鉴定和选择的反应监测(SRM)与麻木相关的内吞作用因子的定量

  • Jonathan R. Krieger.
    隶属关系
    多伦多大学医学生物物理学系,多伦多,安大略省,M5G 2M9,加拿大

    亚瑟和索尼娅Labatt脑肿瘤研究中心和细胞生物学,病患者,生病儿童医院,多伦多,安大略省M5G 1x8,加拿大
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  • 保罗泰勒
    隶属关系
    分子结构和功能的程序,医院生病儿童,多伦多,安大略省M5G 1X8,加拿大
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  • Aaron S. Gajadhar.
    隶属关系
    多伦多大学医学生物物理学系,多伦多,安大略省,M5G 2M9,加拿大

    亚瑟和索尼娅Labatt脑肿瘤研究中心和细胞生物学,病患者,生病儿童医院,多伦多,安大略省M5G 1x8,加拿大
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  • Abhijit Guha.
    脚注
    隶属关系
    亚瑟和索尼娅Labatt脑肿瘤研究中心和细胞生物学,病患者,生病儿童医院,多伦多,安大略省M5G 1x8,加拿大

    多伦多大学多伦多西部医院神经外科部门,加拿大多伦多M5A 2N4
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  • Michael F. Moran.
    隶属关系
    分子结构和功能的程序,医院生病儿童,多伦多,安大略省M5G 1X8,加拿大

    多伦多大学多伦多大学,加拿大多伦多大学的分子遗传学系,龙亭和最佳医学系
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  • C. Jane McGlade.
    一致
    应解决谁的通信:医学生物物理学部,多伦多大学,科学家,细胞生物学计划,以及亚瑟和索尼娅Labatt脑肿瘤研究中心,生病儿童医院,多伦多医疗探索塔,101大学街,东塔,11-308室,多伦多,在,加拿大,M5G 1L7。电话:(416)813-8657;传真:(416)813-8456
    隶属关系
    多伦多大学医学生物物理学系,多伦多,安大略省,M5G 2M9,加拿大

    亚瑟和索尼娅Labatt脑肿瘤研究中心和细胞生物学,病患者,生病儿童医院,多伦多,安大略省M5G 1x8,加拿大
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了加拿大卫生研究院的补助金(CJM - MOP-106507,MFM - MOP-102536)和加拿大研究椅计划(MFM)。
    本文包含补充图。 S1至S3和表S1和S2。
    †死者。
      麻木的是一种内吞适配物,调节内吞作用和贩运跨膜受体,包括缺口,E-CDADHERIN和整联蛋白。脊椎动物麻木是在外显子3和9处拼接以产生四种蛋白质同种型。这些同种型的表达在不同的发育阶段各不相同,尽管已经研究了含有外显子3的麻木同种型的功能,但尚未显示外显子9夹杂物的作用。在这里,我们使用亲和纯化和串联质谱法以鉴定Numb相关蛋白质,包括与Reps1,BMP2K和BCR的新型相互作用。体外绑定测量指示EXON 9无关的NUMB与REPS1和EPS15 EH结构域的交互。选择的反应监测质谱法定量地比较与P72和P66 Numb同种型相关的蛋白质,其不同由外显子9区域不同。这表明,通过使用接近连接测定,可以通过使用近距离结扎测定,明显更多的EPS15和三个AP-2亚基蛋白结合Numb同种型。最后,我们使用多路复用的选择反应监测质谱法,评估与内吞蛋白的麻木关联的动态调节。麻木的超磷酸化导致麻木内核复合物的脱离,而内吞作用的抑制性并未改变AP-2复合物的麻木关联,但改变EPS15,Reps1和BMP2K的招募。因此,NMBB蛋白质 - 蛋白质相互作用的定量质谱分析已经为蛋白质复合物的组装和调节提供了新的洞察力和调节的发育和癌症。
      果蝇黑胶基 发展, 麻木的 作为内在细胞命运决定蛋白,调节感觉器官前体细胞中的细胞命运决定,其产生外部感官器官,周围神经系统的组分(
      • Rhyu M.S.
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      在感觉器官前体细胞分裂过程中麻木蛋白的不对称分布将不同的粘性分裂到子细胞。
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      在果蝇中的肌原素谱系的分离需要麻木。
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      Prospero转录因子在果蝇在果蝇中的神经细胞有丝分裂期间对细胞皮质局部局部化。
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      numb,一种在果蝇在果蝇胚胎中形成感觉器官形成期间的细胞命运所需的基因。
      )。保守的麻木基因已被识别 Caenorhabditis elegans. 以及脊椎动物(
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      麻木在有丝分子禽神经头脑细胞的基础皮质中定位,并通过与Notch-1结合调节神经元分化。
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      小鼠皮质神经发生期间哺乳动物Numb同源物的不对称定位。
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      一种新型衔接蛋白使用磷酸酪氨酸结合结构域和异常碱性N-末端结构域,以捕获和定位非典型蛋白激酶C:Caenorhabdise胶虫C激酶适配器1的表征,杀菌蛋白质激酶C3。
      )。麻木对哺乳动物的发展至关重要,发挥着调节胚胎发生期间神经祖细胞群的增殖和分化的作用(
      • Petersen P.H.
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      • Hwang J.K.
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      祖细胞维持在小鼠神经发生期间需要麻木和麻木。
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      胚胎背侧前脑中麻木和Numblike的失活损害神经发生,破坏皮质形态发生。
      )。此外,证据表明,在乳腺癌和肺癌中抑制肿瘤发生的麻木的作用(
      • 韦斯霍夫B.
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      肺癌中凹口途径的改变。
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      通过NUMB OVERCH丧失负调节与人类乳腺癌有关。
      )。
      麻木的含有氨基末端磷酸吡罗氨酸结合(PTB)结构域,脯氨酸富区域,两种DPF(天冬氨酸 - 脯氨酸 - 苯丙氨酸)基序和NPF(天冬酰胺 - 脯氨酸 - 苯丙氨酸)基序(Fig. 1A)。 Numb的羧基末端DPF基序与AP-2复合物的α-Adaptin亚基的保守相互作用,克拉林涂层凹坑的主要成分(
      • Santolini E.
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      G蛋白偶联受体和蛋白激酶C活化的哺乳动物Numb动态调节:与皮质膜麻木闭合的结构决定簇。
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      在果蝇中的麻木介导的不对称细胞分裂需要内吞蛋白α-Adaptin。
      )。 NPF基序对于含有蛋白质的EPS15同源域(EH)结构域的结合是重要的,包括EPS15(通过EPS15的EH2介导),其调节内吞作用和囊泡输送(
      • DHO S.E.
      • Trejo J.
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      G蛋白偶联受体和蛋白激酶C活化的哺乳动物Numb动态调节:与皮质膜麻木闭合的结构决定簇。
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      • Pelicci P.G.
      • 迪菲尔德P.P.
      结合特异性和EH结构域的体内靶标,新型蛋白质蛋白质相互作用模块。
      )。与EHD1和EHD4蛋白质的相互作用也通过NPF基序介导在膜受体再循环中的蛋白质(
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      细胞命运决定簇麻木与EHD / RME-1家族蛋白相互作用,并在内吞再循环中具有作用。
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      含有管状EHD1的隔室,涉及主要组织相容性复合体I分子的再循环到质膜。
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      • d'souza-schorey c.
      • Chavrier P.
      ARF蛋白:膜交通和超越的角色。
      )。除了与内吞机械的组分相互作用之外,麻木定位于内吞室,用克拉肽涂层凹坑和早期胚胎中的α-Adaptin分致均可,以及EPS15和Endocytic囊泡中的EPS15和EHD4(
      • Santolini E.
      • Puri C.
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      麻木是一种内吞蛋白。
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      G蛋白偶联受体和蛋白激酶C活化的哺乳动物Numb动态调节:与皮质膜麻木闭合的结构决定簇。
