可伸缩性未标记的肽)或单独的重复(Fig. 1C,ITRAQ标记的肽)和所有相对标准偏差(肽光谱匹配(PSM)每馏分的电荷 - 状态分布)低于未标记肽的8.5%,低于ITRAQ标记肽的12.5%。
      在基于HPLC的Chafradic和Chafra的比较中 小费 ,SH-SY5Y细胞的三种生物学重复,每个细胞在DMSO中用Staurosporine治疗,以诱导细胞凋亡或用DMSO作为对照。标记和汇集后,样品分裂为六个等分试样,其中三个用于HPLC的Chafradic和三个用于Chafra 小费 。将鉴定的N-末端肽基于其级联序列和Uniprot释放。只有在每种方法中至少有两种重复中的至少两个中发现的唯一n termini(HPLC 相对 提示)用于比较(Fig. 2)。为了生成共识主题和网络,考虑了六个数据集中的至少三个中至少三个中至少三个的唯一n末端,仅被考虑在六个数据集复制中至少三个。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2(A)使用用载体或用Staurosporine处理的SH-Sy5Y细胞比较基于HPLC和尖端的Chafradic的工作流程,以诱导凋亡蛋白水级级级。 (B)两种策略显示出在技术复制的类似再现性和所有量化的N-末端肽的一定程度的互补性。在三种重复中至少有两个量化的那些是颜色编码的。 (C)Neo-N-末端肽(>2倍上调, p <0.05)明确指向Caspase活性(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了彩易福彩共识序列的可视化。
      )。 ( D)鉴定的蛋白水解基材的字符串网络。颜色代表连接程度(红色高,绿色低)。
      对于研究Staurosporine诱导的细胞凋亡的时间动态,SH-SY5Y细胞用Staurosporine处理1.5小时,3小时,6小时,或用作对照,在每次的生物二进制中(ITRAQ 8-Plex标记)。仅考虑在每个时间点至少三个重复中量化的n个终端,中值log2比率和a p 基于双面的价值 t 每种生物重复测定测试( IE。 1.5 H A和B,3 H A和B,6 H A和B)。仅有的 (i)独特的N-末端肽( II )与对照和( III )有A. p value <将0.05被认为是各个时间点的调节。

       基于肽的肽分离(未标记和ITRAQ标记)

      细节是给出的 补充方法.

       HPLC与尖端的Chafradic - 细胞培养和样品制备的比较

      SH-SY5Y细胞的六种生物重复在Dulbecco改良的鹰媒体(PAN-BIOTECH)中生长至90%以上的汇合。培养基被含有1μ的新鲜培养基取代m 在DMSO(Sigma Aldrich)或DMSO(10μl)中的Staurosporine至三次重复,然后在37℃下孵育6小时。弃去含有漂浮细胞的每个烧瓶的上清液,并用冰冷的PBS洗涤细胞,刮擦,并在室温下用300g离心5分钟收集。用1mL PBS洗涤细胞粒料并通过另一种离心步骤收集。裂解最终的细胞粒料,氨基甲酰化并进行BCA测定以进行彩易福彩浓度(见 补充方法)。然后,从每个样品中取出100μg(根据BCA)的彩易福彩并进行乙醇沉淀。将彩易福彩粒料用10μl10%SDS和40μL的ITRAQ标记缓冲液(0.5 m 加入三乙基碳酸氢铵(Temarium碳酸氢铵(Temarium)以20%(v / v)异丙醇)以具有2%SDS的终浓度。接下来,将80μl异丙醇加入六个ITRAQ 8-PLEX(113,114,115,116,119,121)试剂中,将每种标记加入到不同的样品中,并在室温(RT; 25℃)下温育2小时。用60米淬火反应m 甘氨酸在室温下10分钟,然后加入130米m 羟胺在室温下10分钟。之后,将样品合并并直接进行另一次乙醇沉淀步骤。将彩易福彩颗粒与150μl6重溶液溶解 m 氯化胍(GUHCL),稀释至0.2 m with 50 mm 茶,pH 7.8。接下来,乙腈(ACN)和CaCl2 加入到5%和2米的最终浓度m, 分别。最后,将胰蛋白酶在1:20(w / w,酶至底物)的比例中加入并在37℃下孵育14小时。使用单片反相色谱法控制蛋白水解消解,如前所述(
      • 伯克哈特准
      • 舒姆布吕兹基C.
      • Wortelkamp S.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      消化效率和特异性的系统和定量比较揭示了胰蛋白酶质量对基于MS的彩易福彩组学的影响。
      )。通过固相萃取(OASIS HLB提取盒,10mg)脱盐肽。在脱盐后,通过纳米LC-MS / MS分析1μg等分试样,以进行全局分析,以(i)根据ITRAQ彩易福彩比例测定样品制备的系​​统误差和( II )确定标记效率。将其余的样品干燥,在310μLSCX缓冲液A中溶液,并分成六个等分试样对应于〜100μg肽的六个51μl。

       使用HPLC Chafradic富集N-末端肽

      使用CHAFRA使用基于HPLC的Chafradic和其他三(每种,BCA)进行三种技术等分试样(每种,BCA结果,每种,BCA结果100μg)分级 小费 。使用U3000 HPLC系统(Thermo Sciencific)和150×1mm多硫甲基柱(Polylc,哥伦比亚,美国,5μm粒径,200孔径)进行HPLC分离,与SCX组合的三级缓冲系统缓冲a(10米m KH2 夜晚 4,20%ACN,pH 2.7),SCX缓冲B(10米m KH2 夜晚 4,250米m KCl,20%ACN,pH 2.7)和SCX缓冲器C(10米m KH2 夜晚 4,600米m NaCl,20%ACN,pH 2.7)。以80μl/ min的流速分离51μl腐蚀性肽。用优化的梯度分离肽以有效地分离不同的电荷状态,并且使用U3000分馏选项自动收集级分。梯度如下:100%A持续10分钟,然后在9.3分钟内从0%至15%B的线性增加。之后,B保持为15%8.7分钟,然后梯度线性地从15%增加到8分钟。然后B保持恒定在30%以上11分钟,并且在5分钟内线性增加至100%。在100%b下5分钟后,C在1分钟内升高至100%并保持恒定5分钟。最后,A在1分钟内增加到100%,塔在100%A中重新平衡20分钟。按重复,收集对应于充电状态+1,+ 2,+ 3和+4的四个级分,如图所示 补充图1。将收集的级分在真空下完全干燥,并达到200米的300μlm Na2 HPOA. 4,pH 8.0,到最后pH值~7.0。用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)乙酸酯衍生内肽的自由N末端,两步中的醋酸酯,从STAE改性 等等。 (
      • Staes A.
      • 赋予F.
      • van damme p.
      • ruttens b.
      • 潮气米
      • Demol H.
      • Timmerman E.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过组合分数对角线色谱选择彩易福彩N-末端肽。
      )最初将NHS-三角蛋白醋酸盐加入到20米的最终浓度中m并且将样品在37℃下孵育1小时,然后加入另外10米m NHS-Trideutero醋酸盐在相同的条件下。在总孵育时间2小时后,使用60米淬灭反应m 甘氨酸在室温下10分钟,然后在95℃下孵育5分钟。用10%三氟乙酸(TFA)酸化级分,并使用孔孔R3反相材料脱盐。用0.1%的甲酸(FA)洗涤结合的肽两次,然后用100μl70%(v / v)acn,0.1%Fa,然后0.1%发布。将真空干燥肽在51μLSCX缓冲液中溶液中溶解后。将每个第一尺寸馏分分离并在第二SCX尺寸下分离在与上述相同的条件下。虽然n末端肽保留了它们的保留时间窗口( IE。 电荷状态窗口),基于由N-末端乙酰化诱导的理论净电荷的减少转移到早期保留时间。收集后,脱盐,干燥,并在22μLTFA0.1%中溶解。从每个级分,纳米LC-MS / MS取2/3。

       使用chafratip富集N-末端肽

      柱制制剂(25μlSCX材料),柱调理,样品加载(在50μLSCX缓冲液A中溶液),并如上所述进行第一尺寸分级。 补充方法和表S1 在补充方法中。将收集的级分干燥并达到300μl,200米m Na2 HPOA. 4,pH 8.0。接下来,如上所述衍生内肽的自由N末端,然后脱盐。在50μlSC​​X缓冲液中溶解真空干燥肽后,如下所述进行二维尖端的分级 表S2 在补充方法中,将级分脱盐,干燥,并在22μLTFA0.1%中溶液。从每个级分2/3均用于纳米LC-MS / MS。

       LC-MS分析

      使用围网融合Lumific(Thermo Sciencific),在线耦合到U3000 HPLC系统的纳米LC-MS / MS分析级分,使用电荷 - 状态依赖决策树(
      • Mischerikow N.
      • van Nierop P.
      • 李克..
      • 伯恩斯坦H.G.
      • smit a.b.
      • Heck A.J.
      • Altelaar a.f.
      使用HCD和决策树引导CID / ETD在LTQ orbitrap上的平行定量和鉴定效率的效率和鉴定ITRAQ标记的肽。
      ),详细说明 补充方法。值得注意的是,每种肽,获得两个片段离子光谱,在用于识别的离子阱中用于定量和一个低分辨率MS / MS的侧面的一个高分辨率MS / MS(参见 补充方法 )。