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      细胞命运决定簇麻木与EHD / RME-1家族蛋白相互作用,并在内吞再循环中具有作用。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1LC-MS / MS识别密切相关的麻木相互作用蛋白,形成内吞复合物: A,示出了四个麻木同种型结构的示意图。将3xFlag表位标签序列加入NUMB P72或NUMB 66构建体的氨基或羧基末端,然后用于产生稳定的细胞系。 B,可视化分析在具有麻木同种型的七个生物学上不同的LC-MS / MS / MS实验中至少五个中鉴定的蛋白质之间的相互作用表明麻木相关的蛋白质是相关的,并且在很大程度上形成内吞复合物的一部分。虚线边缘线代表新识别的麻木关联,这些关联已通过共同免疫训练证实 体外 binding assays.
      麻木的内吞炎和贩运跨膜受体包括缺口,E-Cadherin和β1-整合蛋白(
      • McGill M.A.
      • DHO S.E.
      • Weinmaster G.
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      麻木调节Notch1的内吞贩和降解。
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      • Nishimura T.
      • Kaibuchi K.
      麻木的对照细胞迁移与APKC和PAR-3的定向细胞迁移进行整合素内吞。
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      • 佐藤K.
      • Watanabe T.
      • 王S.
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      • Sugiyama I.
      • ozawa M.
      • Kaibuchi K.
      麻木的通过P120 Catenin用APKC控制E-Cadherin内吞作用。
      )。两者的PTB域 果蝇 已显示哺乳动物Numb与跨膜蛋白的细胞内结构域结合,并且通过与AP-2复合物的保守相互作用,被认为将受体招募促进克拉族涂层坑和内化(
      • Santolini E.
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      整联蛋白β细胞质结构域与磷酸酪氨酸结合结构域的相互作用:整合素信号传导中的多样性结构原型。
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      非对称划分期间的子细胞命运的控制:Numb和Notch的相互作用。
      )。此外,还证明NUMB在哺乳动物细胞和哺乳动物细胞中的回收率产生负面调节受体 C. Elegans. (
      • McGill M.A.
      • DHO S.E.
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      麻木调节Notch1的内吞贩和降解。
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      • 格兰特B.D.
      • 塞克斯。
      CaenorhabditiseDeltans Num-1负调节内吞再循环。
      )。哺乳动物Numb似乎通过与包括瘙痒(包括瘙痒)的EHD家族和泛素连接酶的协会调节内吞贩的事件
      • 史密斯C.A.
      • DHO S.E.
      • Donaldson J.
      • Tepass U.
      • McGlade C.J.
      细胞命运决定簇麻木与EHD / RME-1家族蛋白相互作用,并在内吞再循环中具有作用。
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      • McGill M.A.
      • McGlade C.J.
      哺乳动物Numb蛋白促进Notch1受体泛素化和Notch1细胞内结构域的降解。
      )。已经显示受体内化和再循环的麻木依赖性调节对粘附结稳定性,凹口信号传导和细胞迁移具有影响,尽管所涉及的机制未得到完全理解。
      哺乳动物Numb转录物或者通过包含或排除外显子3和9产生的四种蛋白质同种型(Numb P72,P71,P66,P65)产生四种蛋白质同种型(Fig. 1A)(
      • DHO S.E.
      • 法国M.B.
      • 伍兹S.A.
      • McGlade C.J.
      四种哺乳动物麻木同种型的表征。鉴定磷酸酪氨酸结合结构域的细胞质和膜相关变体。
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      • verdi j.m.
      • Bashirullah A.
      • Goldhawk D.E.
      • kubu c.j.
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      • Meakin S.O.
      • Lipshitz H.D.
      不同的人麻木同种型调节分化与神经元谱系中的增殖。
      )。由于在蛋白质的中心区域中包含外显子9编码序列,而出现了两个最大的同种型(P71和P72),而两个较小的蛋白质(P65和P66)出现来自外显子9跳跃。类似地,包含外显子3,导致PTB结构域内的插入件产生P66和P72同种型,而跳过外显子3产生P65和P71蛋白质(
      • DHO S.E.
      • 法国M.B.
      • 伍兹S.A.
      • McGlade C.J.
      四种哺乳动物麻木同种型的表征。鉴定磷酸酪氨酸结合结构域的细胞质和膜相关变体。
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      • Jamali M.
      • Meakin S.O.
      • Lipshitz H.D.
      不同的人麻木同种型调节分化与神经元谱系中的增殖。
      )。外显子9的替代拼接是显影压的,并且已经报道了特异性特异性生物功能。例如,在P19细胞中,通过视黄酸诱导分化后,在含有外显子9的P71和P72同种型的表达减少(
      • DHO S.E.
      • 法国M.B.
      • 伍兹S.A.
      • McGlade C.J.
      四种哺乳动物麻木同种型的表征。鉴定磷酸酪氨酸结合结构域的细胞质和膜相关变体。
      )通过含有Exon9的Numb同种型的表达促进P19细胞增殖(
      • verdi j.m.
      • Bashirullah A.
      • Goldhawk D.E.
      • kubu c.j.
      • Jamali M.
      • Meakin S.O.
      • Lipshitz H.D.
      不同的人麻木同种型调节分化与神经元谱系中的增殖。
      )。在胚胎小鼠脑中观察到类似的表达模式,以及显影视网膜和胰腺,其中包括外显子9的麻木同种型在早期发育阶段表达,然后在分化期间减少(
      • verdi j.m.
      • Bashirullah A.
      • Goldhawk D.E.
      • kubu c.j.
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      不同的人麻木同种型调节分化与神经元谱系中的增殖。
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      麻木的在脊椎动物视网膜开发中的参与:多种角度在神经分化和成熟中的多种作用的证据。
      )。最近,还表明外显子9包含在人肺癌以及结肠癌和乳腺癌中常见的替代剪接事件(
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      肺癌误解的替代剪接事件的全局分析和分子表征。
      )。
      麻木替代剪接的发育调节及其与人肿瘤的关系表明Numb蛋白质同种型可以赋予不同的功能性质。为了解决假设,即通过NUMB的分子相互作用产生这种性质,我们采用了涉及质谱(MS)的蛋白质组学方法,以鉴定与NMBB的单个同种型相关的蛋白质复合物。我们鉴定了内吞复合物的已知组分和先前未被鉴定为与NUMB相关的几种蛋白质的组分。涉及所选反应监测(SRM)-MS的靶向蛋白质组学方法
      使用的缩写是:
      SRM.
      选定的反应监测
      IP.
      免疫亲亲亲爱的纯化
      AP-MS.
      亲和纯化串联质谱法
      DPF.
      天冬氨酸 - 脯氨酸 - 苯丙氨酸基序
      EH.
      EPS15同源域
      HRP.
      辣根过氧化物酶
      IP.I.
      国际蛋白质指数
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      MSRM.
      多路复用的SRM.
      NPF.
      天冬酰胺 - 脯氨酸 - 苯丙氨酸基序
      pl
      近距离连接测定
      PTB.
      磷酸酪氨酸结合结构域。
      1使用的缩写是:SRM.
      选定的反应监测
      IP.
      免疫亲亲亲爱的纯化
      AP-MS.
      亲和纯化串联质谱法
      DPF.
      天冬氨酸 - 脯氨酸 - 苯丙氨酸基序
      EH.
      EPS15同源域
      HRP.
      辣根过氧化物酶
      IP.I.
      国际蛋白质指数
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      MSRM.
      多路复用的SRM.
      NPF.
      天冬酰胺 - 脯氨酸 - 苯丙氨酸基序
      pl
      近距离连接测定
      PTB.
      磷酸酪氨酸结合结构域。
      用于量化与Numb同种型相关的相互作用蛋白,并监测Numb内胶质复合组件的动态。