       数据分析

      使用吉祥物2.4(矩阵科学)和彩易福彩组发现软件V1.4在包括报告离子量化器和渗滤器节点的彩易福彩组发现软件V1.4,搜索原始数据(2015年7月,20,207个目标序列)。 ARGC酶特异性,最多两个错过的裂解位点。为了使得能化两类N-末端肽,具有N-末端ITRAQ标签的那些和具有内源性N-乙酰化的那些,我们执行了两步搜索策略:首先,使用ITRAQ 8-Plex搜索数据(+304.2053 DA)在肽N Termini和Itraq 8-Plex,Lys AT固定修改。其次,N-末端乙酰化(+ 42.0105Da)和Itraq 8-Plex在Lys下被设定为固定修改。在这两种情况下,选择Cys(+57.0214Da)的氨基甲酰基甲基化作为蛋氨酸的固定和氧化(+15.9949Da),为可变改性。作为过滤器,高信心对应错误的发现率<使用1%和搜索引擎等级1。对于MS / MS,MS和0.5Da的质量耐受设定为10ppm。 PSM表示相同的PSM(i)氨基酸序列和( II )彩易福彩加入分组,并求出其相应的报告离子区域(补充表1)。使用源自全局分析的归一化因子来标准化总结区域,以便弥补频道上的样本量的系统差异。标准化区域用于计算用于控制细胞的石榴石处理的比例(三个Starosporine的平均报告离子面积重复/平均报告离子区域的三个对照重复)并确定 p 基于双面的值 t 测试。首先为每个组单独进行数据分析,并且基于唯一的N-末端肽合并数据集( IE。 连接序列,UNIPROT加入,修改集)。基于相应的唯一条目,评估三个HPLC和三个提示重复之间的重叠(Fig. 2B)。为了比较HPLC和尖端的富集,仅考虑两种方法中的任一种至少两次的N-末端肽(Fig. 2B)。下一个, (i)只有独特的N-末端肽( IE。 仅代表单个UNIPROT条目)( II )至少有三个( III )根据Schechter和Berger的术语,使用六个数据集中的至少三个用于确定氨基酸P5-P5'的共识基序。
      • Schechter I.
      • 伯杰A.
      在蛋白酶的活性部位。 3.映射木瓜蛋白酶的活跃部位;木瓜蛋白酶的特异性肽抑制剂。
      )( Fig. 2C)。使用相应的彩易福彩条目使用Cytoscape产生高置信串彩易福彩网络(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      )( http://www.cytoscape.org/ )。