      实验步骤

       构建体,细胞培养和抗体

      通过使用EcoR1限制性摘要网站将同种型特定的小鼠Numb构建体括成3xFlag-CMV-10向量(来自Vuk Stambolic博士,大学健康网络,多伦多的慷慨礼品)。使用基于麻木的BamH1限制性位点确认方向取向。为了克隆进入羧基3xFlag-CMV-14载体,使用PCR使用以下引物扩增NMBB cDNA:前进5'GTGGAATTCGGCTTAGTTAACATG 3',并反向5'CTGCAGAGAGTTCGGTCTAGACAAAGTTCTTC 3'。用EcoR1 / Xbai消化扩增的DNA,并插入载体的多个克隆位点。以前产生NumbP66ΔC构建体(
      • McGill M.A.
      • McGlade C.J.
      哺乳动物Numb蛋白促进Notch1受体泛素化和Notch1细胞内结构域的降解。
      )。通过PCR使用以下引物产生NumBP72ΔC构建体:前进5'CGCGAATTCTAACAACTACGGCAAGCTTC 3',并反向5'GATCTCGAGTCAGGTGCCTGGAGGGAG 3'。为了生成NUMB P72-NPW-AAA-ΔC,则使用以下引物来放大NUMBP72ΔC模板:前进5'CCTGTCCGTGAACCGCGCGCGCGCCCTGTCCCTGATG 3',并反向5'CATCAGGATGGGCGGCGGCGGCGGTTTCAGGGAGG 3'。 Reps1从Sidnet(Signing识别网络,生病儿童,多伦多的医院)获得全长构建。 GST-REPS1(EH域221-323)通过PCR使用以下引物生成:前进5'GCCattgaAtcGTAGGGGATCCAGTATG 3',并反向5'ATCCCCAACATCTGCGAATTTTCAAATCAATCAG 3'。消化扩增产物并克隆到GST表达载体中,PGEX4T1。类似地,EPS15(106-215)的EH2结构域使用以下引物进行PCR扩增:前进5'CCAAGATTTCATGATCCAGCAGTCCG 3',并反向5'GGATACAACCAGAATTCTCTTAGAAGG 3',并克隆到同一载体中。如前所述制备GST融合蛋白(
      • 聂杰。
      • McGill M.A.
      • 面部米
      • DHO S.E.
      • Wolting C.D.
      • McGlade C.J.
      LNX用作环型E3泛素连接酶,其靶向细胞命运决定簇Numb,用于泛素依赖性降解。
      )。他标记的eh的版本2 通过使用相同的引物和克隆到PET32A载体中的PCR扩增产生Reps1的EPS15和EH域的域。通过在2mL裂解缓冲液中裂解BL21细胞(50μm)来制备他的融合蛋白m HEPES pH 7.5,0.5 m NaCl,10%甘油,10米m 咪唑,完全蛋白酶抑制剂(Roche),4米m β-巯基乙醇,4米m 己酸),其次是超声处理,并用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen,Valencia,CA)纯化。使用洗涤缓冲液中的步进梯度法洗脱纯化的蛋白质(50米m HEPES pH 7.5,0.5 m NaCl,10%甘油,5米m β-巯基乙醇,4米m 含有含量增加的咪唑(20至600米的丙酮酸,完全蛋白酶抑制剂(罗氏))m)。通过在具有已知浓度的牛血清白蛋白标准的SDS-PAGE凝胶上运行通过在SDS-PAGIN凝胶上运行纯化的蛋白质。
      HEK293T细胞生长并维持在Dulbecco的改性鹰培养基(智慧)中,补充有10%胎牛血清(智慧)。使用每10cm组织培养板的1μgDNA在70%汇合下进行转染,并在脂质切除胺2000(Invitrogen,Carlsbad,Ca)转染方案中。通过在PBABE-PURO的1:10的比例中通过COTRANSFecting NBBB-嘌呤霉素抗性质粒产生稳定的细胞系。在24小时后,将细胞分成四个10cm平板,并在添加2μg/ ml嘌呤霉素之前再生24小时。选择并膨胀单细胞菌落。将稳定的细胞系保持在与亲本系相同的介质中,补充有嘌呤霉素(1μg/ ml)。对于磷酸化研究,用50℃处理细胞20分钟 m 花萼A或等同的二甲基亚砜(DMSO)载体。对于Numb免疫亲和纯化(IP)和Western印迹,如前所述使用针对CUMB末端的抗体(
      • DHO S.E.
      • 法国M.B.
      • 伍兹S.A.
      • McGlade C.J.
      四种哺乳动物麻木同种型的表征。鉴定磷酸酪氨酸结合结构域的细胞质和膜相关变体。
      )。 EPS15的市售抗体(Covance&Santa Cruz),Myc(9e10,Upstate Biotechnology)和Ha(克隆16b12,covance)用于蛋白质印迹,而抗HA克隆12ca5(roche)用于IP。抗标志-M2(Sigma)用于IP和Western Blotting。
      为了分析阻断和恢复内吞作用对NumB相互作用的影响,汇合HEK293T细胞的汇率-P66或P72 NUMB进行K消耗,如Larkin所述 等等。 (
      • Larkin J.M.
      • 棕色M.S.
      • Goldstein J.L.
      • 安德森·卢比。
      细胞内钾的耗尽捕获涂覆坑形成和受体介导的成纤维细胞内吞作用。
      )。简而言之,通过低渗休克介质(50%Dulbecco改良的Eagle培养基,50%H处理细胞2o)在37°C下5分钟,然后与K孵育+ depleted media (50 mm HEPES pH 7.4, 100 mm NaCl)在37℃下15分钟捕获内吞作用。收获细胞(0'时间点)或与K孵育+ 恢复介质(50米m HEPES pH 7.4, 100 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CaCl2,10%胎牛血清)以恢复克拉辛涂层的形成并允许内吞作用进行。在添加K后,在5,15或25分钟收获细胞+ 恢复媒体。如下所述进行细胞裂解,标志IP和MS样品制剂。

       质谱蛋白样品制备

      如前所述进行细胞裂解,标志IP和MS(LC-MS / MS和SRM)样品制剂(
      • 陈G.I.
      • Gingras A.c.
      丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的亲和纯化质谱(AP-MS)。
      ,
      • 桐j.
      • 泰勒P.
      • 佩德曼三
      • Prakash A.
      • 莫兰姆。
      表皮生长因子受体磷酸化位点SER991和TYR998涉及调节SER1039和THR1041的受体内吞作用和磷酸化。
      )。简而言之,在MS裂解缓冲液中裂解表达3×Flag-Nbp66或3xFlag-Nbp72的90%汇合细胞的六个150mm组织培养板(50米)m hepes-koh ph 8.0,100 mm KCl, 2 mm EDTA,0.1%Nonidet P-40,10%甘油,0.25米m Na3vo.4, 50 mm β-甘油磷酸,10米m NaF, 1 mm 二硫醇,补充有1米m 苯基甲基磺酰氟,1米m MgCl2和1个完全蛋白酶抑制剂片剂(Roche),并进行2个冻融循环,在液体n之间交替2 和37°C水浴。裂解物含有琼脂糖珠,并进行抗标岛免疫亲和纯化(标志M2-琼脂糖,σ,5μl50%浆料/ 10mg蛋白裂解物),以分离麻木相互作用蛋白。对于溶液消化,使用标志肽(300ng /μl)或氢氧化铵(pH 11-12)洗脱免疫亲和纯化的蛋白质。氢氧化铵中的洗脱蛋白冻干,然后重新悬浮于25米m 用0.75μg胰蛋白酶(NEB)碳酸氢铵和消化过夜。对于凝胶中的消化,使用在4-12%梯度凝胶上的纽扣系统通过SDS-PAGE分离免疫亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲亲和性的复合物。将凝胶固定在50%甲醇/ 7%乙酸中,然后用Gelcode Blue(Thermo Scientific)染色。如上所述,切除并消化并提取凝胶带(
      • 金刚石r.l.
      • 白色m.y.
      • 默里C.I.
      • Kane L.A.
      • 傅Q.
      • 斯坦利B.A.
      • 范艾克J.E.
      自下而上蛋白质组学工作流程中质谱分析蛋白质和肽的制备。
      )。

       霰弹枪液相色谱分析串联质谱(LC-MS / MS)

      在表达氨基或羧基端子标记标记的Numb P66或P72的稳定细胞系上进行霰弹枪LC-MS / MS分析。分析一式三份与溶液溶液消化,单独进行凝胶消化。将冻干的肽混合物溶于0.1%甲酸中,并在4μL/ min的自制150μmC18(Magic C18,Michrom Biosciences)上煅烧。反相纳米升量表HPLC(易N-LC,热捕捞)用于在具有相同C18材料的发射极尖端的75μm分析柱上解析肽。在0.1%甲酸中的0至40%乙腈梯度,在300 nl / min的速率下肽以超过120分钟洗脱。纳米电喷雾将肽引入LTQ-杂交杂交质谱仪(热渔业)。质谱仪在数据相关模式下操作,并且在横向的最大分辨率下以60,000个全宽度获得扫描。 MS / MS在线性离子阱中进行,其中通过碰撞诱导的解离产生6ms / MS扫描。
      通过使用Xcalibur(Thermo-Fisher)来分析由LC-MS / MS产生的原始数据(Xcalibur 2.2生成的峰值光刻)进行离子电流分析,并针对国际蛋白质指数人类数据库进行了搜索,下载 http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html (v3.49,条目数= 74024),通过使用x!串联(www.thegpm.org.,Cyclone版本2010.12.01.2)。修改数据库以包括用于产生上述稳定细胞系的鼠标Numb同种序列。校准数据库搜索以使用5 ppm的母离子精度,片段离子精度为0.5 da,并允许两个错过的胰蛋白酶切割。丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的磷酸化以及甲硫氨酸的氧化均被选择为可变修饰,并包括在搜索中。然后将搜索的数据导入以前描述的脚手架3(蛋白质组软件)进行分析(
      • 桐j.
      • 泰勒P.
      • 佩德曼三
      • Prakash A.
      • 莫兰姆。
      表皮生长因子受体磷酸化位点SER991和TYR998涉及调节SER1039和THR1041的受体内吞作用和磷酸化。
      )。