       使用Chafratip - 细胞培养,样品制备,ChaFratip,Nano-LC-MS / MS,数据分析研究Staurosporine诱导的细胞凋亡的动态

      神经母细胞瘤SH-SE5Y细胞生长至超过70%的汇合(10 7 每T75烧瓶的细胞)在Dulbecco的改良鹰介质(Pan-Biotech)中。培养基被含有Staurosporine1μ的新鲜培养基取代m 在DMSO(Sigma Aldrich)或DMSO(10μl)中并孵育:15分钟,1.5小时,3小时和6小时,以检查凋亡和胱天蛋白酶蛋白酶的激活。在每个时间点,在显微镜下检查细胞,以进行细胞形状和脱离的变化作为细胞凋亡的指示(补充图2)。收集含有浮体的每个烧瓶的中型上清液,并用冰冷的PBS洗涤细胞。然后在37℃下用胰蛋白酶(EDTA PBS中0.025%)处理细胞2-3分钟。合并中清液和胰蛋白酶化细胞,并在270时通过离心分离细胞 g 5分钟。在含有0.1%Triton X-100的PBS中裂解细胞粒料,并在室温下与化合物SV149(用于将活性胱天蛋白酶蛋白酶的基于活性的探针培养)孵育45分钟。通过添加Laemmli样品缓冲液淬灭标记反应,并通过SDS-PAGE解析一半的样品。通过使用Typhoon Trio +扫描羧丁络甲基吡啶(Tamra)荧光通过扫描活性胱天膜酶(补充图2)。对于MS样本,应用了类似的程序。在270时离心后收集的细胞粒料 g 在液氮中闪蒸,并在-80℃下储存在-80℃下进行后续MS制剂。只收获最后三个时间点(1.5,3和6小时),包括每个时间点的两个生物重复。用DMSO处理的另外两种额外的T75烧瓶6小时用作对照。然而,如上所述进行裂解,氨基甲酰化和Itraq标记,包括八个样品(4条件×2生物重复)和ITRAQ标签。通过氨基酸分析测定彩易福彩浓度,每样品的总量为210μg。汇集后,将样品分成六个等分试样±35μg。然后,为了评估方法的鲁棒性三等分试样,每种富含CHAFRA的N-末端肽 小费 两个不同的个人。如上所述完成纳米LC-MS / MS测量 补充方法。通过技术复制,通过LC-MS测量四个级分(每小部分90分钟的MS时间; HPLC程序的总长度:155分钟,包括平衡,分离,在50cm列上再平衡。对于数据分析,即使基于ITRAQ标记的Lys残基进行量化,也排除了内源性乙酰化肽。每次重复都分析( 补充表2)。 psms量化相同的唯一条目( IE。 分组连接的Uniprot加入和序列,并且相应的记者离子强度总结。如上所述完成归一化。对于每种生物复制(A和B),使用四个相应的报告离子总和来计算中值强度(A和B)。这些中位强度用于缩放相应的报告离子强度。基于唯一条目,合并了六个数据集。对于每个复制和时间点,使用报道离子强度和LOG2转化确定与相应的对照相比的比率。仅考虑在每个时间点至少三个重复中量化的n个终端,中值log2比率和a p 基于双面的价值 t 每种生物重复测定测试( IE。 1.5 H A和B,3 H A和B,6 H A和B)。仅有的 (i)独特的N-末端肽( II )与对照和( III )有A. p value <将0.05被认为是各个时间点的调节。这些调节的N-末端肽被认为使用Perseus产生热爱图(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Sinitcyn P.
      • 卡尔森A.
      • 嘿m.y.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      Perseus综合分析(Prote)OMICS数据的计算平台。
      )使用Cytoscape的串彩易福彩网络(Fig. 3 )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3(A)N-末端肽的时间谱调节在Staurosporine处理时为0,1.5,3和6小时。与0H控制相比,Log2-Fold变化(FC)与每次两次的两个生物(A,B)和六个技术复制(GS1 / 2/3,MN1 / 2/3)相比显示出来。 (B)受调节蛋白酶基材的彩易福彩相互作用网络分析,其含有至少两倍的调节 p value <两种生物复制中0.05。在1.5小时后,几个细胞稳态的关键球员已经裂开。特别地,拼接机械,细胞骨架和内吞作用是早期靶标,而DNA复制蛋白在以后的阶段被切割。 (C)而是>用至少两个独特的肽量化的5,500种彩易福彩没有显示出丰富的主要变化,大多数〜5,900高置信磷酸肽显示出显着的下调。有趣的是,一组上调的磷酸肽包括拼接机械的许多彩易福彩。使用Perseus产生热量(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Sinitcyn P.
      • 卡尔森A.
      • 嘿m.y.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      Perseus综合分析(Prote)OMICS数据的计算平台。
      )。