       通过选定的反应监测分析

      如前所述开发和优化SRM方法(
      • 桐j.
      • 泰勒P.
      • 佩德曼三
      • Prakash A.
      • 莫兰姆。
      表皮生长因子受体磷酸化位点SER991和TYR998涉及调节SER1039和THR1041的受体内吞作用和磷酸化。
      ,
      • Jin L.L.
      • 桐j.
      • Prakash A.
      • 佩德曼三
      • ST-兆头J.R.
      • 泰勒P.
      • Trudel S.
      • 莫兰姆。
      选定反应监测质谱法测量蛋白质磷酸化化学计量。
      )。测量缺乏甲硫氨酸或半胱氨酸的胰蛋白酶肽,并且基于在LC-MS / MS期间观察到的最大信号强度,并根据SRM试验期间进一步精制的最大信号强度来选择转变(3或4个)。使用Pinpoint软件(Thermo Scientific)计算SRM峰面积。每个SRM实验包括每个生物样品的三种技术重复,每种麻木同种型三种生物重复。对于每种技术复制,总结了两种NumB肽(AVLWVSADGLR,GFPALSQK)的总面积,并通过将该求和值除以所有生物实验的最高值来产生归一化因子。这是为了考虑细胞系横跨细胞系数的NUMB表达的差异,并以先前描述的蛋白质()正常化SRM测量的差异(
      • 桐j.
      • 泰勒P.
      • 佩德曼三
      • Prakash A.
      • 莫兰姆。
      表皮生长因子受体磷酸化位点SER991和TYR998涉及调节SER1039和THR1041的受体内吞作用和磷酸化。
      )。每种生物复制内的技术复制被平均,然后计算生物重复的平均值。使用学生计算统计显着性 t 测试(双尾,不平等方差)在哪里 p <0.05被认为是统计学意义。

       免疫亲和纯化,Western印迹,GST体外结合测定,以及近距离连接分析

      转染的HEK293T细胞生长到汇合并在非皮肤下裂解(50米)m HEPES pH 7.5, 150 mm NaCl, 1.5 mm MgCl2 1 mm EGTA,10%甘油,1%Nonidet P-40)含有完全蛋白酶抑制剂片剂(Roche)用于Reps1免疫耐核测定,细胞在MS裂解条件下裂解细胞。对于每种IP,1mg裂解物由Nonidet P-40裂解缓冲液制成高达750μL的体积,并与抗体和蛋白A或蛋白G琼脂糖珠在4℃下孵育1.5小时。将复合物用Nonidet P-40洗涤缓冲液洗涤四次(20米m HEPES pH 7.5, 150 mm NaCl,10%甘油,0.1%Nonidet P-40)。对于GST融合蛋白结合测定,将1mg裂解物由Nonidet P-40裂解缓冲液制成高达750μl的体积,并在4℃下与〜5μg融合蛋白孵育1.5小时。用高盐H​​NTG缓冲液洗涤复合物五次(20米m HEPES pH 7.5, 500 mm NaCl,10%甘油,0.1%Triton-X100)。为了 体外 结合测定,将10μg纯化的His标记的蛋白质与含有1%牛血清白蛋白和1%Triton-X的1ml PBS中的〜5μg融合蛋白一起温育。用高盐H​​NTG缓冲液洗涤复合物五次。通过沸点在2×SDS样品缓冲液中煮沸,通过SDS-PAGE分离的蛋白质复合物洗脱,转移到聚偏二丙烯膜上,并用一代抗体免疫印迹,如在23℃下在23℃或4℃下过夜所示,然后孵育辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗在室温下为1小时。使用化学发光底物(Amersham Biosciences)可视化蛋白质。
      允许在细胞中可视化细胞中蛋白质 - 蛋白质相互作用的邻近连接测定(Olink Biosciences,乌普萨拉,瑞典,如前所述预先成形(
      • Fredriksson S.
      • 古伯格米
      • 贾维斯J.
      • olsson c.
      • Pietras K.
      • Gustafsdottir S.M.
      • Ostman A.
      • LANDEGREN U.
      使用邻近依赖性DNA连接测定的蛋白质检测。
      ,
      • Gajadhar A.
      • 瓜哈A.
      使用瞬时转染的表位标记蛋白质的近距离连接测定:用于原位检测二聚受体酪氨酸激酶的应用。
      ,
      • Soderberg O.
      • 古伯格米
      • 贾维斯M.
      • Ridderstrale K.
      • Leuchowius K.J.
      • 贾维斯J.
      • Wester K.
      • 氢干P.
      • Bahram F.
      • Larsson L.G.
      • LANDEGREN U.
      通过近距离连接直接观察单个内源性蛋白质复合物。
      通过3xflag-numb p66或p72瞬时转染的HeLa细胞,如下用主要抗体和稀释液,如下所示:EPS15(Santa Cruz,Santa Cruz,CA)1:750,Flag-M2(Sigma)1:1000,转移素受体(Zymed Laboratories Inc.,South San Francisco,CA和Millipore)1:500。也通过使用抗麻木(1:500)进行相同细胞中麻木的间接免疫荧光。使用旋转盘共聚焦显微镜可视化荧光,并使用卷软件套件(Perkin Elmer)进行图像分析。