       定量蛋白酶和磷酸酯:样品制备和纳米LC-MS / MS

      使用过滤剂辅助样品制备(FASP)进行样品制备和消化(
      • Manza L.L.
      • 定位器S.L.
      • 火腿A.-J.
      • Codreanu S.G.
      • Liebler D.C.
      使用旋转过滤器的彩易福彩组学分析的样品制备和消化。
      ,
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      • 由商店 garaj N.
      彩易福彩组分析的通用样品制备方法。
      )具有微小变化的协议。简而言之,用新制备的8稀释对应于彩易福彩的50μg(氨基酸分析化)的细胞裂解物(氨基酸分析)彩易福彩稀释至450μl m urea/100 mm Tris-HCl, pH 8.5 (
      • Kollipara L.
      • Zahedi R.P.
      彩易福彩氨基甲酰化:体内改性或体外人工制品?
      ),并置于纳米乙型离心装置(30kDa,Pall)上。将设备以13,900离心 g 在室温下20分钟。所有以下离心步骤在13,900处进行 g,Rt,15分钟。通过三个洗涤步骤除去残留的SDS,其中100μL8 m urea/100 mm Tris-HCl,pH 8.5,后跟三个步骤,100μl50米m 茶,pH 7.8。接下来,包含1:20(w / w)测序级胰蛋白酶,0.2的100μl消化缓冲液。 m GuHCl, 2 mm CaCl2 in 50 mm 加入茶,pH7.8,并在37℃下孵育14小时。通过离心回收产生的胰蛋白胨肽,然后用两次用50μl50μm的洗涤步骤回收m Teab,pH 7.8和50μl超纯水。用10%TFA酸化肽(pH值<3.0),并且摘要如前所述控制质量(
      • 伯克哈特准
      • 舒姆布吕兹基C.
      • Wortelkamp S.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      消化效率和特异性的系统和定量比较揭示了胰蛋白酶质量对基于MS的彩易福彩组学的影响。
      )。将所有样品完全干燥并在0.5中溶液 m 茶,pH 8.5。使用Nanodrop 2000 UV-Vis分光光度计(Thermo Sciencific,Germany)测定肽浓度。在用Itraq 8-Plex试剂标记之前(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      多路复用彩易福彩定量 酿酒酵母酿酒酵母 使用胺反应性的等离性标记试剂。
      ),通过纳米LC-MS / MS分析每个样品(~1μg),以调节由于引发误差或基于总离子色谱图的对准的彩易福彩/肽浓度估计而导致的样品量的微小差异。根据制造商的指示(AB SCIEX),用ITRAQ试剂标记每个样品。多路复用样品(〜400μg)分为两部分, IE。 对于全局彩易福彩组分析50μg,磷酸富集富集350μg,并且两个部分完全以速度干燥。使用TiO完成磷肽富集2 (
      • Palmisano G.
      • Parker B.L.
      • Engholm-Keller K.
      • 恒星
      • Kulej K.
      • Schulz M.
      • SchwämmleV。
      • 格雷厄姆M.E.
      • Saxtorph H.
      • Cordwell S.J.
      • Larsen M.R.
      一种新的富集,鉴定和定量磷酸肽和唾液酸化糖肽的富集,鉴定和定量应用于小鼠脑发育的时间剖面。
      ,
      • 迪克特C.
      • Radau S.
      • Zahedi R.
      使用二氧化钛的微小样品量快速,高效,质量控制的磷酸富集。
      )珠子,然后是亲水相互作用色谱法(
      • Solari F.a.
      • Kollipara L.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      两只鸟一块石:使用ITRAQ的彩易福彩组和磷酸蛋白酶的平行定量。
      )。在总共三种亲水性相互作用色谱级分,干燥并在-80℃下储存直至进一步使用。对于全球彩易福彩组分析,将干燥的肽在200μl0.5%TFA(pH值)中溶解<3.0)使用C18规格提示(4毫克,瓦里安)脱盐。将洗脱的肽干燥并在10米中溶解m 铵甲酸铵,pH8.0。使用终极3000型LC系统(Thermo Sciencific,Germany),在生物酶C18,0.5×150mm,5μm粒度柱上通过反相色谱法在pH 8.0上进行反相色谱法分级25μg的多重样品。使用缓冲器A:10米m 甲酸铵,pH8.0和B:10米的84%ACNm 铵甲酸铵,pH8.0。肽以12.5μl/ min的流速加载到柱上,并在40分钟内使用以下梯度分离10分钟,3-45%B,5分钟,45-60%B, 60-95%B在5分钟内,95%B保持5分钟,5分钟内为95-3%B,柱重新平衡,3%B持续20分钟。在倾斜模式下以1分钟的间隔收集16个级分,并且将所有级分完全干燥并在-80℃下储存直至进一步使用。将干燥的亲水相互作用色谱级分在15μl0.1%TFA中溶解,并使用耦合到Q辐射HF(Thermo Scientific)的终极3000纳米RSLC系统,通过纳米-LC-MS / MS分析,如下文所详述 补充方法。在数据相关的采集模式下运行Q辐射HF,并获得MS调查扫描 m / z. 300至1,500以60,000的分辨率,使用聚硅氧烷离子 m / z. 371.1012作为锁定质量(
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )。将15个最强烈的离子分离为0.4 m / z. 考虑到20秒的动态排除,窗口和较高的能量碰撞解离(HCD)的碰撞能量为33%的碰撞能量。将所有16个pH 8.0级分在45μl0.1%TFA中溶解,通过如上所述通过纳米LC-MS / MS分析每种样品的1/3,细微变化(见 补充方法 )。

       定量彩易福彩组和磷酸蛋白:搜索参数

      所有ITRAQ原始数据都是使用Mudpit选项同时处理,其中Mudpit选项1.4并按照上述数据库搜索。为了最大化PSM的数量,我们包括三种不同的搜索算法(吉祥物(
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库来搜索基于概率的彩易福彩识别。
      ),续集(
      • ENG J.K.
      • mccormack a.l.
      • yates j.r.
      一种与彩易福彩数据库中氨基酸序列相关的肽串联质谱数据的方法。
      )和Amanda女士(
      • Dorfer V.
      • Pichler P.
      • Stranzl T.
      • Stadlmann J.
      • Taus T.
      • Winkler S.
      • Mechtler K.
      Amanda MS,一种用于高精度串联质谱的通用识别算法。
      ))使用相同的参数集。 MS和MS / MS分别设定为10ppm和0.02de02de0.02daps;胰蛋白酶作为酶,最多两个错过的切割; Cys(+57.0214DA)和ITRAQ-8-Plex在N末端和LYS(+304.2053DA)中的氨基甲酰 - 8-Plex作为固定修改;欧元氧化(+15.9949 da);以及Ser / Thr / Tyr(+79.9663AD)的磷脂蛋白酶物体磷酸化作为可变修饰。使用以下筛选条件导出所有数据:肽PSM具有虚假发现率<1%(高置信度设置),搜索引擎等级1.对于磷蛋白酶组数据,我们还使用磷光体节点(3.1版)(
      • Taus T.
      • kocher t.
      • Pichler P.
      • Paschke C.
      • 施密特A.
      • Henrich C.
      • Mechtler K.
      使用磷光体的普遍和自信的磷酸化位点定位。
      )计算站点本地化概率。