      结果

       LC-MS / MS识别的新麻木交互蛋白

      为了鉴定异染素的NUMB相互作用复合物,使用LC-MS / MS分析一组NUMB免疫沉淀物。生成稳定表达3x-Flag的HEK293T细胞(氨基或羧基)NUMB P66或P72,用不同水平的P66和P72过表达分离克隆(补充图。S1)。 LC-MS / MS在溶液中和凝胶中的胰蛋白酶消化的标志 - 免疫沉淀物中进行。在每个样品中,用多种独特的肽(P66的〜32%覆盖32%覆盖,P72的〜41%覆盖),并且是基于总肽的最丰富的蛋白质(表I.)。由于胰蛋白酶切割位点的分布,预期观察到的麻木的有限覆盖率,其产生几大用于通过所用的LC-MS / MS条件检测的几种肽。使用肽先知和蛋白质先知分别分配的95%肽和蛋白质识别概率的标准鉴定了共423个蛋白质(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      ,
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )至少两个不同的肽(补充表S1)。为了排除非特异性污染蛋白,我们使用稳定地表达空标志载体的细胞系来进行同时的免疫亲和纯化和LC-MS / MS分析作为对照。除去该对照中鉴定的蛋白质,总共留下320个鉴定的蛋白质。我们进一步改进了我们的数据列表,仅包括在7个生物实验中至少5个中鉴定的蛋白质,如下所示 表I..
      表I.LC-MS / MS识别许多已知和几种新型Numb相互作用蛋白。通过LC-MS / MS鉴定的蛋白质列表,如用NUMB同种型共沉淀。这里显示的是在标志对照中未鉴定的蛋白质,并且在七个生物学复制中的至少五种中出现,具有P66或P72同种型。每个鉴定的蛋白质的蛋白质识别概率为100%。 *表明以前识别出Numb相互作用蛋白
      鉴定的蛋白质基因符号加入号码分子Weightp66p72
      光谱计数序列覆盖范围光谱计数序列覆盖范围
      蛋白质Numb同源物的同种型1麻木的IP.I.0013794371 kDa25332%106041%
      *适配器相关的蛋白质复合物2,alpha 2AP2A2IP.I.00016621.104 KDA.18734%67136%
      AP-2复合亚基β-1的同种型1AP2B1IP.I.00784156.105 kda.17835%64338%
      AP-2复杂亚单位的同种型1AP2M1IP.I.00022256.50 kDa10735%37555%
      * AP-2复杂亚基α-1的同种型BAP2A1IP.I.00256684.105 kda.12721%35925%
      *表皮生长因子受体衬底15EPS15IP.I.00292134.99 kDa3824%29441%
      RALBP1相关的EPS域包含1个同种型A.REPS1IP.I.0033753287 kDa7518%15131%
      * cDNA FLJ60624,与表皮生长因子受体衬底15相似,如1EPS15L1.IP.I.00163849.100 kda.77%12423%
      25 kda蛋白质IP.I.0087243025 kDa3028%7937%
      AP-2复数亚基Sigma-1的同种型2AP2S1IP.I.00183781.12 kDa00%8744%
      AP-1复合亚基Beta-1的同种型AAP1B1IP.I.00328257.105 kda.1610%7717%
      * RALA结合蛋白1RALBP1IP.I.0000954476 kDa99%7027%
      三官能酶亚基α,线粒体哈哈IP.I.00031522.83 kDa75%7422%
      丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白2的同种型1SRRM2IP.I.00782992.300 KDA.378%344%
      BMP-2诱导蛋白激酶的同种型1BMP2KIP.I.00337426129 KDA.226%4012%
      * 14-3-3蛋白εywhae.IP.I.00000816.29 kDa1322%3128%
      同种型1脆弱的X精神迟滞综合征相关蛋白1FXR1IP.I.00016249.70 kDa67%3212%
      断点聚类区域蛋白的同种型1BCR.IP.I.00004497.143 KDA.00%278%
      Bcl-2相关转录因子1的同种型1BCLAF1IP.I.00006079.106 kda.95%125%
      在包括EPS15和α-Adaptin(
      • Santolini E.
      • Puri C.
      • Salcini A.E.
      • Gagliani M.C.
      • Pelicci P.G.
      • Tacchetti C.
      • 迪菲尔德P.P.
      麻木是一种内吞蛋白。
      ,
      • Salcini A.E.
      • Confalonieri S.
      • Doria M.
      • Santolini E.
      • Tassi E.
      • Minenkova O.
      • Cesareni G.
      • Pelicci P.G.
      • 迪菲尔德P.P.
      结合特异性和EH结构域的体内靶标,新型蛋白质蛋白质相互作用模块。
      ),验证方法是否适合识别NUMB相关复合物(表I.)。此外,几种蛋白质如BMP-2可诱导蛋白激酶(BMP2K),断点聚类区蛋白(BCR)和含有蛋白质1(REPS1)的RALBP1相关的EPS结构域被重复地鉴定为麻木相互作用蛋白(表I.)。为了评估麻木相关蛋白之间的关系,我们使用串以鉴定已知的物理蛋白质 - 蛋白质相互作用并可视化NIMB相关蛋白质交互网络(
      • Jensen L.J.
      • Kuhn M.
      • 斯塔克米
      • Chaffrons。
      • CREEVEY C.
      • Muller J.
      • Doerks T.
      • 朱利安P.
      • 罗斯A.
      • Simonovic M.
      • Bork P.
      • von mering c.
      String 8-蛋白质的全球视图及其在630个生物中的功能相互作用。
      )。该分析表明,大多数蛋白质具有与相互联系的内肾复合物的一部分相互作用(Fig. 1B)。
      我们进行了额外的实验,以验证由LC-MS / MS鉴定的新型Numb相关蛋白质。虽然BCR被发现低频谱数,但在我们的LC-MS / MS实验中仅与NUMB P72相关联(表I.),当在HEK293T细胞中表达时,用P66和P72同种型纯化Myc-BCR共传解亲和力(Fig. 2B)。与表达细胞裂解物的MyC-BCR混合不同区域的GST融合。 BCR以独立于外显子9序列(图。 2A2C)。因此,BCR能够与麻木同种型相互作用。可以存在额外的决定因素,其限制了LC-MS / MS实验中的BCR相互作用对P72 NUMB,或者BCR-P66 NUMB复合物可以简单地存在于FLAG-P66免疫沉淀物中的检测极限下。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2鉴定的蛋白质Reps1和BCR与Numb的羧基区域相互作用: A,示意图,显示了用于的GST融合蛋白 体外 在面板中拉下测定 CE. B.,HEK293T细胞与如图所示用MyC-BCR和HA-NUMB同种型共转染。将细胞裂解物免疫沉淀,用指向麻木的HA表位标签的抗体,通过SDS-PAGE分离蛋白质复合物并通过免疫印迹分析。 C,Numb PTB结构域(GST-NB PTB)的GST融合蛋白,羧基末端麻木的一半包括(GST-NB 184-603)或排除(GST-NB 184-555)外部区域,或单独使用GST并从过表达MyC-BCR的HEK293T细胞与细胞裂解物一起温育。通过SDS-PAGE分离复合物,并使用抗Myc抗体分析免疫印刷。 D,HEK293T细胞用HA-REPS1和标记NUMB同种型或如图所示的空载体对照。将裂解物与针对Reps1或Flag表位的HA表位标签的抗体一起温育。用SDS-PAGE分离蛋白质复合物,并通过免疫印迹使用抗体(NUMB)分析。 E,仅纯化GST融合蛋白GST-NB PTB,GST-NB 184-603或GST,与过表达HA-REPS1的HEK293T细胞与细胞裂解物一起温育。通过SDS-PAGE分离复合物,并使用抗HA抗体分析免疫印刷。
      Reps1是含有先前综述以与RAL结合蛋白1相互作用的蛋白质(RALBP1)的蛋白质(
      • yamaguchi A.
      • urano t.
      • goi t.
      • Feig L.A.
      EPS同源性(EH)域蛋白质与RAL-GTPA酶RALBP1结合。
      ),这又被证明与Numb相关联(
      • 罗西C.
      • L'Hoste S.
      • offner n。
      • 皮卡德A.
      • Camonis J.
      RLIP是RAL GTP酶的效应器,是CDK1在有丝分裂中的内吞作用的关闭期间磷酸化epsin的平台。
      )。我们鉴定了RALBP1和REPS1,虽然两个蛋白质可以直接且独立地与NUMB相互作用,但这些蛋白质可能与麻木的三种蛋白质复合物接合。与RALBP1相比,从与麻木同种型相关联的REPS1导出的更多光谱计数。尽管与不同蛋白质相关的光谱计数在定量意义上没有相当,但是该观察促使我们测试Reps1是否直接与Numb相互作用。要确认REPS1和NUMB交互,我们在HEK293T细胞中表示NUMB P72或P66和HA-REPS1,并进行了共同免疫耐压。 REPS1与P66和P72 NUMB同种型绑定(Fig. 2D),这种互动被复制 体外 使用Numb的C末端区域的GST融合(Fig. 2E)。这些数据与其中REPS1的EH结构域介导的型号的模型一致,并且在已经显示NMB的NUMB末端附近发现结合EPS15和EHD1的羧基末端附近的NPF基序。
      为了进一步定义与Reps1的交互,我们测试了孤立的reps1 eh域绑定到numb的能力。在HEK293T细胞裂解物中,REPS1和EPS15 GST-E域融合蛋白结合到内源性麻木(Fig. 3B)。虽然两种REPS1和EPS15 EH结构域与HA标记为P66和P72同种型,但缺失包括NPF基序(P66ΔC和P72ΔC)的NUMB C末端氨基酸强烈地减少与EPS15 EH2结构域的结合(图。 3.A3C)。相比之下,REPS1 EH域仍然绑定到NumBP66ΔC和P72ΔC,尽管在P66的情况下虽然在降低的水平下,但是据说Reps1 EH域可以通过替代网站与NUMB相互作用(Fig. 3C)。我们还观察到,P72 Numb同种型中的羧基末端NPF基序的缺失对Reps1 EH结构域结合具有较小的影响,并且EPS15 EH2仍然能够弱到这种突变形式的麻木。这表明在P72的背景下,可以存在含有蛋白质的NUMB和EH结构域之间的额外相互作用模式(下面讨论)。以前,据报道,REPS1 EH结构域与含有DPF基序的肽结合(
      • 金斯。
      • cullis d.n.
      • Feig L.A.
      • Baleja J.D.
      Reps1 EH结构域的溶液结构及其与NPF靶序列结合的表征。
      )。麻木同种型两种DPF基族含有两个DPF基序,其中一个在蛋白质(DPF1)的中央区域中,并且在上述羧基截短中删除的区域内,其形成AP-2(DPF2)的结合位点。我们测试了Reps1 EH域的结合,使NPF或DPF基序突变或删除了NPB蛋白。尽管单独的DPF1的突变不影响Reps Eh域结合,但Reps1结合缺少羧基末端DPF和NPF主题的Numb需要DPF1( 图。 4.A4B)。 NPF基序的突变消除了与EPS15 EH2结构域的结合,但对Reps1 EM域结合几乎没有影响到麻木,而DPF1和NPF基序的双突变体被废除与Reps1 EH结构域的结合(Fig. 4B)。这些数据表明DPF1表示新颖的EH域绑定基序,并且REPS1通过DPF1或NPF主题直接绑定到EH域依赖性方式中的NUMB。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Reps1的EH域介导与麻木的结合。 A,表示用于映射Reps1绑定站点的突变构建体的位置的Numb示意图和Reps1和EPS15的示意图。 B,将EPS15的Reps1或EH2结构域的分离的EH结构域的GST-融合蛋白纯化并固定在谷胱甘肽琼脂糖上,并与HEK293T细胞裂解物温育。洗涤结合的配合物,用SDS-PAGE分离并用针对麻木的抗体免疫。 C,HEK293T细胞用HA标记的Numb P66,P72或羧基 - 末端截短突变体(HA-P66ΔC,HA-P72ΔC)转染,裂解,并与融合到EP域的EH结构域或EPS15的EH2结构域的固定的GST混合。用抗HA抗体通过免疫印迹洗涤并分析复合物。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4REPS1 EH域绑定NPF和DPF三肽图案在NUMB中。 A,指示DPF1和NPF突变在NUMB中的位置的示意图。 B,映射REPS1 EH结构域和NUMB之间的相互作用,通过(()在(左右)中用突变构建体转染HEK293T细胞。A),与纯化的GST-EH结构域融合蛋白一起孵育的转染细胞裂解物。 C,为了评估直接结合麻木,纯化的固定化的GST-麻木融合蛋白,具有或不具有外显子9(GST + EXON9,GST-EXON9)和融合蛋白,其单独使用羧基末端截短(ΔC)或与突变组合将DPF1主题(DPF1)与EPS15或REPS1的纯化的His标记的EH域一起孵育。将GST融合蛋白结合复合物洗涤五次,并通过SDS-PAGE分离蛋白质,并使用抗体的抗体免疫。
      为了确定REPS1-NIMB相互作用是否直接,我们生产了NUMB(野生型,ΔC或DPF1-AAAΔC的羧基末端的GST融合蛋白, Fig. 2A)和他标记的Reps1的EH域的版本。使用纯化的GST-NUMB和HIS-REPS1-EH,我们观察了REPS1 EH域的直接绑定到羧基末端麻木的一半。甲基末端NPF和DPF2基序(ΔC)的缺失没有改变REPS1 EH结构域与GST-NUMB结合的能力,包括外显子9,但减少与GST-NUMB的结合缺乏外显子9.另外的DPF1基序的进一步突变进一步突变ΔC突变废除结合表明,REPS1 EH结构域直接与DPF1三肽基序结合在麻木上(Fig. 4C)。此外,这些数据表明,在外显子9序列存在下,DPF1可以是显性REPS1结合位点。

       使用SRM定量NUMB同种型相关蛋白质复合物的定量

      我们认为NUMB同种型之间的功能差异可以表示结合化学计量或优先复杂关联的差异,其超出上述LC-MS / MS方法的分辨率。因此,更精确地量化Numb相关蛋白,我们使用了SRM-MS的定量靶向方法。建立SRM标准,要求单个过渡峰值至少两倍大于近端背景水平,并监测每种肽的至少三种过渡,以及每种蛋白质的两种肽。我们选择并优化了由LC-MS / MS识别的36种蛋白质的过渡,基于 在Silico. 通过从LC-MS / MS实验中检查产生的肽特性以及检查光谱。其中,九岁达到了我们的纳入标准(补充表S2):AP2A1,AP2B1,AP2M1,AP2S1,EPS15,EPS15L1,REPS1,RALBP1和BMP2K。除了开发这些相互作用蛋白的SRM方法之外,开发了用于NumB肽的方法,以促进标准化并区分P62和P72同种型。为了验证从P66区分P72的能力,通过稳定转染的HEK293T细胞系通过抗标志IP分离这些蛋白质。如预期的那样,获得仅来自P72蛋白的三种不同转变的共同洗脱SRM信号,而使用P66和P72同种型()测量衍生自GFPALSQK的四种共同洗脱转变。Fig. 5)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5SRM.分析可以在Numb同种型之间可重复区分。 A,将稳定表达FLAG NUMB P66或P72的HEK293T细胞系被抗标绳抗体裂解,裂解和免疫沉淀。用胰蛋白酶洗涤,洗脱蛋白质复合物并用胰蛋白酶消化并消化。然后通过SRM-MS分析肽。图表表示所指示的过渡和肽的SRM信号的代表性实例。在P66和P72中发现GFPALSQK和Ylghevdesr肽,而Etnpwahvpdaank仅在Numb P72中发现。 B,来自p66和p72常见的肽的Srm信号(Ylghvevdesr&gfpalsqk)指出(A),量化,显示了3个独立生物学和技术复制的平均信号。 C,与在相同样品中测量的p72特异性Numb paptide etnpwahvpdaank相关的平均srm信号。误差线表示均值的标准差。
      为了相对量化上述九个NumB P66或72相关蛋白,对P66和P72 IP进行多重SRM(MSRM)方法,该方法监测一组转变,其单一分析延流中的所有九个蛋白的肽(补充表S2)。该分析显示,在P72相关复合物中,四个九种蛋白质,EPS15,AP2A1,AP2M1和AP2S1比P66复合物更丰富(Fig. 6)。对于P72,其他两个内吞蛋白AP2B1和EPS15L1的平均值也更大,但没有统计学意义。其他三种蛋白质在P66复合物中出现更普遍,但这些差异也没有统计学意义(Fig. 6)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6麻木相关蛋白质的SRM分析显示同种型之间的优先关联。 裂解过表达稳定细胞系的NumB P66或P72,并使NimB相关的蛋白质复合物免疫沉淀,洗涤,洗脱和胰蛋白酶消化。然后通过复用的SRM-MS分析该肽的混合物以相对量化的表明蛋白质。条形图表示从3个独立实验中鉴定的平均所指明的蛋白质的量,标准化为麻木。误差条表示平均值的标准误差,星号表示使用学生的统计显着性 t test (p < 0.05).
      我们还使用了相同的方法来量化内源性Numb相关蛋白质复合物。这种方法不允许比较特异性Numb同种型相关复合物,因为两种同种型以不同水平表示,并且通过抗麻痹抗体识别,但是我们能够监测来自三种Medulloblastoma细胞系的内源性麻木复合物的差异( 补充图S2)。例如,与ONS76细胞相比,AP-2复合物在所有三种细胞系中与麻木的麻木有关,而与ONS76细胞相比,在Daoy和Med8a细胞中相互作用的Reps1的量高得多。

       EPS15优先与麻木的P72同种型相关联

      为了确认我们的观察结果,即与P66相比,与P66相比的72个同种型相关的EPS15显着更多,我们瞬时将两个标志Numb同种型转染到HEK293T中,并进行了标志免疫亲和纯化,然后进行了内源EPS15的蛋白质​​印迹。我们量化了与每种Nimb同种型复合的EPS15的量相对于三种生物学重复的麻木量,并且与P66相比,观察到与Numb P72结合的EPS15更高(Fig. 7A)。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7EPS15优先与P72相关联: A,HEK293T细胞用FLAG NUMB P72,P66或空载体转染,并在非经济型P-40裂解缓冲液中裂解。进行抗标志抗体或正常小鼠IgG(对照IP)的免疫耐药,并通过SDS-PAGE分离分离的蛋白质复合物,并使用抗体与EPS15和旗帜进行免疫印迹分析。 Immunoblot显示的印迹是表示三种复制实验的。将EPS15的西免疫斑化学发光信号量化并标准化为每个样品中的麻木量。该分析表明,EPS15至P72 NUMB的平均比率(0.23 SE = 0.07)显着大于EPS15至P66 NUMB的比率(0.19 SE = 0.06)(p = 0.027)。 B,用3xFlAG Numb P66或P72瞬时转染HeLa细胞免疫荧光图像的代表性实例,并使用针对旗和内源EPS15的抗体进行接近连接测定(PLA)。为了确认麻木表达,用抗麻木(绿色)染色细胞,并且过表达细胞中的NUMB信号明显大于未转化的细胞,并且在未经缩合的细胞中观察到很少的PLA事件。 C,量化从最少三个生物重复的PLA事件(红色)大于50个细胞。计算并绘制平均计数(平均PLA事件:NUMB / EPS15 PLA:P66 237.3±8.3,P72 307.0±24.5; NUMB / TFR P66 234.0±14.6,P72 249.9±29.7; TFR / EPS15 P66 150.9±12.0,P72 149.8±19.0)。误差线表示均值的标准差;双星形表示统计显着性, p <0.05。 (Numb / EPS15 P66 n = 161,p72 n = 183,NUMB / TFR P66 n = 122,p72 n = 105,TFR / EPS15 P66 n = 80,P72 n = 74).
      一个 原位 接近结扎测定(PLA)(
      • Fredriksson S.
      • 古伯格米
      • 贾维斯J.
      • olsson c.
      • Pietras K.
      • Gustafsdottir S.M.
      • Ostman A.
      • LANDEGREN U.
      使用邻近依赖性DNA连接测定的蛋白质检测。
      ,
      • Gajadhar A.
      • 瓜哈A.
      使用瞬时转染的表位标记蛋白质的近距离连接测定:用于原位检测二聚受体酪氨酸激酶的应用。
      ,
      • Soderberg O.
      • 古伯格米
      • 贾维斯M.
      • Ridderstrale K.
      • Leuchowius K.J.
      • 贾维斯J.
      • Wester K.
      • 氢干P.
      • Bahram F.
      • Larsson L.G.
      • LANDEGREN U.
      通过近距离连接直接观察单个内源性蛋白质复合物。
      )用于量化完整细胞中的NumB-EPS15相互作用。在该测定中,使用寡核苷酸结合的物种特异性抗体来检测两个潜在的相互作用蛋白。当两种蛋白质紧密(30nm)时,结合的寡核苷酸杂交,并且可以指示对多丙烯蛋白复合物的直接相互作用或分层化。通过用荧光寡核苷酸扩增和标记来检测杂交的寡核苷酸。用氨基 - 末端标志 - Numb P66或P72转染HeLa细胞,覆盖在盖玻片上,然后针对标志或内源EPS15的抗体用于检测相应的蛋白质。除了PLA荧光信号之外,使用针对羧基末端的Numb末端的抗体免疫染色,以允许检测转染的细胞。从至少三个生物复制中,在过表达NUMB P66或P72的随机选择的细胞中计数PLA信号(Fig. 7B7C)。在与SRM数据的一致性中,PLA信号的统计学显着差异表明,在完整的细胞EPS15中更常用于P72(307.0事件/小区±24.5, n = 183)比P66(237.3事件/小区±8.3, n = 161) (Fig. 7D)。为了确定这些观察是否可能是由Numb同种型或EPS15募集到克拉霉蛋白涂覆的囊泡的差异引起的,我们用针对麻木的抗体和转铁蛋白受体(TFR)的PLA测定,用于Clathrin涂层凹坑和囊泡的标记物。观察到麻木同种型和TFR之间的PLA事件数量没有显着差异(Fig. 7D, 补充图S3)表明两种蛋白质与克拉棘涂层凹坑类似地定位。另外,当用过表达P72或p66麻木的细胞中的抗EPS15和TFR抗体进行PLA时,没有观察到显着差异( Fig. 7D, 补充图S3),表明EPS15与Clathrin涂层囊泡的类似招募。