       定量彩易福彩组和磷酸酯:ITRAQ数据标准化和统计评估

      对于全球彩易福彩组,而不是通过彩易福彩组发现软件提供的,而不是使用七个ITRAQ比例,而是通过彩易福彩组发现软件提供的,而是将比率转化为归一化丰度值(NAV)。因此,统计比较假设比率( IE。 产生113/113),以便在实验中具有八个数据点。每种彩易福彩的单个通道比是转化的,对于每个彩易福彩的每个通道,所有彩易福彩的中值是(MD1)计算的。接下来,通过在所有渠道跨越中位数来产生第二个中值(MD2)。然后从单个MD1中减去MD2,以推导每个通道的标准化值(NVS)。随后使用这些NVs用于对每个彩易福彩/通道(标准化比率,NR)进行归一化各自的Log2转化比。接下来,通过将每个彩易福彩占据所有频道的每个彩易福彩来计算第三个中值(MD3,缩放因子)。然后从每种彩易福彩的NR中减去该MD3以获得每种彩易福彩的NUR。最后,通过划分平均导航或每一点来计算比率, IE。 1.5 H Staurosporine,由控件的平均导航。仅考虑至少两个独特的肽量化的彩易福彩(补充表3.)。使用类似的策略用于磷脂蛋白酶体数据分析。然而,考虑了独特的磷酸化PSM的记者离子区域而不是比率。接下来,对于代表相同彩易福彩,肽序列和磷酸化位点的独特磷酸肽PSM,每个通道求和区域,并且计算比例以上。只有独特的磷酸肽,磷矿物概率>90%被认为是(补充表3.)。 5,877和5,547的比例分别定量高置信磷酸肽和彩易福彩,用于使用Perseus产生热量(Fig. 3 )。

       沉积数据

      质谱彩易福彩组学数据通过骄傲沉积在Proteomexchange联盟中(
      • VizcaínoJ.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q.W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      )与DataSet标识符PXD005954,PXD006594,PXD006595的合作伙伴存储库。