       麻木相关内胶质复合物的动态调节

      已知麻木磷酸化调节其与AP-2复合物的关系,并且对于维持麻木的不对称膜定位是重要的(
      • DHO S.E.
      • Trejo J.
      • siderovski d.p.
      • McGlade C.J.
      G蛋白偶联受体和蛋白激酶C活化的哺乳动物Numb动态调节:与皮质膜麻木闭合的结构决定簇。
      ,
      • 史密斯C.A.
      • 刘开
      • Rahmani Z.
      • DHO S.E.
      • 兄弟G.
      • 她是的
      • 浆果d.m.
      • 博尼尔E.
      • Thibault P.
      • Schweisguth F.
      • Le Borgne R.
      • McGlade C.J.
      APKC介导的磷酸化调节细胞命运决定簇NUMB的不对称膜定位。
      ,
      • Tokumitsu H.
      • HATANO N.
      • yokokura s.
      • Sueyoshi Y.
      • nozaki n。
      • Kobayashi R.
      麻木的的磷酸化调节其与Clathrin相关的适配器AP-2的相互作用。
      )。为了确定与NUMB相关的复合物是否在磷酸化时改变,我们处理了用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂Calyculin A表达细胞系的P66和P72,我们以前所示诱导麻木的高磷酸化(
      • 史密斯C.A.
      • 刘开
      • Rahmani Z.
      • DHO S.E.
      • 兄弟G.
      • 她是的
      • 浆果d.m.
      • 博尼尔E.
      • Thibault P.
      • Schweisguth F.
      • Le Borgne R.
      • McGlade C.J.
      APKC介导的磷酸化调节细胞命运决定簇NUMB的不对称膜定位。
      )。用钙霉素A治疗细胞,导致两种同种型的电泳迁移率降低,反映其异磷酸化(Fig. 8A)。通过SRM分析来自Calyculin处理或载体控制处理过的细胞裂解物的旗帜 - 免疫亲安复合物。与DMSO相比,P66和P72麻痹相关的蛋白质复合物在用钙霉素治疗后脱离,(Fig. 8B)。 Numb相关的AP-2复合亚基以及REPS1和RALBP1,减少〜50%,较少的EPS15和EPS15L1复合物的20%仍然依赖于钙霉素A治疗后相关(Fig. 8B)。 BMP2K与P72 NUMB的关联是Calyculin未改变的唯一相互作用,该治疗表明其与Numb同种型的结合可以差异调节。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8高磷酸化导致麻木复合物的脱离: A,用50 n处理表达3xFLAG NUMB P66或P72的稳定细胞系20分钟m Calyculin A或同等卷DMSO(车辆)。 Western印迹显示出由于用钙黄素A处理的麻木同种型的超磷酸化引起的带偏移。抗α-微管蛋白探针用于表示等于蛋白质负载。 B,对来自表达NumB P66或P72的细胞系的标志免疫沉淀物进行SRM-MS,以分析磷酸化(Calyculin A处理)对Numb相互作用蛋白的影响。与DMSO处理的对照相比,每个相互作用蛋白的相对量被绘制为炭疽蛋白A诱导的折叠变化,并将其标准化为每个样品中的麻木蛋白的量。误差栏代表标准错误。星号表示统计学意义(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
      我们认为正在监测的SRM过渡可以通过Calyculin A治疗来改变,从而消除了我们检测到它们的能力。然而,尽管麻木肽均含有单个丝氨酸,但既没有含磷酸化的残留物也不是磷酸化,也没有观察到钙霉素的LC-MS / MS实验中这些残留物的磷酸化进行处理过的样品(数据未显示数据)。此外,非丝氨酸的分析,监测蛋白的肽肽的肽显示出与完整过渡列表的相似趋势,支持磷酸化导致麻木复合物的解离的结论。
      我们还使用SRM在抑制Clathrin介导的内吞作用并随时间抑制克拉仑介导的内吞作用和恢复内吞作用后监测麻木相关蛋白质复合物。通过破坏克拉仑晶格和克拉林涂覆的囊泡的形成抑制钾抑制内吞作用,并重新加入等渗钾允许克拉林涂层凹坑的重整,并允许内吞作用进行(
      • Larkin J.M.
      • 棕色M.S.
      • Goldstein J.L.
      • 安德森·卢比。
      细胞内钾的耗尽捕获涂覆坑形成和受体介导的成纤维细胞内吞作用。
      )。 HEK293T表达标记标记的P72或P66麻木的细胞未经处理,或经受钾耗尽,然后用含钾培养基重构5,15和25分钟的回收率。通过SRM分析来自未处理,耗尽的钾的免疫沉淀物或重构时间点的标志 - Numb免疫沉淀物。在任何条件下观察到AP-2复合物的亚基与亚基的亚基相关差异,表明NUMB和AP-2的关联不受耗尽或(活性或抑制)的内吞作用(Fig. 9A)。相比之下,EPS15与麻木的关联导致内吞作用的抑制导致显着降低。对于NEPS1与NIMB的抑制表明,抑制内吞作用的抑制损害含有EH域域蛋白质的抑制作用(Fig. 9A)。 EPS15,REPS1和BMP2K的结合产生了显着增加的内吞作用导致了麻木。细胞内的麻木水平以及EPS15似乎在内核细胞嵌段和恢复阶段进行细胞中是稳定的(Fig. 9B)。因此,与这些蛋白质的麻木关联的变化似乎不是蛋白质丰度变化的结果。这些数据表明,尽管与AP-2复合物的麻木关联是本构相关的,但是与内吞机械的附加组分有动态调节麻木关联。
      图缩略图GR9.
      Fig. 9内吞作者逮捕和恢复揭示了麻木相关复合物的变化: A,HEK293T细胞系稳定过表达麻木的细胞系为汇合,然后进行k+ 用低渗介质耗尽5分钟,然后是k+ 耗尽培养基15分钟以阻止内吞作用。细胞在此时裂解,或放入k+ 恢复媒体表示指示的时间点。对裂解物进行免疫纯净,以向下拉出麻木络合物,然后用胰蛋白酶消化并通过SRM-MS分析以定量相互作用蛋白的相对量。每个相互作用蛋白的定量SRM信号在每个实验中归一化至NUMB,并且条形图表示所识别的蛋白质相对于0'时间点的比率。误差栏代表平均值的标准误差,星号表示统计学意义(p < 0.05). B,当内吞作用被阻断时或在未处理的细胞中,或者在未处理的细胞中,或者在未经处理的细胞中,或者在指示时间点的内吞回收相中,免疫印迹,在未处理的细胞中显示Numb p72的细胞间水平和EPS15。

      讨论

      在这里,我们使用串联质谱法鉴定与NumB和SRM-MS相关的内吞蛋白网络,以量化与个体麻木同种型相关的特异性相互作用蛋白质。我们鉴定了与NUMB相关的内吞复合物,其包括若干已知的麻木相互作用蛋白,例如α-Adaptin,其相关的AP-2亚基和EPS15。此方法揭示了可以参与包括BMP2K(骨髓蛋白2可诱导激酶),BCR(断点聚类区域),RALBP1(也称为RLIP,RLIP76)和REPS1(RALBP1相关的EPS-结构域含有蛋白质)。
      BMP2K最初鉴定为BMP2诱导基因,编码丝氨酸/苏氨酸激酶,与AP-2相关激酶1(AAK1)共享42%的氨基酸相似性,已知的NUMB相互作用伴侣(
      • kearns a.e.
      • donohue m.m.
      • 三洋B.
      • 贬低M.B.
      一种新的蛋白激酶的克隆与表征,损害体外骨细胞分化的蛋白激酶。
      ,
      • Sorensen E.B.
      • 康纳S.D.
      AAK1在克拉辛介导的内吞作用的早期步骤中调节麻木功能。
      )。 AAK1已被证明磷酸化AP-2的μ2亚基,并调节AP-2复合物的组装(
      • 瑞科斯D.
      • 康纳S.D.
      • Schmid S.L.
      • von figura k。
      • 珩磨S.
      AAK1磷酸化AP2Mu亚基介导高亲和力结合到膜蛋白分选信号。
      )。此外,已显示AAK1调节麻木的定位对Perinuclect核心和血浆膜(
      • Sorensen E.B.
      • 康纳S.D.
      AAK1在克拉辛介导的内吞作用的早期步骤中调节麻木功能。
      )。最近BMP2K被鉴定为克拉肽涂层囊泡相关蛋白,表明它可能还可调节内吞复合物(
      • 鲍恩G.H.
      • 一个trobus R.
      • 赫斯特J.
      • Bhumbra G.S.
      • Kozik P.
      • 杰克逊L.P.
      • Sahlender D.A.
      • 罗宾逊M.S.
      多变量蛋白质组学分析识别涂覆囊泡的新型辅助蛋白。
      )。我们无法获得全长BMP2K CDNATO,进一步表征其与NUMB的互动。然而,BMP2K很可能以与AAK1相似的方式相互作用,所述术语具有高度的序列相似性,包括两个蛋白质的羧基末端中的电位PTB畴结合基序。
      我们还确定了BCR和Numb之间的相互作用,并且能够确认这种互动 体外 GST下拉实验以及免疫亲和纯化。 BCR基因对于其在慢性髓性白血病中的作用,作为与ABL酪氨酸激酶的致癌易位(
      • 罗利J.D.
      字母:通过喹吖啶荧光和Giemsa染色鉴定的慢性髓性白血病中的一种新的一致染色体异常。
      )。 BCR蛋白包括GEF和GAP结构域,并调节小GTP酶,包括RAC1(
      • Cho Y.J.
      • CUNNICK J.M.
      • yi s.j.
      • Kaartinen V.
      • Groffen J.
      • 赫里斯特坎普N.
      ABR和BCR,两种同源RAC GTP酶活化蛋白,对照鼠巨噬细胞的多个细胞功能。
      )。尽管MS分析表明BCR仅与P72相关联,但生物化学分析表明BCR可以通过麻木羧基与PTB结构域的麻木区域相互作用。 NUMB-BCR相互作用可以提供麻木介导的内吞作用和RAC介导的肌动蛋白细胞骨架动力学之间的联系。实际上,我们之前已经表明,MDCK细胞中的麻木耗竭导致rac1在细胞去极化下游的RAC1(
      • 刘开
      • McGlade C.J.
      麻木的是HGF依赖性细胞散射和RAC1激活的负调节器。
      )。
      我们的分析显示,REPS1和RALBP1形成麻木内吞复合物的一部分。 REPS1是含有最初被识别为RALBP1的结合伙伴的蛋白质的EH结构域(
      • yamaguchi A.
      • urano t.
      • goi t.
      • Feig L.A.
      EPS同源性(EH)域蛋白质与RAL-GTPA酶RALBP1结合。
      )。来自Hela细胞的克拉肽涂层囊泡的最近蛋白质组学谱鉴定了Reps1作为新型内吞囊泡粘稠蛋白(
      • 鲍恩G.H.
      • 一个trobus R.
      • 赫斯特J.
      • Bhumbra G.S.
      • Kozik P.
      • 杰克逊L.P.
      • Sahlender D.A.
      • 罗宾逊M.S.
      多变量蛋白质组学分析识别涂覆囊泡的新型辅助蛋白。
      )。两种REPS1和相关REPS2 / POB1的EH结构域已被证明对NPF和DPF三肽基序具有独特的结合特异性(
      • Salcini A.E.
      • Confalonieri S.
      • Doria M.
      • Santolini E.
      • Tassi E.
      • Minenkova O.
      • Cesareni G.
      • Pelicci P.G.
      • 迪菲尔德P.P.
      结合特异性和EH结构域的体内靶标,新型蛋白质蛋白质相互作用模块。
      ,
      • 金斯。
      • cullis d.n.
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      • Baleja J.D.
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      POB1 EH域与DPF-MOTIF绑定是负责POB1-EPS15的相互作用。
      )。在一致中,我们证明了REPS1 EH域可以将羧基末端NPF基序或在NUMB中央区域中发现的DPF1基序结合。 RALBP1是RAL GTP酶效应蛋白,具有RAC和CDC42的间隙活动(
      • yamaguchi A.
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      EPS同源性(EH)域蛋白质与RAL-GTPA酶RALBP1结合。
      )。先前已经表明,RALBP1在具有内吞蛋白的复合物中发现,并且据报道据据报道与麻木相互作用(
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      RLIP是RAL GTP酶的效应器,是CDK1在有丝分裂中的内吞作用的关闭期间磷酸化epsin的平台。
      )。我们无法在共同表达和互惠共同免疫耐药实验中展示Numb-RALBP1结合。鉴于该REPS1包括RALBP1结合域,我们的羧基末端我们得出结论,REPS1可以将RALBP1的募集介绍为麻木内吞复合物。作为RALA效应器,已显示RALBP1调节受体酪氨酸激酶的内吞作用,并且最近,细胞分裂期间的线粒体裂变(
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      小G蛋白RAL及其下游分子调节EGF和胰岛素受体的内吞作用。
      )。 RALBP1还已经证明促进R-RAS依赖性粘附诱导的RAC激活和迁移以及EPSIN介导的入侵和移民(
      • Goldfinger L.E.
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      )。因此,与NUMB的REPS1和RALBP1关联对于介绍NUMB对受体贩运,RAC激活和细胞迁移的一些影响可能是重要的。
      本研究的目标之一是评估麻木蛋白同种型,特别是含有P72同种型的外显子9,与独特的蛋白质复合物相关联。尽管没有蛋白质与麻木的P72同种型唯一相关的蛋白质,但麻木蛋白复合物的定量SRM分析表明P72-EPS15关联比P66-EPS15关联更丰富。我们通过共同免疫耐用和免疫印迹以及使用A的术语来证实了这一观察 原位 接近连接测定。除了EPS15之外,我们通过SRM分析α,μ和σ亚基的SRM分析优先结合观察到AP-2复合物的含有麻木的含外的P72同种型的α,μ和σ亚基。这些AP-2亚基和P72之间的关联可能与与EPS15的增加的关联链接,因为EPS15还可以通过多个DPF基序结合AP-2(
      • Benmerah A.
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      酪氨酸激酶衬底EPS15构成富有素地与质膜适配器AP-2相关联。
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      AP-2 / EPS15受体介导的内吞作用需要相互作用。
      )。我们无法在可能解释我们观察的P72同种型中识别额外的EPS15结合基序,这表明P72的其他一些性质影响其与EPS15和AP-2的关联。
      以前的研究表明,麻木在几个位点磷酸化,影响其蛋白质相互作用和与细胞膜联合(
      • 史密斯C.A.
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      麻木的对照细胞迁移与APKC和PAR-3的定向细胞迁移进行整合素内吞。
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      麻木的的磷酸化调节其与Clathrin相关的适配器AP-2的相互作用。
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      )。我们使用SRM进一步研究磷酸化对Numb相关复合物的影响。观察到大多数复合物在钙霉素治疗中脱离的络合物,以及随后的麻木高磷酸化,以与先前的观察结果保持,表明麻木磷酸化破坏与β-整联蛋白的相互作用(
      • Nishimura T.
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      麻木的对照细胞迁移与APKC和PAR-3的定向细胞迁移进行整合素内吞。
      ),α-Adaptin(
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      麻木的的磷酸化调节其与Clathrin相关的适配器AP-2的相互作用。
      ),并导致来自血浆膜的麻木的解离(
      • 史密斯C.A.
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      APKC介导的磷酸化调节细胞命运决定簇NUMB的不对称膜定位。
      )。然而,我们不能排除所需的可能性通过其他方式影响与其他方式的相互作用,例如麻木相互作用蛋白本身的磷酸化。我们还使用SRM监测抑制内吞作用的细胞中的Numb相关的内肾复合物。这些研究表明,NUMB与AP-2的关联是本构的,而对BMP2K,EPS15和REPS1的结合在抑制或恢复内吞作用的细胞中具有显着差异。这些数据表明,与Clathrin涂层或翻译后修改的相互作用会影响蛋白质募集到麻木内吞复合物中。
      已经显示Numb调节内吞作用和缺血后缺乏缺口,E-Cadherin和整联蛋白,但涉及的机制也不太了解。与麻木相关的内吞机械的鉴定可能有助于确定麻木在膜蛋白贩运中不同点的作用。需要进一步的机械研究来确定与内部化和内核贩运事件中的其已知功能Numb相关的蛋白质的贡献。

      致谢

      非常感谢Vuk Stambolic for旗舰载体,Fabio Morgese有助于辅助内吞咽封闭的实验,leanne wy​​benga-groot寻求帮助 体外 绑定测定和唐氏桐,托马斯·西仑,Tharan Srikumar,Donna Berry,Sascha Dho和McGlade实验室的其他成员,有助于讨论和评论。

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