      结果

      在系统优化SCX尖端条件后,即(i)制备包括玻璃料类型/设计的尖端和( II )SCX珠粒掺入肽比,以及方案的个体(洗脱和洗涤)步骤:( III )缓冲剂组合物和组合,( IV. )卷,和(v)离心条件,最终方案允许我们可重复地单独的未标记(Fig. 1B)和ITRAQ标记(Fig. 1C)胰蛋白酶肽。所得级分平均富含85-90重量%,以富含电荷+ 1,+ 2,+ 3和+4。分馏是可扩展的(Fig. 1B),可以应用于复杂的细胞裂解物和纯化的彩易福彩,并使我们完全转移最初的基于HPLC的N-末端Chafradic(
      • venne A.S.
      • vögtlef.n.
      • Meisinger C.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      综合N-末端彩易福彩组学的高度敏感,具体和直接策略揭示了线粒体肽酶ICP55的未知基材。
      )富集简体的冲心 小费 setup (Fig. 1D)。这随着时间和成本的大量减少,因为不再需要专用和可重复的HPLC仪器,并且可以并行处理样品。
      我们想知道是否chafra 小费 可以提供与原始HPLC的设置相当的结果,但在成本和努力的一小部分中。因此,我们在生物三份酸盐中培养了SH-SY5Y细胞,并用载体或Staurosporine进行处理,以诱导细胞凋亡。得到的六个样品(基于BCA的100μg彩易福彩)用Itraq-8-Plex试剂在彩易福彩水平上单独标记,多用,用胰蛋白酶酶活化,并分为六个100μg肽的等分试样。三种等分试样用于高效的基于HPLC的Chafradic和Chafra 小费 ,其次是每富集2/3的纳米LC-MS / MS(Fig. 2A)。实际上,我们对两种方法实现了类似的技术再现性水平(Fig. 2B)以1%的假发现率定量为975±24(HPLC)和783±71(提示)独特的N-末端肽。基于ITRAQ的量化在技术和生物学复制以及两种方法中高度可重复(补充表1)。显着差异的新末端肽清楚地指向预期的Caspase活性(Fig. 2C),并且涉及所识别的基材 例如 拼接,彩易福彩折叠,翻译和转录(Fig. 2D)。因此,Chafra. 小费 使高度敏感的N-ingrinomics具有类似的性能,作为基于昂贵的HPLC的工作流程。
      我们决定说明Chafra的力量 小费 通过研究SH-SY5Y细胞中石榴孢菌诱导的细胞凋亡的动态的方法。基于初始时间谱的石榴孢菌诱导的胱天蛋白酶活化(补充图2),我们选择了四个时间点:0.0小时(对照),1.5小时,3.0小时和6.0小时的Staurosporine治疗,每种都在生物重复。在ITRAQ标记为26μg(基于氨基酸分析)的肽(总共8×26 =208μg),多路复用和胰蛋白酶消化,我们将所得样品分成六个等分试样à35μg,对应于4.3μg每时间点和复制彩易福彩。为了评估方法转移到其他实验室的潜力,我们有两种不同的个人进行整个Chafra 小费 独立富集三个样品,总共六种技术复制。平均而言,我们量化了2,073±52个独特的N-末端肽,只有独特的彩易福彩条目,跨生物和技术复制的强烈相关性(补充表2和3, Fig. 3A)。这种前所未有的敏感性,对应于每μg彩易福彩裂解物的482个独特的N-末端肽的定量,将允许未来的样品量的定量N-术语,例如临床活组织检查。施用严格截止后,总共288 n个末端(220蛋白)显示出显着的调节:如果()只考虑唯一的N-末端肽(i)它们在至少三种生物复制的技术复制中量化并显示出( II )与对照相比,至少一个双重中值调节( III )与A. p value < 0.05 ( IV. )在两个生物复制中。我们还确定了来自我们的定量数据的相对标准偏差的帧间(所有六种技术复制之间)和interA(在生物学复制的平均值之间) 补充表2 (表“i - 摘要原始”),并获得平均相对标准偏差为5%(inter)和9%(intra)。
      在一孢子处理1.5小时后,鉴定出81个蛋白酶底物,然后分别在3小时和6小时后进行109和30个另外的底物(补充表2和3)。这些底物清楚地证实了预期的胱天蛋白酶活性,并且还在策划调节的特定途径(Fig. 3B)。 1.5小时底物包括拼接和翻译机械的几个成员,而且包括细胞内蛋白易位的中央分量(SEC61B,TOMM70,HSPD1,RTN4),内吞作用/囊泡输送(CLTA,DBNL,CTTN,SEC22B,SNX12,SNX2,RAB12) ,细胞骨骼组织(SEPT2,STMN1,CLASP1)和脂质代谢的彩易福彩核心(LPIN1,常规)。另外,在用蛋白水解越来越多地靶向3小时后,在三孢菌素处理DNA复制(MCM2,5和6,RRM2)和核封(LMNA,TMPO,TPR)之后,在6小时后切割的基材确认了前述效果的扩增。
      我们与定量彩易福彩组学和磷彩易福彩组织数据进行了补充,用定量彩易福彩组学和磷蛋白组数据进行了补充,定量了5,547个彩易福彩,具有至少两个独特的肽以及5,877个高置信磷肽(≥90%的位点定位概率; Fig. 3C; 补充表4.)。值得注意的是,只观察到彩易福彩丰度的少数显着变化。相比之下,作为一个未特异性激酶抑制剂Staurosporine导致彩易福彩磷酸化水平大量降低,近2,000种磷酸肽显示出在1.5小时后至少2送2送2左两份(Fig. 3C)。有趣的是,来自29个彩易福彩的31种磷酸肽在1.5小时后显示出较高三倍的上调。这些彩易福彩包含一组抗磷酸体组分(XAB2,DDX23,PRPF4B,DDX23,SRRM1,SRRM2,SRSF7,儿子)。通过蛋白水解和磷酸化对拼接机械的早期多级调节可以反映各种凋亡基因的替代剪接变体的已知作用(
      • Paronetto M.P.
      • Passacantilli I.
      • 制定C.
      替代剪接和细胞存活:从组织稳态到疾病。
      ,
      • van damme p.
      • 玛特L.
      • van damme J.
      • Hugelier K.
      • Staes A.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      在FAS诱导的细胞凋亡期间的Caspase特异性和非特异性的体内彩易福彩加工。
      ),似乎是Staurosporine诱导的细胞凋亡的驱动力。

      讨论

      我们的小说Chafra 小费 方法允许在彩易福彩组尺寸上进行蛋白水解靶标的超细鉴定和共有矩阵。该协议是简单的,低成本,并且只需要最小的设备,即彩易福彩组学实验室标准。因此,该协议应该很容易地转移到全球其他其他实验室,并且可以促进生成关于蛋白酶,目标和动态的现有知识的新颖和扩展。作为基于提示的程序,Chafra 小费 进一步具有使用液体处理系统的自动化潜力,以便并行化高通量无标记的定量N-术语。如所示,方案可以适应不同量的起始材料,并且还适用于进一步的化学标记策略,例如二甲基或串联质量标签(TMT)标记(未示出的数据)。此外,可以进一步适用于使用肽文库的直接和敏感的蛋白酶特异性分析(

      Nguyen,M.T.N.,Shema,G.,Zahedi,R。P.和Verhelst,S.H。L.,使用“电荷同步”彩易福彩组衍生的肽文库在移液管尖端中蛋白酶特异性分析。提交。

      )。
      这里证明的敏感性对于N-术语来极高,并且可以允许研究具有严重限制量的样品,例如活组织检查,而且结合不同的分析策略,如所示。因此,量化N-末端(2,073末端肽),彩易福彩组(具有至少两个独特的肽的5,547个彩易福彩),以及具有相当大的深度的磷蛋白酶组(5,900个高置信磷酸盐)仅需要4.3μg,6.25μg和每时间点43.75μg彩易福彩和生物复制(基于氨基酸分析的彩易福彩量)。值得注意的是,这些N-术语结果是在标记26μg蛋白条件(总共208μg)后实现的,后来将其分成六个等分试样(总共35μg),对应于4.3μg彩易福彩/通道。通过LC-MS(6小时总MS时间,对应于每小时345.5定量的独特N-末端肽,通过LC-MS测量40分钟,通过测量4,073个N-末端肽的平均值。例如,通过梯度优化使用专用软件工具(
      • Moruz L.
      • KällL.
      梯度优先考器:用于计算反相液相色谱中的优化梯度的开源图形环境。
      )。然而,给定的最先进的LC-MS设备和采样协议,所示的工作流程甚至可能与5μg的起始材料一起工作,尽管可以预期较低的量化N-末端肽和更高的技术变化部分是由于裂解过程中不可避免的损失和以下样品制备步骤。然而,结合最佳的采样策略和标准化,这里呈现的灵敏度甚至可能允许针活检的N-术语。我们还分析了我们对富集可能产生的潜在物理化学偏差的数据,因为PTM浓缩程序并不罕见(
      • Solari F.a.
      • Dell'aica M.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      为什么磷彩易福彩仍然是一项挑战。
      )。因此,我们将本研究中鉴定的3,086个独特的鉴定的N-末端肽与肽阿特拉斯(2017年10月,总共1,222,862个肽条目)中的N-末端肽进行了比较,如下所述 补充方法。我们只能发现肽长度和净充电状态分布的轻微差异,但是,可以归因于ITRAQ标签的使用(
      • Thingholm T.e.
      • Palmisano G.
      • Kjeldsen F.
      • Larsen M.R.
      不希望的电荷增强等异质标记的磷酸矿物导致鉴定效率降低。
      )而不是我们的chafra 小费 丰富(参见 补充图3-6 )。
      彩易福彩组,磷酸酯组和N-末端的组合分析特别有趣,因为多种后翻译改性之间的复杂相互作用(
      • 彭米
      • Spolten A.
      • Heck A.J.
      • van Breukelen B.
      从大型实验数据集中鉴定富集的PTM串扰图案。
      ,
      • venne A.S.
      • Kollipara L.
      • Zahedi R.P.
      下一个复杂程度:后期修改的串扰。
      ,
      • Zahedi R.P.
      加入力量:研究多种翻译后修饰,以了解动态疾病机制。
      )但也在不同的生物分子物种之间(
      • COMAN C.
      • Solari F.a.
      • Hentschel A.
      • 镰刀A.
      • Zahedi R.P.
      • Ahrends R.
      同时代谢物,彩易福彩,脂质提取(Simplex):系统生物学的组合多分子常规常规方法。
      )变得越来越明显。已经表明,蛋白酶通过磷酸化调节(
      • Cardone M.H.
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      • Salvesen G.S.
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      通过磷酸化调节细胞死亡蛋白酶caspase-9。
      ),而激酶可以通过蛋白水解裂解调节(
      • Chan K.T.
      • Bennin D.A.
      • Huttenlocher A.
      CALPAIN介导的抗粘连激酶(FAK)调节粘附动力学。
      )。所谓的磷脂直接调节蛋白酶基材的降解(
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      两只鸟一块石:使用ITRAQ的彩易福彩组和磷酸蛋白酶的平行定量。
      )药物靶标和治疗控制的生物标志物。

      数据可用性

      质谱彩易福彩组学数据已经通过PRIDE(31)伙伴存储库与DataSet标识符PXD005954,PXD006594,PXD006595的PXD006595沉积在Proteomexchange联盟中。

      致谢

      我们感谢Julia Burkhart博士进行批判性阅读。

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